Gelişmekte Embriyonik Fare Kalp Vana Bölgesi'nde Protein İzolasyonu
23 Eylül 2014
Genç embriyonik fare kapakçıklarında protein ekspresyonunun analizi, mevcut sınırlı doku nedeniyle engellenmiştir. Bu el yazması, western blot analizi için gelişmekte olan embriyonik fare valf bölgelerinden protein hazırlamak için bir protokol sağlar.
Bu prosedürün genel amacı, embriyonik kalp kapakçıklarından proteini izole etmek ve çıkarmaktır. Bu, önce hamile bir fareden bir embriyonun izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, kalp embriyodan diseke edilir ve daha sonra son aşamada kalp kapakçıkları toplanır.
Doku parçalanır ve elde edilen protein örneği sonraki analizler için hazırlanır. Sonuç olarak, protein ekspresyon seviyelerini değerlendirmek için batı BLO analizi kullanılabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, gelişmekte olan kalbin küçük kompakt şekli nedeniyle diseksiyon adımlarının öğrenilmesi zor olduğu için kritik
öneme sahiptir.İstenilen embriyonik gelişim gününde, hamile kadının karnını sterilize etmek için% 70 etanol kullanın. Daha sonra alt karın bölgesinin derisini ve kasını yukarı kaldırın ve iç organlardan uzaklaştırın ve uterus boynuzuna erişim sağlamak için alt karın boşluğunu inceleyin. Daha sonra, rahim ağzını forseps ile tutun ve uçlara dikkatlice coddle kesin.
Daha sonra boynuzu yerinde tutan herhangi bir bağ dokusunu keserek rahim boynuzunu kaldırın ve rahim boynuzunun uct ile birleşim yerini keserek çıkarma işlemini tamamlayın. Diseke uterus boynuzunu soğuk 0.1 molar tris tamponu içeren bir Petri kabına yerleştirin ve gerektiği gibi durulayın. Sonra rahim boynuzunu kesin.
Embriyonik keseleri ortaya çıkarmak için uzunlamasına açın. Bir embriyoyu ortaya çıkarmak için, plasenta ve embriyonun birleştiği yerde bir embriyonik torba kesin ve embriyoyu serbest bırakmak için göbek damarlarını kesin. Diseke edilmiş embriyoyu soğuk 0.1 molar tris tamponu olan ikinci bir Petri kabına yerleştirin ve ilk Petri kabını kalan ve disseke edilmiş embriyolarla birlikte bir sonraki embriyonik diseksiyona kadar buza geri koyun.
Dekapitasyondan sonra, embriyoyu sırt üstü yerleştirin ve göğüs duvarını göğüs kafesinin kenarı boyunca dikey olarak, topallama için a'ya yakın ve diyaframın üzerinde yatay olarak kesin. Kalbi görselleştirmek için göğüs duvarını açın. Sonra forsepsleri büyük damarlar boyunca yukarıda tutun, kalbi kaldırın ve aşağıdaki damarları kesin.
Sonra, kalbi serbest bırakmak için forsepsin üzerini kesin. Pulmoner damarlar kesilmeden kalırsa, burada açıklanan embriyonik aşamalara devam etmeden önce kalple birlikte akciğerleri çıkarın, pulmoner arter hafif opaktır. Arteri tanımladıktan sonra, kapak seviyesinin üzerinde kesin ve çıkarın.
Şimdi, ECD ventriküler miyokarddan kaçınarak pulmoner kapağın hemen altından kesin ve fazla tris tamponunu ilgilenilen bölgeden uzaklaştırın. Valfi, pulmoner arter gibi iki mikrolitre lizis tamponu içeren bir einor tüpüne yerleştirmeden önce, aort hafif opak görünecektir. Tanımlandıktan sonra, aort kapağının hemen altından kesin.
Yine, trabeküle ventriküler miyokarddan kaçınmak. Fazla tri çözeltisini çıkarın ve ardından valfi lizis, tampon ve pulmoner arter dokusu içeren einor tüpüne aktarın. Dokunun tamamı toplandıktan sonra, numuneleri hemen eksi 80 santigrat dereceye kadar yerleştirin.
Protein ekstraksiyonu için kullanın, toplanan dokuları buz üzerinde çözdürün ve ardından numuneleri dört santigrat derecede 13, 100 Gs'de bir dakika boyunca peletleyin. Elde edilen numunenin hacmini kontrol edin ve toplam hacmi 40 mikrolitreye çıkarmak için lizis tamponu kullanın. Ardından, üreticinin talimatlarına göre 50 hertz'de iki ila dört dakika boyunca bir lyr'deki numuneleri parçalamak ve homojenize etmek için beş milimetre paslanmaz çelik boncuk ekleyin.
Homojenizasyondan sonra, tüpleri kısa bir süre döndürün ve numuneleri yeni tüplere aktarın ve daha fazla deneysel analiz için çözünmeyen kalıntıları geride bırakın. Bu hazırlama tekniği kullanılarak, E 13.5 embriyolarından tek aort kapak bölgelerinde fosforile smad 1 5 8 tespit edilebilir. Örneğin, tek bir kapak bölgesinden bile izole edilen protein, bir araya getirilen valf bölgelerinin sayısıyla orantılı olarak artan sinyal yoğunluğu ile soluk bir p smad bandını tespit etmek için yeterlidir.
Daha da önemlisi, p smad beta aktin oranı, mevcut düşük protein seviyeleri nedeniyle farklı numune boyutlarında açıkça sabit kalır, aynı leke sıyrılamaz ve toplam smad için yeniden incelenemez. Bununla birlikte, toplam smad bir ve beta aktini gösteren ayrı bir leke aynı ifade modelini sergiler. Bu kapak bölgeleri, sağ ventrikülden alınan örneklerle kombinasyon halinde bu hazırlama tekniği kullanılarak ventriküler miyokardın kontamine edilmesinden neredeyse tamamen yoksundur, ventriküler miyokard markörü, aort kapak bölgelerinde bir NP tespit edilemezken, bu belirteç ventrikülde kolayca tespit edilir.
Ayrıca, ventriküler miyokardiyal belirteç miyozin hafif zincir iki V de ventriküler örnekte kolayca tespit edilebilir, ancak aort kapak bölgelerinde zar zor tespit edilebilir, bu diseksiyonu takiben diseksiyonun kesinliğini vurgulamaktadır. QPCR veya RN AIC gibi diğer me'ler, farklı gelişim adımları sırasında hangi alt genlerin etkilendiği gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, farelerde embriyonik kalp kapaklarından protein izole etme ve ekstraksiyonu için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, sınırlı doku mevcudiyeti nedeniyle protein ekspresyonunu analiz etme zorluklarına yöneliktir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Kardiyovasküler Araştırmalar
Arka Plan
- Embriyolar dokuda protein ekspresyon analizi genellikle numune büyüklüğü ile sınırlıdır.
- Kardiyak kapakçıklardaki protein seviyelerinin anlaşılması gelişimsel çalışmalar için kritik öneme sahiptir.
- Western blot analizi, protein ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılan yaygın bir tekniktir.
- Embriyolar kalp gibi küçük dokuların diseksiyonu teknik olarak zor olabilir.
Çalışmanın Amacı
- Embriyolardan fare kalp kapaklarından protein ekstraksiyonu için detaylı bir protokol sağlamak.
- Protein ekspresyon seviyelerinin incelenmesi için western blot analizini kolaylaştırmak.
- Sınırlı numunelerden protein analizinde tekrarlanabilirlik ve doğruluğu artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Hamile farelerden embriyoların izole edilmesi.
- Embriyodan kalbin diseksiyonu.
- Protein ekstraksiyonu için kalp kapaklarının toplanması.
- Analiz için protein örneklerini hazırlamak üzere dokunun lizin işlemi.
Ana Sonuçlar
- Embriyolar kalp kapaklarından proteinin başarılı bir şekilde ekstraksiyonu.
- Western blot analizi için uygun numunelerin hazırlanması.
- Etkili öğrenme için diseksiyon tekniklerinin gösterimi.
- Gelişmekte olan kalp dokularında protein ekspresyon seviyelerinin değerlendirilmesi.
Sonuçlar
- Protokol, embriyonik kalp kapaklarındaki protein ekspresyonunun etkili bir şekilde çalışılmasına olanak tanır.
- Diseksiyon tekniklerinde ustalaşmak için görsel yardımcılar esastır.
- Bu yöntem, kalp gelişimi ve ilgili alanlarda araştırmalara katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Protein isolation from limited embryonic tissue enables detection of signaling pathway activation in early developmental models. This approach supports target validation by providing semi-quantitative data on phosphorylated proteins from pooled microdissected valve regions. The method addresses a key bottleneck in preclinical research where sample scarcity hinders mechanistic de-risking of cardiovascular targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in cardiac valve development through detection of phosphorylated signaling proteins like pSmad1/5/8.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow for protein extraction from four E13.5 mouse aortic valve regions, each yielding ~1 µg protein.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing semi-quantitative assessment of pathway activation in disease-relevant embryonic systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological samples for downstream western blot analysis, enabling reliable compound evaluation in phenotypic screening.
- Operational Value: Standardizes lysis and homogenization protocols using Tris-based buffer with protease inhibitors and SDS-sample buffer for denaturation.
- Scalability: Enables platform reuse across developmental timepoints by pooling tissue to overcome low protein yield limitations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase protein expression data to preclinical validation through consistent pSmad/β-actin ratios across sample sizes.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target engagement by confirming ventricular myocardium exclusion via absence of MYL2V and ANP markers in valve regions.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by linking protein expression patterns to developmental stages using internal controls.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing mechanistic readouts from disease-relevant embryonic systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through detection of phosphorylated signaling proteins in valve tissue.
- Screening: Delivers assay-ready samples with standardized protein extraction, enabling reproducible western blot outputs for compound screening.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements via chemiluminescent signal intensity proportional to protein pool size, supporting comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains continuity from embryonic discovery to preclinical models by preserving pathway-specific expression patterns detectable in separate blots for total Smad and β-actin.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable capability for protein isolation across embryonic cardiovascular studies, reducing redundant protocol development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by enabling detection of low-abundance phosphorylated proteins from microdissected tissues.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined lysis volumes, bead-based homogenization, and consistent sample preparation for western blot.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in early cardiovascular target assessment.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by providing semi-quantitative pathway activation data from embryonic valve regions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection of embryonic cardiac structures to isolate valve regions without ventricular myocardium contamination.
- Dependent on instrumentation for homogenization (lyser with stainless steel beads) and centrifugation at 13,100 × g for sample clarification.
- Necessitates cross-team standardization of lysis buffer volumes (40 µL final volume) and protease inhibitor use to ensure sample consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other embryonic tissues or developmental stages beyond E13.5 aortic valve regions.
- Includes practical limitations such as inability to quantify total protein via spectrophotometry due to low yield, requiring reliance on semi-quantitative western blot analysis.
