Protein fonksiyonu için bir 2DE-Jel Spot: Kronik Lenfositik Lösemide HS1 öğrendim Ders

Aşağıdaki deneyin genel amacı, insan hastalıklarında potansiyel prognostik belirteçleri ve/veya terapötik hedefleri belirlemek için kombine bir proteomik yaklaşım kullanmaktır. Bu, primer lösemik hücrelerin hastanın periferik kanından izole edilmesi, iyi veya kötü prognoz taşıması ve ikinci adım olarak proteomik analiz için kullanılmak üzere hem CD 19 hem de CD beş yüzey belirtecinin eksprese edilmesiyle elde edilir. Lösemik hücre lizatları, iki boyutlu elektroforez veya iki DE ile çözülür ve proteomik haritaların karşılaştırılması, daha sonra kütle spektrometresi veya ms ile tanımlanabilen, iyi ve kötü prognoz hastaları arasında farklı şekilde ifade edilen noktaların tanımlanmasına izin verir.

Daha sonra, tanımlanan proteinlerin hastalığın doğal tarihindeki rolünü doğrulamak ve incelemek için farklı testler kullanılabilir. Sonuçlar, iki jel ile tespit edilen HS'nin farklı fosforilasyon durumunun, hastaların klinik sonuçları ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin anlamı, kronik lenfositik löseminin tedavisine kadar uzanır, çünkü hastalığın ilerlemesinde rol oynayan ve prognostik belirteç olarak kullanılabilecek proteini tanımlamaya yardımcı olabilir ve/veya bu prosedürü gösteren terapötik hedefler benimle birlikte olacaktır.

Pamela, laboratuvardaki teknisyene ve harici bir laboratuvardan bir doktora sonrası doktora öğrencisine koştu Bu işleme başlamadan önce, sodyum heparin içeren vakutainer kan alma tüplerinde periferik kan toplayın. Kanı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve mililitre tam kan başına 50 mikrolitre insan B hücresi zenginleştirme kokteyli ekleyin. Sonra iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, numuneyi eşit hacimde PBS artı %2 FBS karışımı ile seyreltin, nazikçe ve dikkatlice kanı sinek çağrısının üzerine yerleştirin, arayüzü kırmamaya dikkat edin. Numuneyi oda sıcaklığında 400 kez G'de 20 dakika ara vermeden santrifüjleyin. Bittiğinde, hücreleri kurtarmak ve yeni bir tüpe yerleştirmek için arayüzü dikkatlice aspire edin.

Santrifüjleme ve süpernatan uzaklaştırma işleminden sonra hücreleri bir kez PBS ile yıkayın. Resus. Seyreltmeyi takiben tüpü manuel olarak ileri geri hareket ettirerek peleti kalan süpernatantta askıya alın. Tam RPMI ortamı ile, Trian mavisi dışlama yöntemini kullanarak hücreleri sayın.

Daha sonra, bir faks tüpündeki saflaştırılmış hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresine aşağıdaki antikorları ekleyin. Numuneyi karanlıkta dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Numuneyi dört mililitre PBS ile yıkadıktan sonra, saflığı akış sitometrisi ile kontrol edin.

Kronik lenfositik lösemi veya KLL hücrelerinin yüzdesini kontrol edin, bu hücreler Coex yüzeylerinde CD 19 ve CD beşi eksprese eder. Bu noktada sıfıra yakın olması gereken çizimdeki CD üç, CD 14 ve CD 1656'nın yüzdesini kontrol ederek preparatların neredeyse NK t lenfositleri ve monositlerinden yoksun olduğundan emin olun. CLL hücre peletlerini 380 mikrolitre iki boyutlu elektroforez tamponunun nihai hacmi ile çözündürün.

İzo elektro odaklama yapmak için protein örneklerinin bir miligramını 18 IPG şeridine uygulayın. Çalıştırmadan sonra, şeritleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 2 taze DTT ile desteklenmiş iki mililitre dengeleme tamponunda dengeleyin. Çözeltiyi attıktan sonra,% 2.5 I oto asetamid ile desteklenmiş iki mililitre dengeleme tamponu ekleyin.

Daha sonra numuneyi sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bunu takiben, fazla çözeltiyi çıkarmak için jele dokunmadan şeritleri kağıt üzerinde kurutun. Kuruduktan sonra, her bir şeridi %9 ila %16 gradyanlı bir SDS sayfa jelinin üzerine yükleyin.

Şeridin yüklenmesini kolaylaştırmak için jelin üzerine küçük bir hacimde SDS elektroforez tamponu ekleyin. Daha sonra, şeridin yüzmesini önlemek için yaklaşık beş mililitre% 0.8 agar çözeltisi ekleyerek jeli kapatın. Elektroforez ünitesi monte edildikten sonra, SDS Elektroforez Tamponu ile doldurun.

Ardından, çalışmayı dört saat, dört santigrat derece veya bir soğutma sistemi kullanarak jel başına 60 miliamperde gerçekleştirin. Jeli elektroforetik üniteden çıkardıktan sonra uygun boyama kutusuna yerleştirin. Her çözeltiden yaklaşık 200 mililitre hazırlayın.

Her bir çözeltiyi jeli içeren boyama kutusuna dikkatlice ekleyin. Tüm inkübasyonları sallanan bir platformda gerçekleştirin. Boyamadan sonra, durdurma solüsyonunu çıkarın ve jeli% 1'lik bir asetik asit çözeltisi içinde bırakın.

Migrasyon tahlili için, daha önce saflaştırılmış hücreleri tekrar askıya alın. Tam RPMI'de, spesifik uyaranlar olsun veya olmasın, 600 mikrolitre tam RPMI ekleyerek alt transwell odasını hazırlayın. Sırasıyla indüklenen ve spontan göçü ölçmek için, üst bölmeyi üstüne yerleştirin ve sistemin inkübatörde 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca dengelenmesine izin verin.

Bittiğinde, üst haznedeki 200 mikrolitre başına altı hücreye 10 tohum atın ve plakayı inkübatörde 37 santigrat derecede dört saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, üst hazneyi çıkarın ve ortamı alt haznede toplayın. Ardından alt hazneyi bir mililitre PBS ile bir kez yıkayın.

PBS'yi bir tüpte topladıktan sonra, süpernatan çıkarıldıktan sonra numuneyi 300 kez G'de beş dakika santrifüjleyin. Numuneyi akış sitometrisi ile 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Alımdan bir dakika sonra geçirilen hücrelerin sayısını sayın.

Hücrelerin yan dağılımlarını ve hesaplama için kullanılacak sayı olan bir dakika içinde görselleştirilen olay sayısını göz önünde bulundurarak iki boyutlu bir nokta grafiğindeki hücre sayısını kontrol edin. KLL hastalarından izole edilen primer lösemik hücre örnekleri, her hastanın klinik özelliklerine göre iki ana alt gruba ayrıldı ve belirli bir kitle toleransı içinde iki DE ve MS kitlesi ile analiz edildi. Veritabanındaki peptit dizilerine atandı ve daha sonra belirli bir olasılık skorunu geçip geçmediği konusunda tanımlanmış olarak kabul edilen bir proteine birleştirildi.

Bu analizle, bu proteinler arasında esas olarak hücre iskeleti aktivitesi ve metabolik süreçlerde yer alan proteinler tanımlandı. Hematopoetik soy, hücreye özgü protein veya hs. Diferansiyel fosforilasyonu hastalığın klinik seyri ile güçlü bir şekilde ilişkili olan biri farklı şekilde ifade edildi.

Özellikle, tek nokta taşıyan hastalar kötü bir klinik sonuç yaşarken, iki nokta taşıyan hastalar iyi prognoza sahiptir. HS'yi tek nokta olarak taşıyan KLL hücrelerinin, hipofosforile HS'ye göre migrasyon, adezyon ve aktin polimerizasyonu açısından bozulmuş hücre iskeleti aktivitesine sahip olduğu bulundu. Bir, iki nokta örneği. Böylece farklı bir klinik davranışı açıklar.

Bu videoyu izledikten sonra, prognostik belirteç ve/veya terapötik hedefler olarak kullanılabilecek hastalığın ilerlemesinde rol oynayan biyolojik adayları belirlemek için proteomiğin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.