Kinaz İnhibitörleri Karşı Dayanıklı Mutasyonlarının Tarama ve Doğrulama için Bir Yöntem

Bu prosedürün genel amacı, ilaca dirençli mutasyonları tanımlamak ve doğrulamaktır. Bu, önce hedeflenen onkogenin rastgele bir mutasyon kütüphanesi oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adım, dirençli klonların ortaya çıkması için in vitro tarama yapmaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, dirençli mutasyonları tanımlamak için dirençli klonları sıralamaktır. Son adım, bölgeye yönelik mutajenez ve ardından in vitro ve in vivo tahliller kullanarak mutasyonları yeniden oluşturarak dirençli mutasyonları doğrulamaktır. Sonuç olarak, belirli bir ilaç hedef çiftine karşı klinik olarak anlamlı ilaca dirençli mutasyonlar tanımlanabilir.

Bu tekniğin ENU veya PCR tabanlı yöntemler gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, tarafsız olması ve PCR tabanlı METAGENE SSIS'den farklı olarak, bunun herhangi bir genin onkogeninin boyutu veya GC içeriği ile sınırlı olmamasıdır. Genel olarak, bu tekniğe yeni olanlar, moleküler ve hücre biyolojisindeki bilgi eksikliği nedeniyle mücadele edeceklerdir. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir.

Neogenez ve tarama basamaklarının öğrenilmesi zor olduğu için. Bunun nedeni, birçok insanın viral üretim, hücre kültürü ve yarı hücre ortamında deneyimsiz olmasıdır. Bu prosedür, XL bir kırmızı e coli hücresinin, JAK iki V 617 f'nin onkojenik bir izoformu olan bir plazmid ile dönüştürülmesiyle başlar, iki XL bir kırmızı e coli hücresi DNA onarım mekanizmalarında kusurludur, böylece replikasyon sırasında rastgele mutasyonları birleştirmelerine izin verir.

50 ila 100 nanogram plazmit DNA'yı önceden soğutulmuş bir polipropilen tüpte 100 mikrolitre yetkin hücre ile karıştırın. 100 nanogramdan fazla DNA kullanmayın çünkü dönüşüm verimliliğini azaltır. Buz üzerinde 30 dakika inkübe edin, iyi bir kütüphane kapsamı için her beş dakikada bir hafifçe döndürün.

Dört ila altı tüp yetkin hücre kullanın. Polipropilen tüpleri 45 saniyelik bir ısı şoku için 42 santigrat derecede bir su banyosuna daldırın ve ardından iki dakika buz üzerinde inkübe edin. Ardından, her tüpe bir mililitre SOC ortamı ekleyin.

90 dakika boyunca 225 ila 250 RPM'de çalkalarken tüpleri 37 santigrat derecede inkübe edin. Mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren dört adet 10 santimetre LB burgu plakası üzerindeki plaka hücreleri. Plakaları 16 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Koloniler göründüğünde, plakaları steril bir plaka kazıyıcı ile kazıyarak toplayın. Hücreleri her plakadan toplayın. Daha sonra, plazmit DNA, ticari bir plazmit ekstraksiyon kiti kullanılarak izole edilir ve kütüphanedeki mutasyonların heterojenliği, transfeksiyon plakasından bir gün önce, dört kez 10 ila altıncı HEK 2 93 T hücrelerine, %10 FCS, penisilin, streptomisin ve iki milimolar L-glutamin içeren DM EM'deki 100 milimetrelik tabaklara dizileme ile değerlendirilir.

Ertesi gün, her 100 milimetrelik çanak için transfeksiyon reaktiflerini hazırlayın. Beş mikrogram plazmit kütüphanesini, beş mikrogram retroviral ambalaj plazmidini ve 40 mikrolitre FU genini serum içermeyen DM E EM ortamı kullanarak toplam 400 mikrolitre hacme karıştırın. DNA ve lipit karışımını oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.

Daha sonra, HEK 2 93 T hücrelerinin ortamını taze ortamla değiştirin ve DNA lipid kompleksini hücrelerin üzerine damla damla ekleyin. Altı saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Altı saat sonra, transfeksiyon ortamını taze ortamla değiştirin ve plakaları virüs üretimi başına 37 santigrat derecede 48 saat boyunca inkübe edin.

48 saatlik inkübasyondan sonra, ilaca dirençli JAK iki V 607 F mutantının retroviral süpernatanlarla BAF üç hücresini taraması ve tanımlaması için prosedüre başlamak için 0.45 mikrometrelik bir acro disk filtreden süzülen viral süpernatanları toplayın. 100 milyon BAF üç hücresini 100 mililitre virüs süpernatant ile toplam 300 mililitre hacme %10 serum ve poli beyin içeren RPMI ortamı kullanarak karıştırın. Bu hücre ve virüs supernat karışımını, her bir kuyucuğu dört ila beş mililitre ile doldurarak birden fazla altı oyuklu plakaya dağıtın.

Plakaları 1, 250 GS'de 37 santigrat derecede 90 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, plakaları ertesi gün 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, her ilaç konsantrasyonu için dönüştürülen hücreleri bir araya getirin. 50 mililitrelik bir tüpte 10 mililitre hücreyi ruxolitinib ile karıştırın.

Bu örnekte test edilen ruxolitinib konsantrasyonları 1, 5, 2, 0.5 ve 10 mikromolardır. % 20 serum içeren RPMI kullanarak hacmi 40 mililitreye kadar çıkarın. Hücrelere 10 mililitre% 1.2 burgu ekleyin ve altı kuyucuklu plakada dikkatlice karıştırın.

Kuyu başına dört mililitre dağıtmak. Plakaları iki hafta boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Dirençli koloniler göründüğünde, kolonileri toplamak ve bunları ayrı ayrı alt kültürlemek için 0,2 mililitrelik pipet uçları kullanın.

Üç ila dört gün boyunca 24 oyuklu plakalarda, dirençli BAF üç hücresini, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 450 GS'de santrifüjleme ile hasat edin. Genomik DNA'yı ticari bir genomik, DNA ekstraksiyon kiti kullanarak izole ettikten sonra, genomik DNA'dan tam uzunlukta JAK iki CDNA'yı PCR ile çoğaltın. PCR ürünleri daha sonra Agar Rose'un jel elektroforezi ve 3.4 KİLOBAZ DNA bandı ile ayrılır.

JAK'ı temsil eden iki kaplama çerçevesi, ticari bir jel ekstraksiyon kiti kullanılarak izole edilir. Son olarak, kodlama dizisini kapsayan sekiz dahili primer kullanarak tam uzunlukta CDNA'yı sıralayın ve ilaca dirençli mutasyonları doğrulamak için ticari yazılım kullanarak dizileri analiz edin. İn vitro seçilen varyantlar, JAK iki V 617 F dizisinin bölgeye yönelik mutajenezi ile üretilir ve BAF üç hücresine yeniden verilir.

Plaka boyunca oyuklara ayrı ayrı çeşitli konsantrasyonlarda ruxolitinib içeren 50 mikrolitre ortam ekleyin, plaka 10 ila BAF üç JAK iki V 617 F hücresi 96 Kuyu plakasının her bir oyuğuna plakaları 37 santigrat derecede 60 saat inkübe edin Hücre canlılığını değerlendirmek için, her oyuğa 10 mikrolitre WST bir reaktif ekleyin ve iki ila dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir plaka okuyucu kullanarak absorbansı 450'de kaydedin. Tüm tahlilleri üç nüsha halinde gerçekleştirin ve ruxolitinib konsantrasyonlarına karşı ortalama absorbansı çizin.

Doğrusal olmayan bir eğri uydurma algoritması puanı kullanarak en uygun sigmoidal eğriyi gerçekleştirin. Hücresel IC 50 olarak% 50 hücre canlılığı ile sonuçlanan ilaç konsantrasyonu ve ardından dirençli mutasyonların in vivo validasyonu, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi gerçekleştirilir. Rastgele mutajenez ile üretilen dirençli hücre klonları birden fazla mutasyon taşıyabileceğinden, bu mutasyonların hem in vitro hem de in vivo deneylerle izole olarak doğrulanması gerekir.

İn vitro testte, seçilen varyantlar, JAK iki V 607 F dizisinin bölgeye yönelik mutajenezi ile üretildi ve daha sonra IC 50 değerlerini değerlendirmek için farklı ruksolitinib dozlarında hücre proliferasyon kabiliyeti için ölçülen BAF üç hücresine yeniden sokuldu. Ek olarak, fosfotirozin veya fosfo STAT beş için immüno-bloklama, herhangi bir hedef dışı aracılı direnci ekarte etmek için artan dozlarda ruksolitinib ile inkübe edilen BF üç hücresinin protein lizatları üzerinde gerçekleştirildi. Bu nedenle, daha yüksek ruksolitinib konsantrasyonlarında gelişmiş IC 50 değerleri ve kalıcı otomatik fosforilasyon sergileyen mutantların, in vivo direnci doğrulamak için ilaca dirençli varyantlar olduğu doğrulanmıştır.

BF, JAK'ı eksprese etmek için tasarlanmış üç hücre, iki V, altı 17 F varyantı ve lusiferaz kirazı farelere enjekte edildi ve daha sonra iki hafta boyunca ruksolitinib enjekte edildi. İki hafta sonra. Fareler lusiferaz katalizli biyolüminesans açısından görüntülendi, kemik iliğinde BAF üç kimerizm ve periferik kan akışı, kiraz pozitif hücrelerin floresansı ölçülerek değerlendirildi.

Sonuçlar, JAK iki V 607 F'yi eksprese eden farelerin ruksolitinib olduğunu, dirençli varyantların ise tedavi süresi boyunca biyolüminesansta ilerleyici artışlar gösterdiğini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, düzgün bir şekilde yapılırsa rastgele neogenez dört ila beş gün içinde gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, herhangi bir ilaç hedef çiftine karşı in vitro tarama için rastgele seçilmiş bir plazmit, DNA kütüphanesinin nasıl geliştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Retrovirüslerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu işlem yapılırken her zaman önlem alınacaktır.