Ölçme Mekansal ve zamansal Ca ^{2+ Sinyalleri}

Bu prosedürün genel amacı, kalsiyum sinyallerini hem hücresel hem de tüm bitki düzeyinde izlemek için bir yöntem göstermektir. Bu, ilk olarak MS agar plakası üzerinde veya doğrudan görüntüleme odası içinde fidelerin yetiştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, fideleri yapışkan bir film üzerine aktarmak veya görüntüleme odasında tutmaktır.

Kalsiyum sinyallerini indüklemek için fidelere uygulanan sonraki uyaranlar. Sonuç olarak, yaşam tarzı lüminesansı veya floresan görüntüleme, farklı uyaranlara sırasıyla tüm fide veya sitozolik nükleer kalsiyum tepkisini göstermek için kullanılır. Bu tekniğin, örneğin tek bitki gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, film yapıştırıcı fide tahlilinin basit, hassas ve sağlam olmasıdır.

Bu nedenle, bu teknik, değişmiş kalsiyum sinyal tepkilerine sahip mutantlar için yüksek verimli taramaya uyarlanabilir. Ek olarak, düz tabanlı kalsiyum görüntüleme ile karşılaştırıldığında, GFP tabanlı genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörünün kullanılması, karmaşık mikroskobik ayarlardan ve hesaplamalardan kaçınır. Bu yöntem, Arabidopsis'teki stres tepkisi sırasında kalsiyum sinyalizasyonu hakkında bilgi sağlar, ancak diğer bitki modellerinde geliştirme veya savunma gibi diğer bağlamlarda da kullanılabilir.

Bu yöntemi göstermek parlak olacaktır. Laboratuvarımızdan bir öğrenci: Bu işleme başlamak için, bir tavşan opsis bitkisinin tohumlarını% 0.01 Triton 100 içeren% 10 ağartıcı çözeltisi ile sterilize edin, tohumları tam mukavemetli MS% 1.2 sakaroz ve% 1.2 agar içeren kare bir tabağa ekin. Daha sonra, iki gün boyunca dört santigrat derece tabakalaşmadan sonra plakaları dikey olarak bir büyüme odasına yerleştirin.

Daha sonra fideleri bir filme aktarın. Plaka üzerinde büyüyen yedi ila 10 günlük fidelerin üzerine yapışkan bir film yerleştirin. Fidelerin filme yapıştığından emin olmak için filmi elinizle hafifçe itin.

Ardından, fidelerin filme yapışması için filmi nazikçe soyun. Daha sonra, A yapışkan fidelerini suda mililitre HCTZ başına 15 mililitre iki mikrogram içeren kare bir plakaya yerleştirerek fideleri kofaktör ile inkübe edin. Fideleri oda sıcaklığında dört saat ila gece boyunca kuluçkaya yatırın.

Lüminesans görüntülemeye hazırlanmak için, filmi HCTZ solüsyonundan çıkarın ve iki parça oluşturacak şekilde ortadan kesin. İki film parçasını, fideler yukarı bakacak şekilde iki farklı tabağa yerleştirin. Ardından, karanlıkta ışıldayan görüntüler elde etmek için plakaları beş dakika karanlıkta bırakın.

Lüminesans görüntüleme sisteminin sahnesinde iki plakayı yan yana yerleştirin. Plakalara aynı anda 20 mililitre uyaran çözeltisi ekledikten hemen sonra görüntüler elde edin. Lüminesans görüntülerini analiz etmek için, tüm lüminesans görüntüleri için aynı görüntüleme aralığını seçin, ROI'yi kırpın ve görüntüleri jpeg dosyaları olarak oluşturun.

Alternatif olarak, görüntüleri SPE formatındaki dosyalar olarak dışa aktarın ve bunları görüntü J görüntü analiz yazılımına aktarın. ROI'nin ortalama gri değerini hesaplamak için ölçümleri ayarlayın, aynı boyutta ROI alanı seçin. Ardından ortalama gri değeri ölçün ve verileri çubuk grafikler olarak sunun.

Fideleri konfokal görüntüleme için hazırlamak. Durum 12'yi ifade eden opsis bitkilerinin tohumlarını% 0.01 Triton içeren% 10 ağartma solüsyonu ile sterilize edin. Bu nedenle, tam mukavemetli MS tuzları,% 1 sakar ve% 1.2 agar içeren bir tabakta steril tohumlar.

Daha sonra plakaları, iki gün boyunca dört santigrat derecede tabakalaşmadan sonra dikey olarak bir büyüme odasına yerleştirin. Bu arada, bir slayt ve bir kapak fişi ile bir görüntüleme odası monte edin. Sürgünün üstüne bir parça suya batırılmış pamuk yünü yerleştirin.

Daha sonra bir veya iki beş günlük fideyi plakadan slaydın ortasına aktarın. Daha sonra örtü kaymasının her bir köşesine küçük kil parçaları yapıştırın ve örtü kaymağı ile kayma arasında bir boşluk oluşturmak için örtü bezini fidelerin üzerine yerleştirin. Bundan sonra, polietilen tüpün bir ucunu bir mililitrelik bir şırıngaya bağlayın ve tüpün diğer ucunu haznenin hemen yanına yerleştirin.

Pleksiglas hazneli bir görüntüleme haznesi monte etmek için boruyu bantla yerinde tutun. İki polietilen tüpün etrafına ince bir silikon gres tabakası sürün ve kaplanmış tüpleri pleksiglas haznenin her iki yanındaki kanallara bastırın. Ardından, boru oluklarını içeren haznenin yüzeyine ince bir silikon gres tabakası sürün ve hazne açıklığının bir tarafını kapatmak için gresin üzerine bir kapak fişi yerleştirin.

Daha sonra, beş günlük bir fideyi plakadan hazneye aktarın ve fidanın üzerine suyla ıslatılmış pamuk yünü parçasını yerleştirin. Silikon gresi haznenin diğer yüzeyine yayın ve sızdırmaz hale getirmek için üstüne başka bir kapak sürgüsü bastırın. Daha sonra, tüplerden birinin ucunu bir mililitrelik şırıngaya bağlayın ve diğer tüpün ucunu açık bırakın.

Odacıklı bir kapak camı ile bir görüntüleme odası hazırlamak için, önce odacıklı kapak camını% 70 etanol ile sterilize edin ve 0,6 mililitre veya 0,2 mililitre tam mukavemetli MS'de kuruyana kadar davlumbazda bırakın. Sırasıyla iki kuyulu bir odanın veya sekiz oyuklu bir odanın her bir oyuğuna% 1 sükroz ve% 0.5 savaşçı jeli içeren ortam. Daha sonra tohumları sterilize edin ve doğrudan ince bir berrak jel tabakası içeren odacıklı bir kapak camına ekin ve beş gün boyunca dikey olarak büyümelerine izin verin. Görüntü alımı için.

Konfokal bir mikroskop kullanarak, görüntüleri elde etmeden hemen önce hazneye 200 mikrolitre 150 milimolar sodyum klorür, buz gibi soğuk su veya bir milimolar hidrojen peroksit solüsyonu yavaşça enjekte ederek stres uyaranları uygular. Uyaran solüsyonunu uyguladıktan hemen sonra görüntüleri yakalayın. 20 x suya daldırma lensi ile ters konfokal lazer tarama mikroskobu kullanma.

Sırasıyla 4 88 nanometre ve 500 ila 550 nanometre uyarma ve emisyon dalga boyları ve beş 12'ye beş 12 AIX çözünürlüğü veya Nikon öğelerini kullanarak görüntü analizi ile dört saniyelik aralıklarla bir zaman serisi görüntü toplayın. ROI'ler, ilgilenilen her hücrenin etrafına çizilir. Her bir ROI içindeki toplam yoğunluk, zaman ölçümü iletişim kutusu kullanılarak zaman içinde ölçülür.

Daha sonra toplam yoğunluk ölçümleri dışa aktarılır ve gösterilen veri grafiğinde işlenir. İşte 10 günlük fidelerin mekansal zamansal kalsiyum tepkisinin karşılaştırılması. Buradaki farklı stres uyaranları, lüminesansın zaman serisi, 400 milimolar mannitol ve 400 milimolar ole artı bir milimolar bakır klorür, 75 milimolar sodyum klorür ve 75 milimolar sodyum klorür artı bir milimolar bakır klorür ve bir milimolar hidrojen peroksit veya bir milimolar hidrojen peroksit artı bir milimolar bakır klorür.

Üst ve alt paneller, sırasıyla ilk 40 saniye ve ikinci 40 saniye boyunca elde edilen lüminesans görüntüleridir. Ve burada, burada sitozolik ve nükleer kalsiyum salınımı olarak gösterilen belirtilen stres uyaranlarına yanıt olarak fidelerin ortalama lüminesans yoğunluğunun çubuk grafiği yer almaktadır. Tuz stresine yanıt olarak, konfokal görüntüler, durum 12'nin kök hücrelerin sitoplazmasında ve çekirdeklerinde ve durum 12'yi ifade eden transgenik bitkilerin yaprak hücrelerinde ifade edildiğini göstermektedir.

Bu görüntü ortaya çıkar, kloroplastların kırmızı, otofloresansı ve vaka 12'nin yeşil floresansı ortaya çıkar. Bu iki grafik, kök hücrelerin bir çekirdeği olan sitozolde tuz stresinin neden olduğu kalsiyum salınımını göstermektedir. Bu prosedürü denerken, iyi yetişmiş fideleri kullanmayı unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, dynas'ı hem hücresel hem de tüm bitki düzeyinde nasıl izleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.