Name: Tek kullanımlık Pnömatik Biyoreaktör Sistemi kullanılarak memeli hücrelerinde yetiştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Öğrenin, tek kullanımlık pnömatik biyoreaktör sistemiyle memeli hücrelerinde yüksek yoğunluklu hücre yetiştirme yöntemini. Sensör kalibrasyonu, aseptik bağlantı ve kontrollü ortam sağlama adımlarını keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu proje kısmen Johns Hopkins Üniversitesi, Gateway Science Initiative aracılığıyla Provost Ofisi tarafından desteklenmiştir.

1. Giriş <ol><li> Biyoreaktör kadar güç. Giriş sayfasını açmak için herhangi bir yere tıklayın. Kullanıcı adı seçin ve parolanızı girin ve &quot;Giriş&quot; e tıklayınız. </li></ol> 2. Kalibrasyon <ol><li> PH sensörü (önceki otoklav 2 puan) kalibre. </li><li> PH sensörü kontrol edin ve sensör ucu elektrolit solüsyonu ile doldurulur onaylayın. PH kalibrasyon çözeltiler (elektrolit), pH 4 ve pH 7 ile beher iki hazırlayın ve damıtılmış su ile uygun bir yıkama şişe. </li><li> PH sensörü, pH kablosunu bağlayın. Merhaba arayüzünde &quot;Eylemler&quot; sekmesine gidin ve &quot;kalibre&quot; tıklayın. Kalibrasyon Çözüm Temp alanına tampon sıcaklığını girin. </li><li> Tamponu 1 (pH 4) pH sensörü yerleştirin ve &quot;sıfır&quot; alanına değer girin. Stabilize grafiği bekleyin ve &quot;kalibre 1&quot; butonuna tıklayın. Damıtılmış su ile pH sensörü durulayın. </li><li> Tampon içinde yer sensör 2 (pH 7). Tampon girin&quot;Yayılma&quot; alanında 2 değer. Stabilize ve 2 düğmesine kalibre tıklayın grafiği bekleyin. </li><li> &quot;Kaydet&quot; sonra &quot;Kapat&quot; tıklatın. </li><li> Çözünmüş Oksijen (DO) sensörünü kalibre. </li><li> DO sensörü sağlamak birkaç saat sistemine bağlı olması ile polarize edilmiştir. Merhaba arayüzünde &quot;Eylemler&quot; sekmesine gidin ve kalibre tıklayın. &quot;Bir DO&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> DO sensörünü ayırın ve &quot;sıfır&quot; alanına 0 girin. Stabilize ve &quot;Kalibre 1&quot; butonuna tıklayın grafiği bekleyin. </li><li> DO sensörünü takın ve &quot;yayılma&quot; alanına 100 girin. Stabilize ve &quot;Kalibre 2&quot; butonuna tıklayın grafiği bekleyin. </li><li> &quot;Kaydet&quot; sonra &quot;close&quot; tıklatın. </li></ol> 3. Otoklav ve Install Sensörler ve Reaktif Gemiler <ol><li> AutoC kalibrasyon, yer sensörleri ve termal kuyuda sonrayıkamak poşetler ve 121 ° C, 15 psi&#39;de 30 dakika süreyle otoklav. </li><li> % 70 izopropil Alkol (IPA) ve biyolojik güvenlik kabini transfer torbalar (BSC) ile otoklav torbalar sanitize. Geminin dış ambalajı çıkarın. </li><li> % 70 IPA ile iç ambalajların dezenfekte ve biyolojik güvenlik kabini (BSC) ile gemi aktarın. İç ambalajını çıkarın ve nakliye sırasında hasara için gemi ve boru inceleyin. </li><li> PH takın ve iki ön limanlarında sensörleri DO. Sol arka kapısına termal kuyu yükleyin. Sensör kapağını açın. </li><li> Sensör bağlantı noktası üzerinden sensörü Kılavuzu. Portuna sıkıca sensörünü geçirin. </li><li> BSC üzerinden gemi aktarın. </li><li> Damar kovan dışında DO ve pH sensörü kablolarını asın ve hiçbir şey kovanı olduğunu kontrol edin. Ilk olarak, kovan içine ayak kabı kaydırın. </li><li> Dikkatlice Kabın termal kuyuya sıcaklık sensörü uygun. Teknenin tabanına dayanacak ısıtıcılar emin olun. </li><li> Kaldırboru kendi çanta ayarlar. Biyoreaktör kontrol ünitesindeki ilgili konnektörleri ve pompalara boru üzerine Maç renk kodlaması. </li><li> Doğalgaz prize konektörü basarak ana gaz hattını takın. Gaz prize konektörü saat yönünde bükerek mikro gaz hattını takın. Egzoz filtre boru yükleyin: </li><li> Filtre Fırını açın. Onun boru filtre ve fırın dışında iki kanca geçer böylece U-kanal egzoz filtresini sabitleyin. </li><li> Boru tutucu kondansatör torba ile boruyu takın. Kapıyı kapatın. </li><li> Sonraki biyoreaktör kontrol ünitesine Yol ekleme hatları A ve B, hem medya hem de çizgiler ve DO sensörü arkasında tezgah üzerine hasat hattı. </li><li> DO ve pH sensörlere kablolarını bağlayın. </li></ol> 4. Ekleme Orta ve Mikro-taşıyıcılar <ol><li> &quot;Eylemler&quot; sekmesine gidin ve tıklayın bilgisayar arayüzü &quot;Denetim Pompalar&quot;. </li><li> Bir Steri FormKullanılmayan bir orta ilave hat (1 portakal bant) ve tüp kaynak veya luer bağlantı parçaları kullanılarak orta şişe / çanta kaynağı arasındaki le bağlantısı. </li><li> Ortam pompa açmak için kaydırıcıyı tıklayın. Medya ortamının eklenmesi istenilen miktarda sonra pompa kapalı kapatmak için kaydırıcıyı tıklayın. </li><li> Oda sıcaklığında 3 saat boyunca, Ca2 +, Mg + 2 serbest PBS mikrotaşıyıcı boncuklar yerleştirin. </li><li> Yıkama Ca 2 +, Mg 2 + ücretsiz PBS ile birkaç kez boncuk. </li><li> 115 ° C, 15 psi&#39;de 15 dakika süreyle otoklavlanmaktadır. NOT: Bu deneyde 3 g / L, (kuru ağırlık) ekleyin. </li><li> , Sulu yıkandı ve ortam, aşama 4.1 &#39;de ilave edildi aynı şekilde reaktöre otoklave edilmiş mikro-taşıyıcılar pompalama. </li></ol> 5. Dengeleme ve Tek-nokta kalibrasyon DO <ol><li> Otomatik kontrolörleri ayarlayın ve istenilen ayar noktalarını girin. Burada, Ajitasyon Set Point (SP) = 15 rpm, sıcaklık SP = kullanmak 37.0 ° C, pH = 7.2, =% 100 DO. P bekleyinarameters dengelenmesi için akmaktadır. </li><li> Sensörünü onaylamak tamamen polarize olduğunu. DO bugünkü değeri onaylayın stabilize. </li><li> &quot;Eylemler&quot; sekmesine gidin ve &quot;kalibre&quot; tıklayın. &quot;Tek nokta&quot; tıklayın, &quot;DO A&quot; tıklayın. </li><li> &quot;Açıklık&quot; alanına &#39;100&#39; girin. , Tıklayın &quot;Save&quot; ve &quot;Kapat&quot; düğmesini tıklatın &quot;Kalibre 1&quot; düğmesine tıklayın: </li></ol> 6. Çalıştır Başlangıç <ol><li> Eylemler sekmesine gidin. &quot;Toplu&quot; ı tıklayın. Toplu adı 16 karakter veya daha az girmek için ekran klavyesini veya harici bir klavye kullanın. </li><li> Ekrandaki klavyenizin &quot;Hide&quot; butonuna tıklayın. &quot;Toplu Başlat&quot; overlay &quot;Başlat&quot; tıklayarak onaylayın tıklayın. </li></ol> 7. Hücreleri ile inoküle <ol><li> Kaynak tarafından kullanılmayan bir ortam ilavesi hattı (1 turuncu bant dışı) arasında steril bir birleşme ve hücre şişe / torba kaynak FormLuer parçaları kullanarak boru veya. </li><li> Pompa ve tank arasındaki borular doğru ok noktalarına kadar ortam pompa hortumunun silikon bölüm takın. </li><li> Boru kelepçesi edin açıktır ve dallı boru kelepçesi kapalıdır. Ortam pompa açmak ve hücreleri ekledikten sonra &quot;Off&quot; tıklayın kaydırıcısını tıklayın. </li><li> &quot;Eylemler&quot; sekmesine gidin ve &quot;Denetim Pompalar&quot; tıklatın. </li></ol> 8. Örnekleme <ol><li> Sık kültürü izlemek için arzu edildiği gibi inoküle edilmesi ve sonra, aşağıdaki şekilde, bu kültürden örneği almak: </li><li> &quot;Eylemler&quot; sekmesine gidin ve &quot;örnek almak&quot; tıklayın. Örnekleme pompaya örnekleme boru yerleştirin ve ekrandaki talimatlara göre örnekleme stopcock manipüle. </li><li> Bu örnekler en az bir gün mikroskopik gözlem ve hücre sayımı gerçekleştirin. </li><li> Hücreleri bu c istenilen yoğunluğa ulaştığında,1.2 x 10 6 hücre / ml &#39;ase bir virüs aşı ilavesi ile hücreleri enfekte etmektedir. </li><li> Aseptik 20 ml&#39;lik bir şırınga inokulum ekleyin ve reaktörün boş bir ek bağlantı noktalarından birine şırınga bağlayın. Şırınga pistonu basarak reaktöre inokulum tanıtılması. </li><li> Örnekleme Devam ve adenovirüs hücre içi partikül konsantrasyonu için kültürünü analiz. </li></ol>

<ol><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells+A+Manual+of+Basic+Techniques+and+Specialized+Applications%22">Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications</a>. , 6th edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2010).</li>
<li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+Data+File+18-1140-62%22%5BJournal%5D)">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li>
<li>Simaria, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+cell+therapy+bioprocess+economics+and+optimization+Single-Use+cell+expansion+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+and+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies.</a> Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).</li>
<li>Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+pneumatic+mixing+for+single-use+bioreactor+application%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Proc%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application.</a> BMC Proc. 5 (S8), O12(2011).</li>
<li>Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disposable+bioreactors+in+cell+culture-based+upstream+processing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+Int%22%5BJournal%5D)">Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing.</a> BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).</li>
<li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biopharm+Int+Supp%22%5BJournal%5D)">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li>
<li>Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Effects+on+Animal+Cells+Grown+in+Microcarrier+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+and+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures.</a> Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).</li>
<li>DePalma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-use+Equipment+on+Cusp+of+Industrialization%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Eng+Biotechnol+News%22%5BJournal%5D)">Single-use Equipment on Cusp of Industrialization.</a> Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).</li>
<li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaltz%2C+RH+%22Manual+of+Industrial+Microbiology+and+Biotechnology%22">Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology</a>. , 3rd ed, ASM Press. Washington, DC. (2010).</li>
<li>Applied Technical Bioreactors, , Seminole (FL), USA. <a target="_blank" href="http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/bioreactors/bench-top-bioreactors/minifors">http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/bioreactors/bench-top-bioreactors/minifors</a> (2012).</li>
<li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSousa%2C+MF+%22Impact+of+Bioreactor+Design+on+the+Performance+of+Microcarrier+Cultures%22">Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures</a>. , 3rd ed, Abstract. Cell Culture Engineering XIII. Scottsdale, Arizona. (2012).</li>
</ol>

Yazarlar D. Giroux ve Y. Hashimura Bu makalede kullanılan reaktifler ve aletleri üreten PBS Biotech çalışanlarıdır.

Bu tek kullanımlık biyoreaktör sisteminin kullanımı nispeten basittir ve reaktör izleme ve analiz için gerçek zamanlı bir analiz içerir. Bu, son derece iyi 30000000 fazla hücre / ml hücre yoğunluğu ile ulaşan memeli ve böcek hücre kültürü için uygundur. A549 hücreleri, bu raporda 11&#39;de tarif yanı sıra, hem de biyoreaktör SF-9 böcek hücreleri büyüdü. Pnömatik hava tekerleği tarafından sağlanan nazik karıştırma hücre hasarı azaltır. Bu reaktör kurarken birkaç adım önemlidir. İlk olarak, uygun bir pH kalibrasyonu ve sensörler kültür uygun izlenmesi için ve pH-değerini ya da sistemde oksijen ayarlamak için reaktifler ilave önemlidir DO. İkinci olarak, reaktif ve tohum şişe doldurulmuş ve diş ek bir BSC gibi, steril bir ortamda yapılmalıdır. Reaktif şişeleri steril ortamda dışına taşındı sonra, biyoreaktör besleme hatlarına bağlantıları mikrobik kontaminasyonu önlemek için dikkatle yapılmalıdır. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Bu biyoreaktör sistemi bakteri kültürleri için tasarlanmış değildir memeli ve böcek hücre hatları için iyi çalışıyor. Sistem, bakteri hücreleri için gerekli olan, hızlı karıştırma ve oksijen sağlayamaz. Bakteriyel çoğalma iyi bir karıştıran bioreaktör içinde gerçekleştirilir. Memeli ya da böcek hücre kültürü için diğer tek kullanımlık biyoreaktörlerde karşılaştırıldığında, bu sistem, kullanımı kolay çalışır analiz için yeterli veri sağlar ve biz değerlendirdik diğer tek kullanımlık sisteminden daha benzer veya daha iyi hücre büyümesini vardır. Tek kullanım için pnömatik biyoreaktör sistemi hücreleri, araştırma ve Biotherapeutics, aşıların alanda klinik uygulamaların bir çoğu yerine kök potansiyel ve kişiselleştirilmiş ilaç 4 sahiptir. Buna ek olarak, bu sistemin esnekliği Batch, ilaveli-fasılalı, serpme, ve transfeksiyonu göre biyoreaktör uygulamalar 5 sağlar. Son olarak, tek kullanımlık biyoreaktör sistemi potansiyeli taşıdığıbüyük ölçekli sanayi üretim ihtiyaçlarını karşılamak için kurallar ve ulusal ve uluslararası düzenleyici kurumlar 6-10 tavsiyelerine uymak için TIAL.

Süspansiyon içinde büyümeye hücreleri, agregat Çoğalan hücreler, ve hücreler, bir alt-tabakaya sabitlenmiş yükselmektedir memeli hücre soyları büyüme özelliklerine göre üç kategoriye ayrılabilir. Bu video gösterilen hava tekerlekli biyoreaktör hücrelerin her üç tip büyümeye mümkün olsa da, bu video mikro-taşıyıcılar üzerinde ankoraj-bağımlı hücreleri büyütmek için bioreaktörün kullanımını gösterecektir. , Hücreler ürünü - ankoraj-bağımlı hücreleri daha memeli hücreleri üretmek amacıyla yetiştirilebilir. Örneğin, insan kemik iliği kökenli mezenkimal kök ile henüz hücrelerin hasat edilmesi ve hastalıklı doku içine enjekte edilmesi ile yetiştirilmektedir. Bu video gösterilen pnömatik biyoreaktör bu uygulama için bu tür mezenkimal kök hücrelerin üretilmesi için uygun olduğu kanıtlanmıştır (Serra et al., Kişisel iletişim, 2013). Anchorage dependent memeli hücreleri, tipik olarak, özel bir muamele edilmiş büyüme yüzeyi 1 &#39;e uygun hücre kültür plakaları, hücre kültürü şişeleri veya silindir şişelerde, 2B kültür kabına küçük çaplı büyütülür. Daha fazla hücre arzu edildiği zaman, ya da plakalar, şişeler daha fazla ya da daha büyük damarların kullanılarak genişletilebilir. Bununla birlikte, daha düşük maliyetli bir ankoraj-bağımlı hücrelerin büyük miktarlarda kültivasyonu, hücre bağlanması için yüzey alanını artırmak için gerekli mikro-taşıyıcılar olarak adlandırılan küçük bir katı boncuklar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Hücrenin bağlanma özelliklerine bağlı olarak, mikro-taşıyıcılar birden fazla değişik tipte örneğin kaplanmış dekstran, peptid, ya da kolajen gibi, ticari olarak temin edilebilir. Mikro taşıyıcılar, hücre büyümesi için daha geniş bir yüzey alanı hacim oranı sağlamak için geniş bir yüzey alanına sahiptir; ve mikro taşıyıcılar, hücreler biyoreaktör de 2 yüksek yoğunluklarda kültive edilmesini sağlar çalkalama ile süspansiyon içinde muhafaza edilebilir. Biorea Şu anda, türleriyapışık hücreler mikro-taşıyıcılar üzerinde yetiştirilen ctors hücre kaplı mikro-taşıyıcı süspansiyonu sağlamak için eksenel pervaneler kullanır döndürme şişeleri ve karıştırılmıştır tankı sistemleri içerir. Çeşitli faktörler, oksijen gerilimi, kesme stresi, yüzey matris ve bir gıda maddesi ve metabolit konsantrasyonları dahil olmak üzere, hücrelerin başarılı bir şekilde ekimi için önemlidir. Biyoreaktörler kullanılması, gerçek zamanlı büyüme koşullarının izlenmesi ve önemli ölçüde daha düşük üretim maliyetleri 1&#39;e potansiyeli sağlar. Dahil olmak üzere, in vitro hücre ekimi, karıştırılmış bir süspansiyona, dönen duvar kap, içi boş elyaf, bir rocker platformunda torba biyoreaktör ve akışkan yataklı sistemler 3 birçok ortak biyo-reaktör tasarımları vardır. Bu sistemlerin birçoğu gibi yüksek maliyet besin konsantrasyonu geçişlerini, hidrodinamik kesme, hücre toplama ve zorluk örnekleme, izleme ve kontrol cel gibi, hücre ekimi için benzersiz sorunları sunmak ve -up ölçekl ölçek-up. Çeşitli yapışık hücre çizgileri, viral aşıların üretimi veya gen terapi uygulamaları için viral vektörlerin üretimi için ya da, virüs üretiminde kullanılmaktadır. Bu video, tek kullanımlık hava basınçlı (Hava Tekerlek) biyoreaktör sistemi kullanılarak, insan akciğer kanser hücreleri (A549) bir onkolitik adenovirüsün üretimi için mikro-taşıyıcılar üzerinde hücre kültürünü göstermektedir. Pnömatik biyoreaktör tasarımı bioreaktörün dibine serpilmiştir gaz kaldırma kuvveti tarafından desteklenmektedir dikey bir çalkalama tekerlek kullanır. Bu nazik Karıştırma yöntemi hidrodinamik kesme kuvvetleri sınırlar, ama yine de iyi, orta ve hücre 4 karıştırma sağlar. Karıştırılmakta olan tank reaktörden ile karşılaştırıldığında, pnömatik reaktör daha yüksek hacimli hava Teker biyoreaktör sistemleri (Şekil 1) olarak düşük duvar kesme stresine sahip bulunmaktadır. Karıştıran tank biçimindeki bioreaktörlerde aksine, bu tek kullanımlık reaktörün dikey itici gaz kabarcıklarının akışı içinde tarafından açıldığındaYumuşak ve düzgün karıştırma ortamı (Şekil 2) sağlayan kabından oluşur.

<table><tbody><tr><td>PBS 3&nbsp;</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Montaj</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan Akciğer Karsinomu Hücreleri (A549)</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Yüksek Glikozlu Orta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsin EDTA,%</td><td></td><td></td><td></td> 0.25</tr> <tr><td>Cytodex 1 Mikro Taşıyıcılar</td><td>GE</td><td>3781</td><td></td></tr><tr><td>Köpük Önleyici C</td><td>Sigma</td><td>A8011</td><td></td></tr></tbody></table>

tek kullanımlık pnömatik biyoreaktör sistemi kullanılarak memeli hücrelerinde yetiştirme

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Memeli, böcek ve kök hücre yetiştiriciliği ve ölçek büyütmedeki son gelişmeler, yeni terapötikler ve kişiselleştirilmiş tıp yenilikleri için muazzam fırsatlar yaratmıştır. Bununla birlikte, bu ilerlemeleri terapötik uygulamalara dönüştürmek, sağlam, esnek ve uygun maliyetli biyoreaktör sistemlerine izin veren in vitro sistemler gerektirecektir. Şu anda araştırma ve ticari ortamlarda kullanılan birkaç biyoreaktör sistemi vardır; Bununla birlikte, bu sistemlerin çoğu, farklı hücre tiplerinin büyümesini oluşturmak, genişletmek ve izlemek için optimal değildir. Bu sistemlerde kontrol edilmesi en zor kültür parametreleri arasında hidrodinamik kaymanın en aza indirilmesi, besin gradyanı oluşumunun önlenmesi, tek tip kültür ortamı havalandırmasının oluşturulması, mikrobiyal kontaminasyonun önlenmesi ve kültür koşullarının gerçek zamanlı olarak izlenmesi ve ayarlanması yer alır. Pnömatik tek kullanımlık bir biyoreaktör sistemi kullanarak, mikro taşıyıcılar üzerinde yetiştirilen memeli hücreleri için bu yeni biyoreaktörün montajını ve çalışmasını gösteriyoruz. Bu biyoreaktör sistemi, hidrodinamik kesme ve besin gradyanı oluşumunu en aza indirerek ve tek tip kültür ortamı havalandırmasına izin vererek mevcut sistemlerle ilgili birçok zorluğu ortadan kaldırır. Ayrıca, biyoreaktörün yazılımı, biyoreaktör çalışma parametrelerinin uzaktan gerçek zamanlı olarak izlenmesine ve ayarlanmasına olanak tanır. Bu biyoreaktör sistemi aynı zamanda çeşitli terapötik proteinlerin, monoklonal antikorların, kök hücrelerin, biyobenzerlerin ve aşıların üretimi için yapışık ve süspansiyonlu memeli hücrelerinin ölçeklendirilmesi için muazzam bir potansiyele sahiptir.

Şekil 3'te, biyoreaktör çalıştırmak başlatılması için parametreler gösterilir. Bu rakam sıcaklık, çözünmüş oksijen, pH ve ajitasyon parametreleri ayarlayarak önce ekranını gösterir. Parametreleri ayarlandıktan sonra, çalışma parametreleri sürekli olarak takip edilmekte ve ayarlamalar gerekli koşulları korumak için yapılabilir. Yazılım sorunları kolay tanımlanması için izin veren bir sürekli okuma üretir. DMEM,% 10 FBS, SAFC anti-köpük C, 250 ppm, 2 mM L-glutamin ve 3 g / mikro-taşıyıcı L ihtiva eden 2.5 ml kullanarak bu deneyde, sistem o kadar oksijen yüzdesi% 50, bir stabilize sıcaklık 37 ° C ve pH 7.2. Reaktör 10 x 7 4 hücre / ml (ve / veya mikro-taşıyıcı 10 hücre) bir konsantrasyonda A549 hücreleri ile aşılanır. Bu çalışma için seçilen parametreler, 2 saat (Şekil 4) bulunan mikro-taşıyıcılar yapışan hücrelerin çoğunluğunda sonuçlandı. 12 saat sonra, hücreler şeytan(Şekil 5) ve düzleşme mikro taşıyıcı yüzeye yayılması ve süzücü işaretler. 24 saatin sonunda, mikro-taşıyıcıların (Şekil 6) hücreleri olmadan mikro taşıyıcı ve mikro-taşıyıcılar üzerinde hücrelerin herhangi bir iri kümeleri ile hücrelerin nispeten daha dağılımı vardır. A549 hücrelerinin mikro-taşıyıcı kolonizasyon yüzdesi, 24 saat ve daha sonra% 90 (Şekil 7) ile% 75 olduğu. Hücreler, 48 saat (Şekil 8) sonra ~ 1000000 hücre / ml olacak şekilde katlanarak büyümeye devam etti. 50 saat sonra, onkolitik adenovirüs ile (2 x 10 8 virionlar / ml) bir dozu ile enfeksiyondan sonra, yoğunluk mi 1.200.000 hücre / yükseldi ve daha sonra litik enfeksiyon ilerledikçe düşmeye başladı. Viral inokülüm ~ 10.000 kat büyütme oldu. Önceki deneylerde, gaz akışı izleme ve uyarlama hücre büyümesi (yayınlanmamış veriler) üst düzeye çıkarmak için önemli olduğunu bulduk. Hızla büyüyen hücreleri oksijen sistemi ile tüketebilir sıfıra bırakarak DO seviyesi. Hücreler büyümeye devam ederken, çok daha yavaş bir oranda olmuştur. Izlemek ve logaritmik büyüme fazı sırasında hücre taleplerini karşılamak için oksijen akışını ayarlamak için kritik öneme sahiptir. Her çalışma, günlük hücre sayısı ile pH, DO ve sıcaklık karşılaştırarak optimum büyüme için analiz edilebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg"> Reaktör çeşitli hacimlerde duvar kayma kuvvetlerini ölçen bir karıştırıcı bioreaktör kıyasla Pnömatik Biyoreaktör Sistemi (PBS) Şekil 1. Akışkan dinamiği. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg"> Şekil 2. Pnömatik-Tekerlek reaktör çark. 52008 / 52008fig3highres.jpg "/&gt; Biyoreaktör Çalışmayı başlatmak için parametrelerin 3. Pnömatik Tekerlek yazılım ekran görüntüsü Şekil. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg"> A549 hücreleri 2 saat Aşıdan ile Şekil 4. Mikro-taşıyıcı kolonizasyon. (Ortalama mikro-taşıyıcı çapı ~ 180 mikron.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg"> Şekil 5. 12 saat kültürünün başlatılmasından sonra, A549 hücreleri, bağlama düzleştirme ve mikro-taşıyıcılar üzerine yayılmaktadır.5highres.jpg "target =" _blank "&gt; Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg"> Kültüründe 24 saat sonra hücreler ile kaplanmış Şekil 6. Mikro-taşıyıcılar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg"> A549 hücreleri tarafından mikro-taşıyıcı kolonizasyon Şekil 7. yüzdesi aşılamadan. <img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg"> Şekil 8. adenovir ile kültür öncesi canlı A549 hücrelerinin sayısı ve Enfeksiyondanbize. viral enfeksiyon adım 50 saatte meydana unutmayın.

Pnömatik bir biyoreaktör kullanarak, memeli hücrelerinin büyümesi için bu tek kullanımlık biyoreaktör sisteminin montajını, çalışmasını ve performansını gösteriyoruz.

Tek kullanımlık Pnömatik Biyoreaktör Sistemi kullanılarak memeli hücrelerinde yetiştirme

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Bu prosedürün genel amacı, büyük miktarlarda memeli hücresi yetiştirmektir. Bu, önce pH'ı ve çözünmüş oksijeni kalibre ederek veya probları yaparak ve ardından pH'ı, do problarını ve sıcaklık probu manşonunu otoklavlayarak gerçekleştirilir. İkinci adım, probları ve manşonu kaba yerleştirmek ve kabı biyoreaktör üzerine yerleştirmek ve egzozu, filtreyi, gaz hatlarını ve sıcaklık probunu bağlamaktır.Bir sonraki adım, çözünmüş oksijen ve pH kablolarını bağlamak ve biyoreaktöre pompalanan ortam ve mikro taşıyıcıları aseptik olarak bağlamaktır. Son adım, biyoreaktörün istenen pervane hızına, sıcaklığına ve oksijen doygunluğuna ulaşmasını sağlamak için kontrolörleri başlatmaktır. Sonuç olarak, aşılama ve bilgisayar izlemesinden sonra, kültür, istenen ürünün ekstraksiyonu ve saflaştırılması için işlenebilir.Bu tekniğin yeniden kullanılabilir karıştırma tankı biyoreaktörü gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, hava çarklı biyoreaktörün kullanımının kolay olması ve mikrobiyal kontaminasyon olasılığını en aza indirmesidir. Başlayalım. Protokolü başlatmak için merhaba ekranına giriş yapın.Ardından, pH sensörünü inceleyin ve sensör ucunun elektrolit solüsyonu ile dolu olduğunu onaylayın. pH dört çözeltisi olan bir beher, pH yedi çözeltisi olan başka bir beher ve damıtılmış su içeren bir yıkama şişesi edinin. Ardından pH kablosunu pH sensörüne bağlayın.Merhaba arayüzündeki eylemler sekmesine gidin, kalibre et'i seçin. Ardından PHA sekmesini ve iki nokta kalibrasyonunu seçin. Tampon sıcaklığını kalibrasyon çözeltisi sıcaklığı alanına girin.Sensörü kalibre etmek için pH dört çözeltisine yerleştirin Sıfır alanına değeri girin. Grafik dengelendikten sonra pH sensörünü itin, kalibre edin ve damıtılmış suyla durulayın. pH yedi için kalibrasyonu tekrarlayın ve ayarları kaydedin.Açıklık alanına tampon değerini girin ve greftin stabilize olmasını bekleyin. Çözünmüş oksijeni başlatmak veya kalibrasyon yapmak için. Çözünmüş oksijen sensörünün birkaç saattir sisteme bağlı olduğundan ve kalibre et sekmesinde polarize edildiğinden emin olun, DOA ve iki noktalı kalibrasyonu seçin.Çözünmüş oksijen sensörünün bağlantısını kesin. Sıfır sekmesine sıfır girin ve grafik dengelenene kadar bekleyin. Birini kalibre etmeyi seçmeden önce, do sensörünü yeniden bağlayın ve açıklık alanına 100 girin.Grafik dengelendiğinde, iki kalibre et'e tıklayın. Ardından ayarları kaydedin ve programı kapatın. Kalibrasyondan sonra, sensörleri ve termal kuyuyu otoklav torbalarına yerleştirin ve 30 santigrat derece ve 121 PSI'da 15 dakika otoklavlayın.Otoklav bittikten sonra, otoklav poşetlerini %70 izopropil alkol ile sterilize edin ve poşetleri bir biyolojik güvenlik kabinine veya BSC'ye aktarın. Reaktif kabını sterilize edin ve BSC'ye sokun. İç ambalajı çıkarın ve kapta ve boruda hasar olup olmadığını kontrol edin.Ardından, çözünmüş oksijen sensörünü reaktif kabının sol ön portuna ve termal kuyuyu sol arka porta takın. Takmak için pH sensörünü sağ ön bağlantı noktasına takın. Sensör kapağını açın ve sensörü kabın üst kısmındaki bağlantı noktasına hafifçe geçirin.Ardından gemiyi BSC'den dışarı aktarın. pH ve çözünmüş oksijen sensörü kablolarının kap kılıfının dışında olduğundan ve kılıfın içinde hiçbir şey bulunmadığından emin olun. Tekneyi ön tarafa bakacak şekilde tutun ve önce tekne ayaklarını manşonun içine kaydırın.Kabın tabanının ısıtıcıların üzerine oturduğundan emin olun. Ardından sıcaklık sensörünü dikkatlice kabın termiline yerleştirin. Kuyu. Ardından, boru setlerini çantadan çıkarın.Boru üzerindeki renk kodlamasını biyoreaktör kontrol ünitesindeki ilgili konektörler ve pompalarla eşleştirin. Ortam ekleme ve örnekleme hatlarını çözünmüş oksijen sensörünün ve termalin arkasına yönlendirin. Boruyu biyoreaktörün sol tarafındaki renk kodlu pompaya iyice yerleştirin.Ana ve mikro gaz hatlarını bağlayın. Ana gaz hattını kurmak için ana gaz hattı konektörünü gaz çıkışına bastırın. Ardından mikro gaz hattını takmak için mikro gaz hattı konektörünü saat yönünde çevirerek gaz çıkışına yerleştirin.Filtre fırın borusunu takmak için filtre fırınını açın ve egzoz filtresi borusunu uan'a sabitleyin. Borunun iki kancadan filtreye geçtiğinden ve fırından çıktığından emin olun. Alt çizgiyi filtre fırınının altındaki kancadan geçirin ve kapağı kapatın.Ardından kabloları çözünmüş oksijen ve pH sensörlerine bağlayın. Kurulum tamamlandıktan sonra, kullanılmayan bir orta baskı hattı ile orta boy şişe torbası kaynağı arasında yem bağlantı parçaları kullanarak steril bir bağlantı oluşturun. Merhaba arayüzündeki eylemler sekmesine gidin.Kontrol pompalarına tıklayın, medya pompasını seçin ve medya pompasını açmak için kaydırıcıya tıklayın. Ardından 1,5 ila 3,0 litre ortam ekleyin ve pompayı kapatmak için kaydırıcıya tıklayın. Sistem artık önceden hazırlanmış mikro taşıyıcıları reaktöre pompalamaya hazırdır.Bunlar bir toplama satırı kullanılarak eklenebilir. MICROCAR şişesini steril bir yem kilidi kullanarak uygun ekleme hattına takın. Kontrol pompası ekranındaki ekleme pompasını açın.Mikro taşıyıcıların eklenmesinden sonra, kaydırıcıyı kullanarak pompayı kapatın, merhaba arayüzündeki ana ekrana geri dönün, eylemleri ve ardından gelişmiş'i seçin. Ayarları düzenlemek için uygun oyun kumandasını seçin. Denetleyicileri otomatik olarak ayarlayın ve ayar noktalarını girin.Kontrolörleri ayarladıktan sonra hava pompasını açın. Hava çarkının döndüğünden emin olmak için reaktif kabının içine bakın. Çözünmüş oksijen sensörünün tamamen polarize olduğundan ve çözünmüş oksijen değerinin stabilize olduğundan emin olun.Ardından, bir turuncu bantla tanımlanan kullanılmayan bir ortam ekleme hattı ile yem bağlantı parçaları kullanarak hücre şişesi torbası kaynağı arasında steril bir bağlantı olan do sensörü formunu kalibre edin. Ardından, borunun silikon bölümünü medya pompasına takın. Boru kelepçesinin açık olduğundan ve dallı boru kelepçesinin kapalı olduğundan emin olun.Kontrol pompası sekmesine gidin ve ardından medya pompasını açın. Hücreleri ekleyin ve medya pompasını kapatın. Aşılamadan sonra eylemler sekmesine gidin ve örnek al'ı seçin.S'nin olduğundan emin olunampling hortumuampling pompasında ve sampling durdurma musluğunu ekrandaki talimatlara göre manipüle edin. Hücre sayımı için numunenin bulunduğu şırıngayı çıkarın ve diğer aşağı akış uygulamaları hücre sayımları gerçekleştirir. Son olarak, hücreler mililitre başına 1.2 kez 10 ila altı hücre istenen yoğunluğa ulaştığında, septik olarak virüs aşısını 20 mililitrelik bir şırıngaya ekleyin.Şırıngayı reaktör üzerindeki yedek bir ekleme portuna bağlayın. Ekleme pompasını açmak ve virüs aşısını eklemek için kontrol pompası ekranını kullanın. A 5 49 hücrelerinin çoğunluğu iki saat içinde mikro taşıyıcılara yapıştı.12 saat sonra, hücreler mikro araba yüzeyinde düzleşme ve yayılma belirtileri gösterdi. 24 saat sonra, mikro taşıyıcılar hücrelerin eşit bir dağılımını gösterdi. Mikro araba kolonizasyonu, burada gösterildiği gibi hızlı bir şekilde gerçekleşir.54 9 hücre tarafından mikro araba kolonizasyonunun yüzdesi 24 saat içinde %75'tir. Bu grafik, adenovirüs ile enfeksiyon öncesi ve sonrası kültürdeki canlı a 54 9 hücresinin sayısını göstermektedir. Hücreler 48 saat sonra katlanarak mililitrede 1 milyon hücreye kadar büyümeye devam eder.Bu videoyu izledikten sonra, hücresel veya protein üretimi için memeli hücrelerini yüksek yoğunlukta büyütmek için bir hava çarkı biyoreaktörünün nasıl monte edileceğini ve çalıştırılacağını iyi anlamış olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde bol şans.

cultivation-mammalian-cells-using-single-use-pneumatic-bioreactor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz, mikro-biyoreaktörler hücrelerin üç boyutlu ekimi için çip tabanlı platform açıklar. Bir çip 10 milyon kadar ev. steril, kapalı bir dolaşım döngü içinde sıvı akışı, oksijen basıncı vb ilişkin kesin olarak tanımlanmış koşullar altında yetiştirilen hücreler.

Perfüze Mikro-biyoreaktörler Chip tabanlı üç boyutlu Hücre Kültürü

Grubumuz, kardiyovasküler sistem fizyolojik pulsatil gerilmeler implante küçük çaplı vasküler greft yeniden taklit eden bir biyoreaktör kültür sistemi geliştirmiştir.

Pulsatif Biyoreaktör kullanarak Mühendislik Biyolojik Tabanlı Vasküler Greftler

Bu protokolde, prokaryotik mikroorganizmaların tek hücreli analizi için bir mikroakışkan pikolitre biyoreaktörün (PLBR) üretimi, kurulumu ve temel çalışması tanıtılmaktadır. Endüstriyel olarak ilgili mikroorganizmalar, geleneksel yöntemlerle neredeyse imkansız olan, belirli zaman dilimlerinde büyüme hızı, morfoloji ve fenotipik heterojenlik hakkında bilgi sahibi olmaya izin veren ilke kanıtı olarak analiz edildi.

Mikrobiyal Tek Hücreli Analiz için Mikroakışkan Pikolitre Biyoreaktör: Fabrikasyon, Sistem Kurulumu ve Çalışması

Biz mikro ölçekli hücre stimülasyonu deneyler için otomatik bir hücre kültürü ve sorgulama platformu geliştirdik. Platform yetiştirilmesi ve hücrelerin küçük nüfus uyarıcı ve moleküler analizler için lizatları kurtarma, basit, çok yönlü ve hassas kontrol sağlar. Platform de değerli hücreleri ve / veya reaktif kullanmak çalışmalar için uygundur.

Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu

Sürekli büyümeye göre ayarlanmış besleme kullanan besin düzenlemesi, karıştırılmış süspansiyon biyoreaktörlerindeki kültürler için aralıklı toplu beslemeye kıyasla memeli hücre sferoidlerinin büyüme oranlarını iyileştirir.  Bu çalışma, basit düzeltilmiş oranlı beslenen kültürlerin oluşturulması için gerekli yöntemleri göstermektedir.

Küresellerde Memeli Hücrelerinin Büyük ölçekli Genişleme için sürekli Beslenme ile Besin Yönetmeliği

Kültürdeki hücrelerin işlevsel davranışı, 3 boyutlu bir kültür ortamında 16-21 benzeri in vivo olarak daha fazla kültür iyileştirilebilir. Bu el yazması, in vivo benzeri memeli doku kültürü için bir içi boş fiber biyoreaktör sisteminin kurulum ve çalışması açıklanmaktadır.

için içi boş fiber Biyoreaktörler<em&gt; İn Vivo</em&gt; Benzeri Memeli Doku Kültürü

Detaylı bir protokol 48 paralel hücre kültürlerinde bir microbioreactor sisteminde çeşitli koşullar altında eşzamanlı işlem için sunulmaktadır. Hücre kültür süreci, hasat ve sonraki antikor titresi analiz anlatılmıştır.

Yüksek üretilen iş kullanımı otomatik Microbioreactor sistemi modeli Igg1 CHO hücrelerdeki imalatı için

Burada, otomatik bir mikro-biyoreaktörde deney tasarımı ve ardından hücre hasadı ve protein nicelemi nin bir Protein A sütunu kullanılarak çalıştırılaması için ayrıntılı bir prosedür saklıyız.

Çin Hamster Yumurtalık Hücre Yetiştiriciliğinde Yüksek İş-İş BulaMetli Otomatik Mikro-Biyoreaktörler Kullanılarak Proses Optimizasyonu

Burada, gen transfeksiyonuna veya retroviral vektörlere ihtiyaç duymadan, memeli pluripotent hücrelerini verimli bir şekilde üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren bir yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, bu strateji translasyonel tıp için umut vericidir ve kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerlemeyi temsil etmektedir.

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

Burada, GMP sınıfı çözünebilir mikro taşıyıcılara dayanan tamamen kapalı bir sistem aracılığıyla yapışık hücrelerin büyük ölçekli üretimini gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz. İnsan mezenkimal kök hücrelerinin, HEK293T hücrelerinin ve Vero hücrelerinin yetiştirilmesi doğrulandı ve hücre ve gen terapisi endüstrisi için hem miktar taleplerini hem de kalite kriterlerini karşıladı.

GMP Sınıfı Çözünebilir Gözenekli Mikro Taşıyıcılara Dayalı Büyük Ölçekli Hücre Üretimi

Ankraj bağımlı hücrelerin mikrotaşıyıcı-mikrobiyoreaktör üretimi için bir protokol, potansiyel hücre tabanlı tedaviler olarak tanımlanır. Akut solunum sıkıntısı sendromunun kullanım durumunu hedefleyen bir durum, karşılaştırılabilir hücre verimi ve flask bazlı süreç koşullarına göre olumlu gen ekspresyonu gösterilmiştir. Bu protokol, diğer demirleme bağımlı hücrelere ve hedef endikasyonlarına genişletilebilir.

Akut Solunum Sıkıntısı Sendromu İçin Hazırlanmış Anchorage-Bağımlı Mesenkimal Stromal Hücrelerin Mikrobiyoreaktor Tabanlı Üretimi

Öğrenin, tek kullanımlık pnömatik biyoreaktör sistemiyle memeli hücrelerinde yüksek yoğunluklu hücre yetiştirme yöntemini. Sensör kalibrasyonu, aseptik bağlantı ve kontrollü ortam sağlama adımlarını keşfedin.

Tek kullanımlık Pnömatik Biyoreaktör Sistemi kullanılarak memeli hücrelerinde yetiştirme

Daha fazla video keşfet