Name: Ölçme Mekansal ve zamansal Ca 2+ Sinyalleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Öğrenin, Arabidopsis bitkilerinde hücresel ve bitki bütünlüğü düzeyinde kalsiyum sinyallerini görüntülemek için genetik olarak kodlanmış göstergeler kullanarak basit ve sağlam bir yöntemi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik yardım için B. Stevenson'a ve Aequorin transgenik hattını sağladığı için Dr. Marc R. Knight'a minnettarız. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe R01 GM059138 tarafından finanse edilmiştir.

FAS Sistemini Kullanma 1. Aequorin Tabanlı Ca 2 Görüntüleme <ol><li> Lüminesans görüntüleme için fide hazırlayın. % 0.01 Triton-100 içeren% 10 çamaşır suyu çözeltisi ile Aequorini Arabidopsis bitkileri tohumları sterilize edin. Tam kuvvet MS (Murashige ve Skoog temel tuz karışımı),% 1 sükroz ve% 1.2 agar içeren bir kare plaka (ızgara ile 10 x 10 cm kare Petri kabı,) hakkında steril tohum ekmek. Dikey olarak 2 gün boyunca 4 ° C&#39;de (Şekil 1A) tabakalaşma sonra bir büyütme odası içinde yer plakalar. </li><li> Bir film üzerine fidan aktarın. Plaka üzerinde büyüyen 7-10 günlük fidelerin üzerine bir yapışkan film (Şekil 1B) yerleştirin. Yavaşça fidan filmin (Şekil 1C) uygun olmasını sağlamak için elle filmi itin. Fideler filme bağlanmış kalacak, böylece yavaşça filmin sıyrılması (Şekil 1D ve 1E) </li><li> Cofactor, fide inkübe edin. A yerleştiriniçeren kare plaka (10 x 10 cm) üzerine dhered fide 2 ug, 15 ml / ml sa-CTZ su (coelenterazine). Gece boyunca (Şekil 1F), 4 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe fide. </li><li> Lüminesans görüntüleme için hazırlayın. Iki parça oluşturan, h-CTZ çözeltiden filmi çıkarın ve orta aşağı kesti. Fideler iki farklı plakalarda yüz ile filmin her parça yerleştirin. 5 dakika boyunca karanlıkta plakaları bırakın. </li><li> Lüminesans görüntü kazanır. Karanlıkta, aşağıdaki lüminesans görüntüleme sistemi (Şekil 1G) evresine üzerinde birbirine iki tabak yerleştirin. Hemen eş zamanlı olarak plakalara uyaranlara çözeltisi 20 ml ilave edilmesiyle görüntüler elde. </li><li> Lüminesans görüntüleri analiz. Tüm ışıldama görüntüler için aynı görüntü aralığını seçin. Faiz (ROI) bölgesini kırpın ve JPEG dosyaları (Şekil 2A) olarak görüntüler oluşturmak. Alternatif olarak, SPE olarak formatındaki dosyalar görüntüleri dışa ve içe aktardıktanİmageJ görüntü analizi yazılımı. ROI ortalama gri değerinin hesaplanmasında ayarlama ölçümleri. ROI alanının aynı boyutunu seçin ve çubuk grafikler (Şekil 2B) olarak ortalama gri ve mevcut verileri ölçmek. </li></ol> 2. Canlı Hücre Eşodaklı Ca 2 Görüntüleme <ol><li> Konfokal görüntüleme için fide hazırlayın. % 0.01 Triton ihtiva eden% 10 çamaşır suyu solüsyonu ile case12 Arabidopsis bitkileri tohumları sterilize edin. Tam kuvvet MS tuzları,% 1 sükroz ve% 1.2 agar ihtiva eden bir plaka üzerinde steril tohum ekmek. 2 gün boyunca 4 ° C&#39;de tabakalaşma sonra bir büyütme odası içinde dikey olarak yer plakalar. </li><li> Kurulum Görüntüleme Chambers <ol><li> Bir slayt ve lamel (Chamber A) kullanarak bir görüntüleme odasının birleştirin. Slayt ortasında üzerine su batırılmış pamuk parçası yerleştirin. Daha sonra su ile ıslatılmış pamuk üst plaka üzerine bir ya da iki 5 günlük fidan aktarın. Bir lamel, An her köşesine kil küçük parçalar sopalamel ve slayt arasındaki boşluğu (hazne) (Şekil 3A, sol panel) oluşturmak için fidan üstüne d yer lamel. Bir tane 1 ml&#39;lik şırınga polietilen tüp (0.58 mm çapında) bir ucunu ve bölmenin hemen bitişik borunun diğer ucuna yerleştirin. Bant (Şekil 3A, sağ panel) ile yerine boru tutun. </li><li> Pleksiglas odasını (Karain B) kullanılarak bir görüntüleme odasının birleştirin. <ol><li> Pleksiglas odasının her tarafında kanallar içine kaplanmış tüpler iki polietilen borular (0.58 mm çap) etrafında silikon gres ince bir tabaka yayıldı ve basın (Şekil 3B paneli bıraktı). Tüp oluklar içeren haznenin yüzeyi üzerine silikon ince bir yağ tabakası yayıldı ve hazne ağzı (kesilmiş) bir tarafını kapatmak için yağ içine bir lamel basın. </li><li> Odasına plakasından beş günlük fidelerden aktarın ve üst o su ile ıslatılmış pamuk parçası yerleştirinfide f. Odanın diğer yüzeyine silikon gres yayıldı ve mühür üstünde başka bir lamel basın. Bir tane 1 ml&#39;lik şırınga tüplerin biri ucunu. Başka boru açık (Şekil 3B sağ panel) ucunu bırakın. </li></ol></li><li> Bir odacıklı cam kapak (Chamber C) kullanarak bir görüntüleme odası hazırlayın. % 70 etanol ile odacıklı cam kapak Sterilize ve kuru kadar kaput üzerinde bırakın. 0.6 ml veya, sırasıyla, bir 2-çukurlu odanın havuzlarında veya bir 8-çukurlu odasına (Şekil 3C sağ panel),% 1 sükroz ve% 0.5 Phytagel içeren tam kuvvet MS ortamı, 0.2 ml ekleyin. Sterilize tohumlar ve berrak bir jel ince bir tabakasını ihtiva eden bölmeli bir kapak camı doğrudan tohum ekmek ve bunları 5 gün boyunca (Şekil 3C) için dikey olarak büyümesine izin. </li></ol></li><li> Konfokal mikroskop kullanılarak görüntü kazanır. , Buz col yavaş yavaş 150 mM NaCl yaklaşık 200 ul enjekte, tuz, soğuk ya da peroksit gibi stres uyaranları, uygulamak içinhemen önce sırasıyla görüntü almak ya da hafifçe 2 veya 8-çukurlu bölmenin oyuğuna uyarıcı çözeltisi 500 ul veya 100 ul için bölme (Oda A veya B) içine akar, su ya da 1mM H2O 2 çözeltisi . Yakalama görüntüleri hemen 20X su daldırma lens (Sayısal açıklık 0.75) ile ters Nikon A1R odaklı lazer tarama mikroskobu kullanarak uyaran çözümü uyguladıktan sonra. Sırasıyla 550 nm, ve 512 x 512 piksel çözünürlükte - 488 nm ve 500 uyarma ve emisyon dalga boyları ile 4 sn aralıklarla görüntüleri bir zaman serisi toplayın. </li><li> Görüntü Analizi Nikon Elements kullanarak, ROI&#39;ler ilgi her hücrenin (veya alan) etrafında çizildi. Her ROI içerisindeki toplam yoğunluğu Zaman Ölçümü iletişim kutusunu (İmageJ yerine kullanılabilir) kullanılarak zamanla ölçüldü. Toplam yoğunluğu ölçümleri ihraç ve DataGraph işlenmiştir. Ca 2 + başak genlik inci gibi piklerinde eksi istirahat şiddeti, süresi olarak tanımlandıİki sivri bitişik başak zirveleri arasındaki zaman aralığı olarak başlatılması ve bir başak tamamlanması ve dönem arasında e saati. -test aracı karşılaştırmak için kullanıldı; t. </li></ol>

<ol><li>Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals%3A+the+lead+currency+of+plant+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signals: the lead currency of plant information processing.</a> Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).</li>
<li>Pan, Z., Zhao, Y., Zheng, Y., Liu, J., Jiang, X., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+screening+Arabidopsis+mutants+with+disordered+abiotic+stress-induced+calcium+signal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for screening Arabidopsis mutants with disordered abiotic stress-induced calcium signal.</a> J. Genet. Genomics. 39 (5), 225-235 (2012).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense-related+calcium+signaling+mutants+uncovered+via+a+quantitative+high-throughput+screen+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana.</a> Mol. Plant. 5 (1), 115-130 (2012).</li>
<li>Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+luminescence+imaging+reveals+stimulus-+and+tissue-specific+Ca2%2B+dynamics+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants.</a> Mol. Plant. 6 (2), 444-455 (2013).</li>
<li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).</li>
<li>Van der Luit, A. H., Olivari, C., Haley, A., Knight, M. R., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+calcium+signalling+pathways+regulate+calmodulin+gene+expression+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct calcium signalling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco.</a> Plant Physiol. 121 (3), 705-714 (1999).</li>
<li>Johnson, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+oscillations+of+cytosolic+and+chloroplastic+free+calcium+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants.</a> Science. 269 (5232), 489-503 (1995).</li>
<li>Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+calcium+signaling+in+Arabidopsis+involves+two+cellular+pools+and+a+change+in+calcium+signature+after+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation.</a> Plant Cell. 8 (3), 489-503 (1996).</li>
<li>Logan, D. C., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+and+cytosolic+calcium+dynamics+are+differentially+regulated+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants.</a> Plant Physiol. 133 (1), 21-24 (2003).</li>
<li>Mehlmer, N., Parvin, N., Hurst, C. H., Knight, M. R., Teige, M., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolset+of+aequorin+expression+vectors+for+in+planta+studies+of+subcellular+calcium+concentrations+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 63 (4), 1751-1761 (2012).</li>
<li>Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+calcium+responses+to+drought%2C+salt+and+cold+in+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root.</a> Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
<li>Souslova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+fluorescent+protein-based+Ca2%2B+sensors+with+increased+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range.</a> BMC. Biotechnol. 7, 37-46 (2007).</li>
<li>Tanaka, K., Swanson, S., Gilroy, S., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+nucleotides+elicit+cytosolic+free+calcium+oscillations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular nucleotides elicit cytosolic free calcium oscillations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154 (2), 705-719 (2010).</li>
<li>Iwano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+of+the+cytoplasmic+Ca2%2B+concentration+is+essential+for+pollen+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1322-1334 (2009).</li>
<li>Sieberer, B., Chabaud, M., Timmers, A., Monin, A., Fournier, J., Barker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear-targeted+Cameleon+demonstrates+intranuclear+Ca2%2B+spiking+in+Medicago+truncatula+root+hairs+in+response+to+rhizobial+nodulation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A nuclear-targeted Cameleon demonstrates intranuclear Ca2+ spiking in Medicago truncatula root hairs in response to rhizobial nodulation factors.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1197-1206 (2009).</li>
<li>Loro, G., Drago, I., Pozzan, T., Lo Schiavo, F., Zottini, M., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Cameleons+to+different+subcellular+compartments+reveals+a+strict+cytoplasmic%2Fmitochondrial+Ca2%2B+handling+relationship+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Targeting of Cameleons to different subcellular compartments reveals a strict cytoplasmic/mitochondrial Ca2+ handling relationship in plant cells.</a> Plant J. 71 (1), 1-13 (2012).</li>
<li>Krebs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+genetically+encoded+sensors+allow+high-resolution+live+cell+imaging+of+Ca2%2B+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics.</a> Plant J. 69 (1), 181-192 (2012).</li>
<li>Bonza, M. C., Loro, G., Behera, S., Wong, A., Kudla, J., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+Ca2%2B+accumulation+and+dynamics+in+the+endoplasmic+reticulum+of+Arabidopsis+root+cells+using+a+genetically+encoded+Cameleon+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analyses of Ca2+ accumulation and dynamics in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis root cells using a genetically encoded Cameleon sensor.</a> Plant Physiol. 163 (3), 1230-1241 (2013).</li>
<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2O2+in+plant+peroxisomes%3A+An+in+vivo+analysis+uncovers+a+Ca2%2B+dependent+scavenging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">H2O2 in plant peroxisomes: An in vivo analysis uncovers a Ca2+ dependent scavenging system.</a> Plant J. 62 (5), 760-772 (2010).</li>
<li>Zhu, X., Caplan, J., Mamillapalli, P., Czymmek, K., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+in+innate+immunity-mediated+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Function of endoplasmic reticulum calcium ATPase in innate immunity-mediated programmed cell death.</a> EMBO J. 29 (5), 1007-1018 (2010).</li>
<li>Roszik, J., Lisboa, D., Szöllosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75 (9), 761-767 (2009).</li>
<li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%3A+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578 (Pt 1), 55-67 (2007).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Biz Arabidopsis fidelerinin mekânsal-zamansal Ca 2 + yanıt kayıt için FAS sistemi göstermiştir. Bu FAS Ca 2 + kayıt sistemi, CA burada sunulmuştur abiyotik stres uyarılara ek olarak çeşitli uyaranlar tarafından tetiklenen 2 + dinamiğini ölçmek için adapte edilebilir bir basit, hassas ve güçlü bir yaklaşım sağlamaktadır. Bu sistemi kullanarak, kolayca bütün bitki düzeyinde doku ya da uyaranlara özgü mekânsal-zamansal Ca 2 + dinamiklerini karşılaştırabilirsiniz. FAS yüksek hassa...

Bitki hücresi, hücre hareketlerini koordine sinyalizasyonu ile çevreye göre. Çevresel uyarılara tepki olarak sinyal olayını erken hücre, bir geçici Ca 2 + artıştır. Serbest Ca2 + konsantrasyonu içindeki desen ya da geçici bir artış imzası, genliği, sıklığı ve süresi ile karakterize edilir. Farklı uzay-zamansal Ca 2 + imzalar farklı hücresel aktiviteler 1 düzenler. Sıcak, soğuk, tuz, kuraklık, ışık, veya bitki hormonları gibi belirli uyaranlara, ince ayar olabilir membran lokalize Ca 2 + kanalları ve / veya taşıyıcıların uzay-zamansal etkinliği, belirli Ca 2 + imzalar sonuçlanır. Ca 2 + taşıyıcıları, iyi karakterize edilmiş olmasına rağmen, küçük bitkilerde 1 Ca 2 + kanalları moleküler kimlikleri ve işlevleri hakkında bilinmektedir. Uyaranlara stres değiştirilmiş Ca 2 + tepki ile mutantlar için genetik ekranlar etkili olabilir yaklCa 2 + imzaları oluşturan bileşenleri belirlemek için oach. Son zamanlarda birçok Aequorin göre Ca +2 algılama sistemleri patojen saldırısı ve abiyotik stres 2-4 yanıt bileşenleri sinyalizasyon 2 + Ca genetik ekranlar kolaylaştırmak geliştirilmiştir. Aequorin ilk 1990&#39;ların başında 5 CA bitkilerde 2+ sinyalleri algılamak için kullanıldı. O zamandan beri, Aequorin Ca-2 belirli bir hücre izlemek için kök 8 tonoplast sitoplazma 5, 6 çekirdeği, kloroplastlar 7, 9 mitokondri ve stroma 10, yanı sıra farklı hücre tipleri gibi farklı hücresel bölümlerin, hedeflendi + sinyalleri 11. Aequorin tabanlı Ca 2 + ölçümleri uyaranlara stres hücrelerin bir nüfusun mekansal ve zamansal Ca 2 + tepkilerini ortaya çıkarmak. Bununla birlikte, çoğu durumda, tek hücreler Ca 2 + tepkileri vardır unsynchroniyanıt doku 4 zed. Bu nedenle, Aequorin Ca 2 + kayıt mutlaka bireysel hücrelerin Ca 2 + sinyalini bildirmiyor. Son yıllarda, genetik olarak kodlanmış floresan proteini (FP), yüksek çözünürlüğe sahip hücre içi Ca2 + sinyali incelemek için kullanılmıştır, CA böyle sarı cameleon (YÇS) 12 ve 13 olarak CASEs12 2 + göstergelerini tabanlı. YÇS flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) CFP ihtiva eden Ca2 + göstergeleri tabanlı ve YFP proteini kalmodulin ve kalmodulin-bağlanma peptidi M13 etmeye dayanır 2 + Ca ile bağlantılı varyantları bulunmaktadır. Ca2 bağlanan kalmodülin olarak bu şekilde daha yüksek enerji transferi (FRET geliştirilmiş) ile sonuçlanan, birbirine CFP ve YFP getiren, yapısal bir değişiklik olur. CFP sinyal yoğunluklarının için YFP oranı olarak yaklaşık olarak hesaplanan zaman, FRET düzeyi, hücre içi Ca2 + dinamiklerini göstermektedir. Çeşitli SK versiyonları tesislerinde kullanılmaktadır. YC3.6 t oldusitozolde 14,15, çekirdeğin 16, mitokondri 17 ve plazma zarı 18 ve YC4.6 ve D4ER için argeted ER 15,19 hedefleyen edildi ve D3cpv proksisomlara 20 hedeflenmiştir. YÇS sentezleyen transgenik bitkiler, farklı hücre tiplerinin farklı hücresel bölmeleri içinde Ca 2 + dinamiklerinin canlı hücre görüntüleme sağlar. DAVALAR (muhtemelen Ca lcium se Nsor) bir kalmodulin ve kalmoduline bağlayıcı peptid M13 barındıran tek dairesel sırası büyük floresan proteinleri (cpFPs) vardır. Ca 2 + bağlanma üzerine, olgu floresan yoğunluğundaki bir artışa yol açan, konformasyonel değişiklikler yapılabilir. Kasanın floresan tepkisi ve Ca +2 konsantrasyonu arasında korelasyon hücre içi Ca + 2 dinamikleri kantitatif olarak ölçüldü sağlar. Case12 varyant 12 kat Ca 2 + -saturated formları floresan artmıştır. N benthiminana bitkilerin geçici olarak İfadeessing Case12 veya stabil bir şekilde eksprese eden Örneği 12 Arabidopsis bitkileri koruma ve abiyotik stres 4,21 Ca 2 sinyalini incelemek için kullanılmıştır. , Veya dehidrasyon strese patojen saldırısına yanıt hücrelerinde asenkron mekansal ve zamansal Ca 2 + salınımlar Case12 göre Ca 2 + görüntüleme ile ortaya konmuştur. Burada, Arabidopsis fide 2+ dinamikleri Ca özel ve sitozolik konfokal görüntüleme ve nükleer Ca mendil ve uyaranlara Aequorin göre lüminesans görüntülemesi için ayrıntılı talimatlar sunmak FAS Vaka 12. Lüminesans görüntüleme ifade Arabidopsis kök hücrelerinde 2+ dinamikleri bozulmamış bitki ya da burada açıklanmayan dokularda stres ile indüklenen Ca2 + dinamiklerini analiz etmek için ya da 2 + sinyaller Ca etkisiyle değişmiş stres mutantlar için mutajenize bitki popülasyonlarını Arabidopsis taranması için adapte edilebilir. Canlı hücre Ca 2 + görüntüleme kurulum Ca analiz adapte olabilirCa 2 + Diğer göstergeler kullanılarak farklı bölmeler içinde subcelluar veya farklı hücre tiplerinde 2 + dinamiği.

<table><tbody><tr><td>10 cm x 10 cm kare Petri kabı</td><td>VWR</td><td>60872-310</td><td></td></tr><tr><td>Yapışkan film</td><td>VWR</td><td>60941-062</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen boru</td><td>PerkinElmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>1 ml şırınga</td><td>VWR</td><td>53548-000</td><td></td></tr><tr><td>Silikon gres</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>2 kuyulu odacıklı kapak camı&nbsp;</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155379</td><td></td></tr><tr><td>8 kuyulu odacıklı kapak camı</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Lüminesans görüntüleme sistemi</td><td>Princeton Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ters konfokal lazer tarama mikroskobu</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Yok</td><td>Nikon A1R&nbsp;</td></tr><tr><td>Görüntüleme yazılımı</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Nikon Elements&nbsp;</td></tr><tr><td>DataGraph</td><td>Visual Data Tools Inc</td><td>N/A</td><td>DataGraph 3.1.1 en yeni sürümüdür</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>NanoLight Technolgies</td><td>#301B NF-BCTZ-FB</td><td></td></tr><tr><td>Çok amaçlı çamaşır suyu</td><td>Herhangi bir yerel mağaza</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151500</td><td></td></tr><tr><td>MS tuzu</td><td>Fitoteknoloji Laboratuvarları</td><td>M524-50L</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>VWR</td><td>BDH8029-12KG</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

Ölçme mekansal ve zamansal ca 2+ sinyalleri

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Gelişimsel ve çevresel ipuçları ca bitki hücrelerinde 2+ dalgalanmaları. Stimulus özgü mekânsal-zamansal Ca 2 + desenler Ca +2 sinyal kaskadlarını başlatmak hücresel Ca +2 bağlayıcı proteinler tarafından algılanır. Ancak, biz yine de belirli Ca 2 + sinyalleri üretilir uyaran nasıl hakkında biraz biliyorum. Ca 2 + sinyalinin özgünlüğü belirli bir uyarana cevap Ca 2 + kanalları ve / veya taşıyıcıların faaliyetlerinin sofistike regülasyonuna bağlı olabilir. Bu hücresel bileşenlerini belirlemek ve onların işlevlerini anlamak için, doku ve hücresel düzeydeki Ca 2 + sinyalleri hassas ve sağlam kayıt izin sistemleri kullanmak çok önemlidir. Farklı hücre bölmeleri hedefleyen genetik olarak kodlanmış Ca 2 + göstergeleri hücresel Ca 2 + sinyalleri canlı hücre konfokal görüntüleme için bir platform sağladı. Burada talimat tarifİki Ca 2 + algılama sistemlerinin kullanımı için s: FAS (film yapıştırıcı fidanları) ışıldama Ca 2 + görüntüleme ve case12 tabanlı canlı hücre konfokal floresan Ca 2 + görüntüleme bazlı Aequorin. Case12 kullanarak canlı hücre konfokal görüntüleme yüksek çözünürlükte sitozolik ve nükleer Ca 2 + sinyalleri aynı anda taranmasını sağlayan ise FAS sistemini kullanarak Lüminesans görüntüleme, doku seviyesinde mekansal ve zamansal Ca 2 + sinyalleri basit, sağlam ve duyarlı bir algılama sağlar.

Mannitol, NaCI ve H2O 2, sırasıyla, kurutma, tuz ve oksidatif stres uyarıcılar temsil etmek üzere kullanılmıştır. Ağır metal iyonu Cu2 +, bu üç stres uyaranları herhangi biri ile sinerji içinde kontrol etmek için, Cu2 + varlığında ya da yokluğunda her bir uyarana Ca 2 + tepkiyi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, FASB lüminesans görüntüleme Arabidopsis fide dehidrasyon, tuz ve oksidatif stres farklı tepki ortaya koymuştur. 1 mM H2O 2 indüklerken, bu çalı...

Ca 2 + sinyalizasyon tesislerinde çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Burada mekansal ve zamansal Ca kaynaklı abiyotik stres izlemek için yaklaşımlar sunmak Arabidopsis hücre ve genetik olarak kodlanmış Ca 2 + göstergeleri Aequorin veya Case12 kullanarak dokularda 2+ sinyaller.

Ölçme Mekansal ve zamansal Ca 2+ Sinyalleri

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Bu prosedürün genel amacı, kalsiyum sinyallerini hem hücresel hem de tüm bitki düzeyinde izlemek için bir yöntem göstermektir. Bu, ilk olarak MS agar plakası üzerinde veya doğrudan görüntüleme odası içinde fidelerin yetiştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, fideleri yapışkan bir film üzerine aktarmak veya görüntüleme odasında tutmaktır.Kalsiyum sinyallerini indüklemek için fidelere uygulanan sonraki uyaranlar. Sonuç olarak, yaşam tarzı lüminesansı veya floresan görüntüleme, farklı uyaranlara sırasıyla tüm fide veya sitozolik nükleer kalsiyum tepkisini göstermek için kullanılır. Bu tekniğin, örneğin tek bitki gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, film yapıştırıcı fide tahlilinin basit, hassas ve sağlam olmasıdır.Bu nedenle, bu teknik, değişmiş kalsiyum sinyal tepkilerine sahip mutantlar için yüksek verimli taramaya uyarlanabilir. Ek olarak, düz tabanlı kalsiyum görüntüleme ile karşılaştırıldığında, GFP tabanlı genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörünün kullanılması, karmaşık mikroskobik ayarlardan ve hesaplamalardan kaçınır. Bu yöntem, Arabidopsis'teki stres tepkisi sırasında kalsiyum sinyalizasyonu hakkında bilgi sağlar, ancak diğer bitki modellerinde geliştirme veya savunma gibi diğer bağlamlarda da kullanılabilir.Bu yöntemi göstermek parlak olacaktır. Laboratuvarımızdan bir öğrenci: Bu işleme başlamak için, bir tavşan opsis bitkisinin tohumlarını% 0.01 Triton 100 içeren% 10 ağartıcı çözeltisi ile sterilize edin, tohumları tam mukavemetli MS% 1.2 sakaroz ve% 1.2 agar içeren kare bir tabağa ekin. Daha sonra, iki gün boyunca dört santigrat derece tabakalaşmadan sonra plakaları dikey olarak bir büyüme odasına yerleştirin.Daha sonra fideleri bir filme aktarın. Plaka üzerinde büyüyen yedi ila 10 günlük fidelerin üzerine yapışkan bir film yerleştirin. Fidelerin filme yapıştığından emin olmak için filmi elinizle hafifçe itin.Ardından, fidelerin filme yapışması için filmi nazikçe soyun. Daha sonra, A yapışkan fidelerini suda mililitre HCTZ başına 15 mililitre iki mikrogram içeren kare bir plakaya yerleştirerek fideleri kofaktör ile inkübe edin. Fideleri oda sıcaklığında dört saat ila gece boyunca kuluçkaya yatırın.Lüminesans görüntülemeye hazırlanmak için, filmi HCTZ solüsyonundan çıkarın ve iki parça oluşturacak şekilde ortadan kesin. İki film parçasını, fideler yukarı bakacak şekilde iki farklı tabağa yerleştirin. Ardından, karanlıkta ışıldayan görüntüler elde etmek için plakaları beş dakika karanlıkta bırakın.Lüminesans görüntüleme sisteminin sahnesinde iki plakayı yan yana yerleştirin. Plakalara aynı anda 20 mililitre uyaran çözeltisi ekledikten hemen sonra görüntüler elde edin. Lüminesans görüntülerini analiz etmek için, tüm lüminesans görüntüleri için aynı görüntüleme aralığını seçin, ROI'yi kırpın ve görüntüleri jpeg dosyaları olarak oluşturun.Alternatif olarak, görüntüleri SPE formatındaki dosyalar olarak dışa aktarın ve bunları görüntü J görüntü analiz yazılımına aktarın. ROI'nin ortalama gri değerini hesaplamak için ölçümleri ayarlayın, aynı boyutta ROI alanı seçin. Ardından ortalama gri değeri ölçün ve verileri çubuk grafikler olarak sunun.Fideleri konfokal görüntüleme için hazırlamak. Durum 12'yi ifade eden opsis bitkilerinin tohumlarını% 0.01 Triton içeren% 10 ağartma solüsyonu ile sterilize edin. Bu nedenle, tam mukavemetli MS tuzları,% 1 sakar ve% 1.2 agar içeren bir tabakta steril tohumlar.Daha sonra plakaları, iki gün boyunca dört santigrat derecede tabakalaşmadan sonra dikey olarak bir büyüme odasına yerleştirin. Bu arada, bir slayt ve bir kapak fişi ile bir görüntüleme odası monte edin. Sürgünün üstüne bir parça suya batırılmış pamuk yünü yerleştirin.Daha sonra bir veya iki beş günlük fideyi plakadan slaydın ortasına aktarın. Daha sonra örtü kaymasının her bir köşesine küçük kil parçaları yapıştırın ve örtü kaymağı ile kayma arasında bir boşluk oluşturmak için örtü bezini fidelerin üzerine yerleştirin. Bundan sonra, polietilen tüpün bir ucunu bir mililitrelik bir şırıngaya bağlayın ve tüpün diğer ucunu haznenin hemen yanına yerleştirin.Pleksiglas hazneli bir görüntüleme haznesi monte etmek için boruyu bantla yerinde tutun. İki polietilen tüpün etrafına ince bir silikon gres tabakası sürün ve kaplanmış tüpleri pleksiglas haznenin her iki yanındaki kanallara bastırın. Ardından, boru oluklarını içeren haznenin yüzeyine ince bir silikon gres tabakası sürün ve hazne açıklığının bir tarafını kapatmak için gresin üzerine bir kapak fişi yerleştirin.Daha sonra, beş günlük bir fideyi plakadan hazneye aktarın ve fidanın üzerine suyla ıslatılmış pamuk yünü parçasını yerleştirin. Silikon gresi haznenin diğer yüzeyine yayın ve sızdırmaz hale getirmek için üstüne başka bir kapak sürgüsü bastırın. Daha sonra, tüplerden birinin ucunu bir mililitrelik şırıngaya bağlayın ve diğer tüpün ucunu açık bırakın.Odacıklı bir kapak camı ile bir görüntüleme odası hazırlamak için, önce odacıklı kapak camını% 70 etanol ile sterilize edin ve 0,6 mililitre veya 0,2 mililitre tam mukavemetli MS'de kuruyana kadar davlumbazda bırakın. Sırasıyla iki kuyulu bir odanın veya sekiz oyuklu bir odanın her bir oyuğuna% 1 sükroz ve% 0.5 savaşçı jeli içeren ortam. Daha sonra tohumları sterilize edin ve doğrudan ince bir berrak jel tabakası içeren odacıklı bir kapak camına ekin ve beş gün boyunca dikey olarak büyümelerine izin verin. Görüntü alımı için.Konfokal bir mikroskop kullanarak, görüntüleri elde etmeden hemen önce hazneye 200 mikrolitre 150 milimolar sodyum klorür, buz gibi soğuk su veya bir milimolar hidrojen peroksit solüsyonu yavaşça enjekte ederek stres uyaranları uygular. Uyaran solüsyonunu uyguladıktan hemen sonra görüntüleri yakalayın. 20 x suya daldırma lensi ile ters konfokal lazer tarama mikroskobu kullanma.Sırasıyla 4 88 nanometre ve 500 ila 550 nanometre uyarma ve emisyon dalga boyları ve beş 12'ye beş 12 AIX çözünürlüğü veya Nikon öğelerini kullanarak görüntü analizi ile dört saniyelik aralıklarla bir zaman serisi görüntü toplayın. ROI'ler, ilgilenilen her hücrenin etrafına çizilir. Her bir ROI içindeki toplam yoğunluk, zaman ölçümü iletişim kutusu kullanılarak zaman içinde ölçülür.Daha sonra toplam yoğunluk ölçümleri dışa aktarılır ve gösterilen veri grafiğinde işlenir. İşte 10 günlük fidelerin mekansal zamansal kalsiyum tepkisinin karşılaştırılması. Buradaki farklı stres uyaranları, lüminesansın zaman serisi, 400 milimolar mannitol ve 400 milimolar ole artı bir milimolar bakır klorür, 75 milimolar sodyum klorür ve 75 milimolar sodyum klorür artı bir milimolar bakır klorür ve bir milimolar hidrojen peroksit veya bir milimolar hidrojen peroksit artı bir milimolar bakır klorür.Üst ve alt paneller, sırasıyla ilk 40 saniye ve ikinci 40 saniye boyunca elde edilen lüminesans görüntüleridir. Ve burada, burada sitozolik ve nükleer kalsiyum salınımı olarak gösterilen belirtilen stres uyaranlarına yanıt olarak fidelerin ortalama lüminesans yoğunluğunun çubuk grafiği yer almaktadır. Tuz stresine yanıt olarak, konfokal görüntüler, durum 12'nin kök hücrelerin sitoplazmasında ve çekirdeklerinde ve durum 12'yi ifade eden transgenik bitkilerin yaprak hücrelerinde ifade edildiğini göstermektedir.Bu görüntü ortaya çıkar, kloroplastların kırmızı, otofloresansı ve vaka 12'nin yeşil floresansı ortaya çıkar. Bu iki grafik, kök hücrelerin bir çekirdeği olan sitozolde tuz stresinin neden olduğu kalsiyum salınımını göstermektedir. Bu prosedürü denerken, iyi yetişmiş fideleri kullanmayı unutmamak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, dynas'ı hem hücresel hem de tüm bitki düzeyinde nasıl izleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

measuring-spatial-and-temporal-ca2-signals-in-arabidopsis-plants

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hücre Özgül Analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves

Bu makale RootChip içinde Arabidopsis fide ekimi için bir protokol, mikroskobik kök izleme ve hücre içi metabolit düzeylerinin FRET tabanlı ölçümü ile büyüme koşullarını otomatik kontrol birleştiren bir mikroakışkan görüntüleme platform sağlar.

RootChip kullanarak Kök Çevre Rapid manipülasyonu ile Arabidopsis Kök Büyüme Time-lapse Floresans Görüntüleme

Bu protokol, etkili jeomanyetik alanın (GMF) tersine çevrilmesinin diferansiyel gen ekspresyonunu indüklediği ve Arabidopsis thaliana'nın morfolojisini değiştirdiği hipotezini test etmek için bir yöntemi açıklar. Bitki büyüme odasında yapay olarak ters GMF koşulları oluşturmak için üç eksenli sekizgen bir Helmholtz bobin çifti sistemi kullanıldı.

Manyetik Alan (GMF) ve Bitki Gelişimi: GMF İptalleri Etkileri üzerine Araştırılması<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Geliştirme ve Gen İfadesi

Bu iletişim kuralı hemipteran böcekler, yaprak bitleri gibi besleme tarafından üretilen bitkilerde kalsiyum sinyalleri analiz etmek için basit bir yöntem özetliyor. GFP kalsiyum Biyoalgılayıcı GCaMP3 ile dönüştürülmüş Arabidopsis thaliana kalsiyum dinamiği yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüğü ile gerçek zamanlı vivo içinde görüntüleme için izin verir.

Floresan Biyoalgılayıcı kullanarak böcek besleme sırasında gerçek zamanlı Vivo kayıt Arabidopsis kalsiyum sinyallerin

Burada, bitki büyüme davranış ve özellikle fenotipleri tekrarlanabilir bir şekilde eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Değişken ve aynı zaman istikrarlı ışık koşulları sağlamak için nasıl gösterir. Uygun analizleri yeterli örnek numaraları ve geçerli istatistiksel değerlendirme bağlıdır.

Farklı ışık nitelikleri Arabidopsis thaliana büyüme davranış analizi

Giberellin algı sensör 1 (GPS1) Giberellin etki kronolojik zamanmekansal yüksek çözünürlüğe hücresel düzeyde ölçmek için ilk Förster rezonans enerji transferi tabanlı biyoalgılayıcı olduğunu. Bu iletişim kuralı yöntemi görselleştirmek ve genetik olarak kodlanmış nlsGPS1 biyoalgılayıcı Arabidopsis hypocotyls ve kök ipuçlarını kullanarak hücresel Giberellin düzeyleri ölçmek için raporlar.

NlsGPS1 Förster rezonans enerji kullanarak görüntülenmesi hücresel Giberellin düzeyleri (FRET) biyoalgılayıcı aktarma

Bu protokol amacı nasıl Arabidopsisalt kısımlarında farklı sitelere CFDA yüklemek için göstermek için. Daha sonra çekim içinde CF ortaya çıkan dağıtım deseni sunuyoruz.

Arabidopsis 'In alt lavabo dokularında yüklü CFDA Tracer Shootward hareketi

Hücre dışı glutamat tetiklenen sistemik kalsiyum sinyali, bitkilerde mekanik yaralama ve otobur saldırısına karşı bitki savunma yanıtlarının indüksiyonu için kritik öneme sahiptir. Bu makalede, kalsiyum ve glutamaca duyarlı floresan biyosensörleri ifade eden Arabidopsis thaliana bitkilerini kullanarak her iki faktörün de mekansal ve zamansal dinamiklerini görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Arabidopsis'te Lokal ve Sistemik Yara Sinyallerinin Geniş Alan, Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Burada, Arabidopsis fide de-etiolasyonunun erken aşamalarında klorofil biyosentezinin izlenmesi için tasarlanmış gelişmiş bir aracı açıklıyoruz. Yeni metodoloji, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte non-invaziv gerçek zamanlı klorofil floresan görüntüleme sağlar.

Arabidopsis De-etiolasyonunun Erken Aşamalarında Klorofil Biyosentez Kinetiğinin Belirlenmesi için Non-İnvaziv Test

Bu biyolojik membranlar elektrik modelleri kullanarak nasıl anlaşılabilir bir gösteri. Ayrıca öğrenci yönelik laboratuarlar için kerevit ventral sinir kordonundan aksiyon potansiyelleri kayıt prosedürleri göstermektedir.

Devre Biyolojik Membranlar Modelleme ve Aksonlar Elektrik Sinyalleri Ölçme: Öğrenci Laboratuvar Egzersizler

Öğrenin, Arabidopsis bitkilerinde hücresel ve bitki bütünlüğü düzeyinde kalsiyum sinyallerini görüntülemek için genetik olarak kodlanmış göstergeler kullanarak basit ve sağlam bir yöntemi.

Ölçme Mekansal ve zamansal Ca^{2+ Sinyalleri}

Daha fazla video keşfet