Üretilmesi Enterobacter Sp. YSU oksotroflan transpozon mutajenezi kullanarak,

Aşağıdaki deneyin genel amacı, glikoz ile desteklenmiş minimum tuz ortamında büyüyen vahşi tip bir bakteri suşunun TRO'larını üretmektir. Bu, ekler üzerinde rastgele transpoze ile kanna misine dirençli bir bakteri popülasyonu elde etmek için bir transpo zonunun vahşi tip konak suşuna dönüştürülmesiyle elde edilir. Daha sonraki dönüştürücüler, zengin ortamda büyüyen, ancak glikoz ile desteklenmiş ortam olan minimum tuzlarda büyümeyen TRO'ları tanımlayan replika kaplama ile taranır.

Daha sonra, mutanttan gelen DNA sindirilir, bağlanır ve her iki ucunda kesintiye uğramış genin segmentleri ile çevrili transpozonu içeren bir plazmit elde etmek için e coli'ye dönüştürülür. DNA dizilimi ve temel yerel hizalama arama aracı analizine dayalı olarak kesintiye uğrayan genin varsayılan kimliğini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu teknikte kullanılan transpozon, bir replikasyon kökenine, kanamisine dirençli bir gene ve mozaik uçlara sahiptir.

Protein bağlanmasını transpoze etmek için. Transpoze protein geninden yoksundur ve bu nedenle bu transpoze geni transpozon DNA fragmanı ile eklememiz gerekir ve daha sonra transpoz DNA ile protein arasındaki kompleks konakçıya elektropore edilir. Elektroporasyonun temel avantajları, transdüksiyon veya konjugasyon ihtiyacının ortadan kaldırılmasıdır.

Bir transpoze bir genin olmaması genellikle stabil ekler üretir ve bir replikasyon orijininin ve bir CIN direnç geninin varlığı, rekombinant bir plazmit olarak geri kazanılan mutasyona uğramış genin kolayca tanımlanmasına izin verir. Bu yöntem, amino asitlerin, nükleik asitlerin ve vitaminlerin biyosentezi için gerekli genlerin tanımlanması gibi mikrobiyal fizyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem için ilk olarak enterobacter türü YSU'da metal direnç genlerini ararken aklıma geldi ve bunu, enterobacter türlerinin bir gecede kültürünü kullanarak yetkin hücreleri elektropore etmek için geliştirdiğim bir mikrobiyal fizyoloji laboratuvarına dahil etmeye karar verdim.

YSU, taze LB ortamında bir ila 20 seyreltme hazırlar ve 30 santigrat derece ve 120 RPM'de 0.4 ile 0.6 arasında bir OD 600'e inkübe eder. Hücreler uygun yoğunluğa ulaştığında, onları beş dakika boyunca buz üzerinde soğutun ve ardından beş dakika boyunca dört santigrat derece ve 7.000 Gs'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve Resus'a eşit hacimde buz gibi soğuk su kullanın.

Hücre santrifüjünü beş dakika boyunca dört santigrat derece ve 7.000 Gs'de askıya alın. Yıkamayı tekrarladıktan sonra, süpernatanı atın ve buz gibi soğuk su ile hücreleri hücre peletinin hacmine eşit bir hacimde askıya alın. Daha sonra, 40 mikrolitre hücreye 0,5 mikrolitre transpo bölgesi ekleyin.

Daha sonra hücre transpo bölge karışımını buz gibi soğuk bir elektroporasyon veterinerine yerleştirin ve karışımı Q Vet'in dibine hafifçe vurun, hücreleri 25 mikro phs, 200 ohm ve 2.5 kilovoltta şok edin. Hücreleri steril 1,5 mililitrelik bir mikro füj tüpüne aktarmadan önce hemen yukarı ve aşağı pipetlenerek karıştırılmış 960 mikrolitre filtre sterilize edilmiş SOC ortamı ekleyin. Hücreleri 30 santigrat derece ve 120 RPM'de 45 ila 60 dakika inkübe edin.

Daha sonra, plakayı gece boyunca 30 santigrat derecede ızgara Dönüştürücülerine inkübe etmeden önce bir LB kutu agar plakasına 100 mikrolitre hücre yayın. Boş bir 100 x 15 milimetre Petri kabının kapağına bir ızgara bantlayın. Bir LB kutu agar plakasının altına bir çizgi çizin ve ızgaralı kapağa sabitlemek için küçük bir bant parçası kullanın, böylece ızgara burgudan görünür Steril bir kürdan ile.

Tek bir dönüştürücü seçin ve onu ızgaradaki bir karenin ortasında bulun, bitişik bir karede başka bir dönüştürücü bulun ve plaka dolana kadar devam edin. Daha sonra gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Bu, ızgaralı olan her plaka için ana plakadır.

Birden üçe kadar numaralandırılmış üç yeni burgu plakasından oluşan bir yığın yapın. LB için bir numara, M için iki numara, dokuz kutu olabilir. Ve LB için üç numara, kullanmadan önce plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede baş aşağı kurutabilir.

Daha önce gösterildiği gibi her bir plakanın üstüne bir çizgi çizdikten sonra, replika kaplama aletini silmek için %70 etanol kullanın ve veltin kareyi sıkıştırmadan önce üzerine steril bir veltin kare yerleştirin. Ardından, ana plaka üzerindeki çizgiyi kelepçe üzerine çizilen bir çizgi ile hizalayın ve plakayı veltin karenin üzerine yerleştirin. Bakterileri plakadan veltin karesine aktarmak için hafif bir baskı uygulayın.

Daha sonra bir numaralı plakaya çizilen çizgiyi kelepçe üzerindeki çizgi ile hizalayın ve veltin karenin üzerine yerleştirin. Bakterileri veltin karesinden plakaya aktarmak için hafif bir baskı uygulayın. Bir numaralı plakayı çıkarın.

Kadife genç kareyi bir su kabına atın ve replika kaplama aletinin üzerine temiz, steril bir kadife kare yerleştirin. Daha önce olduğu gibi, bir numaralı plakadaki çizgiyi kelepçe üzerindeki çizgi ile hizalayın ve yeni kadife karenin üzerine yerleştirin. Bakterileri bir numaralı plakadan kadife kareye aktarmak için hafif bir baskı uygulayın.

Bir numaralı plakayı çıkarın, iki numaralı plakaya çizilen çizgiyi kelepçe üzerindeki bir çizgi ile hizalayın ve kadife karenin üzerine yerleştirin. Bakterileri kadife on kareden iki numaralı plakaya aktarmak için hafif bir baskı uygulayın, üç numaralı plaka için işlemi tekrarladıktan sonra iki numaralı plakayı çıkarın, plakaları gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Her iki LB kutu plakasında büyüyen ancak M dokuz plakasında büyüyemeyen koloniler hazine olarak kabul edilir.

Bir numaralı plakadan TRO'ları seçin ve yeni bir LB kutu tabağına sürün. Gece boyunca kuluçkaya yatırıldıktan sonra, çizgi plakasından üç koloni seçin ve ertesi gün bunları taze bir LB kutu plakasına koyun. Yeni çizgili plakadan kolonileri bir LB kutu ızgara plakasına yerleştirin ve bu plakayı az önce gösterildiği gibi replika kaplamayı tekrarlamak için kullanın.

Gen kurtarma işlemi gerçekleştirin. Üç mililitre lb büyütmek için izole edilmiş bir mutant koloni kullanın. 30 santigrat derecede gece boyunca kültür yapabilir.

Daha sonra, buz üzerinde 20 mikrolitrelik bir reaksiyonda 0.025 birim BFUC bir kısıtlama endonükleazında bir mililitre kültürden DNA'yı saflaştırmak için ticari olarak temin edilebilen bir genomik DNA saflaştırma kiti kullanın. Daha sonra reaksiyonu 20 dakika boyunca 80 santigrat dereceye aktarmadan önce 37 santigrat derecede 25 dakika inkübe edin. Enzimi etkisiz hale getirmek için, kısmen sindirilmiş DNA'nın üç mikrolitresini %0.8'lik bir AROS jeli üzerinde analiz edin.

Daha sonra, 500 mikrolitrelik bir reaksiyonda 15 mikrolitre kısmen sindirilmiş genomik DNA'ya 800 ünite T dört DNA ligaz ekleyin ve reaksiyonu ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. 50 mikrolitre üç molar sodyum asetat pH 5.5 ve bir mililitre% 95 Etanol ekleyerek bağlanmış DNA'yı 20 dakika boyunca eksi 20 santigrat derecede inkübe ederek çökeltin. Mikro, DNA'yı dört santigrat derecede ve 10 dakika boyunca 13.500 Gs'de karıştırın.

Peleti yıkamak için yedi% 70 etanol olan supernat mekanlarını dökün. Santrifüjlü bir vakum yoğunlaştırıcıda kurutun ve 10 mikrolitre nükleaz içermeyen su kullanın. DNA'yı yeniden süspanse etmek için: Elektroporasyon e coli suşu ile dönüştürmek için dört mikrolitre yeniden askıya alınmış DNA kullanın, ECD 100 DPIR veya ECD 100 DPIR bir 16, tek bir koloni ile beş mililitre LB teneke kutu aşılayın.

Gece boyunca 37 santigrat derece ve 120 RPM'de büyütün. Ertesi gün, DNA'yı tüm kültürden saflaştırdıktan sonra, 14 mikrolitre plazmidi sindirmek için Joe one kullanın. Sindirilmemiş ve sindirilmiş plazmitin 10 mikrolitresini %0.8'lik bir agarro jeli üzerinde analiz edin.

Plazmid diziliminden sonra, transpozun son yedi baz çifti olan beş asal GA, G-A-C-A-G üç asal dizisini arayın ve bunu kesintiye uğrayan gen için dizi izleyecektir. Kesintiye uğrayan genin olası işlevini belirlemek için blast kullanın. Başarılı bir elektroporasyon, bu şekilde her biri ek üzerinde en az bir transpoze olan birkaç bin dönüştürücü verdi.

Siyah kareler, LB teneke kutu plakasında büyüyen, ancak M dokuz minimal orta plakada büyümeyen iki koloniyi göstermektedir. Bu TRO'lar muhtemelen bir amino asit, bir nükleik asit veya bir vitaminin sentezinde yer alan genlerde kesintiler içeriyordu, bunların tümü lb'de bulunur, ancak M dokuz, minimal ortamda bulunmaz. Diğer 86 kolonide, M dokuzda büyüme için gerekli olan bir gende bir kesinti yoktu.

Burada görüldüğü gibi minimal ortam, izole edilmiş bir TRO'dan kısmen sindirilmiş genomik DNA, 10 kilobazın üstünden 0.5 kilobazın altına kadar uzanır. Kurtarılan plazmit, iki kilobaz transpozon artı yan konak DNA'sından oluşur. Bu şekil, bir trodan izole edilen bir plazmit için bir patlama sonucunu göstermektedir.

Kesintiye uğramış dizi, gece boyunca birden fazla büyüme adımına bağlı olarak L tirozin, L fenilalanin ve L triptofanın biyosentezinde rol oynayan mutaz için bir enterobacter cloy genine benzer. Bu teknik, uygun şekilde uygulandığı takdirde 10 veya 11 gün içinde tamamlanabilir. Replika pla yaparken, plakaları lekelememeyi unutmamak önemlidir ve bunu kuru plakalar kullanarak ve plakaları veltin karesine yerleştirildikten sonra hareket ettirmeyerek önleyebilirsiniz.

Bu prosedürü takiben, tanımlanan genin işlevini doğrulamak için klonlama veya tamamlama deneyleri gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, transpozon mutajenezi kullanarak TRO'ların nasıl oluşturulacağını ve mutasyona uğramış genlerin geçici olarak nasıl tanımlanacağını iyi anlamış olmalısınız.