Name: Kinaz İnhibitörleri Karşı Dayanıklı Mutasyonlarının Tarama ve Doğrulama için Bir Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Öğrenin, kinaz inhibitörlerine karşı ilaç dirençli mutasyonları tespit ve doğrulama yöntemini. Rastgele mutasyon kütüphanesi oluşturarak kanser tedavisinde direnç mekanizmalarını keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) ve Lösemi Araştırma Vakfı'ndan MA'ya verilen hibelerle desteklenmiştir. MA, V-Vakfı'ndan V-Scholar ödülü sahibidir. Yazarlar, editörlük için Dr. Sara Rohrabaugh'a müteşekkirdir.

NOT: Bu protokol tüm işlemler hayvanların etik tedavisi ve bakımı için kurallar Ulusal Enstitüsü göre yapılan ve onaylı IACUC hayvan kullanımı protokolüne göre edildi. 1. Hücre Hat Bakım <ol><li> RPMI-1640 ortamı içinde kültür BAF3 hücreleri,% 10 fetal sığır serumu ve penisilin / streptomisin (100 ünite / ml ve 100 ug / ml) ile WEHI Hücrelerinin geçirilerek kültür ortamı desteklenmiştir. % 10 fetal sığır serumu ve penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş DMEM içinde HEK293T hücrelerin büyümesine (100 birim / ml ve 100 ug / ml). % 5 CO2 içeren nemli bir atmosferde 37 ° C&#39;de hücreler muhafaza edin. </li></ol> 2. Plasmid Yapı <ol><li> Fareyi JAK2 ve LR tarafından pMSCV-puro-GW onun onkojenik izoformu JAK2-V617F standart rekombinasyon klonlama prosedürü kullanılarak klonaz Clone. </li><li> Lusiferaz ekspresyon vektörü (pMSCV-Luc-Kiraz-GH) oluşturulması için in vi kullanılanvo görüntüleme kullanılır pENTR-Luc oluşturmak için pENTR SD-TOPO klonlama ile takip primerler (AP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC LUC SD / PR TTACAATTTGGACTTTCCG ve LUC SD /) kullanılarak PCR ile pLVX-Tet-ON vektöründen lusiferaz yükseltmek LR klonaz kullanılarak yeniden birleştirme aracılı klonlaması ile bir retroviral vektör, pMSCV Cherry-GW Lusiferaz geninin aktarmak için kullanılır. </li></ol> Rastgele Mutasyon Kütüphanesi 3. hazırlanması, Mutasyonlar Eleme ve belirlenmesi 3.1), rasgele mutajeniz <ol><li> JAK2 yabani tip ve ticari rekombinasyon klonlama teknolojisini kullanarak pMSCV-puro-GW retroviral vektörü içine V617F mutasyon Klon tam uzunlukta. </li><li> , Dönüştürmek için JAK2-V617F plazmid DNA 1 mikrogram kullanın XL-1 Kırmızı, E. böylece onları çoğaltma sırasında rastgele mutasyonlar dahil etmek izin DNA tamir mekanizmaları kusurlu coli hücreleri,. Daha özel olarak ise, 50 karıştırın - DNA, 100 ng, 10 ile (daha fazla DNA 100 ng transformasyon etkinliğini azaltır)0 önceden soğutulmuş polipropilen tüp içinde yetkin hücre ul ve yavaşça her 5 dakikada dönen, 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Iyi bir kütüphane içerisinde için yetkin hücrelerin 4-6 tüpler kullanmaktadır. NOT: DNA 100&#39;den fazla ng dönüşüm verimliliği azaltır </li><li> 45 saniyelik bir ısı şoku 42 ° C &#39;de bir su banyosunda tüp daldırın ve 2 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Daha sonra, SOC ortamında 1 ml (% 2.0 tripton,% 0.5 maya ekstresi,% 0.05 NaCl, 10 mM MgCI2, 10 mM MgSO4 ve% 0.4, D-glukoz) ekleyin. 90 dakika boyunca 225-250 rpm&#39;de çalkalanırken 37 ° C&#39;de tüp inkübe edin. </li><li> 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden dört adet 10 cm LB-agar plakaları üzerinde her tüp Plaka hücreleri. 37 ° C&#39;de 24 saat - 16 inkübe edin. </li><li> Görünür koloniler ardından, steril bir plaka kazıyıcı ile plakaları kazınarak onları toplamak. Ticari bir plazmid ekstre etme kiti kullanılarak her plaka ve izole plazmid DNA Havuz hücreleri. Genellikle koloniler küçük ve olmaya 18-24 saat sürebilir: NOTGörünür bu yavaş büyüyen bakteri suşları çünkü. Bu aşamada, örneğin Sau3A1 veya Taq1 ya da sekanslama Bir sık ​​kesici ile sınırlama sindirimi ile kütüphanede mutasyonlarının heterojen değerlendirmek. </li></ol> Retroviral süpernatanlarından ve İletim 3.2) üretimi <ol><li> Transfeksiyondan bir gün, levha% 10 FCS, penisilin / streptomisin ve 2 mM L-glutamin içeren DMEM içinde 100 cm&#39;lik kaplar üzerine 4 x 10 6 HEK 293T hücreleri önce. </li><li> Ertesi gün, orta yerine ve Mutagenezli pMSCV-JAK2-V617F kütüphanesi ile hücreleri transfect. Her biri 10 cm plaka için, serumsuz DMEM ortamı kullanılarak 400 ul toplam hacmine FuGENE 40 ul DNA 10 ug (plazmid kütüphanesi 5 ug ve retroviral paketleme plazmid 5 ug, pCLEco) karıştırın. Oda sıcaklığında 20 dakika için DNA ve lipit karışımı inkübe edin. 20 dakika sonra HEK293T hücrelerin üzerine damla DNA lipit kompleksi damla ekleyin. </li><li> Altı saat sonra, transfeksiyon ortamı ağırlık değiştirmeki taze ortam virüs üretimi, 37 ° C &#39;de 48 saat süre ile plakalar inkübasyon ve. Inkübasyondan 48 saat sonra, bir 0.45 um Acrodisc filtreden filtre viral süpernatanların toplanması. </li></ol> In Vitro dirençli klonlar, 3.3) Seçim <ol><li> Ilaca dirençli JAK2 V617F-mutantlar için, 0.5-1 x10 6 arasında bir viral titreye sahip bir virüs yüzer 100 ml 100,000,000 BAF3 hücrenin transduse edilmesi. Daha özel olarak ise,% 10 serum içeren RPMI ortamı kullanılarak, 300 ml lik bir toplam hacme kadar virüs yüzer, 100 ml ve polyberene 24 ug / ml (ployberene nihai konsantrasyon 8 mg / ml) ile 10 8 hücreleri karıştırın. Birden altı kuyu plakaları (4-5 ml başına iyi) Bu hücre mikserler dağıtın. </li><li> 25 ° C&#39;de 90 dakika boyunca 1250 x g&#39;de plakaları santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, 24 saat süre ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, hücreleri birlikte havuz ve Ruxolitinib ve orta yumuşak agar içeren karıştırın ve si kaplamax kuyu plakalar. Her bir ilaç konsantrasyonu için, bir 50 ml tüp içinde Ruxolitinib uygun miktarı ile transduse BAF3 hücreleri (10-20.000.000 hücre) 10 ml karıştırın. RPMI% 20 ​​serum içeren kullanarak 40 ml sesini olun. Altı yuvalı plakalar içinde mixcarefully, hücrelere% 1.2 agar ve 10 ml ilave edilir ve plaka. </li><li> Iki hafta boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. 0.2 ml pipet uçları ve alt-kültür onlara 3-4 gün için ayrı ayrı 24 kuyu plakalar kullanılarak dirençli koloniler seçin. </li><li> Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 450 x g&#39;de santrifüj ile dirençli BAF3 hücreleri hasat edilir. Ticari bir genomik DNA izolasyon kiti kullanılarak genomik DNA izole edin. PCR genomik DNA kullanılarak primerler (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG ve mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) ve yüksek sadakat PCR sistemleri genişletmek uzun şablonun 100 ng tam uzunlukta JAK2 cDNA yükseltmek. </li><li> Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürünleri ayırın. JAK2 kodlama çerçeveyi temsil eden DNA bandı 3.4 kb tüketim ve DNA izoleticari bir jel ekstre etme kiti kullanılarak. Sıra 8 iç astar (P1 - P8) kullanılarak cDNA tam uzunlukta ticari yazılımı kullanarak kodlama dizisini kapsayan ve analiz dizileri. </li></ol> Dayanıklı Mutasyonların 4. İn Vitro Doğrulama Birçok hücre klonları, direnç fenotipinin her mutasyonun katkısını test etmek şablon olarak pMSCV-JAK2V-617F plasmidi kullanılarak yer yönelimli mutagenezle seçilen türevlerini oluşturmak için birden fazla mutasyonu taşır. <ol><li> Ticari bir mutajenez kiti ve nokta mutasyonları oluşturmak için tasarlanmış oligonükleotidler kullanılarak pMSCV-JAK2 V617F-plazmid üzerinde yer yönelimli mutagenez yapın. Dizileme ile mutant klonların kimliklerini teyit edin. </li><li> Retrovirüsler ile BAF3 hücreleri nakletmek seçeneklerini 1 ug / ml puromisin ile takip mutant plazmitleri kullanılarak yapılan. </li><li> Levha 10 4 BAF3-JAK2 V617F-hücreleri, 96 gözlü bir plakanın her oyuğuna (% 10 FCS ile RPMI 50 ul). Ayrı37 ° C&#39;de 60 saat boyunca plakaları (0, 1, 3, 5, 10 ve 20 uM son konsantrasyon) ve inkübe ly plaka üzerinde çukurlara ruxolitinib içeren ortamda 50 ul ekle. </li><li> 2-4 saat boyunca 37 ° C&#39;de her bir oyuğa inkübasyon ile takip için, WST-1 reaktifi 10 ul eklenmesi ile hücre canlılığı değerlendirmek. Bir plaka okuyucu kullanarak A450 Tutanak emme. Üç nüsha ve arsa tüm tahlilleri gerçekleştirin INCB018424 konsantrasyonları karşı absorbans ortalama. Bir doğrusal olmayan eğri uydurma algoritması kullanarak en uygun sigmoid eğri gerçekleştirin. Hücresel IC50 olarak% 50 hücre canlılığı ile sonuçlanan ilaç konsantrasyonunu puan. </li><li> Daha sonra, ruxolitinib artan konsantrasyonlarda ve 37 ° C&#39;de 4-6 saat süreyle inkübe edildi,% 10 serum ihtiva eden RPMI ortamı içinde altı yuvalı plakalar JAK2 varyantlarını eksprese eden plaka altı milyon BAF3 hücreleri. </li><li> 4 ° C&#39;de beş dakika boyunca 450 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplanır. 20 mM Tris-CI içinde hücreler, bir kez PBS ile zaman ve lize yıkayın (pH 7,5), 50mM NaCI,% 1 NP-40,% 0.1 SDS, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM sodyum florit, 2 mM sodyum vanadat ve% 5 Gliserol proteaz inhibitör kokteyli ve fosfataz inhibitörleri ile takviye edilmiştir. 5x jel yükleme tamponu (bunu takiben 1 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu sonikasyon 350 mM Tris-HCI [pH 6.8], 500 mM DTT,% 15 SDS, 10 mM benzamidin, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 5 mM sodyum vanadat Protease kokteyl, 50% gliserol, ve 5-10 dakika boyunca 70 ° C &#39;de% 0.001 Bromofenol Mavi) ve denatürasyon. </li><li> Denatüre edici koşullar altında,% 8 SDS poliakrilamid jeli üzerinde proteinleri çözmek. Fare monoklonal anti-phopsho STAT5 ile immün yapın. Lekeleri Şerit ve tavşan poliklonal anti-SATA5 antikoru ile yeniden sondaj. Tedarikçinin tavsiyelerine göre ECL reaktifler kullanılarak bantları görselleştirmek. </li></ol> Vivo Doğrulama 5. <ol><li> Lusiferazı ve kiraz ifade BAF3 hücreleri nakletmek (pMSCV-Luc-cher yapılan retrovirüslere ile transdükJAK2 V617F-dirençli varyantları ifade virüs Ry GH). JAK2 ve direnci varyantlarının sentezlenmesi için puromisin seçimi hayatta hücreleri seçin. </li><li> Kuyruk ven enjeksiyon yoluyla 6 Balb / C farelerine 200 ul PBS JAK2 V617F-ve dirençli varyantları taşıyan iki milyondan aktif olarak büyüyen BAF3-Luc / kiraz hücreleri enjekte edilir. </li><li> Hücre nakli üç gün sonra, iki hafta boyunca, günde iki kez Ruxolitinib (100 mg / kg) ile farelere enjekte edilir. </li><li> Bir görüntüleme sistemi ile lusiferaz tabanlı biyoışıldama görüntüleme yapın. . <ol><li> Kısaca, steril iyondan arındırılmış su, 300 mg 25 ml, daha küçük hacimlerde ve mağaza kısım çözülmesiyle lusiferin solüsyon hazırlanır. Not: -80 ° C&#39;de saklayın lusiferin ve kullanılana kadar ışıktan koruyunuz. </li><li> Her bir fare, 125 mg / kg, elde etmek için IP ve her bir farenin 250 ul enjekte edilir. Birlikte bir kapalı kutu inhale izofluran (% 1.5 -2.0%) kullanarak aynı gruptan fareler anestezi. Inci veteriner merhem sürüne göz kuruluğu önlemek için. NOT: fareler için alınan zaman uyku (10-15 dk) zirveye luciferin aktivitesini izin. Varyasyonu önlemek için gruplar arasında tutarlı bir süre tutun. </li></ol></li><li> Görüntüleme odası aşamasına derhal fareler aktarın ve görüntüleme işlemleri sırasında 1.5-2% isofluorane de anestezi korumak. Sıralı 0.1, 0.5, 1, 5, 30, 60 ve 300 saniye maruz görüntü fareler. Görüntü yakalamak ve görüntü elde etme ve analiz yazılımı kullanılarak biyoışıldama yoğunluğunu ölçmek. Görüntüleme kendi kafesine geri dönmek fareler ardından. </li><li> In vivo şimerizm hasat toplam Kemik iligi hücreleri için. Servikal dislokasyon ile takip 5 dakika için CO 2 ile fareler Euthanize. Kemikleri Hasat ve kemik iliği toplamak için soğuk PBS 4 ml ezmek. Floresan mikroskop altında yüzde kiraz pozitif hücreleri analiz ve FACS kullanarak ölçmek. Her örnekten yirmi bin olayları toplayın. </li></ol>

<ol><li>Huse, M., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+plasticity+of+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The conformational plasticity of protein kinases.</a> Cell. 109, 275-282 (2002).</li>
<li>Melnikova, I., Golden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Targeting protein kinases.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 993-994 (2004).</li>
<li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinases--the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).</li>
<li>Dancey, J., Sausville, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Issues+and+progress+with+protein+kinase+inhibitors+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment.</a> Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).</li>
<li>Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+inhibitors%3A+insights+into+drug+design+from+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure.</a> Science. 303, 1800-1805 (2004).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nat Med. 2, 561-566 (1996).</li>
<li>Gorre, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+resistance+to+STI-571+cancer+therapy+caused+by+BCR-ABL+gene+mutation+or+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification.</a> Science. 293, 876-880 (2001).</li>
<li>Shah, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+confer+polyclonal+resistance+to+the+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+%28STI571%29+in+chronic+phase+and+blast+crisis+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).</li>
<li>Branford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+of+point+mutations+clustered+within+the+adenosine+triphosphate-binding+region+of+BCR%2FABL+in+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+or+Ph-positive+acute+lymphoblastic+leukemia+who+develop+imatinib+%28STI571%29+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance.</a> Blood. 99, 3472-3475 (2002).</li>
<li>Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+autoinhibition+and+STI-571%2Fimatinib+resistance+revealed+by+mutagenesis+of+BCR-ABL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL.</a> Cell. 112, 831-843 (2003).</li>
<li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+dual+SRC-ABL+inhibitors+highlights+the+role+of+BCR%2FABL+kinase+dynamics+in+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).</li>
<li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AP24163+inhibits+the+gatekeeper+mutant+of+BCR-ABL+and+suppresses+in+vitro+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance.</a> Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).</li>
<li>Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+tyrosine+kinases+by+mutation+of+the+gatekeeper+threonine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).</li>
<li>Soverini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+BCR-ABL1+kinase+domain-mediated+resistance+in+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+research%22%5BJournal%5D)">Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia.</a> Leukemia research. 38, 10-20 (2014).</li>
<li>Deshpande, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase+domain+mutations+confer+resistance+to+novel+inhibitors+targeting+JAK2V617F+in+myeloproliferative+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms.</a> Leukemia. 26, 708-715 (2012).</li>
<li>Koppikar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterodimeric+JAK-STAT+activation+as+a+mechanism+of+persistence+to+JAK2+inhibitor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy.</a> Nature. 489, 155-159 (2012).</li>
<li>Marit, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+mutagenesis+reveals+residues+of+JAK2+critical+in+evading+inhibition+by+a+tyrosine+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor.</a> PLoS One. 7, 43437(2012).</li>
<li>Weigert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+resistance+to+JAK2+enzymatic+inhibitors+is+overcome+by+HSP90+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition.</a> The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).</li>
<li>Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+AC220+resistance+of+FLT3-ITD+by+SAR302503%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+cancer+journal%22%5BJournal%5D)">Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503.</a> Blood cancer journal. 3, 138(2013).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Klinik nüks ve hedef gen ilaç direnci mutasyonlarının ortaya çıkması: KML tedavisinde Imatinib klinik başarısı küçük molekül inhibitörleri ile rouge kinazlar hedef potansiyelini, ancak hedeflenen tedavinin de ortaya sınırlamaları sadece gösterdi. Direnç mutasyonlarının tanımlanması daha iyi klinik yönetimi ve gelecek nesil inhibitörlerinin gelişimine yardımcı olur. Bu protokol, hedeflenmiş genin ilaca dirençli mutasyonları tespit etmek için bir yöntem tarif etmektedir. Bu yöntem E. inşa rastgele mutasyona uğrat...

Protein kinazlar, görünüşte her hücre fonksiyonunu modüle eden hücre içi sinyal iletim yollarında önemli bir düzenleyici enzimdir. Kinaz aracılı sinyalizasyon düzgün bir denetim çoğunlukla UPS tarafından kinazlar, fosfatazların ve bozulması uygun yönetmelik (Ubikutin proteazom sistemi) dayanır homeostaz ve gelişim için çok önemlidir. Kuralsız kinazlar birçok kanser merkezi aşamasında olan ve insan hastalıklarının 1 ev sahibi sorumlu. İnsan genomu ile doğrudan ya da dolaylı olarak bağlantılı olmuştur 500&#39;den protein kinazları için ~ 400 insan hastalıkları 2 kodlar. Bu gözlemler, küçük molekül inhibitörleri 3-5 kinaz terapötik hedefleme için düşüncesini desteklemiştir. Kronik miyeloid lösemi (KML) tedavisinde gibi Imatinib gibi ABL kinaz inhibitörlerinin, gösteri, bu yaklaşımın 6,7 konseptinin kanıtı sağlanmıştır. Bu gözlem sadece karınca devrimi-kinaz tedavi değil, aynı zamanda Miyeloproliferatif neoplazmlar (EMS) ile polisitemi vera (PV) ve hastaların JAK2&#39;nın onkojenik mutasyonlar keşfine yol terapötik hedefleme için diğer neoplastik hastalıklar, genetik lezyonların tespit etmek fikri zorlanan. Bu keşif, küçük molekül kinaz inhibitörleri ile JAK2 hedefleyerek MPNs tedavisinde büyük ilgi gördü. Şimdi, JAK2 inhibitörlerinin neredeyse bir düzine klinik çalışmalarda ve bunlardan bir tanesi myelofibrozis tedavisi için son onaylanmıştır. Kanserlerde küçük molekül inhibitörleri tarafından onkojenik kinaz spesifik hedefleme umut verici sonuçlar getirmek, aynı zamanda tedaviye direnç gelişmekte muzdarip. Aslında, bugüne kadar, hastalar çoğunlukla ilaç 8-10 hedefler için hangi kinaz etki mutasyonlar alarak böyle İmatinib, Gefitinib, Erlotinib ve Dasatinib gibi kinaz inhibitörleri, direnç mutasyonları geliştirdi tedavi. Gen mutasyonu sonucu direnç o sınırlamaları vurgulamaktadırf onkojenik kinazlara karşı monoterapi hedefli ve her zamankinden daha başarılı kanser kemoterapisi gelişiminde bir sonraki meydan temsil eder. Ilaç direncinin mekanik ve fonksiyonel sonuçları seçimi ve ilaç geliştirme için ücretsiz bileşiklerin tasarımı için bir gerekçe sunmalıdır. In vitro ekranlar ile tanımlanan mutasyonlar, hastalarda bulunanlar ile korelasyon yüksek derecede göstermiştir. Bu nedenle, klinik nüks neden muhtemeldir direnç kalıplarını belirlemede klinik veya preklinik kalkınma asist belirli bir ilaç hedef çiftleri için ilaç direnç kazandıran mutasyonlar in vitro tarama. Bu mutant formlarının tanımlanması sadece ilaç tepkisi ve nüksetme ama daha güçlü yeni nesil inhibitörlerinin tasarımı için de gereklidir için hastaların izlenmesinde yararlı olacaktır. Örneğin, yeni nesil BCR / ABL inhibitörleri, nilotinib ve Ponatinib gelişmesi için, çünkü daha mec mümkün olmuşturhanistic anlayış mutagenez, yapısal ve fonksiyonel çalışmalar elde. Daha önce, biz böyle Imatinib 11,12, PD166326 12, ve AP24163 13 gibi inhibitörleri direnç kazandıran mutasyonlar spektrumunu ortaya çıkarmak için BCR / ABL rastgele mutajenezini kullanarak ekranın sonuçlarını bildirmişlerdir. Sonuçlar sadece klinik direnç ve hastalık nüksü veren mutasyonları tespit değil, aynı zamanda ilaç direnci ve kinaz fonksiyonunu 11,14 yöneten ilkeler mekanik anlayış sağladı. İşte bu tarama stratejisinin daha geniş bir uygulama sağlamak için, bir ilaç hedef çifti olarak Ruxolitinib ve JAK2 kullanarak, ek metodolojik ayrıntı sağlar.

<table><tbody><tr><td>Hücre ve Doku kültürü&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaF3 Hücreleri</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T hücreleri</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW</td><td>Ross Levine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C'den bir hediye. GW</td><td>Evde</td><td></td><td></td>üretilmiştir</tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F / L983F. GW</td><td>Evde</td><td></td><td></td>üretilmiştir</tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F / P58A. GW</td><td>Evde</td><td></td><td></td></tr> üretilmiştir <tr><td>pMSCV-V617F-Cherry.GW</td><td>Evde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>üretilmiştir pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW</td><td>Evde</td><td></td><td></td>üretilmiştir</tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW</td><td>Evde</td><td></td><td></td></tr> üretilmiştir <tr><td>pMSCV-Luciferase-puro.GW</td><td>Evde</td><td></td><td></td>üretilmiştir</tr><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Cellgro (corning)</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta biyolojik</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin EDTA 1X</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Cellgro (corning)</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco (yaşam teknolojileri)</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Protamin sülfat</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>5 mg/ml su stoğu</td></tr><tr><td>Tripan Mavisi çözeltisi (%0.4)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>INCB018424 (Ruxolitinib)</td><td>ChemieTeK</td><td>941678-49-5</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Roche</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>0.45 mikron disk filtre</td><td>PALL</td><td>2016-10</td><td></td></tr><tr><td>70 mikron naylon hücre süzgeci</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Bakteri Kültürü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XL-1 kırmızı E. coli hücreleri</td><td>Agilent Tech</td><td>200129</td><td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>New England Biolabs</td><td>B90920s</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>100 mg/ml stok çözeltisi&nbsp;</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Difco</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Müthiş et suyu</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Genemate</td><td>E-3119-500</td><td></td></tr><tr><td>Kitleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Kan ve doku kiti</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Uzun şablon PCR sistemini genişletin</td><td>Roche</td><td>1168134001</td><td></td></tr><tr><td>Sihirbazı Sv jel ve PCR temizleme sistemi</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Saf Verim plazmid mini hazırlama sistemi</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>pDONR 221 & ile Ağ Geçidi Teknolojili PCR Klonlama Sistemi OmniMAX 2 Yetkin Hücreler</td><td>İnvitrojen</td><td>12535029</td><td></td></tr><tr><td>Ağ Geçidi&nbsp; LR Klonaz Enzim karışımı&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791019</td><td></td></tr><tr><td>Fare reaktifleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vivo-Glo Luciferin in-vivo Sınıf</td><td>Promega</td><td>P1043</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc Lo-Dose u-100 insülin şırıngası 28 G1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Mortor havaneli</td><td>Coor tek & nbsp;</td><td>60316 ve 60317</td><td></td></tr><tr><td>Isoflorane (Isothesia TM)</td> <td>Butler Schien</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAPCO serisi 8000 WJ CO2 inkübatörü</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salıncak kovalı rotor santrifüjü 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-10 otomatik hücre sayacı</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td>Bu gerekli değildir, hücre sayımı için standart hemocytomemetr kullanılabilir</td></tr></tbody></table>

kinaz İnhibitörleri karşı dayanıklı mutasyonlarının tarama ve doğrulama için bir yöntem

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

Kronik miyeloid lösemi (KML) bir sürücü onkogen olarak BCR / ABL keşif aslında, etkin bir KML hastaları tedavi ile kanserlerde kinaz hedefleyen potansiyelini gösterdi, Imatinib, geliştirme sonuçlandı. Bu gözlem gibi EGFR, B-RAF, KIT ve PDGFRs, gibi çeşitli diğer maligniteler, karıştığı onkojenik kinazlar hedef ilaç geliştirme devrim. Ancak, anti-kinaz tedavilerin bir büyük dezavantajı hedef render ilaç direnci mutasyonlarının ortaya çıkması azalır veya ilaç için afinite kaybetmiş olmaktır. Gelecek nesil inhibitörleri gelişmekte yardımcı olur, aynı zamanda kişiselleştirilmiş ilaç kullanarak klinik yönetimi ivme verir sadece dirençli varyantları tarafından istihdam mekanizmaların anlaşılması. Biz yeni nesil BCR / ABL inhibitörleri gelişmekte yardımcı oldu BCR / ABL, mutasyonlar veren direnç spektrumunu belirlemek için bir retroviral vektör tabanlı tarama stratejisi bildirdi. Ruxoli kullanılmasıBir ilaç hedef çifti olarak tinib ve JAK2, burada JAK2 kinaz rastgele mutasyon kütüphane ifade fare BAF3 hücrelerini kullanan in vitro tarama yöntemleri açıklar.

Genetik mutasyonların ortaya çıkması hedeflenen anti-kinaz tedavisi için büyük sorun teşkil etmektedir. Mutasyon çalışmaları, seçimi ve yeni nesil ilaç geliştirme tasarım vesile olan mekanik ve fonksiyonel anlayışlar sağlamanın yanı sıra, aynı zamanda daha iyi klinik yönetimi sağlar ve gelecekte kişiselleştirilmiş tedavi için daha yararlı olabilir. Bu deneyde, JAK2 V617F-kinaz ruxolitinib direnç mutasyonları (Şekil 1) için tarama göstermektedir. Biz pMSCV-Kiraz-GW içine tam uzunlukta fare JAK2-V617FcDNA...

Kinaz inhibitörü tedavisi karşı genetik direnç ortaya çıkması etkili kanser tedavisi için önemli bir sorun teşkil etmektedir. Yeni geliştirilen ilacın karşı tanımlanması ve dirençli mutasyonların karakterizasyonu daha iyi klinik yönetim ve yeni nesil ilaç tasarımında yardımcı olur. Burada, in vitro tarama ve dirençli mutasyonların doğrulama için bizim protokol açıklar.

Kinaz İnhibitörleri Karşı Dayanıklı Mutasyonlarının Tarama ve Doğrulama için Bir Yöntem

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

Bu prosedürün genel amacı, ilaca dirençli mutasyonları tanımlamak ve doğrulamaktır. Bu, önce hedeflenen onkogenin rastgele bir mutasyon kütüphanesi oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adım, dirençli klonların ortaya çıkması için in vitro tarama yapmaktır.Prosedürün üçüncü adımı, dirençli mutasyonları tanımlamak için dirençli klonları sıralamaktır. Son adım, bölgeye yönelik mutajenez ve ardından in vitro ve in vivo tahliller kullanarak mutasyonları yeniden oluşturarak dirençli mutasyonları doğrulamaktır. Sonuç olarak, belirli bir ilaç hedef çiftine karşı klinik olarak anlamlı ilaca dirençli mutasyonlar tanımlanabilir.Bu tekniğin ENU veya PCR tabanlı yöntemler gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, tarafsız olması ve PCR tabanlı METAGENE SSIS'den farklı olarak, bunun herhangi bir genin onkogeninin boyutu veya GC içeriği ile sınırlı olmamasıdır. Genel olarak, bu tekniğe yeni olanlar, moleküler ve hücre biyolojisindeki bilgi eksikliği nedeniyle mücadele edeceklerdir. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir.Neogenez ve tarama basamaklarının öğrenilmesi zor olduğu için. Bunun nedeni, birçok insanın viral üretim, hücre kültürü ve yarı hücre ortamında deneyimsiz olmasıdır. Bu

a-method-for-screening-validation-resistant-mutations-against-kinase

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lösin Zengin Kinaz 2 tekrarlayın büyük bir multidomain kinaz, mutasyonlar olan Parkinson hastalığı, en sık rastlanan genetik nedenidir. Bu protein kinaz aktivitesinin analizi, biyoloji ve bu protein disfonksiyonu anlamada çok önemli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu...

LRRK2 Kinaz Aktivitesi Assaying In vitro</em

Klinik başlangıcından önce aşağıdaki ya da - - hedefli tedavilerin ilaç direnci yaygın ve direniş mekanizmaları tanımlamak için ihtiyaç alternatif klinik yönetim stratejileri rehberlik için kritik öneme sahiptir. Burada, bu mekanizmaların keşfini hızlandırmak için sıralama ile in vitro ilaca dirençli hatların çift türetme bir protokol mevcut.

Uygulanması<em&gt; İn Vitro</em&gt; İlaç Direnci Tahliller: Klinik İlgili Direnç Mekanizmaları ortaya çıkararak yönelik Potansiyeli maksimize

Protein fosforilasyonu, hücrelerin hücre dışı ortamlarındaki bilgileri nasıl yorumladığının ve ona nasıl yanıt verdiğinin merkezi bir özelliğidir. Burada, ilgilenilen bir substratı (substratları) fosforile eden kinazları hızlı bir şekilde tanımlamak için memeli hücrelerinden saflaştırılmış kinazları kullanan yüksek verimli bir tarama protokolü sunuyoruz.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik

Protein kinazlar, inter-ve intraselüler sinyal iletimi için kritik olan, oldukça gelişen sinyalleme enzimleri ve iskeletleridir. Radyoaktif işaretli adenosin trifosfatın ([γ- 32 P] ATP) kinaz aktivitesini ölçmek için bir protokol sunuyoruz, bu hücresel sinyal düzenlenmesinin aydınlatılmasına yardımcı olan güvenilir bir yöntemdir.

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Peptid rekabet testleri, çeşitli moleküler ve immünolojik deneylerde yaygın olarak kullanılır. Bu makale , in vitro oligopeptitle rekabet eden kinaz testi için ayrıntılı bir yöntem ve ilgili fosforilasyon sitelerini bulmak için yararlı olabilen ilişkili validasyon prosedürlerini açıklamaktadır.

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Burada, bir protokol sinyal yolları çeşitli hücresel modellerinde değişiklikler tanımlamak antikor diziler için mevcut. Uyuşturucu/hipoksi/ultra-violet ışık/radyasyon, veya overexpression/downregülasyon/altını gizleme, neden bu değişiklikleri çeşitli hastalık modelleri için önemlidir ve bir tedavi etkili olacak veya mekanizmaları ilaçların belirleyebilirsiniz olup olmadığını gösterir direnç.

Direnç Tirozin kinaz inhibitörleri sinyal iletim yollarının antikor dizileri tarafından bir sorgulama tarafından değerlendirilmesi

Burada, c-Fos ve Dusp1 genetik ve kimyasal doğrulama uyuşturucu hedef olarak tüp bebek ve içinde vivo genetik ve insanlaşmış fare modelleri kullanarak lösemi için iletişim kuralları açıklar. Bu yöntem, herhangi bir hedef için genetik doğrulama ve terapötik geliştirme için uygulanabilir.

C-Fos rolü ve Dusp1 onkogen bağımlılığı değerlendirme yöntemleri

Bu kağıt akış sitometresi-tabanlı bir tahlil kimyasal inhibitörleri ekran kitaplıklarına inhibitörleri ve T hücre reseptör sinyal etkileyen hedefleri tanımlaması için kullanır. Yöntem tanımlamak burada da yüksek üretilen iş gösterimleri için genişletilebilir.

T-hücre reseptör üzerinden tarama kimyasal inhibitörü kütüphanelerin sinyal arabulucu tanımlaması

Bu yazıda, içinde vitro kinaz assay, raf Co-aktivasyon tahlil ve tamamlayıcı Split Lusiferaz assay dahil raf aile kinazları, hastalık ile ilgili mutantlar karakterize için pratik ve uygulanabilir Yöntemler bir dizi sundu.

Bir dizi pratik ve uygulanabilir yöntem kullanarak RAF aile Kinazlarının hastalıkla ilgili mutantları karakterize etme

Kiaz inhibitörlerinin taranması için kendi kendine biraraya getirilen insan proteinmikrodizilerinin üretimi için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur.

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

Burada, doz yükseltme yaklaşımıyla kemodirençli hücreler üretmek için bir protokol sunuyoruz; ardından edinilmiş kemodirenç düzenleyicilerini belirlemek için epigenetik modifikatörleri hedefleyen odaklı bir sgRNA kütüphanesi kullanılarak CRISPR/Cas9 tabanlı bir ekran sunuluyor. Protokol ayrıca, kemodirençli hücre modellerine uyarlanmış çoklu optimizasyon noktaları sunar ve direnç mekanizmalarını araştıran araştırmacılar için sağlam bir çerçeve sunar.

Kemodirençli Hücrelerde Epigenom Genelinde CRISPR-Cas9 Tabanlı Knockout Screen'ler

Öğrenin, kinaz inhibitörlerine karşı ilaç dirençli mutasyonları tespit ve doğrulama yöntemini. Rastgele mutasyon kütüphanesi oluşturarak kanser tedavisinde direnç mekanizmalarını keşfedin.

Kinaz İnhibitörleri Karşı Dayanıklı Mutasyonlarının Tarama ve Doğrulama için Bir Yöntem

Daha fazla video keşfet