Name: In vitro Metilasyona Tahlil Protein Arginin metilasyon Okuyacak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Öğrenin in vitro metilasyon analizi ile PRMT substratlarının metilasyon durumunu belirlemeyi. Bu hassas yöntem, protein arjinin metilasyonunu ve hücresel süreçleri incelemek için etkili bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Gazi İşleri US Department Merit Ödülü tarafından desteklenen ve bir NIH RW için R01CA138528 hibe edildi.

Tanım yapılarından oluşan 1. Hazırlık <ol><li> Protokolü başlamadan önce, bir N-terminal epitop (Myc veya HA) ve bakteriyel bir hücreden yüksek düzeyde protein ekspresyonu ve saflaştırılması için alt-tabaka çerçeve-içi glutation-S-transferaz (GST) ile bir memeli ifade vektörlerine klonlanabilir PRMTs Standart moleküler biyolojik teknikler kullanılarak lizatlarının. </li></ol> PRMTs 2. saflaştırılması <ol><li> İnsan bronş epitel hücrelerinin (Beas2B) sağlamak için, 100 mm kültür kaplarına kullanın. Passage hücreler her 3 gün ve onları izdiham büyümeye izin vermeyin. </li><li> Transfeksiyondan bir önceki gün, 100 mm kültür çanağı içinde 10 ml kültür ortamı içinde 7.5 x 10 5 hücre tohum. Girdap hücreler eşit olarak dağıtmak, ve 5% CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde 37 ° C&#39;de inkübe etmek. </li><li> Ertesi gün, medya aspire ve serum ve antibiyotik olmadan kültür ortamı 5 ml ekleyin. Girdap ve orta aspire. Bu adımı tekrarlayın biridaha fazla zaman, ve son olarak da, serum / antibiyotik içermeyen ortamdan 5 ml ilave edilir ve transfeksiyondan devam edin. </li><li> Steril 1.5 ml&#39;lik plastik bir santrifüj tüpüne, serum barındırmayan ortam içinde 750 ul plazmit DNA&#39;nın 6 ug seyreltin. </li><li> Başka bir 1.5 ml&#39;lik plastik bir santrifüj tüpü, serum barındırmayan ortam içinde 750 ul transfeksiyon tepkin maddesi 30 ul seyreltin. </li><li> Seyreltilmiş DNA (aşama 2.4) içeren tüp seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi çözeltisi (adım 2.5) aktarın. Pipetleme ve birkaç kez yavaşça karıştırın. </li><li> 15 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin transfeksiyon karışımı. </li><li> 15 dakika sonra, hücreler üzerine yavaşça transfeksiyon karışımı pipetle, girdap eşit karıştırın ve 5% CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde 37 ° C&#39;de inkübe etmek. </li><li> 3 saat sonra hücreler transfeksiyon karışımları içeren ortamın aspire. Serum ve antibiyotik ile desteklenmiş taze hücre kültür ortamı ilave edin. </li><li> % 5 nemlendirilmiş CO2 içinde 37 ° C&#39;de inkübe48 saat boyunca kuluçka makinesi. </li><li> 48 saat sonra liziz tamponu 1 ml hücreler lize edildi (1 x fosfat tamponlu tuzlu su,% 1 Nonidet P-40,% 0.5 sodyum deoksikolat,% 0.1 sodyum dodesil sülfat ve 1 ug / ml fenilmetil sülfonil fluorür). Hücre kaldırıcı plastik bir santrifüj tüpüne lisatlan toplayın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe lizatları. </li><li> Hücre lizatları artıklardan temizlemek için bir masaüstü santrifüj ile 10 dakika boyunca 15,000 x g&#39;de santrifüjleyin lizatları. [* Oldukça metilasyon analizi için enzimlerin saflaştırılması geçmeden önce bir anti-HA antikorlarına birleştirilmesi ile lizatları, bir alikotunun imünoblotlama ile HA-PRMT1 ekspresyonunu doğrulamak için tavsiye edilir.] </li><li> PRMTs saflaştırılması için, fosfat tamponlu tuzlu su içinde bir anti-HA afinite matrisi 50:50 süspansiyonu 30 ul (PBS) ile hücre lizatlarının 3 mg inkübe ve bir tüp rotatör içinde 4 ° C&#39;de gece boyunca döner. </li><li> Bir sonraki gün, toplamak için 2 dakika boyunca bir tezgah üstü santrifüj ile 14,000 x g&#39;de tüpler dönmeyeboncuklar. Süpernatant atılır ve 2 için 14,000 x g&#39;de santrifüj ile yıkaması ve ardından taneler [20 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCI, 5 mM EDTA ve% 1 Triton X-100] her RIPA tamponunda, 1 ml ile 3 kez yıkayın Min. Üçüncü yıkamadan sonra, metilasyona tamponu ile bir kez 100 ul boncuk yıkama (50 mM Tris pH 8.5, 20 mM KCI, 10 mM MgCI2, 1 mM β-merkaptoetanol, 100 mM sükroz). Santrifüj işleminden sonra, süpernatant kaldırmak. Hareketsizleştirilmiş PRMTs ihtiva eden haplar, metilasyon deneyinde kullanılmak üzere hazırdır. [* Oldukça metilasyon tahlilde hemen hareketsiz PRMTs kullanmanız tavsiye edilir.] </li></ol> Yüzey 3. saflaştırılması <ol><li> GST-G3BP1 tek bir koloni 100 ug / ml ampisilin içeren Luria-Bertani (LB) aracı maddesinde 5 ml BL21 transforme inoküle. 250 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de bir gece boyunca kültürler büyütün. </li><li> Bir sonraki gün, taze LB aracı ve Kontrol 50 ml kültür, gece boyunca aktarmainue (yaklaşık 2 saat sürer) bir OD 0,5-0,7 600 büyümeye. </li><li> OD 600 0,5-0,7 ulaştığında, 250 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de ek bir 4 saat daha kültüre 1 mM nihai konsantrasyona kadar izopropil-β-D-tiyogalaktozid (IPTG) ekleyin ve devam edin. </li><li> 10 dakika boyunca 1500 x g&#39;de santrifüj ile hücreler hasat ve -80 ° C &#39;de GST saflaştırılması veya deposu için pelet işler. </li><li> Liziz tamponu, 5 ml bakteriyel pelet yeniden askıya (proteaz inhibitörleri, lizozim, 100 ug / ml ile 1 x PBS&#39;de% 0.1 Triton X-100) ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe lizatları. Bu zamanda bakteriyel lizatlar genomik DNA&#39;nın serbest bırakılması için bulanık ve yapışkan görünür. </li><li> Sonikasyon ile genomik DNA (1 sn% 30 lik bir genlik ile her biri 10 palslarının) kayma. </li><li> 10 dakika boyunca 15,000 x g&#39;de santrifüj ile lizatları temizleyin ve 15 ml&#39;lik bir tüp için berrak bir aktif madde aktarın. Süpernatant değil temizse Santrifüj tekrarlayıngasyon süreci bir kez daha. </li><li> Bununla birlikte, buz gibi soğuk PBS ile iki kez GST-sefaroz boncuklar yıkama ve PBS GST-sefarozun 50:50 süspansiyon elde etmek. Temizlenmiş, bakteri hücre lizat GST-sefaroz süspansiyonu 200 ul ilave edin ve 1 saat boyunca 4 ° C &#39;de döner. </li><li> 1 saat sonra, boncuk toplamak için 3 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüj tüpleri. Boncuklar buz gibi soğuk PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> Son yıkamadan sonra, elüsyon tamponu (50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCI, 30 mM glutatyon) 100 ul boncuk tekrar süspansiyon ve 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de döner. </li><li> 2 dakika boyunca 15,000 x g&#39;de santrifüj tüpleri ve başka bir plastik bir santrifüj tüpü içine, saflaştırılmış proteini ihtiva eden üst sıvıyı aktarır. Saflaştırılmış protein konsantrasyonunu tahmin etmek için, sığır serumu albümini (BSA) ile birlikte bilinen miktarlarda saflaştırılmış proteinin 5 ul SDS poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile analiz gerçekleştirmek. </li></ol> 4. Metilasyon Deneyi NOT: radyoizotop çalışmaları ve radyoaktif izotoplar ile deneyler üzerinde kurumun protokolleri ile uyumlu belirlenmiş ayrı bir alanda aşağıdaki adımları uygulayın. <ol><li> Saflaştırılmış GST-alt-tabaka ve metilasyon 1x tamponu (50 mM Tris, pH 8.5, 20 mM KCI, 10 mM MgCI2, 1 mM β-merkaptoetanol, 100 mM sükroz), 1 uCi ihtiva eden bir ana karışımı 2 ug ekleyin, S-adenosil L-[metil-3H] metionin ve su hareketsizleştirilmiş PRMTs (aşama 2.13) ile 10 ul bir son hacme ve 1 saat boyunca 30 ° C&#39;de reaksiyonu inkübe edin. </li><li> 1 saat sonra, 2 x SDS örnek tampon maddesi 10 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun. 10 dakika boyunca 95 ° C&#39;de numunelerin bozunmasından sonra, bir SDS-PAGE jeli üzerinde örnekleri ayırın. </li><li> Daha sonra, yarı-kuru elektroforetik transferi ile nitroselüloz zarı üzerine SDS jelden ayrılan proteinlerin aktarın. </li><li> Aktarımından sonra, bir ile membran kapakutofluor (bir oto radyografik görüntü yoğunlaştırıcı), yavaşça, oda sıcaklığında 2 saat boyunca sallayın. 2 saat sonra, autofluor kapalı dökün ve daha sonra kullanmak üzere saklayın. [* Radyoaktif malzeme olarak tüp Etiket] </li><li> Çabuk hava bir filtre kağıdı üzerinde kuru zar, bir plastik torba içinde sızdırmaz hale getirir ve -20 ° C&#39;de X-ışını filmine maruz membran. Yeterli pozlama süresi 5-30 gün arasında değişmektedir. </li></ol> PRMT İfade ve Yüzey Eşit Yükleniyor 5. Onayı <ol><li> Yeterli maruz elde edildikten sonra, bloke etme tampon içeren plastik bir kutu [Tween-20 (TBST +% 3 yağsız süt), Tris-tamponlanmış tuzlu su] için zarı transferi ve yavaşça 1 saat boyunca sallayın. </li><li> Radyoaktif atık olarak engelleme tampon atın. 4 ° C&#39;de gece boyunca TBST içinde (1000 sulandırma 1) bir anti-HA antikoru ile membran inkübe Hafifçe çalkalanarak ° C olarak ölçülmüştür. </li><li> TBST ile 3x zarın yıkanması ve HRP-işaretli anti-fare ikincil antikoru ile membran inkübeHafifçe çalkalanarak 1 saat boyunca oda sıcaklığında TBST (1 5000 seyreltme). </li><li> 1 saat sonra, TBST&#39;dir 3x zarın yıkanması ve bir HRP alt-tabaka ile kimyasal parlama proteinlerin tespiti gerçekleştirmek. </li><li> HA-etiketli PRMTs saptandıktan sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca Ponseau-S boyama solüsyonu ile membran inkübe edin. Hızlı GST etiketli substratlar tespit etmek için su ile zar 3 kez yıkayın. Görüntüyü tarayın. </li></ol>

<ol><li>Paik, W. K., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+methylase+I.+Purification+and+properties+of+the+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme.</a> J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).</li>
<li>Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+immediate-early+TIS21+protein+and+the+leukemia-associated+BTG1+protein+interact+with+a+protein-arginine+N-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase.</a> J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).</li>
<li>Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+NG%2C+NG%2C-dimethylarginine+in+nuclear+protein+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions.</a> Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).</li>
<li>Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation at a glance.</a> J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).</li>
<li>Lee, Y. H., Stallcup, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+protein+arginine+methylation+of+nonhistone+proteins+in+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.</a> Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).</li>
<li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+mammals%3A+who%2C+what%2C+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Mol Cell. 33, 1-13 (2009).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dishevelled3+is+a+novel+arginine+methyl+transferase+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate.</a> Scientific reports. 2, 805(2012).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+of+G3BP1+in+response+to+Wnt3a+regulates+%7Bbeta%7D-catenin+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA.</a> J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt3a-stimulated+LRP6+phosphorylation+is+dependent+upon+arginine+methylation+of+G3BP2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2.</a> J Cell Sci. , (2012).</li>
<li>Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+arginine+methylation+in+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of arginine methylation in transcription.</a> Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).</li>
<li>Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques in protein methylation.</a> Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).</li>
<li>Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+applied+to+the+study+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods applied to the study of protein arginine methylation.</a> Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).</li>
<li>Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+protein+arginine+methyltransferase+7+%28PRMT7%29+is+a+type+III+enzyme+forming+omega-NG-monomethylated+arginine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues.</a> J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada tarif edilen protokol rutin olarak tespit PRMT substratların metilasyon durumunu belirlemek için kullanılır. Bu sağlam ve tutarlı bir tahlil de kendi alt tabakalar için PRMTs spesifıtesine kesin kanıt sağlayacaktır. Bu deneyde başarısı için anahtar bileşenleri şunlardır: Memeli hücrelerinde PRMTs 1. ekspresyonu arıtılmış PRMTs 2. Aktivite, 3. ekspresyonu ve alt-tabaka saflaştırılması ve nitroselüloz zara 4. Tam proteinlerin western transfer. Rekombinant ifade PRMTs ve bakteriler safla...

Protein metilasyonu ilk kez 1968 1 yılında tanımlanmıştır. Araştırmacılar 2 Bu post-translasyonel modifikasyon önemini takdir başladı, 1996 yılında PRMT1 ilk klonlanması kadar değildi. İlginç bir şekilde, nükleer özler proteinlerinin arginin kalıntısının yaklaşık% 2, bu değişiklik gösteren bolluğu, 3, metile edilir. Arginin olabilir arginin yan zincirleri içinde bir bazik yan zincire ve nitrojen / s olan, pozitif yüklü bir amino asit olup, çeviri sonrası bir metil grubu, arginin metilasyon 4-6 olarak bilinen bir süreç eklenmesi ile değiştirilmiş. Arginin metilasyon enzim yani bir sınıf ile katalize edilmektedir. Protein arjinin metil transferaz (PRMTs). Mono-ya da dimetile arjinin ve ikincisi işlemi 4-6 katalize PRMTs türüne bağlı olarak simetrik veya asimetrik olabilir halinde olabilir. Arginin gösterilecek ProteinlerE-glisin bakımından zengin motifleri PRMT aracılığıyla meydana gelen katalizler için potansiyel hedeflerdir. Substratların PRMT aracılı metilasyon normal hücresel homeostaz 7-9 için çok önemli olan, her biri, protein-protein etkileşimi, protein-nükleik asit etkileşimi, proteinin, fonksiyon, gen ekspresyonunu, ve / veya hücresel sinyal modüle ettiği gösterilmiştir. Protein arginin metilasyon biyolojik rolünü anlamak için, kesin etkili ve yeniden üretilebilir bir deneyler tespit PRMT substratların metilasyon durumunu oluşturmak için gereklidir. Substratlannın metilasyonunu katalize etmek üzere saflaştırılmıştır PRMTs yeteneklerini değerlendirir nitro metilasyon tahlilinde, arginin, metilasyon 10-12 araştırılması için kabul edilen bir testtir. Bu deneyin genel başarısı büyük oranda saflaştırılmış PRMTs aktivitesine bağlıdır. PRMTs ifade bakteri ya da memeli hücrelerinden 10,11 saflaştırılabilir. D Bu in vitro deney, metilasyon,Protokol bölümünde etailed, orjinal Tini ve arkadaşları 10 tarafından tarif edilen bir yönteme dayanmaktadır. Bu protokol, detaylı olarak, memeli hücrelerinde PRMT1 ekspresyonu ve saflaştırılması yer alan adımları göstermektedir. Protein bağlayıcı protein 1 (G3BP1), bilinen PRMT alt-tabaka 8, ras-GTPaz aktive edici ile metilasyonu katalizleme saflaştırılmış PRMT1 kabiliyeti daha olarak S-adenosil-L-[metil-3H] Metioninin varlığında değerlendirildi metil donör. Bu analizi kullanarak, güvenilir bir şekilde bir protein arginin metilasyon çalışmada temel bir adımdır metilat roman ya da bilinen alt-tabakalar için, PRMTs yeteneklerini tanımlayabilir.

<table><tbody><tr><td>S-adenosil-L- [metil-3H] metiyonin</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint ultra&nbsp;</td><td>Ulusal Teşhis</td><td>LS-270</td><td></td></tr><tr><td>Şişe üstü dağıtıcı</td><td>Ulusal Teşhis</td><td>LS-900</td><td></td></tr><tr><td>AutoFluor</td><td>Ulusal Teşhis</td><td>LS-315</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Sintilasyon Şişeleri</td><td>Ulusal Teşhis</td><td>SKU: SVC-06</td><td></td></tr><tr><td>GST-sefaroz</td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutatyon Azaltılmış</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin</td><td>İnvitrojen</td><td></td><td>Transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Beas2B</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>US-Biologicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-HA afinite matrisi</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad jel doc</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-HA antikoru</td><td>roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponseau S</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro metilasyona tahlil protein arginin metilasyon okuyacak

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginin metilasyon çekirdeğinde en bol post-translasyonel modifikasyonlar biridir. Protein arginin metilasyon tespit ve / veya proteomik yaklaşımlar ile belirlenir, ve / ya da metil-arginin özel antikorlar ile immunoblotting edilebilir. Ancak, bu teknikler bazen yanıltıcı olabilir ve sık sık yanlış pozitif sonuçlar vermektedir. En önemlisi, bu teknikler, metilasyon deneyler, diğer yandan, hassas olan yararlı biyokimyasal deneyler, in vitro olarak. PRMT substrat spesifikliği desteklemek için doğrudan bir kanıt sağlayamaz ve tanımlanan proteinlerin gerçekte PRMT alt-tabakalar ise sürekli olarak ortaya koymaktadır. Tipik olarak in vitro deney, metilasyon, saflaştırılmış aktif PRMTs saflaştırılmış alt-tabaka ve bir radyo-izotop işaretli metil donörü (S-adenosil-L-[metil-3H] metionin) içerir. Burada katalitik olarak aktif PRMT1 bir yerde ifade PRMT aile üyesi izole edilmesi için bir adım adım protokol açıklar. BeniSaflaştırılmış PRMT1 arasında methyl transferaz aktiviteleri daha sonra S-adenosil-L-metil donörü [metil-3H] Metioninin varlığında, protein 1 (G3BP1) bağlayıcı bir Ras-GTPaz aktive edici protein, bilinen bir PRMT alt-tabaka test edilmiştir. Bu protokol, yeni fizyolojik PRMT1 substratların metilasyon durumunu oluşturulması için değil, aynı zamanda protein arginin metilasyon temel mekanizmasını anlamak için sadece kullanılabilecektir.

<html> GST-G3BP1 metillenmesi HA PRMT1 ait özellikler, bir in vitro deneyi ile metilasyon belirlenmiştir. Beas2B hücre lizatlarından arıtıldı HA-etiketli PRMT1 GST-G3BP1 ihtiva eden bir metilasyon reaksiyonunda kullanılmıştır ve bir metil vericisi olarak S-adenosil-L-[metil-3H] metionin 1 uCi. PRMT1 etkili bir GST-G3BP1 (Şekil 1, üst panel) metilasyonunu katalize olabilir. Negatif kontrol (Şekil 1, üst panel, kuşak 1) olarak görev yapan, boş vektör transfekte Beas2B h...

Protein arginin metilasyonu, diğer bir deyişle, enzimler sınıfı tarafından katalizlenmektedir. Protein arjinin metil transferaz (PRMTs), proteinler içindeki arginines metil grup (lar) ilave enzimatik işlemidir. In vitro deney, metilasyon, bilinen veya yeni PRMT substratların metilasyon durumunu değerlendirmek için en güvenilir bir araçtır.

In vitro Metilasyona Tahlil Protein Arginin metilasyon Okuyacak

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Bu prosedürün genel amacı, protein arginin, metil transferaz veya PRMT substratlarının metilasyon durumunu belirlemektir. Bu, ilk olarak memeli hücrelerinde epitop etiketli PRT'lerin eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. P RMT'ler daha sonra anti hemaglutinin veya anti HA kaplı SRO hızları kullanılarak hücre lizatlarından immüno-çökeltilir, ardından spesifik olarak bağlı olmayan proteinleri çıkarmak için kapsamlı bir yıkama yapılır.Daha sonra, yıkanan boncuklar, bakterilerden saflaştırılmış substrat proteini ve trityum etiketli salyangoz L, metiyonin veya sam ile inkübe edilir. Son olarak, reaksiyon durdurulur ve substratın metilasyon durumu, sodyum sil sülfat, poli akrilamid jel elektroforezi veya SDS sayfa analizi ve ardından oto radyografi yoluyla belirlenir. Sonuç olarak, p RMT'lerin substratı metilleme yeteneği, boş vektör ve BRMT transfekte edilmiş hücrelerin lizatları üzerinde gerçekleştirilen immünopresipitasyon kullanılarak metilasyon reaksiyonlarının karşılaştırılmasıyla belirlenir.Proteomik yaklaşımlar veya metil arginin spesifik antikorlarla immünoblotlama bazen yanıltıcı olabilir ve genellikle yanlış posta sonuçları sağlar. En önemlisi, PRMT substrat özgüllüğünü destekleyen doğrudan bir kanıt sağlayamazlar. Bu videoda göstereceğim in vitro metilasyon testinin ana avantajı, hassas olması ve PRMT'nin substratlarının bulunduğu tanımlanan proteinlerin transfeksiyondan bir gün önce 10 mililitre kültür ortamında 750.000 insan bronşiyal epitel hücresine tohum atıp atmadığını tutarlı bir şekilde ortaya çıkarmasıdır.100 milimetrelik bir kültür kabında, hücreleri eşit şekilde dağıtmak için çanağı döndürün ve %5 nemlendirilmiş CO2 inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün ortamı aspire edin ve serum ve antibiyotik içermeyen beş mililitre kültür ortamı ekleyin, ortamı döndürün ve aspire edin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın ve son olarak beş mililitre serum antibiyotik içermeyen ortam ekleyin ve transfeksiyona devam edin.Transfeksiyonu gerçekleştirmek için, önce altı mikrogram PRMT plazmid DNA'sını steril bir 1.5 mililitre plastik santrifüj tüpünde, başka bir 1.5 mililitre plastik santrifüj tüpünde 750 mikrolitre serum serbest ortama seyreltin. 30 mikrolitre transfeksiyon reaktifini 750 mikrolitre serum içermeyen ortama seyreltin. Daha sonra seyreltilmiş transfeksiyon reaktif çözeltisini, birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırılmış seyreltilmiş DNA içeren tüpe aktarın.Transfeksiyon karışımını oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Ardından, transfeksiyon karışımını hücrelere nazikçe pipetleyin ve eşit şekilde karıştırmak için döndürün. 37 santigrat derecede üç saatlik bir inkübasyondan sonra, transfeksiyon karışımlarını içeren ortamı hücrelerden aspire edin.Daha sonra serum ve antibiyotiklerle takviye edilmiş taze hücre kültürü ortamı ekleyin. 37 santigrat derecede 48 saatlik bir inkübasyonun ardından, bir mililitre lizis tamponunda liz hücreleri. Lizatları bir hücre kaldırıcı ile plastik bir santrifüj tüpüne toplayın.Daha sonra lizatları 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. Sonra, santrifüj. Tezgah üstü santrifüjde 10 dakika boyunca 15.000 GS'de lizatlar.P mts'nin saflaştırılması için lizatları hücre kalıntılarından temizlemek için. Fosfat tamponlu salin içinde 30 mikrolitre 50 ila 50 anti HA afinite matrisi süspansiyonu ile üç miligram hücre lizatını inkübe edin. Veya PBS, bir tüp döndürücüde gece boyunca dört santigrat derecede döner.Ertesi gün, boncukları toplamak için tüpleri 14.000 GS'de bir tezgah üstü santrifüjde iki dakika döndürün. Talaşı attıktan sonra, boncukları bir mililitre RIPA tamponu ile yıkayın ve ardından daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. Boncukları RIPA tamponu ile üç kez yıkadıktan sonra, boncukları 100 mikrolitre metilasyon tamponu ile bir kez yıkayın.Santrifüjlemeden sonra süpernatanı çıkarın. İmmobilize edilmiş p RMT'leri içeren boncuklar, metilasyon testinde kullanılmaya hazırdır. Metilasyon testini radyoizotop için belirlenmiş ayrı bir alanda gerçekleştirin.Kurumun radyoaktif izotoplarla çalışma protokollerine uygun olarak çalışın. Metin protokolünde açıklandığı gibi saflaştırılmış glutatyon, s transferaz veya GST substratını hazırlayın. İki mikrogramı, bir x metilasyon tamponu ve tridiyum etiketli salyangoz L metiyoninin mikro curie içeren bir ana karışımla birleştirin.Karışımı hareketsiz hale getirilmiş p RMT'lere ekleyin ve 30 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Bir saat sonra, 10 mikrolitre iki XSD ekleyerek reaksiyonu durdurun. Numunelerin 95 santigrat derecede 10 dakika boyunca denatüre edilmesinin ardından numune tamponu.Örnekleri daha sonra SDS sayfasına göre ayırın. Ayrılan proteinleri SDS jelinden yarı kuru bir elektroforetik transfer kullanarak bir nitroselüloz membran üzerine aktarın. Transferden sonra, zarı otomatik radyografik bir görüntü ile kaplayın.Yoğunlaştırıcı ve oda sıcaklığında iki saat boyunca hafifçe sallayın İki saat sonra, yoğunlaştırıcıyı dökün ve daha sonra kullanmak üzere saklayın. Membranı bir filtre kağıdı üzerinde hızlı bir şekilde havayla kurutun, plastik bir torbaya koyun ve membranı eksi 20 santigrat derecede bir x-ışını filmine maruz bırakın. Yeterli maruz kalma süreleri beş ila 30 gün arasında değişir.Yeterli pozlama elde ettikten sonra, membranı bloke edici tampon içeren plastik bir kutuya aktarın ve bir saat boyunca hafifçe sallayın. Engelleme tamponunu radyoaktif atık olarak atın. Daha sonra zarı T tris'te anti HA antikoru ile inkübe edin, tween 20 ile tamponlanmış salin, TBST gece boyunca dört santigrat derecede kısaltın ve ertesi gün hafifçe sallayın.Membranı TBST ile üç kez yıkayın. Daha sonra zarı, hafif sallama ile oda sıcaklığında bir saat boyunca TBST'de at turpu peroksidaz etiketli anti fare ikincil antikoru ile inkübe edin. Membranı TBST ile üç kez yıkadıktan sonra, HA etiketi P RMT'lerin tespitinden sonra yaban turpu peroksidaz substratı ile proteinlerin kemilüminesans tespitini gerçekleştirin.Membranı panço S boyama solüsyonu ile beş dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında, görüntüyü taramadan önce zarı üç kez suyla hızlı bir şekilde yıkayın. GST etiketli substratları tespit etmek için, HA etiketi PMT'nin GST etiketi G üç PP'nin bir metilleme yetenekleri, bir in vitro metilasyon testi ile belirlendi.HA TAG prm T, B2B hücresinden saflaştırılmıştır. Lizatlar, GSTG üç, BP bir ve trityum etiketli salyangoz L metiyoninin bir mikro köri içeren bir metilasyon reaksiyonunda kullanıldı. Bir metil donörü olarak, p MT, boş vektörün lizatları üzerinde gerçekleştirilen aşağı çekme işlemlerini kullanarak GS TG üç BP bir metilasyon reaksiyonunun metilasyonunu verimli bir şekilde katalize edebilir.Transfekte edilmiş B2B hücreleri negatif kontrol görevi gördü. Anti HA antikorları ile immünoblotlama, p rmt ekspresyonunu doğruladı. Daha sonra her iki reaksiyonda da biri olmak üzere GSTG, üç BP'nin eşit yüklenmesini göstermek için bir panço boyaması kullanıldı.Bu videoyu izledikten sonra, in vitro metilasyon testinin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

in-vitro-methylation-assay-to-study-protein-arginine-methylation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol hazırlanması için sentetik bir tRNA substrat...

Entamoeba histolytica DNA ve tRNA Metiltransferaz Dnmt2 (Ehmeth) Enzim ile in vitro tRNA Metilasyon Testi

Burada, sentetik veya in vitro transkripsiyonu RNA üzerinde metiltransferaz aktivitesinin doğrudan analizi için antikor içermeyen bir in vitro tahlil açıklanmıştır.

RNA metiltransferaz aktivite analizi için Antibody Içermeyen tahlil

Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, çoklu biyolojik yolları düzenleyen geniş çaplı bir translasyonel sonrası modifikasyondur. Kütle spektrometresi, modifiye peptid zenginleştirme için biyokimyasal yaklaşımlarla birleştirildiğinde, R-metil-proteomun küresel profilini çıkarmak için en iyi teknolojidir. İnsan hücrelerinde küresel R-metilasyonun yüksek güvenilirlikle tanımlanması için tasarlanan iş akışı burada açıklanmaktadır.

Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

Bu protokoller, protein arginin metiltransfenaz (PRMT) ailesinin bireysel üyelerinin hücrelerdeki enzymatic aktivitesini değerlendirmek için kullanılan metodolojiyi sağlar. Prmt aktivitesinin endojen ve eksojen biyobelirteçler kullanılarak değerlendirilmesi, metil-arginin tanıma antikorları ve inhibitör takım bileşikleri ile ilgili ayrıntılı yönergeler açıklanmıştır.

Hücrelerde Protein Arginin Metiltransfenaz 1-9 Aktivitesini Incelemek için Nicel Yöntemler

Bu protokol, serbest ve proteine bağlı arginin ve metil-argininlerin 1H-NMR spektroskopisi ile hazırlanmasını ve kantitatif ölçümünü açıklamaktadır.

Arginin Metilomunun Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Araştırılması

Edimsel koşullanma paradigması kullanarak rasgele nokta kinematograms ve bilgisayar tarafından oluşturulan omurgasızlar video oynatma kullanan bir kertenkele görsel duyarlılık testi.

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Basma, bitki ve memeli üreme bir olgudur. DNA metilasyon, imprinting mekanizmaları önemli bir rol oynar. Endosperm Yalıtımlı ve baskılı genlerinin metilasyon durumunun...

Baskılı Genler DNA metilasyon Belirlenmesi Arabidopsis Endosperm

Test protein-protein etkileşim protein işlevsellik diseksiyon için vazgeçilmezdir. Burada, bir...

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em

DNA metilasyon analizi için altın standart bisülfit dönüştürülen DNA genom dizileri. Bu yöntem, asidik koşullar altında deaminasyon bisülfit 5-methylcytosine (5-MEC) ile karşılaştırıldığında sitozin artan duyarlılık yararlanır. Unmethylated cytosines hedef genomik DNA PCR sonra metil cytosines ayırt edilebilir.

DNA Metilasyonu: bisülfit modifikasyonu ve Analiz

Bu makalede, basit, kantitatif, sıvı faz afinitesi yakalama deneyi sunulmuştur. Bu bir yandan, diğer tarafta etiketli protein ve ikinci, etiketli protein (örn. poliovirus) arasındaki yakınlığı manyetik boncuk ve etiketli proteinlerin (örneğin nanobodies) arasındaki etkileşime dayanan güvenilir bir tekniktir.

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

Öğrenin in vitro metilasyon analizi ile PRMT substratlarının metilasyon durumunu belirlemeyi. Bu hassas yöntem, protein arjinin metilasyonunu ve hücresel süreçleri incelemek için etkili bir araçtır.

In vitro Metilasyona Tahlil Protein Arginin metilasyon Okuyacak

Daha fazla video keşfet