Name: Yumuşak Agar koloni formasyon deneyi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Öğrenin yumuşak agar koloni formasyon deneyi ile hücrelerin bağlanma bağımsız büyümesini kantitatif olarak değerlendirin. Bu yöntem, dönüşmüş hücrelerin tümör oluşturma potansiyelini ve tümör baskılayıcı proteinlerin etkilerini belirlemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, ABD Gazi İşleri Bakanlığı'ndan bir Başarı Ödülü ve RW'ye R01CA1385282522717 bir NIH hibesi ile desteklenmiştir.

Materyaller ve Reaktifler 1. hazırlanması <ol><li> Etiket, bir doku kültürü içinde her bir oyuğa her bir hücre hattı veya bir durum için uygun bir 6-yuvalı plaka tedavi araştırılmaktadır. </li><li> Toz ortamın 1 g ve 50 ml lik bir son hacme kadar deiyonize su içinde bir sodyum bikarbonat, 0.2 g çözülmesiyle 2x hücre kültürü ortamı hazırlayın. </li><li> Sterilize etmek için bir 0.2 mikron filtre içinden bu orta geçirin. </li><li> Ilgi konusu hücre çizgisinin normal kültür için gerekli ek bileşenler ekleyin. Örneğin,% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin solüsyonu ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamı içinde CMT 167 hücre çizgisi büyür. Kullanmak için sıcak su banyosu içinde 37 ° C&#39;ye ısınmaya orta önce. </li><li> Eğer söz konusu hücre çizgisinin, normal hücre kültürü için olduğu gibi ayrı ayrı 1x hücre kültür ortamı hazırlayın. </li><li> Deiyonize su asil agar 100 ml 1 g ekleyerek% 1 asil agar hazırlayın. NOT: Noble Agar yalnız ajitasyon tamamen çözülür olmaz. </li><li> Hazırlamak% 0.6 deiyonize edilmiş su, 100 ml ağarla 0.6 g eklenerek ağarla. Her iki agar solüsyonları, uzun süreli depolama için kapatılabilir bir kapak 100 ml bir cam şişe içinde yapılabilir. </li><li> Sterilize etmek asil agar karışımları otoklavlayın. Bu karışımlar, önceden yapılmış ve 4 ° C&#39;de saklandı, ancak, agar tamamen çözülene kadar Deney zamanında yeniden ısıtılması gerekmektedir edilebilir. </li><li> 1000 ml nihai hacme kadar H2O PO 4 HPO 4 1x PBS (8 gr NaCl, 0.2 g KCI, 1.44 g 2 Na 1 mg / ml&#39;lik bir stok solüsyonu yaparak nitro mavi tetrazolyum klorür çözeltisi hazırlanmakta ve 0.24 g KH 2 ). Bu, örneğin koloni boyamak için deney sonunda kullanılacaktır. </li></ol> Agar Alt Katmanı 2. Kaplama <ol><li> Yaklaşık 1-2 dakika boyunca% 1 asil agar ve mikrodalga şişesinin kapağını gevşetin. Bir mikrodalga ısıtırken, üzerine kaynar önlemek için yakından çözümünün takipçisi. Aralıklı karıştırma sırasında, ısıtma, Devamagar tamamen çözülene ve kadar çözelti açıktır. NOT: ısıttıktan sonra şişeyi işlemek için ısıya dayanıklı eldiven kullanın. Aksi takdirde yanığına veya ciddi yaralanmalara neden olabilir. </li><li> Sıcak musluk suyu (42 ° C) ile dolu bir buz kovası erimiş agar çözeltisi ve önceden ısıtılmış 2x kültür ortamı yerleştirin. Ayrıca sıcak su ile buz kovası bir tüp tutucu bir 50 ml konik tüp yerleştirin. Sonraki adımlar için hücre kültürü kaputu kova aktarın. </li><li> Agar alt tabaka için, bir 6-yuvalı plaka içinde çukur başına bir agar karışımı, orta, 1.5 ml gerekir. </li><li> Karışımının yeterli bir miktarını temin etmek üzere, her bir 6-yuvalı plaka için 12 ml &#39;lik bir toplam hazırlar. </li><li> 50 ml&#39;lik konik tüpe kültür ortamı 6 ml ve% 1 asal ağar çözeltisi daha sonra 6 ml ekleyerek başlayın. </li><li> Karıştırmak için konik tüpü birkaç kez ters çevirin. Tempolu bir tempoda çalışan yumuşak ağar erken sertleşmesine engel olacaktır. </li><li> 5 ml serolojik pi karışımın içine yaklaşık 5.5 ml çizinPette. </li><li> Hava kabarcıkları her kuyuya, bu karışımın 1.5 ml kaplanmasından önce pipet sütunun üstüne yükselmesine izin verir. Plaka kuyuların içine herhangi bir hava kabarcığı birikmesini önlemek için dikkatli kullanın. </li><li> Plakaları kapak ve ağar karışım 30 dakika için, hücre kültürü kaputu, oda sıcaklığında katılaşacağı için olanak sağlar. </li></ol> 3. Kaplama Agar İçeren Hücreleri Üst Katman <ol><li> Agar alt tabaka katılaştıktan sonra, üst tabakanın hazırlanmasını başlar. </li><li> (Tripsin 1 ml örneğin orta 4 ml) kültür ortamı içinde 5, 15 ml konik bir tüp içinde: İlk olarak, tripsinizasyon ile hasat hücreleri ve onları: 1 seyreltin. </li><li> Hücre sayımı ve bu süre zarfında, bir nihai hücre süspansiyonunu hazırlamak için oyuk başına gerekli olan hücre sayısını hesaplayın. Bu sayı, hücre tipine bağlı olarak değişecektir. 5,000 hücre / sıra bir başlangıç ​​noktası kullanmak ve gerektiği gibi ayarlayın. Bu hücre sayısı için, örneğin, her bir wel (6667 hücre / ml&#39;lik bir hücre süspansiyonunu hazırlamakL Bu süspansiyonun 0.75 ml ve 1.5 ml toplam hacim için agar 0.75 ml alır; 5,000 olan bir nihai toplam hücre sayısı) 2: hücrelerin konsantrasyonu da 1 seyreltilir. </li><li> 6 gözlü bir plakanın her bir kuyucuğu başına gerekli olan hücre süspansiyonu hacmi tekrar 1,5 ml olacaktır. 6 plaka başına 12 ml toplam ek hücre süspansiyonu hazırlayın. </li><li> Yukarıdaki gibi, bir mikrodalga% 0.6 agar çözeltisi eritin ve bir tüp tutucuya 50 ml konik bir tüp ve Adım 3,3 nihai hücre süspansiyonu ile birlikte sıcak su ihtiva eden buz kovası içine koyun. </li><li> Sonraki adımlar için hücre kültürü kaputu erimiş% 0.6 agar ile buz kovası aktarın. </li><li> 6-çukurlu plaka başına 12 ml&#39;lik toplam hacim hazırlanması, 1: 1 oranında% 0.6 agar ve hücre süspansiyonu karıştırılır. 1.5 mi oyuk başına gerekli olacak, fakat ek olarak, yukarıda yapılmalıdır. </li><li> Pipet 50 ml konik bir tüp içine hücre süspansiyonu 6 ml. </li><li> Sonra, tüpe% 0.6 agar, 6 ml ilave ediniz. NOT: Bu karışımın sıcaklığı olmalıdırerken sertleşmesine önlemek ve hücre canlılığını maksimize etrafında 42 ° C tuttu. </li><li> Pipet hücreleri dağıtmak için bu karışımı 2-3x, hızlı çalışma, daha sonra 5 ml serolojik pipet karışımın içine 5.5 ml kadar çizin. </li><li> Herhangi bir hava kabarcığı her kuyuya, bu karışımın 1.5 ml kaplanmasından önce pipet sütunun üstüne yükselmesine izin verir. Plaka kuyuların içine herhangi bir hava kabarcığı birikmesini önlemek için dikkatli kullanın. </li><li> Hücre / agar karışımı, 37 ° C sıcaklıkta nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe yerleştirmeden önce, 30 dakika süre ile, hücre kültürü kaputu, oda sıcaklığında katılaşacağı için izin verin. </li><li> Yeterli koloni oluşumu için gereken süre, yaklaşık 21 gün, tipik olarak, her bir hücre hattı için değişir. </li><li> Büyüme ortamının bir tabaka kuruma önlemek için üst agar tabakası üzerine muhafaza edilmelidir. Haftada iki kez ortam ilave 100 ul bu amaç için yeterlidir. </li></ol> 4. Plakaları Boyama ve Sayma Kolonileri <ol><li> 200 eklenerek Leke hücreleri _6; ve 37 ° C&#39;de gece boyunca plakalar kuluçkaya nitro mavi tetrazolyum klorür solüsyonu ilave edin. </li><li> Koloniler lekeli sonra, bir görüntüleme kullanılarak kuyuların fotoğraflarını çekmek ve görüntü analiz yazılımı kullanarak kolonileri saymayın. </li></ol>

<ol><li>Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+growth+of+mammalian+cells+in+vitro%3B+growth+characteristics+of+colonies+from+single+HeLa+cells+with+and+without+a+feeder+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer.</a> J Exp Med. 103, 273-283 (1956).</li>
<li>Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoikis%3A+an+emerging+hallmark+in+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Anoikis: an emerging hallmark in health and diseases.</a> The Journal of pathology. 226, 380-393 (2012).</li>
<li>Wend, P., Holland, J. D., Ziebold, U., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+stem+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in stem and cancer stem cells.</a> Semin Cell Dev Biol. 21, 855-863 (2010).</li>
<li>Reya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Wnt+signalling+in+self-renewal+of+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells.</a> Nature. 423, 409-414 (2003).</li>
<li>Klaus, A., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+and+its+impact+on+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling and its impact on development and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127, 469-480 (2006).</li>
<li>Takahashi-Yanaga, F., Kahn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Wnt+signaling%3A+can+we+safely+eradicate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting Wnt signaling: can we safely eradicate cancer stem cells.</a> Clin Cancer Res. 16, 3153-3162 (2010).</li>
<li>De, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2FCa2%2B+signaling+pathway%3A+a+brief+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Wnt/Ca2+ signaling pathway: a brief overview.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 43, 745-756 (2011).</li>
<li>Tennis, M. A., Vanscoyk, M. M., Wilson, L. A., Kelley, N., Winn, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+Wnt7a+is+modulated+by+DNMT1+and+cigarette+smoke+condensate+in+non-small+cell+lung+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Methylation of Wnt7a is modulated by DNMT1 and cigarette smoke condensate in non-small cell lung cancer).</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Winn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+Wnt-7a+expression+reverses+non-small+cell+lung+cancer+cellular+transformation+through+frizzled-9-mediated+growth+inhibition+and+promotion+of+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Restoration of Wnt-7a expression reverses non-small cell lung cancer cellular transformation through frizzled-9-mediated growth inhibition and promotion of cell differentiation.</a> J Biol Chem. 280, 19625-19634 (2005).</li>
<li>Winn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumorigenic+effect+of+Wnt+7a+and+Fzd+9+in+non-small+cell+lung+cancer+cells+is+mediated+through+ERK-5-dependent+activation+of+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Antitumorigenic effect of Wnt 7a and Fzd 9 in non-small cell lung cancer cells is mediated through ERK-5-dependent activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma.</a> J Biol Chem. 281, 26943-26950 (2006).</li>
<li>Tennis, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sprouty-4+inhibits+transformed+cell+growth%2C+migration+and+invasion%2C+and+epithelial-mesenchymal+transition%2C+and+is+regulated+by+Wnt7A+through+PPARgamma+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Sprouty-4 inhibits transformed cell growth, migration and invasion, and epithelial-mesenchymal transition, and is regulated by Wnt7A through PPARgamma in non-small cell lung cancer.</a> Mol Cancer Res. 8, 833-843 (2010).</li>
<li>Steele, J. G., Rowlatt, C., Sandall, J. K., Franks, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+properties+of+high-+and+low-metastatic+cell+lines+selected+from+a+spontaneous+mouse+lung+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell surface properties of high- and low-metastatic cell lines selected from a spontaneous mouse lung carcinoma.</a> Int J Cancer. 32, 769-779 (1983).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Sinyal gönderme proteinleri, tümör baskılayıcı fonksiyonu in vitro teyit de zordur. Bu özelliği araştırmak için mevcut en sıkı deneylerden biri yumuşak agar koloni formasyonu testtir. Burada, stabil bir şekilde, parental CMT167 hücre hattına göre Wnt7a ve Fzd9 aşırı ifade eden bir murin akciğer karsinoma hücre soyu kullanılarak, yumuşak agar koloni formasyon deneyi gösterdik. Yumuşak agar tahlil ilgili dikkate alınması gereken birkaç önemli nokta vardır. Bu tahlilde en önem...

Yumuşak Agar koloni formasyon deneyi yaygın in vitro hücresel dönüşümü değerlendirmek için kullanılan bir tekniktir. Tarihsel olarak, Puck ve diğ., 1956 yılında bir deney, klonojenik analiz, koloniler 1 oluşturmak için hücre yeteneğini değerlendirmek için kullanıldı. Bu teknikte, hücreler, kültür plakası üzerine dağıtılmıştır ve gerektiğinde büyüme faktörleri temin etmek üzere &quot;besleyici&quot; hücreler ya da şartlandırılmış ortam varlığında yetiştirilir. Bu tekniğin sınırlama sadece koloni oluşumu ile ilgili bilgi verdi oldu. Normal hücreler nedeniyle anoikis 2 olarak apoptotik ölümden belirli bir tür için, ankrajdan bağımsız büyüme engellenir. Bununla birlikte, dönüştürülmüş hücreler, bir alt-tabakaya bağlanma olmaksızın, büyüme yeteneği ve bölme vardır. Bu kavram yararlanmak için, araştırmacılar yumuşak agar koloni formasyonu testi geliştirdi. Yumuşak Agar koloni formasyon deneyi yana sp gidermek için, daha yakın yıllarda, değiştirilmişecific ihtiyaçları. Bir varyasyon yüksek verimli koloni sayımı için izin florometrık boya dahil edilmesini içerir. Başka bir varyasyon proteini ya da DNA numuneleri gerekli olduğunda koloni oluşumu ile işaretlemeden sonra yaşayabilir hücreler bulunmaya izin vermek için özel bir agar çözeltisi kullanılmasını içerir. Geleneksel yumuşak agar koloni formasyon deneyi, hücreler, hücre kültür ortamı ile karıştırılmış yumuşak agar, bir başka tabaka üzerinde bulunur, hücre kültür ortamı ile karıştırılmış, yumuşak bir agar tabakası içinde yetiştirilen ama agar daha yüksek bir konsantrasyonunu ihtiva eden edilir. Bu kültür plakasına yapışmasını hücreleri engeller, ama görünür koloniler oluşturmak üzere hücrelerin transforme sağlar. Bu tekniğin arkasındaki mantık, normal hücrelerin büyümesine ve bölmek mümkün hücre dışı matris temas hücreye bağlı olmasıdır. Tersine, dönüştürülmüş hücrelerin büyümesine ve ne olursa olsun, çevresini bölmek yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, bir ankrajdan bağımsız bir şekilde bunların koloni oluşturabilme özelliklerini hücreleri ° C,onsidered dönüştürülmüş ve kanserojen olması. Bu yöntemin genel amacı, bir yarı-niceliksel ve sıkı şekilde hücreler, bu yeteneği ölçmektir. Wnt sinyal yolu embriyogenezin kritik ve genellikle tumorigenezden 3-6&#39;da de-regüle olduğunu. Wnt sinyal ile ilişkili birden fazla yol vardır. Kanonik yolu transkripsiyonel koaktivatör beta-katenin üzerindeki etkileri aracılığıyla Wnt sinyalizasyon ve aşağı gen transkripsiyonu düzenlenmesini içerir. Wnts aynı zamanda, örneğin, bir kaç kurallı olmayan yollar aracılığıyla sinyal, endoplazmik retikulum 8 kalsiyum salınımını regüle iskelet yapısı 7 içinde yer alan elemanları düzenleyen düzlemsel hücre kutup yolu, ve Wnt-kalsiyum yolağı. Wnt ligandlar Frizzled reseptörlere bağlanma yoluyla faaliyetlerini gösterirler. Birkaç Wnts akciğer kanserinde yukarı-regüle edilmesi gösterilmiş olmasına rağmen, Wnt7a olmayan Smal aşağı-regüle edilmesi gösterilmiştirpromotör metilasyonu ile 9 l hücreli akciğer kanseri. Wnt7a olmayan bir kurallı yolu aracılığıyla bir tümör baskılayıcı olarak Fzd9 ve eylemleri bağlar. Wnt-7a ve FZD-9 restorasyonu küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hücreleri 10 büyümesini inhibe eder. Wnt7a / Fzd9 etkileri ERK-5, sırayla, peroksizom proliferatörünün aktive ettiği reseptör γ yi (PPARy), 11,12 aktivasyonu ile aracılık eder. Burada, Wnt7a ve Fzd9 fazla sentezlenmesi bir murin akciğer karsinoma hücre çizgisinin ankrajdan bağımsız büyümenin bastırılması ile sonuçlandığı göstermektedir. Murin CMT167 hücreleri, C57BL / lcrf farelerde 13 bir akciğer karsinomu elde edilmiştir ve kalıcı bir şekilde Wnt7A ve Fzd9 ile transfekte edilmiştir. Wnt7A ve Fzd9 aşırı ekspresyonu nicel PCR (Q-PCR) ile Wnt7A ve Fzd9 aşırı ifadesinin işlevselliği ile teyit edildi PPARy alt baş aktivasyonu sureti ile teyit edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Kanser Hücresi İlgi Alanı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10032302</td><td>CMT-167 Hücreleri</td></tr><tr><td>Toz RPMI 1640 Orta</td><td>Gibco</td><td>31800-089</td><td>2x hücre kültürü ortamı hazırlamak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Sıvı RPMI 1650 Orta</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>1x hücre kültürü ortamı olarak adlandırılır.</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>HyClone</td><td>SH30910.03</td><td>Hücre kültürü ortamını desteklemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>CellGro</td><td>30-002-Cl</td><td>Hücre kültürü ortamında kullanılır.</td></tr><tr><td>Difco Noble Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214230</td><td>%1.0 ve %0.6 agar hazırlamak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>Fisher</td><td>BP-328-1</td><td>2x hücre kültürü ortamında kullanılır.</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Cellgro</td><td>25-050-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Steril Şişe Üstü Filtreler</td><td>Fisher</td><td>09-761-126</td><td>2x orta steril filtre için kullanılır.</td></tr><tr><td>Lipofektamin Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>18324-020</td><td>PPAR-RE lusiferaz testinde kullanılır.</td></tr><tr><td>6 oyuklu Plakalar Doku Kültürü Tedavi Edildi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 & # 176; C/5% CO2 İnkübatör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemi-Doc Görüntüleyici</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Kolonilerin fotoğraflarını çekmek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Miktar Bir Yazılım</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Hücre kolonilerini saymak için kullanılır.</td></tr><tr><td>15 ml Konik Tüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Konik Tüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyer Şişeleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrodalga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serolojik Pipetler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet Yardımı Mikropipet</td> Hemasitometre <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> kapaklı <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td>kayma</tr><tr><td>Pipet Uçları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ters Işık Mikroskobu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isıya Dayanıklı Eldiven</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saran Wrap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buz Kovası</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

yumuşak agar koloni formasyon deneyi

The Soft Agar Colony Formation Assay

Ankrajdan bağımsız büyüme, dönüştürülmüş hücrelerin katı bir yüzeyden bağımsız olarak büyüme yeteneğidir ve karsinogenezin ayırt edici özelliğidir. Yumuşak agar koloni oluşumu testi, bu yeteneği in vitro olarak karakterize etmek için iyi bilinen bir yöntemdir ve hücrelerde malign transformasyon için en katı testlerden biri olarak kabul edilir. Bu test aynı zamanda çeşitli tedavi koşullarına yanıt olarak bu yeteneğin yarı kantitatif değerlendirmesine de izin verir. Burada, Wnt sinyal yolunun iki üyesi olan Wnt7A ve Frizzled-9'un (Fzd-9) tümör baskılayıcı etkilerini göstermek için bir murin akciğer karsinomu hücre hattı olan CMT167 kullanarak yumuşak agar kolonisi oluşum testini göstereceğiz. Wnt7a ve Fzd-9'un eşzamanlı aşırı ekspresyonu, CMT167 hücrelerinde koloni oluşumunun inhibisyonuna neden oldu. Bu, Wnt7a ligandının ve Frizzled-9 reseptörünün ekspresyonunun, bir murin akciğer karsinomu modelinde tümör büyümesini baskılamak için yeterli olduğunu göstermektedir.

Bizim yumuşak agar koloni formasyon deneyi ile gösterildiği gibi CMT167 hücrelerinde Wnt7A ve Fzd9 ekspresyonu tümör bastırılmasında etkindir. Başlangıçta, biz Wnt7A ve Fzd9 mRNA CMT167 hücrelerinde düşük seviyelerde eksprese olduğunu göstermek üzere, Q-PCR kullanılmıştır. MLE-12 hücreleri, bir SV40 ile dönüştürülmüş faregiller akciğer epitelyal hücre hattı (Şekil 1) ile karşılaştırıldığında CMT167 hücreleri, endojen Wnt7A ve Fzd9 düşük seviyeleri göstermişlerdir. Daha sonra, iki retrovirütik aşın vektö...

Yumuşak agar koloni oluşum testi, in vitro hücresel ankrajdan bağımsız büyümeyi doğrulamak için kullanılan bir yöntemdir. Bu protokolün amacı, transforme olmuş hücrelerin tümörjenik potansiyelinin ve proteinlerin transforme olmuş hücreler üzerindeki tümör baskılayıcı etkilerinin tespiti için sıkı bir yöntem göstermektir.

Yumuşak Agar koloni formasyon deneyi

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft ...

Bu prosedürün genel amacı, hücresel ankrajdan bağımsız büyümeyi ölçmektir. Bu, önce hücre kültürü plakası üzerine bir agar tabakasının kaplanması ve sertleşmesine izin verilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, önceki agar tabakasının üzerine agar içindeki bir hücre karışımını kaplamaktır.Daha sonra, hücrelerin birkaç haftalık bir süre içinde koloniler oluşturmasına izin verilir. Son adım, görselleştirme ve niceleme için kolonileri boyamaktır. Sonuç olarak, yumuşak agar koloni oluşumu testi, hücresel dönüşümün bir göstergesi olarak Anchorage'dan bağımsız büyümeyi göstermek için kullanılır.Bu tekniğin Clon genetik testi gibi diğer yöntemlere göre ana avantajı, yumuşak agar koloni oluşumu testinin, hücrelerin Anchorage'dan bağımsız bir şekilde koloniler oluşturmasını gerektirmesidir. Prosedüre, tedavi edilen bir doku kültürünün her bir kuyusunu etiketleyerek başlayın. Araştırılan her hücre hattı veya durumu için uygun şekilde altı kuyucuklu plaka.Daha sonra, bir gram toz ortamı ve 0.2 gram sodyum bikarbonatı deiyonize suda 50 mililitrelik bir nihai hacme çözerek iki Xcel kültür ortamı hazırlayın. Bu ortamı 0,2 mikronluk bir filtreden geçirin. İlgilenilen hücre hattının normal kültürü için gerekli ek bileşenleri ekleyin.Örneğin,% 10 FBS ve% 1 penisilin streptomisin çözeltisi ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamında CMT 1 67 hücre hattını büyütün. Kullanmadan önce sıcak su banyosunda ortamı 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Şimdi bir Xcel kültür ortamı hazırlayın.Daha sonra 100 mililitre deiyonize suya bir gram asil agar ekleyerek %1 asil agar hazırlayın. Bundan sonra, 100 mililitre deiyonize suya 0.6 gram asil agar ekleyerek% 0.6 asil agar hazırlayın. Daha sonra asil agar karışımlarını otoklavlayın.Daha sonra, kolonileri boyamak amacıyla bir XPBS'de mililitre nitro mavi tetra oleum klorür stok çözeltisi başına bir miligram yapın. Bu prosedürde, bir mikrodalgada ısıtırken %1 asil agar şişesini yaklaşık bir ila iki dakika mikrodalgada ısıtın. Kaynamayı önlemek için çözeltiyi yakından izleyin.Ardından, agar tamamen eriyene ve çözelti berraklaşana kadar aralıklı olarak ısıtmaya ve karıştırmaya devam edin. Bundan sonra, erimiş agar çözeltisini ve Ön ısıtma iki x kültür ortamını 42 santigrat derece ile doldurulmuş bir buz kovasına yerleştirin. Musluk suyu.Ek olarak, 50 mililitrelik konik bir tüpü sıcak su ile buz kovasındaki bir tüp tutucusuna yerleştirin. Ardından, kovayı hücre kültürü başlığına aktarın. Daha sonra 50 mililitrelik konik tüpe altı mililitre kültür ortamı ve altı mililitre% 1 asil agar çözeltisi ekleyin.Karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Tempolu bir tempoda çalışmak, yumuşak agarın erken sertleşmesini önleyecektir. Daha sonra, beş mililitrelik serolojik pipet ile yaklaşık 5,5 mililitre karışım hazırlayın.Hava kabarcıklarının pipet kolonunun üstüne yükselmesine izin verin. Daha sonra her bir kuyucuğa 1,5 mililitre karışım bırakın ve herhangi bir hava kabarcığı birikmesini önleyin. Plakayı örtün ve agar karışımının hücre kültürü davlumbazında oda sıcaklığında 30 dakika katılaşmasına izin verin.İlk olarak, hücreleri tripsin ile hasat edin ve bunları kültürde bir ila beş, orta ortamda 15 mililitrelik bir konik tüpe seyreltin. Hücreleri sayın ve şu anda son bir hücre süspansiyonu hazırlamak için kuyu başına gereken hücre sayısını hesaplayın. Daha sonra bir mikrodalgada% 0.6 agar çözeltisini eritin.Bir tüp tutucusunda 50 mililitrelik konik bir tüp ve son hücre süspansiyonu ile birlikte sıcak su içeren bir buz kovasına yerleştirin. Daha sonra eritilmiş %0.6 agar içeren buz kovasını sonraki adımlar için hücre kültürü davlumbazına aktarın. Altı oyuklu bir plaka için toplam 12 mililitre hücre süspansiyonu hazırlamak için, önce altı mililitre hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik konik tüpe pipetleyin.Daha sonra tüpe altı mililitre% 0.6 agar ekleyin. Erken sertleşmeyi önlemek ve hücre sağkalımını en üst düzeye çıkarmak için karışımı 42 santigrat derecede tutun. Daha sonra, hücreleri dağıtmak için karışımı iki ila üç kez hızlı bir şekilde pipetleyin.Beş mililitrelik serolojik pipetle 5,5 mililitre karışım çizin ve hava kabarcıklarının pipet kolonunun üstüne yükselmesine izin verin. Daha sonra her birine 1,5 mililitre karışım koyun. Hücre agar karışımının, 37 santigrat derece nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatörüne yerleştirmeden önce hücre kültürü davlumbazında oda sıcaklığında 30 dakika katılaşmasına izin verin.Kurumayı önlemek için haftada iki kez agarın üst tabakasına 100 mikrolitre büyüme ortamı ekleyin ve yeterli koloni oluşumu için yaklaşık 21 gün bekleyin. Hücreleri lekelemek için, her bir oyuğa 200 mikrolitre nitro mavi tetra oleum klorür çözeltisi ekleyin ve plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Koloniler boyandıktan sonra, görüntüleyiciyi kullanarak kuyuların fotoğraflarını çekin ve görüntü analiz yazılımını kullanarak kolonileri sayın.Burada, vektör eksprese eden CMT 1 67 LNCX LPC X hücrelerinin yumuşak agar koloni oluşum testi gösterilmiştir ve CMT 1 67 LL, eksprese eden hücrelerin üzerinde yedi ve kıvırcık dokuz gitti. CMT 1 67 L ve CXL PC X hücrelerini ve CMT 1 67 LL'yi ifade eden vektör yedi a f kıvırcık gitti. Dokuz aşırı eksprese eden hücre, yumuşak bir agar koloni oluşumu testinde kaplandı, CMT 1 67 LL gitti, yedi kıvırcık dokuz hücre, gelişiminden sonra koloni oluşumunda belirgin bir azalma gösterdi.Bu teknik, kanser araştırmaları alanındaki araştırmacıların in vitro hücresel dönüşümü keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, Anchorage bağımsız büyümesi için hücreleri nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

50 yıldan fazla üreme canlılığını değerlendirmek için clonogenic testin uygulanabilirliği için kurulmuştur. Burada yapışık hücrelere clonogenic tahlil yapmak için genel prosedür göstermektedir.

Clonogenic Testi: yapışkan Hücreler

Kültür mikroorganizmalar için kullanılan medya ve reaktifler ile çalışırken, aseptik tekniği kontaminasyonu minimize edilmiştir sağlamak için uygulanan olmalıdır. Kaplama yöntemleri çeşitli rutin bir şekilde, izole yaymak veya numaralandırma bakteri ve faj, deney malzemelerinin steriliteyi korumaya işlemleri dahil, her biri için kullanılır.

Aseptik Laboratuvar Teknikleri: Kaplama Yöntemleri

Bu videoda, bir PADI enzim inhibitörü ve BB-Cl-amidin'in in vitro meme kanseri tümörjenitesi üzerindeki etkilerini test etmek için bir yumuşak agar koloni oluşumu testi açıklanmaktadır. Bu test aynı zamanda genetik bozulmalar bağlamında hücre dönüşüm potansiyelinin kantitatif değerlendirmesini de sağlar.

Yumuşak Agar Koloni Oluşumu Deneyi: Yeni Bileşiklerin Kanser Hücresi Proliferasyonu Üzerindeki Etkilerini Test Etmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, akciğer kanseri hücrelerinin süresiz olarak çoğalma ve bireysel koloniler oluşturma yeteneğini belirlemeye yardımcı olan koloni oluşumu testi açıklanmaktadır. Bir antikanser ajanının koloni oluşturan hücreler üzerindeki etkisini, ortaya çıkan kolonilerin sayısındaki ve/veya boyutundaki değişiklikleri analiz ederek analiz edebiliriz.

Koloni Oluşumu Deneyi: Antikanser Ajanların Koloni Oluşturan Akciğer Kanseri Hücreleri Üzerindeki Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Kaynak: Cayron, J. ve Lesterlin, C. Stres Tedavileri Altında Bakteri Büyümesinin Çok Ölçekli Analizi. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, canlılığı ölçmek için kaplama ve hücre boyutunu ve DNA içeriğini analiz etmek için akış sitometrisi kullanarak hücre bölünmesini inhibe eden antibiyotik tedavisi altında E. coli filamentasyonunu ve DNA replikasyonunu değerlendirme prosedürünü göstermektedir.

E. coli'de Antibiyotiğe Bağlı Filamentasyonun Kaplama Testi ve Akış Sitometrisi Kullanılarak Değerlendirilmesi

Kaynak: Temkin, M. I. ve diğerleri. Mikrobiyal etkileşimlerin araştırılması için yüksek verimli ortak kültür testleri. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, Corynebacterium propinquum ile Staphylococcus arasındaki mikrobiyal etkileşimleri bir ortak kültürde incelemek için in vitro testi sunmaktadır.

Ortak kültürde Mikrobiyal Etkileşimleri Araştırmak İçin Vitro Bir Analiz

Proteinler birbirleri ile etkileşim halindedir ve bu etkileşimler fonksiyonlarını büyük ölçüde belirler. Protein etkileşim ortakları, dihidrofolat redüktaz protein fragmanı tamamlama testine (DHFR-PCA) dayalı bir maya uygunluk testi kullanılarak in vivo olarak yüksek verimli olarak tanımlanabilir.

Yaşayan Hücrelerde Protein-fragmanı tamamlama Assay (PCA) ile genom Protein-protein etkileşimi Eleme

Burada, bir peptidilarginin deiminaz (PADI) enzim inhibitörü olan BB-Cl-amidin'in in vitro meme kanseri tümörjenitesi üzerindeki etkilerini test etmek için yumuşak agar koloni oluşumu testinin kullanımını belgeliyoruz.

Yumuşak Agar koloni oluşturma deneyi kullanılması Meme Kanseri Hücrelerinde tümör oluşum nedenlerinin nin inhibitörlerini teşhis etmek üzere

Maya büyüme fenotipleri, mikrokolonlara dönüşen hareketsiz hücrelerin son derece paralel zaman atlamalı görüntülemesi ile tam olarak ölçülür. Aynı zamanda, stres toleransı, protein ekspresyasyonu ve protein lokalizasyonu izlenebilir, çevresel ve genetik farklılıkların yanı sıra izojenik hücreler arasındaki gen ekspresyon heterojenliğinin büyümeyi nasıl modüle ettiğini incelemek için entegre veri kümeleri üretilebilir.

Büyüme ve Gen İfadesinde Heterojenliği Ölçmek için Mikrokolonların Yüksek Verimli Canlı Görüntülemesi

Bu yöntem, koloni oluşturma birimlerine (CFU'lar) plaka oluşturmak için 96 kuyucuklu bir plaka formatı kullanarak mikrobiyal bolluğu ölçer ve tüm sinek homojenat numunelerinde Drosophila mikrobiyomuna uygulanır. CFU'lar, burada sağlanan otomatik bir görüntü analiz yazılımı ile sayılır.

Drosophila Mikrobiyomuna Uygulanan 96 Delikli Plaka Formatında Hızlı Koloni Oluşturma Birimi Sayımı

Aerobik metan oksitleyici bakterilerin doğal ortamlarında bulunan metan-oksijen karşı gradyanını yeniden oluşturan ve fizyolojilerinin mekansal olarak çözülmüş bir bağlamda incelenmesini sağlayan basit bir model ekosistem hazırlamak için bir protokol açıklanmaktadır. Agaroz bazlı model ekosistemi ile kullanım için yaygın biyokimyasal tahlillerde yapılan değişiklikler de açıklanmaktadır.

Metan-oksijen karşı gradyanında metanotrof yetiştirmek için agaroz tabanlı model ekosistem

Öğrenin yumuşak agar koloni formasyon deneyi ile hücrelerin bağlanma bağımsız büyümesini kantitatif olarak değerlendirin. Bu yöntem, dönüşmüş hücrelerin tümör oluşturma potansiyelini ve tümör baskılayıcı proteinlerin etkilerini belirlemek için kullanılır.

Yumuşak Agar koloni formasyon deneyi

Daha fazla video keşfet