Name: Üretilmesi Enterobacter Sp. YSU oksotroflan transpozon mutajenezi kullanarak, (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: Keşfedin Enterobacter sp. YSU'da transpozon mutajenezi ile oksotrof mutant üretimini. Replika plakalama ve DNA dizileme kullanarak minimal ortamda büyüme için gerekli genleri tanımlayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazar 2010-2014 bahar dönemlerinde benim transpozonunun mutagenez fikirlerini test benim Mikrobiyal Fizyoloji yüksek lisans öğrencilerinin benim lisans Bağımsız Araştırma Öğrenciler tüm ve tüm teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Youngstown State Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü tarafından finanse edildi.

Competent Cells&#39;e 5,11 1. Elektroporasyon <ol><li> Enterobacter sp bir O / N LB kültürünü sulandırmak. Taze LB ortamında 50 ml YSU 1/20 ve 0.4 ve 0.6 arasında bir OD (600 nm), 30 ° C, 120 rpm&#39;de sallama ve büyür. İsteğe bağlı olarak, optimal çoğalma sıcaklığında diğer bakteri soyları büyür. </li><li> 5 dakika santrifüj 4 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca 7,000 x g buz üzerinde hücreleri soğutun. </li><li> , Supernatant 4 ° C&#39;de steril buz gibi soğuk su ve santrifüj 50 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve 5 dakika süreyle 7,000 x g. Bu adımı tekrarlayın. </li><li> Süpernatant atılır ve hücre topağı hacmine eşit buz gibi soğuk su hacminde tekrar süspansiyon hücreleri. Uzun süreli depolama için -80 ° C arasında ve çözülme buz soğukluğunda% 10 (h / h) gliserol, depo eşit pelet hacimde buz soğukluğunda% 10 (h / h) gliserol, tekrar süspansiyon 10 ml Hücreleri yıkamak Elektroporasyonun önce buz üzerinde. </li><li> 40 ul transposome 0.5 ul eklehücreler. Ticari olarak temin edilebilen transposome çözeltisi 0.33 ug / ul DNA konsantrasyonda sağlanır. 0.33 ug tavsiye edilir, ancak, 0.165 mg DNA yeterlidir. </li><li> Bir buz soğukluğunda, 0.2 mm elektroporasyon küveti içinde hücre / transposome karışım konulur ve küvetin altındaki karışımın dokunun. 25 iF 200 Ω ve 2.5 kV hücreleri Şok. , Hücreler soğutulmuş kalmasını sağlamak kullanılmadan önce -20 ° C derin dondurucuda elektroporasyon küvetleri saklamak için. </li><li> Hemen, katabolik baskı (SOC) ortamı ile süper optimum suyu sterilize filtre 960 ul ekleyin. Aşağı yukarı pipetleme ile karıştırın ve steril bir 1.5 ml mikrofüj tüpe hücreleri aktarın. NOT: Hücreler şoktan sonra ölmeye başlar, ama SOC ortamında tuz onları kurtarmak için olanak sağlar. Tasarruf için, transposome eklemek ya da negatif kontrol hücreleri şok için gerekli değildir. Sadece bunu steril SOC orta 960 ul ekleyin. </li><li> 30 ° C f hücreleri inkübeya da 120 rpm&#39;de çalkalayarak 45-60 dakika. Bu kanamisin direnci ifade transposome hücreler, konakçı genomu ile için rekombine için zaman sağlar. </li><li> LB-kan agar plakası üzerinde 100 ul hücre yayıldı ve 30 ° C de bord O / N inkübe edin. 4 ° C&#39;de buzdolabında kalan dönüşüm karışımı saklayın. Gerekirse ilk elektroporasyon 2 hafta sonra bir sonraki tarih kadar ek miktarda yayıldı. </li></ol> Transformantların 2. Gridleme <ol><li> Bant boş bir 100 x 15 mm Petri kabı kapağı için bir ızgara. &quot;Bakteriyel Genetik A Short Course&quot; 12 bir ızgara kopyalayın. </li><li> LB-kan agar levhasının alt tarafında bir çizgi çizin. Izgara agar boyunca görünür şekilde gridded kapağın onu tutturmak için bant küçük bir parça kullanın. Plakanın alt çizgi, ızgaranın üst, merkezi ile hizalanmış olduğundan emin olun. Bant ile plaka Sabitleştirilmesi bile gridding için izin kaymasını onu tutar. Hat çoğaltma sonra kaplama koloni tespitini kolaylaştırır. </li><li> Steril bir kürdan ile bir tek transforman almak ve ızgara bir kare merkezinde o noktaya. Sadece koloni ve yere dokunur. Agar içine kürdan kazmak yok. Plaka kirletmesini önlemek için, yalnızca bir ucunda kürdan anlaştım. </li><li> Adım 2.3 olarak bitişik bir karede başka dönüştürülmüşü nokta. Plaka dolduğunda, 30 ° C / o n inkübe. Bu ana plaka. </li></ol> 3. Kopya Kaplama auxotroph fenotipe 12 belirleme <ol><li> LB-kan için M-9-kan için LB-kan için bir, iki ve üç: gridded her plakanın için, bir ile üç numaralı üç taze agar plakaları destesini yapmak. Kullanımdan önce 37 ° C &#39;de, ters O / N plakaları kurutunuz. </li><li> Aşama 2.2 olarak her bir plakanın üstünde bir çizgi çizin. </li><li> % 70 etanol ile çoğaltma kaplama aracı silin kopya kaplamanın üstüne steril bir pamuklu kadife kare yerleştirmekol ve kadife kare dizginlenebileceği. Eller hatta onları yıkadıktan sonra mikroplarla iç içedir. Kenarndan kadife kare ele mikropları kirletici girişini önlemek. </li><li> Kelepçe üzerine çizilen bir çizgi ile ana plaka üzerinde çizgi hizalayın ve kadife kare üstüne plaka yerleştirin. Kadife meydanına plakadan bakteri aktarmak için hafif bir baskı uygulayın. Bakterileri smear için dikkatli olun. Kadife meydanından ana plakasını sökün. </li><li> Kelepçe üzerinde çizgi ile plaka numaralı çizilen çizgi hizalayın ve kadife kare üstüne yerleştirin. Plakasına kadife meydanından bakteri aktarmak için hafif bir baskı uygulayın. Plaka numarası teker çıkarın. </li><li> Su behere kadife kare atın ve adım 3.3 gibi çoğaltma kaplama aracı üzerinde temiz, steril pamuklu kadife kare yerleştirin. Bu adım aşırı aşılamadan atılım büyüme ve yanlış pozitif sonuçlara neden önler. </li><li> Hizalayınkelepçe üzerinde çizgi ile plaka numarasına bir line ve yeni kadife kare üstüne yerleştirin. Kadife meydanına plaka numara gelen bakteri aktarmak için hafif bir baskı uygulayın. Plaka numarası teker çıkarın. </li><li> Kelepçe üzerinde çizgi ile plaka sayısı iki çizilen çizgi hizalayın ve kadife kare üstüne yerleştirin. Plaka sayısı iki kadife meydanından bakteri aktarmak için hafif bir baskı uygulayın. Plaka numarası iki çıkarın. </li><li> Plaka numarası üç için yineleyin 3.8. Üçüncü levha ise bir diğer iki levha için ana plaka tam devri için bir kontroldür. Su ihtiva eden bir kap içine kadife kare atın. Onları kuru, yıkayın alüminyum folyoya sarın ve bunları yeniden kaynatmayın, kirlenmiş pamuklu kadife kareler içeren beher otoklavlamayın, kadife kareler tekrar kullanmak için. </li><li> 30 ° CO / N de inkübe. Her iki LB-kan agar plakaları üzerinde büyür ancak M-9-kan plakalarına büyümeye başarısız koloniler oksotroflan (olduğu düşünülmektedir <strong&gt; Şekil 2). </li><li> Streak dışarı taze LB-kan agar plaka üzerine plakası itibaren oksotroflan ve 30 ° CO / N de plaka kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Izolasyon taze LB-kan plaka üzerine adım 3.11 çizgi plaka 3 koloniler için dışarı Streak. 30 ° CO / N de plaka kuluçkaya yatmaktadır. Bu mutant iyi izole olmasını sağlar. Bir bölümde her koloninin dışarı üçte içine plaka ve çizgi bölün. </li><li> Taze LB-kan plaka üzerine adım 3.12 türetilen üzerine şerit kolonilerden Spot koloniler adımlar 2,1-2,4 gibi bir tablo oluşturmak için. Her mutant üçlü olarak yeniden test ediliyor. </li><li> Oksotrofu fenotip onaylamak için adımlar 3,1-3,10 gibi yine plaka çoğaltmak. </li></ol> 4. Gen Kurtarma <ol><li> 30 ° C de sıvı LB-kan ortamı içinde aşama 3.13 arasında bir izole edilmiş mutant bir koloni 3 mi göre O / N kültür büyütün. Bir ticari olarak temin edilebilen genomik bir DNA saflaştırma kiti kullanılarak kültürün 1 ml genomik DNA arındırın. </li><li> 0.025 U karışımı kurmakBFU CI kısıtlama endonükleaz ve buz üzerinde 20 ul reaksiyon / ul genomik DNA 1 mcg 14 ul. BFU CI oniki farklı sitelerde transpozonunda keser bu yana, restriksiyon endonükleaz, BFA I veya sırasıyla, iki ve üç farklı sitelerde transpozonunda keser Hae III, kullanmak daha verimli olabilir. </li><li> 25 dakika boyunca 37 ° C&#39;de reaksiyonu inkübe ve daha sonra 80 ° C de 20 dakika enzimler inaktive edildi. % 0.8 agaroz jeli (Şekil 3), kısmen sindirilmiş DNA 3 ul analiz eder. Jel dibine yukarıdaki 10 kb bir karalama başarılı kısmi sindirimi sonuçları. </li><li> 500 ul reaksiyon maddesi içinde T4 DNA ligazı 800 birimleri kullanarak kısmen sindirilmiş genomik DNA 15 ul Arter. Reaksiyon O / N 4 ° C&#39;de inkübe edin. Büyük bir reaksiyon hacmini kendileri tek fragmanların ligasyonu arttırır, ve iki ya da daha fazla DNA fragmanları arasındaki etkileşimi en aza indirir. </li><li> Bir çökeltite 3 M sodyum asetat, pH 5.5 ve 1 ml% 95 etanol içinde 50 ul ilave edilmesi ve 20 dakika boyunca -20 ° C&#39;de inkübe edilerek Bağlı DNA. </li><li> % 70 etanol ile yıkayın pelet, 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de DNA ve 13,500 xg mikrofüj santrifüj vakum yoğunlaştırıcısı kurutun ve nükleaz serbest su 10 ul içinde tekrar süspansiyon haline getirin. Seçenek olarak ise, DNA, havada 15 dakika boyunca oda sıcaklığında kurutulabilir. </li><li> E. dönüştürmek için yeniden süspanse DNA 4 ul kullanın bölüm 1. R6k γ replikasyon orijini olarak elektroporasyon ile E. coli suşu ECD100D pir veya ECD100D pir116 6 çoğaltmak için bir pir gen ile bir bakterinin gerektirir. Düşük kopya plasmidlerde pir zorlanma sonucu, ve pir116 gerginlik yüksek kopya plazmidler sonuçlanan bir pir mutant genini içerir. Her bir transformant transposon ve kesintiye kromozom (Şekil 1 E) bir bölgesi ile bir plazmid içerir. </li><li> InokülasyonlaraTek bir koloni LB-kan, ortamın 5 ml yedi, 120 rpm&#39;de ve 37 ° C&#39;de çalkalama ile G / Ç N çoğaltılmasını ve ticari bir kit kullanılarak bütün O / N kültürden plazmid DNA saflaştırılması. </li><li> Kısıtlama endonükleaz Xhol I&#39;in kullanılması suretiyle plazmidin 14 ul Digest Reaksiyonun nihai hacmi, 20 ul olduğundan emin olun. Bu enzim, kanamisin direnç geninin 5 &#39;ucundaki transpozonun ortasında bir site tanır. Sindirilmemiş 10 ul analiz eder ve bir% 0.8 agaroz jeli (Şekil 3) ile sindirilmiş plasmide. Plasmid 2 kb transpozon artı eteklenen konukçu DNA&#39;dan oluşur. </li></ol> 5. DNA Dizilimi <ol><li> Bir ticari olarak temin edilebilir dizileme kiti, transposon her bir ucuna homolog olan primerler ve bir kılcal dizilim analizi sistemi kullanılarak plazmid dizisi. Seçenek olarak ise, plazmid sekanslama için bir dış kuruma sevk edilebilir. </li><li> Moleküler ağırlık standardı (1 kb merdiven) kullanımJel plazmidin boyutunu tahmin etmek. Daha sonra, 50 fmol için gerekli olan plazmid nanogram (ng) kestirilebilir. </li><li> 260 nm (260) ve 280 nm (A 280) dalga boylarında bir spektrofotometre kullanılarak plazmid DNA konsantrasyonu ölçümü. Küvetinden geçen ışık uzunluğu 1 cm olduğundan emin olun. 50 ng / ml ile 260 nm&#39;de absorbansı çarpılarak konsantrasyonunun belirlenmesi. Yüksek kaliteli plazmid DNA, bir A 260 / 1.8 ve 2.0 arasında bir 280 oranına sahip olacaktır. </li><li> Her sekanslama reaksiyonu için gerekli DNA hacmi plazmid konsantrasyonu ile bölünen, 50 fmol için gerekli ng sayısıdır. 10 ul toplam hacmi getirmek için su ile gerektiği plazmidin miktarda karıştırın. </li><li> 1 dakika boyunca 96 ° C &#39;de plazmid DNA / su karışımının ısıtılması ve daha sonra oda sıcaklığına kadar soğutulması. </li><li> Dizileme kiti ana karışımı 8 ul ve sekanslama primerleri birinin uM 1.6 2 ul ekleyin. </li><li> Foltermal döngü programı ve reaksiyon temizliği için dizileme kiti düşük protokolü. </li><li> Bir kılcal DNA analiz sistemi kullanılarak her bir örnek analiz edin. </li><li> DNA dizisini görüntülemek için piyasada satılan bir yazılım paketi kullanın. Transposon (Şekil 4) ve son 7 bp dizisi, &quot;5&#39;-GAGACAG-3 &#39;,&quot; ara. Bu 7 bp&#39;lik segment 5 &#39;ucunda önce sırası transposon aittir. Bu 7 bp&#39;lik segment 3 &#39;ucundan sonraki sekansı kesintiye uğramış gene aittir. </li><li> Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST) 7,8 kullanılarak kesilen genin olası fonksiyonunu belirler. Aşağıdaki kullanın link: <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch" target="_b;ank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch</a> . Interrupt&#39;ının dizisini yapıştırınsorgu kutusuna ed gen, veritabanı altında &quot;diğerleri&quot; seçeneğini seçin ve sayfanın altındaki &quot;BLAST&quot; üzerine tıklayın. Sonuç göründüğünde, hizalama sonuçları (Şekil 5) görüntülemek için sayfayı aşağı kaydırın. </li></ol>

<ol><li>Kim, B. H., Gadd, G. M. Bacterial physiology and metabolism. , Cambridge University Press. Cambridge. (2008).</li>
<li>Hayes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-based+strategies+for+microbial+functional+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+genetics%22%5BJournal%5D)">Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics.</a> Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).</li>
<li>Hoffman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+chromosomal+gene+disruption+in+vivo+using+transposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes.</a> Methods in molecular biology. 765, Clifton, N.J. 55-70 (2011).</li>
<li>Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+transposon+mutagenesis+by+electroporation+of+released+Tn5+transposition+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes.</a> Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).</li>
<li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+Transformation+of+E.+coli+by+High+Voltage+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li>
<li>Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+rep+technique+for+allele+replacement+to+construct+new+Escherichia+coli+hosts+for+maintenance+of+R6K%CE%B3+origin+plasmids+at+different+copy+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers.</a> Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).</li>
<li>Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Database+indexing+for+production+MegaBLAST+searches%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">a Database indexing for production MegaBLAST searches.</a> Bioinformatics. 24 (16), Oxford, England. 1757-1764 (2008).</li>
<li>Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+computational+biology+a+journal+of+computational+molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).</li>
<li>Holmes, A., Vinayak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+multimetal+resistant+bacterial+strains%3A+Enterobacter+sp.+YSU+and+Stenotrophomonas+maltophilia+OR02%5BTitle%5D)+AND+%22Current+microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02.</a> Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).</li>
<li>Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposome+insertional+mutagenesis+and+direct+sequencing+of+microbial+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes.</a> Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).</li>
<li>Ausubel, F., Brent, R., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+F+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Short Protocols in Molecular Biology</a>. , John Wile., & Sons, Inc. New York, NY. (1997).</li>
<li>Miller, J. H. A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1992).</li>
<li>Gibson, M. I., Gibson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+studies+on+the+isolation+and+metabolism+of+an+intermediate+in+aromatic+biosynthesis%3A+chorismic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid.</a> The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).</li>
<li>Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).</li>
<li>Reznikoff, W., Winterberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-Based+Strategies+for+the+Identification+of+Essential+Bacterial+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Gene+Essentiality%3A+Protocols+and+Bioinformatics+SE%22%5BJournal%5D)">Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes.</a> Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).</li>
<li>Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+genome+deletion+methods+applicable+to+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Random genome deletion methods applicable to prokaryotes.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).</li>
<li>Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knowledge-making+distinctions+in+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays+news+and+reviews+in+molecular%2C+cellular+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Knowledge-making distinctions in synthetic biology.</a> BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).</li>
<li>Zheng, Y. -N., Li, L. -Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Problems+with+the+microbial+production+of+butanol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+industrial+microbiolog.%2C+%26+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Problems with the microbial production of butanol.</a> Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).</li>
</ol>

Yazar ifşa hiçbir şey vardır.

Bir transposome kullanarak transpozonunun mutagenez Enterobacter sp oksotropları üretmek için etkili bir araçtır. YSU ve Gram negatif diğer türleri ve Gram pozitif bakteriler 3,4. Işlem elektroporasyon ile konakçıya Tn 5 türevi transposome katılmasıyla başlatıldı. Uçlar ile kolonilerini teşhis etmek için, dönüştürülmemiş hedef soyu transposon tarafından taşınan direnç seviyesi seçmek için kanamisine karşı duyarlı olması gerekiyordu. Bazı ana bu şekilde konakçı genom ile rekombine önce transp...

Prototrofik bakteri biyosentezi 1, amino asitler, nükleik asitler ve vitaminler gibi öncüleri, oluşturmak için, merkezi karbon metabolizma sentez yollan ile glikoz dönüştürücüler, orta glukoz (M-9 ortamı) ihtiva eden E-9 minimal tuz büyür. E-9 ortamı, bir karbon ve enerji kaynağı olarak bir kükürt kaynağı ve glukoz gibi bir tampon madde ve fosfor kaynağı, magnezyum sülfat gibi bir nitrojen kaynağı, sodyum ve potasyum fosfat, amonyum klorür içermektedir. Luria-Bertani (LB) tripton gelen ve maya ekstraktı vitaminler, büyüme faktörleri, amino asitler açısından zengindir. M-9 ortamı üzerinde büyüme için gerekli olan amino asitler, vitaminler ve diğer büyüme faktörleri sentezleyemediği oksotrofları gelişimini destekler. Oksotroflan M-9 ortamında LB ortamında değil, büyüyecek ise Böylece prototrofları, LB ve M-9 ortamda büyür. Okzotrofik fenotipleri neden mutasyona uğramış genleri bakteri Prototrofik nüfusu mutasyonların sokulmasıyla ve tanımlayarak, bu po olduğunubakterisel bir suş içerisinde metabolizmasının daha iyi bir anlayış elde etmek ssible. Transpozon mutagenezi M-9 ortam içinde glükoz üzerinde büyüme için gerekli olan genlerin çoğu belirlemek için kullanılabilir. Transposonlar konak genomuna 2 içerisine rastgele kendilerini eklemek. E-9, orta agar plakaları üzerine LB agar levhaları onları kaplama çoğaltma transpozon transformantları tespit ederek, oksotrofları taranması mümkündür. Interrupted genler gen kurtarma yoluyla tespit edilir. Bu çalışma, bir ticari olarak temin edilebilir, Tn 5 transposaz protein ile karıştırılmış olarak, bir lineer transpozon DNA segmentinin bir çözelti olarak sevk edildiği transposome -türevli kullanır. DNA segmenti bir transposaz gen yoksun ama kanamisin direnci için bir gen, bir R6K γ tekrarlama orijinini ve bunun sonrasında parçanın 3,4 her bir ucunda bağlama transpozaz için DNA dizileri iki mozaik motifleri ihtiva eder. Transposaz proteinin DNA, tek başına DNA segmenti doğrudan ilave edilir yanatransposon olarak tanımlanır, ve DNA / transposaz protein kompleksi transposome olarak tanımlanır. Transposome bir kanamisin duyarlı konak (Şekil 1A) içine elektroporasyon 5 tarafından dönüştürülür. Kanamisin (LB-kan) içeren LB agar plakaları üzerinde büyüyen koloniler kanamisin (M-9-kan) auksotroplan olan ihtiva eden E-9, orta agar plakaları üzerinde büyümeye başarısız transpozon ekler (Şekil 1B), ve çoğaltma kaplama, transformantların (Figire bilgisi 1C). Bir mutant genomik DNA saflaştırılmış ve kısmen 4-bazlı kesici sınırlama endonükleazı, BFU CI (Şekil 1D) ile sindirilmektedir. Bağlı DNA bu pir geni (Şekil 1E) içeren Escherichia coli (E. Coli) &#39;in bir tür haline dönüştürülür. Bu gen, plazmid transpozonu ihtiva eden ve E içinde replike konak kromozomal komşu bölge sağlar coli 6. Kanamisin e dirençli gen olarak hizmet ederYeni plazmid için seçilebilir sıralarda kalem. Son olarak, kesilmiş olan genlerin kimliğini belirlemek için kullanılan transposon ve elde edilen dizinin Temel Lokal Hizalama Arama Aracı (BLAST) Analiz 7,8 her ucuna tamamlayıcı olan primerler kullanılarak sıralanmasıyla gerçekleştirilmesidir. Bu transposome bir mütajenez stratejisi üç avantaj 3 içerir. Transposaz protein transposon ye direkt olarak bağlı olduğu için ilk, ekleme konak içinde, transposaz gen ifadesi üzerindeki bağlı değildir. Transpozonları bir konakçı genom içine kendisini içerir sonra, transposaz transpozonun ilave hareketinin önlenmesi, parçalanır. Ev sahibi bir endojen Tn 5 transpositional eleman sahip, ancak ilave hareketi önlenememektedir. İkinci olarak, elektroporasyon ile transposome katılması mümkün ana çok çeşitli kullanılmasını mümkün kılmaktadır. Ayrıca, bakteriyel birleşme ya da VI ile transpozonun tanıtmak ihtiyacını ortadan kaldırırral enfeksiyon. Her iki süreç konak duyarlılık gerektirir. Üçüncü olarak, kanamisin direnç geni ve transposome içinde R6K γ replikasyon kaynağının dahil edilmesi daha kolay kesilen genini belirlemek için yapar. Transpozon kesintili bölgeler kaydedilir ve gen tanımlaması için ters polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tekniğini kullanmak için olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, plazmidler gibi dizilenebilmektedir. Bu video sunulan protokol Enterobacter sp transpozon mutagenezi için her bir aşamasını tarif etmektedir. YSU 9 kesintiye farazi geninin tanımlanması için bakteri hücreleri içine getirilmesi, bir transposome kullanılmıştır. Daha önce yayınlanmış protokollere 3,4,10 ek olarak, oksotrofları taranması için çoğaltma kaplama nasıl kullanıldığına ilişkin yöntemler sunulmaktadır. Bu mutagenez tekniği ident için, farklı bakteri türleri, örneğin antibiyotik ve metal dirençleri gibi diğer fenotipleri, araştırmak için kullanılabilmektedirveya bunun genetik veya mikrobik fizyolojisi doğal bir laboratuar bileşeni öğretmek için sentetik biyolojisi çalışmalarında tanımlanmış bir kültür koşulları altında büyüme için gerekli olan genlerin az sayıda seçmek ile.

<table><tbody><tr><td>EZ-Tn5 R6K ve gama; ori / KAN-2 Tnp Transpozom</td><td>Kiti Merkez üssü (Illumina) TSM08KR</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>EC100D pir + Elektroyetkin E. coli</td><td>Merkez üssü (Illumina)</td><td>ECP09500</td><td>R6K ve gama ile plazmitleri çoğaltabilir; düşük kopya sayısında replikasyon orijini</td></tr>: <tr><td>EC100D pir-116 Elektroyetkin E. coli</td><td>Merkez üssü (Illumina)</td><td>EC6P095H</td><td>Plazmitleri bir R6K & gama ile çoğaltabilir; yüksek kopya numarasında replikasyon kaynağı</td></tr><tr><td>5X M-9 Tuzları</td><td>Thermo Fisher</td><td>DF048517</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB Et Suyu</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J637-1KG</td><td>Katı ortam% 1.6 (a / h) agar</td></tr><tr><td>Kanamisin Sülfat ve nbsp içerir;</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0408-25G</td><td>Gerektiğinde, ortam 50 & mu; g / ml kanamisin sülfat</td></tr><tr><td>D-Glikoz Monohidrat</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0643-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J850-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J859-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Amresco, Inc.</td><td>X190-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<alt>2</alt></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO<alt>2</alt></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Katabolit Baskılama (SOC) ortamı</td><td></td><td></td> ile Süper Optimal Et Suyu <td>%0,5 (a/h) maya özütü, %2 (a/h) tripton, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl<alt>2</alt>, 20 mM MgSO4 ve 20 mM Glukoz</td></tr><tr><td>BfuC I</td><td>NEB</td><td>R0636S</td><td>Genomik DNA'nın kısmi sindirimi</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td>Plazmid sindirimi</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz İçermeyen Su</td><td>Amresco, Inc.</td><td>E476-1L</td><td>Çökelmiş DNA'nın çözülmesi ve restriksiyon endonükleaz reaksiyonları için</td></tr><tr><td>GenomeLab DTCS - Hızlı Başlangıç Kiti</td><td>Beckman Coulter</td><td>608120</td><td>DNA dizileme</td></tr><tr><td>Sihirbazı Genomik DNA Saflaştırma Kiti</td><td>Promega</td><td>A1120A</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Saflaştırma Sistemi</td><td>Promega</td><td>A1460</td><td>Plazmid saflaştırma</td></tr><tr><td>Replika Kaplama Bloğu</td><td>Termo Fisher</td><td>09-718-1</td><td></td></tr><tr><td>Kadife Kareler</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-718-2</td><td>Replika kaplama</td></tr><tr><td>PetriStickers</td><td>Çeşitlendirilmiş Biyoteknoloji</td><td>PSTK-1100</td><td>Replika kaplama için ızgara</td></tr><tr><td>Petri Kapları</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II</td><td>BioRad</td><td></td><td>Elektroporasyon Elektroporasyon</td></tr><tr><td>Küvetleri & ndash; 2 mm</td><td>BioExpress</td><td>E-5010-2</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap DNA Vakum Konsantratörü</td> DNA <td>Kurutma</td><td>7970010</td><td>Labconco</td></tr><tr><td>CEQ 2000XL DNA Analiz Sistemi</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>DNA dizileme</td></tr><tr><td>Vektör NTI Advance 11.5.0</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12605099</td><td>DNA dizi analizi</td></tr></tbody></table>

Üretilmesi enterobacter sp. ysu oksotroflan transpozon mutajenezi kullanarak,

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrofik bakteri, bir karbon ve enerji kaynağı olarak kullanılan bir ortam glukoz (M-9 ortamı) ile takviye edilmiş M-9 az tuzlar üzerinde büyür. Oksotroflan bir transposome kullanılarak üretilebilir. Bu protokolde kullanılan ticari olarak temin edilebilir, Tn 5 türevi transposome transposaz bağlanma bölgeleri olarak görev yapabilmeleri bir R6K γ replikasyon orijini, kanamisin direnci ve iki mozaik dizisi ucu için bir geni ihtiva eden bir DNA doğrusal bir segmentten teşekkül eder. Bir DNA / transposaz protein kompleksi olarak sağlanır transposome, prototrofik soyu Enterobachter içine elektroporasyon ile dahil edilir. YSU ve rastgele bu konağın genomuna kendisini içerir. Transformantlar kanamisin, (LB-kan) ihtiva eden agar plakaları, Luria-Bertani üzerine ekildi çoğaltma ve kanamisin (M-9-kan) içeren E-9, orta agar plakaları üzerine bulunmaktadır. M-9-kan plakalarına LB-kan plakalarına büyür ancak Transformantlar oksotroflan olduğu kabul edilir. Saflaştırılmış genomikBir oksotrofdan DNA kısmen sindirilmiş bir pir + Escherichia coli (E. coli) suşu lige ve dönüşür. R6Kγ replikasyon orijini plazmid pir + E. çoğaltmak için izin verir E. coli suşu ve kanamisin direnç marker plazmid seçimi sağlar. Her transformantı kesilen kromozomal bölgeye çevrili transpozonunda içeren yeni bir plazmid sahiptir. Sanger dizileme ve Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST) kesilen genin bir varsayımsal kimliğini öneririz. Bu transposome mutajenez stratejiyi kullanarak üç avantajı vardır. İlk olarak, ana bilgisayar tarafından bir transposaz gen ifadesi üzerindeki dayanmaz. İkinci olarak, transposome elektroporasyon ile yerine konjugasyon veya transdüksiyonu ile hedef konakçı içine dahil edilir ve bu nedenle daha verimli olur. Üçüncü olarak, R6Kγ kopya kökenini kolay mutasyona uğramış g belirlemek için yaparkısmen yeniden birleştirici bir plazmit geri kazanılır en. Bu teknik, Enterobacter sp başka özellikleri ile ilgili genleri araştırmak için kullanılabilir. YSU veya bakteriyel suşlar için daha çeşitli.

Enterobacter sp dönüşümü. Transposome ile elektroporasyon yöntemiyle YSU bunlar, konakçı genomu (Şekil 1A, B) rastgele genom ekleme başlatmıştır. Başarılı bir elektroporasyon LB-kan plakaları üzerinde büyüdü birkaç bin Transformantları vermiştir. 300-400 elde edilmesi için, plaka başına koloni iyi aralıklı, her bir LB-kan agar plakası üzerinde bir dönüşüm karışımı, toplam yayılan optimize edilmiştir. Her Transformant en az bir transposon eki içerdiği, ancak M-9 ortamda büyüme için önemli bir ge...

Enterobacter sp. YSU glukoz az tuz ortamında büyür. Oksotroflan rastgele bir konakçı genom içine kendisini ekleyen bir transposome ile dönüştürülmesiyle oluşturulur. Mutantlar minimal orta karmaşık ortamdan replika plaka tarafından bulundu. Kesilen gen, kurtarma ve dizileme ile tespit edilir.

Üretilmesi Enterobacter Sp. YSU oksotroflan transpozon mutajenezi kullanarak,

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, glikoz ile desteklenmiş minimum tuz ortamında büyüyen vahşi tip bir bakteri suşunun TRO'larını üretmektir. Bu, ekler üzerinde rastgele transpoze ile kanna misine dirençli bir bakteri popülasyonu elde etmek için bir transpo zonunun vahşi tip konak suşuna dönüştürülmesiyle elde edilir. Daha sonraki dönüştürücüler, zengin ortamda büyüyen, ancak glikoz ile desteklenmiş ortam olan minimum tuzlarda büyümeyen TRO'ları tanımlayan replika kaplama ile taranır.Daha sonra, mutanttan gelen DNA sindirilir, bağlanır ve her iki ucunda kesintiye uğramış genin segmentleri ile çevrili transpozonu içeren bir plazmit elde etmek için e coli'ye dönüştürülür. DNA dizilimi ve temel yerel hizalama arama aracı analizine dayalı olarak kesintiye uğrayan genin varsayılan kimliğini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu teknikte kullanılan transpozon, bir replikasyon kökenine, kanamisine dirençli bir gene ve mozaik uçlara sahiptir.Protein bağlanmasını transpoze etmek için. Transpoze protein geninden yoksundur ve bu nedenle bu transpoze geni transpozon DNA fragmanı ile eklememiz gerekir ve daha sonra transpoz DNA ile protein arasındaki kompleks konakçıya elektropore edilir. Elektroporasy

generation-enterobacter-sp-ysu-auxotrophs-using-transposon

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Sistematik, büyük ölçekli sentetik gen (bir gen ya da gen-epistasis) etkileşim ekranlar genetik ve fazlalık yolu çapraz konuşma keşfetmek için kullanılabilir. Burada, yüksek-throughput kantitatif sentetik genetik dizi tarama teknolojisi tarif eSGA biz epistatik ilişkileri durulaştırmada ve genetik etkileşim ağları keşfetmek için geliştirilen...

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Kaynak: Kazi, M.I., vd. al., Yüksek Verimli Dizileme için Gram-Negatif Bakterilerde Transpozon Ekleme Kitaplıkları Oluşturma. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, kanamisin direncine dayalı olarak transpozon eklemeleri taşıyan Gram-negatif alıcı bakterilerin seçimini, miktarını ve korunmasını göstermektedir.

Gram-Negatif Bakterilerin Genomik Transpozon Eklemeleri ile İzolasyonu

Burada, ekrana yüksek yoğunluklu ekleme mutant kütüphanesi oluşturmak için mini-transpozon himar1 mariner dolayımlı mutagenez kullanılarak bir protokol açıklar izole edilmesi ve prototipik Pseudomonas aeruginosa'nın PAO1 in yeni alginat regülatörleri belirlemek.

Alginat içinde üretimi ile ilişkili yeni genlerin tanımlanması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emKullanma&gt; Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon dolayımlı mutagenez

Coxiella burnetii zoonotik hastalık Q ateşi sorumlu zorunlu hücre içi Gram-negatif bir bakteridir. Burada Coxiella flüoresan transpozon mutantlarının üretimi yanı sıra otomatik tanımlama ve elde edilen içselleştirme, çoğaltma ve sitotoksik fenotipleri analizi için yöntemleri tarif eder.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Burada, bir transposon-aracılı rasgele ekleme kodlamayan DNA öğesinin gücünü en iyi kromozom konumunu gidermek için kullanıldı.

En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde

Burada sunulan Escherichia coli veya bakteriyel konjugasyon kullanarak Shigella flexneri yüksek yoğunluklu transposon ekleme kütüphane oluşturmak için basit bir yöntemdir. Bu iletişim kuralı bir transposon rastgele genomik ekleme tarafından bakterilerde benzersiz mutantlar, yüz binlerce topluluğu oluşturulmasına izin verir.

Bir yoğun Transposon ekleme kütüphane kullanarak bakteriyel konjugasyon Escherichia Coli Enterobacterial suşları gibi veya Shigella flexneri oluşturulması

Biz burada transposon mutagenesis tanımlamak ve transposon leptospiral mutantlar dokularda hamster bir meydan okuma sonra ölçmek için yüksek üretilen iş sıralama ile birleştirir bir tekniğini tanımlamak. Bu iletişim kuralı için hayatta kalma ve hayvanlar yayılmasında ekran mutantlar için kullanılabilir ve vitro çalışmalar için de uygulanabilir.

Yüksek üretilen iş paralel sıralama ölçü Fitness Leptospira interrogans Transposon ekleme mutantlar sırasında altın Suriye Hamster enfeksiyon için

Pseudomonas aeruginosa enfeksiyon savunmasız konaklarda önemli morbidite neden olur. Nonredundant transposon ekleme mutant Kütüphane P. aeruginosa baskı PA14 PA14NR grubu olarak belirlenmiş, analiz çok sayıda süreçlerde gen işlevlerinin kolaylaştırır. Burada sunulan yüksek kaliteli PA14NR ayarla mutant kitaplığın kopyalarını oluşturmak üzere bir protokoldür.

Sipariş edilmiş, Pseudomonas aeruginosa baskı PA14 Transposon ekleme mutantlar Nonredundant Kütüphane çoğaltılması

Sıralama (RH-seq) ile karşılıklı hemizygosity türler arasındaki bir özellik farkıgenetik temelharita için güçlü bir yeni yöntemdir. Hemizygot havuzları transposon mutagenezi tarafından oluşturulur ve fitness yüksek sıralama boyunca kullanarak rekabetçi büyüme ile izlenir. Elde edilen verilerin analizi, özelliğin altında yatan genleri saptar.

Genom-Geniş Karşılıklı Hemizygosity Analizi ile Saccharomyces Maya Türleri Arasındaki Termotolerans Farklarının Genetik Haritalama

Gram-negatif bakterilerde doymak üzere transpozon mutant kütüphaneleri oluşturmak ve daha sonra yüksek işlemli sıralama için DNA amplicon kütüphanelerinin hazırlanmasını tanımlayan bir yöntem. Örnek olarak, biz ESKAPE patojen, Acinetobacter baumanniiodaklanmak , ama bu protokol Gram-negatif organizmaların geniş bir yelpazede için münasip olduğunu.

Yüksek İşlem Likör Sıralaması Için Gram-Negatif Bakterilerde Transposon Ekleme Kitaplıkları Oluşturma

Keşfedin Enterobacter sp. YSU'da transpozon mutajenezi ile oksotrof mutant üretimini. Replika plakalama ve DNA dizileme kullanarak minimal ortamda büyüme için gerekli genleri tanımlayın.

Üretilmesi Enterobacter Sp. YSU oksotroflan transpozon mutajenezi kullanarak,

Daha fazla video keşfet