Yumuşak Agar koloni formasyon deneyi

Bu prosedürün genel amacı, hücresel ankrajdan bağımsız büyümeyi ölçmektir. Bu, önce hücre kültürü plakası üzerine bir agar tabakasının kaplanması ve sertleşmesine izin verilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, önceki agar tabakasının üzerine agar içindeki bir hücre karışımını kaplamaktır.

Daha sonra, hücrelerin birkaç haftalık bir süre içinde koloniler oluşturmasına izin verilir. Son adım, görselleştirme ve niceleme için kolonileri boyamaktır. Sonuç olarak, yumuşak agar koloni oluşumu testi, hücresel dönüşümün bir göstergesi olarak Anchorage'dan bağımsız büyümeyi göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin Clon genetik testi gibi diğer yöntemlere göre ana avantajı, yumuşak agar koloni oluşumu testinin, hücrelerin Anchorage'dan bağımsız bir şekilde koloniler oluşturmasını gerektirmesidir. Prosedüre, tedavi edilen bir doku kültürünün her bir kuyusunu etiketleyerek başlayın. Araştırılan her hücre hattı veya durumu için uygun şekilde altı kuyucuklu plaka.

Daha sonra, bir gram toz ortamı ve 0.2 gram sodyum bikarbonatı deiyonize suda 50 mililitrelik bir nihai hacme çözerek iki Xcel kültür ortamı hazırlayın. Bu ortamı 0,2 mikronluk bir filtreden geçirin. İlgilenilen hücre hattının normal kültürü için gerekli ek bileşenleri ekleyin.

Örneğin,% 10 FBS ve% 1 penisilin streptomisin çözeltisi ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamında CMT 1 67 hücre hattını büyütün. Kullanmadan önce sıcak su banyosunda ortamı 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Şimdi bir Xcel kültür ortamı hazırlayın.

Daha sonra 100 mililitre deiyonize suya bir gram asil agar ekleyerek %1 asil agar hazırlayın. Bundan sonra, 100 mililitre deiyonize suya 0.6 gram asil agar ekleyerek% 0.6 asil agar hazırlayın. Daha sonra asil agar karışımlarını otoklavlayın.

Daha sonra, kolonileri boyamak amacıyla bir XPBS'de mililitre nitro mavi tetra oleum klorür stok çözeltisi başına bir miligram yapın. Bu prosedürde, bir mikrodalgada ısıtırken %1 asil agar şişesini yaklaşık bir ila iki dakika mikrodalgada ısıtın. Kaynamayı önlemek için çözeltiyi yakından izleyin.

Ardından, agar tamamen eriyene ve çözelti berraklaşana kadar aralıklı olarak ısıtmaya ve karıştırmaya devam edin. Bundan sonra, erimiş agar çözeltisini ve Ön ısıtma iki x kültür ortamını 42 santigrat derece ile doldurulmuş bir buz kovasına yerleştirin. Musluk suyu.

Ek olarak, 50 mililitrelik konik bir tüpü sıcak su ile buz kovasındaki bir tüp tutucusuna yerleştirin. Ardından, kovayı hücre kültürü başlığına aktarın. Daha sonra 50 mililitrelik konik tüpe altı mililitre kültür ortamı ve altı mililitre% 1 asil agar çözeltisi ekleyin.

Karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Tempolu bir tempoda çalışmak, yumuşak agarın erken sertleşmesini önleyecektir. Daha sonra, beş mililitrelik serolojik pipet ile yaklaşık 5,5 mililitre karışım hazırlayın.

Hava kabarcıklarının pipet kolonunun üstüne yükselmesine izin verin. Daha sonra her bir kuyucuğa 1,5 mililitre karışım bırakın ve herhangi bir hava kabarcığı birikmesini önleyin. Plakayı örtün ve agar karışımının hücre kültürü davlumbazında oda sıcaklığında 30 dakika katılaşmasına izin verin.

İlk olarak, hücreleri tripsin ile hasat edin ve bunları kültürde bir ila beş, orta ortamda 15 mililitrelik bir konik tüpe seyreltin. Hücreleri sayın ve şu anda son bir hücre süspansiyonu hazırlamak için kuyu başına gereken hücre sayısını hesaplayın. Daha sonra bir mikrodalgada% 0.6 agar çözeltisini eritin.

Bir tüp tutucusunda 50 mililitrelik konik bir tüp ve son hücre süspansiyonu ile birlikte sıcak su içeren bir buz kovasına yerleştirin. Daha sonra eritilmiş %0.6 agar içeren buz kovasını sonraki adımlar için hücre kültürü davlumbazına aktarın. Altı oyuklu bir plaka için toplam 12 mililitre hücre süspansiyonu hazırlamak için, önce altı mililitre hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik konik tüpe pipetleyin.

Daha sonra tüpe altı mililitre% 0.6 agar ekleyin. Erken sertleşmeyi önlemek ve hücre sağkalımını en üst düzeye çıkarmak için karışımı 42 santigrat derecede tutun. Daha sonra, hücreleri dağıtmak için karışımı iki ila üç kez hızlı bir şekilde pipetleyin.

Beş mililitrelik serolojik pipetle 5,5 mililitre karışım çizin ve hava kabarcıklarının pipet kolonunun üstüne yükselmesine izin verin. Daha sonra her birine 1,5 mililitre karışım koyun. Hücre agar karışımının, 37 santigrat derece nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatörüne yerleştirmeden önce hücre kültürü davlumbazında oda sıcaklığında 30 dakika katılaşmasına izin verin.

Kurumayı önlemek için haftada iki kez agarın üst tabakasına 100 mikrolitre büyüme ortamı ekleyin ve yeterli koloni oluşumu için yaklaşık 21 gün bekleyin. Hücreleri lekelemek için, her bir oyuğa 200 mikrolitre nitro mavi tetra oleum klorür çözeltisi ekleyin ve plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Koloniler boyandıktan sonra, görüntüleyiciyi kullanarak kuyuların fotoğraflarını çekin ve görüntü analiz yazılımını kullanarak kolonileri sayın.

Burada, vektör eksprese eden CMT 1 67 LNCX LPC X hücrelerinin yumuşak agar koloni oluşum testi gösterilmiştir ve CMT 1 67 LL, eksprese eden hücrelerin üzerinde yedi ve kıvırcık dokuz gitti. CMT 1 67 L ve CXL PC X hücrelerini ve CMT 1 67 LL'yi ifade eden vektör yedi a f kıvırcık gitti. Dokuz aşırı eksprese eden hücre, yumuşak bir agar koloni oluşumu testinde kaplandı, CMT 1 67 LL gitti, yedi kıvırcık dokuz hücre, gelişiminden sonra koloni oluşumunda belirgin bir azalma gösterdi.

Bu teknik, kanser araştırmaları alanındaki araştırmacıların in vitro hücresel dönüşümü keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, Anchorage bağımsız büyümesi için hücreleri nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.