Name: Normal ve Hastalıklı Devletlerinde Fibrin pıhtısı Yapıları incelenmesi için deneysel ve Görüntüleme Teknikleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Keşfedin diyabet ve orak hücre anemisinde fibrin pıhtı morfolojisindeki farklılıkları konfokal mikroskopi ile. Bu yöntem, glikasyonun fibrinoliz üzerindeki etkilerini değerlendirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, deneysel tahlillerin geliştirilmesindeki birçok yararlı tartışma için Georgia Tech'teki Lam Lab'a teşekkür eder. Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü tarafından K01HL115486 Numaralı Ödül ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Direktörlük Ofisi'nden Yeni Yenilikçi Hibe 1DP2OD007433-01 ile desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Not: Aşağıdaki protokol Georgia Tech Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) tarafından belirlenen kurallara uyar. 1. Kan Toplama ve Eritrosit İzolasyon Prosedürü <ol><li> 10 ml heparinli boşaylı tüpler içinde bağışçılardan kan 40-120 ml toplayın. Toplama 4 saat içinde PBMC (periferal kan mononükleer hücre) izolasyon başlatın. Bu süre boyunca, oda sıcaklığında kan tutun. NOT: Bu alt PBMC verim neden olacak gibi RT ya da 4 ° C kan O / N depolama tavsiye edilmez. </li><li> Tam kan 1 seyreltin: 1 buz soğukluğundaki (4 ° C) steril PBS içinde. </li><li> Pipet boş bir steril 50 ml konik bir tüp içine buz soğukluğunda hidrofilik polisakarit 10 mi. Yavaşça hidrofilik polisakaritin üzerine seyreltilmiş tam kan aktarın. </li><li> Çok yavaş tüpün kenarı boyunca yavaş ayarı ve pipet kanda 25 ml'lik pipet kullanın. Kan CENTRI önce sakkaritte ile karışık olmadığından emin olunhidrofilik polisakkaridler, aksi hücreleri ve toksik olan fugation için PBMC verimi daha düşük olacaktır. </li><li> 4 ° C'de 400 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj kan örneği alındı. Varsa, santrifüj sonra daha iyi ayrılması için maksimum yarısına santrifüj fren hızını azaltır. </li><li> Santrifüj kan örneğinin plazma / trombosit fraksiyonu kapalı aspire. Dikkatle doğrudan paketlenmiş RBC katman üzerinde hidrofilik polisakkarit tabakası aspire. </li><li> Paketlenmiş RBCs 8-10 ml toplayın ve 1 sulandırmak: steril olmayan% 0.9 NaCl serum fizyolojik ile 1. </li></ol> 2. Konfokal Mikroskopi Değerlendirme Glike ve pıhtı Yapıları (Simüle Diyabetik pıhtısı) <ol><li> 37 ° C 'de, insan fibrinojen ve floresan etiketli insan fibrinojen konjugatı defrost. </li><li> Pipet 0.5 ml aşağıdaki mikrosantrifüj tüp mezun oldu. <ol><li> Sağlıklı normal fibrinojen pıhtılaşması için,% 10 floresan etiketli insan fibrinojen insan fibrinojen karıştırın5 mg / ml'lik bir konsantrasyonda 50 mM Tris / 100 mM NaCI tampon maddesi içinde konjugat. </li><li> Yapay glikozile fibrinojen için, (diyabetik pıhtıları gibi örneğin) 6.8 mg / ml'lik bir konsantrasyon elde edilen 50 mM Tris / 100 mM NaCI içinde çözülmüş glikoz 5 mM bir çözeltisi içindeki insan fibrinojen ve% 10 floresan etiketli fibrinojen konjugatı inkübe edilir. </li></ol></li><li> Işığa maruz kalmasını önlemek için bir opak malzeme kullanılarak mikro-santrifüj tüplerine örtün. 48 saat süre ile 37 ° C su banyosu içinde inkübe edin. </li><li> Sürgünün 2 tarafı üzerinde ince bir yapışkan sabitlenmesiyle, bir cam mikroskop lamı üzerine bir bölme yapın. </li><li> 48 saatlik bir bekletme süresinden sonra, oda sıcaklığında FXIIIa ve insan alfa trombini çözülüp, fibrin oluşumu için reaktifler hazırlamak. </li><li> 5 mM CaCl2 tampon içinde 80 U / ml FXIIIa seyreltin. </li><li> 5 mM CaCl2 tamponu içinde 4 U / ml trombin seyreltin. <ol><li> Normal pıhtılar için, fibrinojen, FXIIIa ve trombinin nihai konsantrasyonlar 2.5 m sağlamakg / ml, 20 U / ml, ve sırasıyla 50 ul bir hacimde, 1 U / ml olmuştur. </li><li> Glikozillenmiş pıhtıları için, fibrinojen FXIIIa ve trombin nihai konsantrasyonları sırası ile 50 ul'lik bir hacimde, 3.4 mg / ml, 20 U / ml ve 1 U / ml olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Hemen yapışkanın oluşturduğu odasına fibrin çözeltisi 30 ul pipetle. </li><li> Yapışkan 2 kat üstüne 0.15 mm'lik kalınlığa sahip bir 22 mm x 22 mm ebadındaki bir cam kapak kayma yerleştirin. Kurumasını fibrin pıhtısı önlemek için açık yapıştırıcı ile açık yanlarını Seal. Yapışkan fibrin pıhtısı ile etkileşim olmadığından emin olun. </li><li> Fibrin pıhtıları konfokal görüntüleme önce 2 saat 21-23 ° C'de polimerize izin verin. </li><li> 488 nm Argon lazer ile 40X / 1.30 Yağ M27 lens ile bir konfokal mikroskop kullanılarak pıhtıları konfokal mikroskopi görüntüleri çekmek. </li></ol> Orak Hücre Hastalarda gelen eritrositlerde İçeren Fibrin pıhtısı 3. Konfokal Mikroskopi Değerlendirme <ol><li> 37 ° C 'de, insan fibrinojen ve floresan etiketli insan fibrinojen konjugatı defrost. </li><li> Pipet 0.5 ml aşağıdaki mikrosantrifüj tüp mezun oldu. <ol><li> Sağlıklı normal fibrin pıhtısı için, 5 mg / ml'lik bir konsantrasyonda 50 mM Tris / 100 mM NaCI tampon maddesi içinde% 10 floresan etiketli insan fibrinojen konjügatı ile insan fibrinojen karıştırın. </li><li> SCD eritrositlerde ihtiva eden pıhtılar için, fibrinojen sonuçtaki konsantrasyonunun 10 mg / ml olan bir 50 mM Tris / 100 mM NaCI gibi insan fibrinojen ve% 10 floresan etiketli insan fibrinojen konjugatı karıştırın. </li></ol></li><li> Bir hücre-etiketleme çözümü kullanılarak izole eritrositlerde (normal ve RBC izolasyon protokolü elde orak hücre hastalardan olanlar ikisi) Etiket. <ol><li> Seçilen herhangi bir serum içermeyen kültür ortamı içinde ml başına 1 x 10 6 yoğunluğunda süspanse. </li><li> Hücre etiketleme çözeltisine hücre süspansiyonu 5 ul / ml ilave edilir. Nazik pipetleme ile iyice karıştırın yavaşça. </li><li c dakika boyunca ink edin.><li> 37 ° C'de 5 dakika boyunca 1500 rpm'de etiketli süspansiyon tüpleri santrifüjleyin. </li><li> 37 ° C orta hücreleri yeniden askıya hafifçe Süpernatantı ve. </li><li> Yıkama işlemi (3.3.4 ve 3.3.5) iki kez daha tekrarlayın. </li></ol></li><li> 5 mM CaCl2 tampon içinde 80 U / ml FXIIIa seyreltin. </li><li> 5 mM CaCl2 tamponu içinde 4 U / ml trombin seyreltin. <ol><li> Normal pıhtılar için, fibrinojen, FXIIIa ve trombin nihai konsantrasyonları sırası ile 50 ul'lik bir hacimde, 2.5 mg / ml, 20 U / ml ve 1 U / ml olduğundan emin olun. </li><li> SCD eritrositlerde ihtiva eden pıhtılar için, fibrinojen, FXIIIa ve trombin nihai konsantrasyonları sırası ile 50 ul'lik bir hacimde 5 mg / ml, 20 U / ml ve 1 U / ml olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Pipet fibrin çözeltisi içine etiketli eritrosit 10 ul. Pipet mikroskop camı üzerine eritrosit ile fibrin 30 ul (gl için hazırlık slayt bakınycated pıhtıları). </li><li> Fibrin konfokal görüntüleme önce 2 saat 21-23 ° C'de polimerize izin verin. </li><li> Konfokal mikroskop kullanılarak pıhtıları konfokal görüntüleri çekmek ve floresan etiketli fibrin ve eritrositlerde heyecanlandırmak için 488 nm ve 633 nm dalga boylarında ile uyarım lazerleri kullanıyoruz. </li></ol> Glike pıhtı Yapılarında Fibrinolizis Oranları 4. Konfokal Mikroskopi Değerlendirme <ol><li> Glike pıhtıları içinde fibrinoliz oranı değerlendirmesi için glike pıhtıları (Protokol Adım 2) konfokal mikroskopi protokolünü tekrarlayın. </li><li> Net yapıştırıcı ile odasının uçlarını mühür yok. Fibrin pıhtısı kaybını önlemek için 250 ml suyla ihtiva eden kapalı bir muhafaza içinde 21-23 ° C de 1.5 saat süre ile polimerize olmaya bırakın. </li><li> Polimerizasyon sonra, konfokal mikroskop kullanılarak pıhtı görüntüleri elde edebilir. </li><li> Pipet bölmesinin açık ucuna plazmin ve kılcal hareket aracılığı ile pıhtı ile plazmin dağıtılır. <ol><li> IçinNormal konsantrasyonlar, pipet odasının açıklığı içine plazmin, 200 ug / ml'de 25 ul normal glikozile fibrinoliz deneyleri. </li><li> Düşük konsantrasyonlarda pipet odasının açıklığı içine 50 ug / ml'de 25 ul ile glikolize pıhtı için. </li></ol></li><li> Pıhtı yokedici plazminin gerçek zamanlı video görüntüleri yakalamak için konfokal mikroskop yazılımındaki zaman serisi özelliğini (bkz Şekil 1) kullanın. <ol><li> Satın alma modunu tıklayın ve ardından "Zaman Serisi." Döngü sayısını ve kayıt süresi aralığını seçin. </li></ol></li></ol> 5. Fibrinolizis Fiyatlarını Hesaplama <ol><li> Pıhtı sabit alanı çözmek için gerekli geçen süreyi bir alanı (2,500 mikron 2) ayarlayarak ve hesaplayarak parçalama hızını belirleyin. Aşağıdaki denklem (Şekil 2) kullanılarak parçalama hızını hesaplayın: <img alt="Denklem 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52019/52019eq1.jpg" files ftp_upload></li></ol> Fibrinolizis Oranlarının 6. İstatistiksel Analiz <ol><li> İstatistiksel analiz yazılımı kullanılarak lizis verileri analiz. Bir tek-yönlü ANOVA ve hoc Tukey-Kramer testi 44,45 bir yazı gerçekleştirin. </li></ol>

<ol><li>Averett, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Fibrinogen+Model+that+Captures+the+Stress-Strain+Behavior+of+Fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers.</a> Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).</li>
<li>Carlisle, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+properties+of+individual%2C+electrospun+fibrinogen+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers.</a> Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).</li>
<li>Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+origins+of+the+mechanical+properties+of+fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The molecular origins of the mechanical properties of fibrin.</a> Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).</li>
<li>Guthold, M., Cho, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+Unfolding+Mechanisms+Are+Not+Too+Much+of+a+Stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch.</a> Structure. 19, 1536-1538 (2011).</li>
<li>Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+fibrin+clots+II%3A+Linear+viscoelastic+behavior+in+shear+creep%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep.</a> Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).</li>
<li>Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+fibrin+clots.+v.+shear+modulus%2C+creep%2C+and+creep+recovery+of+fine+unligated+clots%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots.</a> Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).</li>
<li>Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+fibrin+clots.+I.%3A+Dynamic+viscoelastic+properties+and+fluid+permeation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation.</a> Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).</li>
<li>Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Origins+of+Fibrin+Clot+Rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural Origins of Fibrin Clot Rheology.</a> Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).</li>
<li>Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+assembly.+Lateral+aggregation+and+the+role+of+the+two+pairs+of+fibrinopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides.</a> Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).</li>
<li>Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+properties+of+fibrin+for+basic+scientists+and+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians.</a> Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).</li>
<li>Wolberg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+generation+and+fibrin+clot+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">Thrombin generation and fibrin clot structure.</a> Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).</li>
<li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+generation%2C+fibrin+clot+formation+and+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+and+Apheresis+Science%22%5BJournal%5D)">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).</li>
<li>Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructure+of+the+Fibrin+Clot%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nanostructure of the Fibrin Clot.</a> Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).</li>
<li>Dunn, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+fibrin+clot+structure+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Herz%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes.</a> Herz. 29, 470-479 (2004).</li>
<li>Gladwin, M. T., Sachdev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+abnormalities+in+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).</li>
<li>Collet, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Fibrin+Architecture+Is+Associated+With+Hypofibrinolysis+and+Premature+Coronary+Atherothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).</li>
<li>Carr, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus%3A+a+hypercoagulable+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+and+its+Complications%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus: a hypercoagulable state.</a> Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).</li>
<li>Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+disease+and+heritability+of+the+prothrombotic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state.</a> Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).</li>
<li>Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+physiology+and+pathology+of+fibrin+structure%2Ffunction%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function.</a> Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).</li>
<li>American Diabetes Association. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.diabetes.org/">http://www.diabetes.org/</a> (2014).</li>
<li>Alzahrani, S., Ajjan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+article%3A+Coagulation+and+fibrinolysis+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+and+Vascular+Disease+Research%22%5BJournal%5D)">Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes.</a> Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).</li>
<li>Sickle Cell Disease Association of America, Inc. , 
 Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.sicklecelldisease.org/">http://www.sicklecelldisease.org/</a> (2014).</li>
<li>Stuart, M. J., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle-cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Sickle-cell disease.</a> The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).</li>
<li>Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+type+2+diabetes+on+fibrin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function.</a> Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).</li>
<li>Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+involved+in+the+resistance+of+fibrin+to+clot+lysis+by+plasmin+in+subjects+with+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).</li>
<li>Famodu, A., Reid, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+fibrinogen+levels+in+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+and+geographical+medicine%22%5BJournal%5D)">Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease.</a> Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).</li>
<li>Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Changes+in+Coagulation+and+Viscosity+during+Sickle-Cell+Crisis%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+haematology%22%5BJournal%5D)">Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis.</a> British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).</li>
<li>Ataga, K. I., Orringer, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercoagulability+in+sickle+cell+disease%3A+a+curious+paradox%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox.</a> The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).</li>
<li>Collet, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+fibrin+architecture+is+associated+with+hypofibrinolysis+and+premature+coronary+atherothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).</li>
<li>Barazzoni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Fibrinogen+Production+in+Type+2+Diabetic+Patients+without+Detectable+Vascular+Complications%3A+Correlation+with+Plasma+Glucagon+Concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).</li>
<li>Ceriello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+activation+in+diabetes+mellitus%3A+the+role+of+hyperglycaemia+and+therapeutic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects.</a> Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).</li>
<li>Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+adhesiveness%2C+plasma+fibrinogen+and+factor+VIII+levels+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 6, 436-440 (1970).</li>
<li>Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+protein+chemistry%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and fibrin.</a> Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).</li>
<li>Collet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Fibrin+Network+Conformation+and+Fibrin+Fiber+Diameter+on+Fibrinolysis+Speed+Dynamic+and+Structural+Approaches+by+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).</li>
<li>Jörneskog, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+properties+of+the+fibrin+gel+structure+in+patients+with+IDDM%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM.</a> Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).</li>
<li>Svensson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+and+glycation+of+fibrinogen+in+vitro+occur+at+specific+lysine+residues+in+a+concentration+dependent+manner%3A+A+mass+spectrometric+and+isotope+labeling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).</li>
<li>Pieters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycation+of+fibrinogen+in+uncontrolled+diabetic+patients+and+the+effects+of+glycaemic+control+on+fibrinogen+glycation%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation.</a> Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).</li>
<li>Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+fibrin+clot+networks+from+stereoscopic+intermediate+voltage+electron+microscope+images+and+analysis+of+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching.</a> Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).</li>
<li>Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+extravascular+and+intravascular+cells+to+fibrin+network+formation%2C+structure%2C+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability.</a> Blood. 114, 4886-4896 (2009).</li>
<li>Curtis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+microstructural+templating+in+fibrin-thrombin+gel+networks+by+spectral+and+viscoelastic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis.</a> Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).</li>
<li>Kim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+fibrin+network+structure+and+mechanical+properties%3A+an+experimental+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis.</a> Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).</li>
<li>Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+cell+disease+activates+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+induce+cathepsins+k+and+v+activity+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anemia%22%5BJournal%5D)">Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells.</a> Anemia. 2012, 201781(2012).</li>
<li>Allison, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+sickle-cell+haemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Properties of sickle-cell haemoglobin.</a> Biochemical Journal. 65, 212(1957).</li>
<li>Kuehl, R. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuehl%2C+RO+%22Design+of+experiments+%3A+statistical+principles+of+research+design+and+analysis%22">Design of experiments : statistical principles of research design and analysis</a>. , 2nd ed, Cengage Learning. Pacific Grove, CA. (2000).</li>
<li>Lindman, H. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindman%2C+HR+%22Analysis+of+variance+in+experimental+designs%22">Analysis of variance in experimental designs</a>. , Springer-Verlag Publishing. New York, N.Y., USA. (1992).</li>
<li>Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastable+Mesoscopic+Clusters+in+Solutions+of+Sickle-Cell+Hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin.</a> Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).</li>
<li>Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+study+on+the+dissolution+of+mural+fibrin+clots+by+tissue-type+plasminogen+activator%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator.</a> Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).</li>
<li>Sazonova, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((127+Mathematic+model+of+fibrin+clot+lysis+by+plasmin%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrinolysis+and+Proteolysis%22%5BJournal%5D)">127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin.</a> Fibrinolysis and Proteolysis. 12, Suppl 1. 45(1998).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Hastalık durumlarında, pıhtılaşma mekanizmalarının yapısı anlamlı veriler elde etmek için, bu koşullar altında, protein ve hücre etkilerini belirlemek için pıhtılaşma faktörleri izole etmek için önemlidir. Bu protokol in vitro diyabetik ve OHA devletler fibrin pıhtı yapısını araştıran amacıyla geliştirilmiştir. Bu değiştirilmiş koşullar hiperkoagülasyon, Aterotrombozu ve KVH neden beri hastalık durumlarında fibrin oluşumu ve fibrinoliz yer alan mekanizmaları anlamak için gereklidir....

Bir kan geminin endotel astar yaralanması hemostatik yanıt, ya da bir kan pıhtısı oluşumu ile tamir edilir. Kan hücre dışı matris içine nüfuz zaman, doku faktörleri koagülasyon kaskad başlatılmasını kolaylaştırmak, kan akışında trombositleri aktive. Bu iyileşme sürecinin önemli mekanik parça son derece esnek olan fibrin liflerden oluşan fibrin matrisi, ve büyük kuvvetler 1-4 muhafaza eder. Birçok araştırmacı yoğun geçmiş yıllarda 5-13 fibrin oluşumu yapısı ve fonksiyonu inceledik. Diabetes mellitus ve orak hücre olarak hastalıkları olan hastalar gibi miyokard enfarktüsü, iskemik kalp hastalığı gibi trombotik komplikasyonların gelişme riski, ve 14-19 okşar. 2 milyondan fazla insan yeni Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde her yıl diyabet tanısı konur. Tip I nerede,: diyabet iki türü vardırvücut insülin dirençli hale insülin ve Tip II, yeterli miktarda üretemez. Diyabetik hastalarda, kardiyovasküler hastalık (CVD) hastalığı 20,21 ile ilişkili morbidite ve mortalitenin% 80 nedenidir. Orak hücre hastalığı (SCD) Amerika Birleşik Devletleri 22 100.000&#39;den fazla insanı etkileyen bir genetik kan hastalığıdır. OHA zor hücreler, kan damar 23 geçmesi için yapım, hilal şeklinde olmak üzere, kırmızı kan hücrelerinin neden olan bir nokta mutasyon hastalıktır. Bu hastalık durumlarının her iki gövde aterosklerotik durumları geliştirme ihtimalini artırır. Bunun nedenlerinden biri, hastalıklı devletlerin 14,24-26 değişmiş fibrin yapısı ve fonksiyonu bir sonucudur. Her iki diyabet ve orak hücre hastalığında, hiperkoagülasyon ve Aterotrombozu ve kardiyovasküler hastalık neden olur hipofibrinolizin aktivitesi (C varVD) sağlıklı hastalarda 17,27,28 ile karşılaştırıldığında. Bu hipofibrinolizin aterosklerozun ilerlemesini teşvik eder ve erken koroner arter hastalığı 29 olan hastalar için tekrarlayan iskemik olayları doğurur bilinmektedir. Mevcut yazıda, bu özel ortamda fibrin fiziksel özelliklerinin rolü araştırıldı. Olmayan hastalıklı hastalarda fibrin pıhtısı yapıları, ince lifler, daha büyük gözenekleri ve daha az yoğun, genellikle 14,24 oluşmaktadır. Sağlıklı hastalarda artan bir geçirgenliğe ve daha az yoğun bir fibrin pıhtısı fibrinoliz 16 kolaylaştırmak için tespit edilmiştir. Diyabetik ve orak hücre hastalığı gibi hyperthrombotic koşullarda sağlıklı hastalarda 30-33 2.5 mg / ml, normal seviyelerine artış fibrinojen neden fibrinojen üretiminde bir artış vardır. Sağlıklı, sigara dia göre diyabetik hastalarda oluşan fibrin pıhtılar daha fazla dal noktalarını, ve daha yoğun, daha sert ve daha az gözenekli olduğu tespit edilmiştirdiyabetik hastalarda 14,24,33-35. değiştirilmiş fibril bağları pıhtı oluşumunda rol oynayan proteinlerde meydana gelen glikozilasyon mekanizmasının bir sonucudur. Glukoz molekülleri, uygun bir şekilde çapraz bağlama glutamin ve lisin tortuları 33,36,37 insan faktör XIIIa (FXIIIa) inhibe fibrinojen molekülü, lizin artıklarının bağlanan zaman Enzimatik olmayan (geri dönüşümsüz) glikasyonu oluşur. Fibrin ağlarının yapısal analiz son zamanlarda yoğun çalışılmıştır. Özellikle, araştırmacılar elektron mikroskobu ve intravasküler (endotel) hücreleri ve ekstravasküler (fibroblastlar ve düz kas) hem hücreler fibrin yapıları 40 analiz fibrin yapısı 39, kullanılan viskoelastik ve spektral analiz nasıl etkilediğini araştırdık fibrin ağları 38, 3D rekonstrüksiyon ve kullanmıştır Fibrin yapısı ve mekanik özellikleri arasında gelişmiş korelasyon deneysel kullanarak ve hesaplamalı yaklaşımlar 41 </sup&gt;. Bu çalışmanın odak simüle diyabetik ve orak hücreli tromboz koşulları altında pıhtı yapıları formüle etmek ve hastalıklı devletlerin pıhtı yapısının incelenmesi ve işlevi için konfokal mikroskopi kullanımı idi. Fibrin pıhtılar insan fibrinojen, insan trombini ve FXIIIa oluşmuş. pıhtılar plazmin kullanılarak lize edilmiştir. Diyabetik koşulların simüle edilmesi için, fibrinojen artan konsantrasyonu, in vitro olarak fibrinojen glikasyonunu uyarılması için glikoz çözeltisi içinde kuluçkalanmıştır. Orak hücre hastalığı pıhtılaşma koşulları simüle etmek için, artmış fibrinojen konsantrasyonları grubumuza 42 tarafından daha önce yapıldığı gibi hastalardan toplanan orak hücre hematokrit ile karıştırıldı. Bu yöntemler, yapı ve hastalıklı koşullar altında, fibrin pıhtısı oluşumu ve fibrinolizde rol alan ve fonksiyonları, yanı sıra CVD neden mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Bu hastalıklar hakkında güncel bilgilere dayanarak, glike fibrin pıhtı yapıları daha az a ile yoğun olduğunund küçük gözenekler. Orak hücre hastalarında (eritrositler) kırmızı kan hücreleri ile fibrin pıhtıları da yoğun ve eritrosit agregasyonunu ve aglomere fibrin kümeleri görüntülenir. Bu, daha önce 43 tespit edilmiştir köklü bir olgudur. Ayrıca fibrinoliz oranı ile sağlıklı, normal bir fibrin kıyasla azalmış plazmin olmadan glike fibrin pıhtıları anlamlı olarak düşük olacağı varsayılmıştır. Sonuçlar, glikolize fibrin pıhtılaşması için önemli ölçüde farklı lisis oranı sonuçları yalnızca sınırlı plazmin konsantrasyonu durumunda görüldüğünü göstermiştir. Hücreler ve proteinler pıhtılaşma faaliyetinin gerçek zamanlı video yakalama sağlayan kendi ana devlet kalır, çünkü konfokal mikroskopi kullanılarak bu deneysel tekniği diğer görüntüleme yöntemlerine göre önemli avantajlar sunmaktadır. Sentetik indükleyici pıhtılaşma Bu yöntem, hasta örnekleri elde etmek ve bireysel filtreleyerek daha da ucuz ve daha fazla zaman verimliproteinler ve enzimler. Örnekler arasında değişkenlik plazma diğer proteinler sonucu olmadığını Bundan başka, pıhtı sentezlenmesi için ayrılmış proteinler ve enzimler kullanarak, pıhtılar standardize edildi.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque (hidrofilik polisakkarit)</td><td>GE Healthcare</td><td>45-001-749</td><td></td></tr><tr><td>10 ml heparinize vakutainer tüpler</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Fibrinojen</td><td>Enzim Araştırma Laboratuvarları</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 insan fibrinojen konjugatı</td><td>Moleküler Problar</td><td>F13191</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml dereceli mikrosantrifüj tüpü</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz tozu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15023-02</td><td></td></tr><tr><td>FXIIIa</td><td>Enzim Araştırma Laboratuvarları</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>VIS Konfokal Mikroskop</td><td>Zeiss LSM 510</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris</td><td>Lonza</td><td>S50-642</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiD hücre etiketleme çözümü</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>L7781</td><td></td></tr><tr><td>Plazmin</td><td>Enzim Araştırma Laboratuvarları</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür (5 M NaCl)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>İstatistiksel Modelleme Yazılımı</td><td>IBM</td><td>SPSS İstatistikleri 22</td><td></td></tr></tbody></table>

normal ve hastalıklı devletleri&#39;nde fibrin pıhtısı yapıları incelenmesi için deneysel ve görüntüleme teknikleri

Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States

Fibrin, kan pıhtılarının yapısal bütünlüğünü korumaktan sorumlu olan hücre dışı bir matriks proteinidir. Son yıllarda fibrin ile ilgili çok sayıda araştırma yapılmıştır ve pıhtıların sentezi, yapısı-fonksiyonu ve parçalanmasının araştırılmasını içermektedir. Bununla birlikte, hastalıklı hastalardan kaynaklanan pıhtıların morfolojik ve yapısal özellikleri hakkında hala çok fazla bilinmeyen vardır. Bu araştırma çalışmasında, diyabet ve orak hücreli anemi gibi hastalıklı durumlara bağlı anormal pıhtı yapılarının morfolojik farklılıklarının incelenmesine olanak sağlayan deneysel teknikler sunulmuştur. Çalışmamız, çeşitli deneysel testler ve konfokal mikroskopi kullanarak morfolojik farklılıkları değerlendirmek için fibrin pıhtılarının hazırlanması ve değerlendirilmesine odaklanmaktadır. Ek olarak, fibrin pıhtılarındaki lizis oranlarının sürekli, gerçek zamanlı olarak hesaplanmasına izin veren bir yöntem de açıklanmaktadır. Burada açıklanan teknikler, diyabet veya orak hücre hastalığı olan hastalarda miyokard enfarktüsü, iskemik kalp hastalığı ve felç gibi komorbid trombotik patolojileri aydınlatmaya çalışan araştırmacılar ve klinisyenler için önemlidir.

Glike Fibrin pıhtı Yapıların Konfokal Mikroskopi Analizi Normal ve glikolize pıhtı konfokal mikroskobu görüntüleri. Şekil 3'te sunulmuştur normal ve glikolize pıhtı mikroskopisi analizi Glike pıhtılar daha yoğun olan ve pıhtı polimerizasyon sırasında FXIIIa ilavesi olmadan hem normal pıhtıları daha küçük gözeneklere sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Şekil 3A ve 3B, daha yüksek bir fibrin konsantrasyonu (Şekil 3C ve ...

Bu yazıda, hastalıklı durumlara bağlı normal ve anormal pıhtı yapıları arasındaki morfolojik farklılıkları incelemek için kan hazırlama, konfokal mikroskopi ve lizis hızı analizi gibi deneysel teknikler sunulmaktadır.

Normal ve Hastalıklı Devletleri&#39;nde Fibrin pıhtısı Yapıları incelenmesi için deneysel ve Görüntüleme Teknikleri

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on ...

Bu işlemin genel amacı, simüle edilmiş diyabetik pıhtılar için hastalık durumları olan diyabet ve orak hücreli anemide ortaya çıkan anormal pıhtı yapılarındaki morfolojik farklılıkları incelemektir. Bu, orak hücreli hastalardan alınan kan örnekleri için konfokal mikroskopi ile glikasyonlu pıhtı yapılarının görüntülenmesiyle gerçekleştirilir. Kırmızı kan hücreleri içeren fibrin pıhtıları gerçek zamanlı konfokal olarak görüntülenir.Daha sonra normal ve glikasyonlu pıhtı yapıları üzerindeki fibrinoliz oranlarını değerlendirmek için mikroskopi analizi yapılabilir. Sonuç olarak, bu gerçek zamanlı analiz, ortaya çıktıkları hastalık durumlarına yanıt olarak anormal pıhtı yapılarında meydana gelen morfolojik farklılıkları değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yöntem, tromboz ve hemostaz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin diyabet veya orak hücre hastalığı olan hastalarda fibrin pıhtı yapıları nasıl farklıdır?Simüle edilmiş diyabetik pıhtıları konfokal mikroskopi ile değerlendirmek için, önce insan fibrinojenini ve ısıtılmış çözeltiler insan fibrinojenine ve fibrinojen konjugatına bir glikoz trik sodyum klorür çözeltisi içinde karıştırıldığında 37 santigrat derecede floresan olarak işaretlenmiş %10 floresan etiketli insan fibrinojen konjugatını çözün ve çözeltiyi 37 santigrat derece su banyosunda 48 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun sonuna yaklaşırken, bir oda yapmak için bir cam mikroskop lamının iki tarafına ince bir yapıştırıcı yapıştırmak için sıvı olmayan bazlı bir yapıştırıcı kullanın, daha sonra oda sıcaklığı faktörü 13 ve trombin ile bir fibrinojen solüsyonunu 50 mikrolitrelik bir nihai hacme karıştırın ve hemen 30 mikrolitre fibrin solüsyonunu mikroskop lam odasına aktarın. Şimdi, yapıştırıcının üzerine 15 milimetre kalınlığında bir nokta ile 22 x 22 milimetrelik bir cam kapak fişi yerleştirin ve yapıştırıcının pıhtı ile etkileşime girmemesine dikkat ederek haznenin açık taraflarını şeffaf bir yapıştırıcı ile kapatın.Fibrin pıhtılarının iki saat boyunca 21 ila 23 santigrat derecede polimerize olmasına izin verin. Daha sonra orak hücreli hastalardan alınan pıhtıları değerlendirmek için 40 x objektif ve 488 nanometre argon lazer kullanarak pıhtıların konfokal mikroskopi görüntülerini elde edin. İlk olarak, kırmızı kan hücresi örneğini serum serbest hücre kültürü ortamında mililitre başına 1 milyon hücrede seyreltin ve hücreleri nazikçe pipetleme ile uygun hücre etiketleme çözeltisinin beş mikrolitresi ile karıştırın.37 santigrat derecede 20 dakika sonra, hücreler santrifüjde iken hücreleri 37 santigrat derece ortamda üç kez yıkayın, taze hazırlanmış fibrinojen çözeltisi faktör 13 ve trombini az önce gösterildiği gibi karıştırın. Daha sonra etiketli kırmızı kan hücrelerinin 10 mikrolitresini fibrin çözeltisine aktarın ve hemen 30 mikrolitre hücre çözeltisini yapışkan bir odaya dağıtın. Bir cam mikroskop lamında, fibrinin iki saat sonra 21 ila 23 santigrat derecede polimerize olmasına izin verin, floresan etiketli fibrin ve kırmızı kan hücrelerini uyarmak için sırasıyla 488 nanometre ve 633 nanometre dalga boylarına sahip uyarma lazerleri kullanarak pıhtıların konfokal görüntülerini elde edin.Fibrinoliz oranlarını ve glikasyonlu pıhtı yapılarını değerlendirmek için önce bu sefer gösterildiği gibi glikasyonlu pıhtıları hazırlayın. Bununla birlikte, fibrin pıhtı çözeltisini yapışkan hazneye dağıttıktan sonra, haznenin uçlarını kapatmayın. Bunun yerine, dehidrasyonu önlemek için pıhtıların 250 mililitre su içeren kapalı bir muhafaza içinde 21 ila 23 santigrat derecede polimerize olmasına izin verin.Bir buçuk saat sonra, az önce gösterildiği gibi konfokal mikroskopi ile pıhtıların görüntülerini elde edin. Daha sonra haznenin açık ucuna 25 mikrolitre plazmin pipetleyin ve plazminin kılcal hareketle pıhtı boyunca dağılmasına izin verin. Son olarak, konfokal mikroskop yazılımının zaman serisi özelliklerini açın, edinme moduna tıklayın ve zaman serisini seçin.Ardından, plazmin kaynaklı pıhtı lizizinin gerçek zamanlı video görüntülerini yakalamak için döngü sayısını ve kayıt zaman aralığını seçin Normal ve glikasyonlu pıhtıların analizi, pıhtı polimerizasyonu sırasında faktör 13 ilavesi olsun ve olmasın, glikasyonlu pıhtıların normal pıhtılardan daha küçük gözeneklerle daha yoğun olduğunu ortaya koymaktadır. Gerçekten de, BM glikasyonlu pıhtılarda, daha yüksek bir fibrin konsantrasyonu içeren glikasyonlu pıhtılarda gözlenenden daha az yoğun bir yapı oluşturan daha düşük bir fibrin konsantrasyonu vardır. Orak hücreli hastalardan elde edilen fibrin pıhtıları, kırmızı kan hücreleri içerir ve bu bireylerde artan fibrinojen konsantrasyonu nedeniyle sağlıklı fibrin pıhtılarından daha yoğun yapılar sergiler.Ayrıca, orak hücreli hastalardan alınan kırmızı kan hücrelerinin agregalar ve cinsiyetler, fibrin ağına iç içe geçen kırmızı kan hücrelerinin kümeleri oluşturma eğilimi, morfolojide normal hastalarda gözlenenlerden belirgin şekilde farklı olan anormal pıhtı yapılarının oluşumuna neden olur. Son olarak, normal ve glikasyonlu pıhtıların fibrinoliz oranlarının analizi, simüle edilmiş diyabetik pıhtıların yeterli plazmin yokluğunda fibrin yapma yeteneğinin önemli ölçüde bozulduğunu göstermektedir. Bu araştırma, özellikle orak hücre hastalığı ve diyabetin bir sonucu olarak komorbid patolojiler geliştiren hastalar için tromboz ve hemostaz alanındaki araştırmacıların önünü açmaya yardımcı olacaktır.

experimental-imaging-techniques-for-examining-fibrin-clot-structures

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kaynak: Kim, D., et. al. Serebral Tromboemboliyi Doğrudan Görselleştirmek için Yakın Kızılötesi Floresan Görüntüleme ve Mikro Bilgisayarlı Tomografi. J. Vis. Uzm.  (2016)Bu video, mikro bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) görüntüleme kullanılarak farelerde serebral trombüsün görselleştirilmesini göstermektedir. Bir serebral trombüs fare modeline, kontrast bir ajan olarak işlev gören fibrin hedefli altın nanopartiküller enjekte edilir. Fare, bir mikro-CT makinesinin yatağına yerleştirilir ve...

Mikro Bilgisayarlı Tomografi Görüntüleme Kullanılarak Bir Farede Serebral Trombüsün Görselleştirilmesi

48 saatlik bir süre boyunca çevre kontrollü bir biyoreaktörde fibroblast aracılı jel sıkıştırma ve fibrin fiber yeniden hizalamayı gözlemlemek ve analiz etmek için zaman atlamalı mikroskopi ve görüntü işleme teknikleri kullanılmıştır.

Fibroblast aracılı Fibrin Jel Sıkıştırmayı Gözlemleme ve Ölçme

Bu protokol serebral emboli görselleştirmek için kombine yakın kızılötesi floresan (NIRF) görüntüleme ve mikro-bilgisayarlı tomografi (mikroBT) uygulanmasını açıklar. Bu teknik trombüs yükü ve evrim ölçümü sağlar. MikroBT'lerin tekniği altın nanopartiküller kullanarak canlı hayvan içinde trombüs görüntüler ise NIRF görüntüleme tekniği floresan, eksize beyinde trombüs etiketli görselleştirir.

Doğrudan Serebral emboli görselleştirme için Kombine Yakın kızılötesi Floresan Görüntüleme ve Mikro bilgisayarlı Tomografi

Bu çalışma, trombosit yapışması, yayılması ve akış altında salgı çalışması için bir floresan mikroskopi tabanlı yöntem açıklanmaktadır. Bu çok yönlü platform tromboz ve hemostaz üzerine mekanik araştırma için trombosit fonksiyonunun araştırılmasını sağlar.

Akım altında Trombosit Degranülasyonu ve Salgılamanın Canlı Hücreli Görüntüleme

Burada sunulan tek tek veya birlikte fibrin pıhtısı yapısı üzerinde beta-amiloid etkisini analiz için kullanılan iki yöntem vardır. Vitro fibrin pıhtısı oluşturma takip için pıhtı bulanıklık ve Tarama elektron mikroskobu ile yöntemleri dahil bir protokoldür.

β-amiloid-indüklenen anormallikler Fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama Analizi

Hasta kaynaklı endotel ile tam kan etkileşimini araştırmak için in vitro vasküler hastalık modeli salıyoruz. Bu sistem çeşitli koşullar altında primer endotel hücrelerinin trombojenik özelliklerinin incelenmesini sağlar. Bu yöntem özellikle pıhtılaşmanın farklı aşamalarında situ trombojenite ve antikoagülasyon tedavisinin değerlendirilmesi için uygundur.

In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma

Fibrin hemostaz ve tromboz sırasında pıhtı oluşumundan sorumludur. Bulanıklık tahlilleri ve tromboelastograhy (TEG) bir pıhtı tamamlayıcı değerlendirme sağlayan sinerjik araçlar olarak kullanılabilir. Bu iki teknik birlikte pıhtılaşma koşulları fibrin pıhtı oluşumunu nasıl etkilediği hakkında daha fazla fikir verebilir.

Tamamlayıcı Pıhtı Karakterizasyonu için Bulanıklık ve Tromboelastografiden Yararlanma

Bu protokol, arteriyel trombozu indüklemek için FeCl3 aracılı bir yaralanmanın nasıl kullanılacağını ve elektron mikroskobu analizi için trombozun çeşitli aşamalarında arteriyel yaralanma örneklerinin nasıl toplanacağını ve hazırlanacağını açıklamaktadır.

Ferrik Klorür Kaynaklı Arteriyel Tromboz ve 3D Elektron Mikroskobu Analizi için Numune Toplama

Bu çalışma, pıhtı eritme, hücre boyama ve rutin kan muayenesi yoluyla serebral kan pıhtılarının hücre bileşen analizi için hızlı ve etkili bir yöntemi tanımlamaktadır.

Serebral Kan Pıhtılarının Hücre Bileşenlerini Analiz Etmek İçin Kapsamlı Bir Yaklaşım

İn vitro tromboliz deneyleri, ister model trombüsün sindirildiği ortamda ister trombolizin meydana geldiği ortamda olsun, in vivo koşulları tekrarlamak için sıklıkla mücadele etmiştir. Burada, Chandler döngüsü ve Gerçek Zamanlı Florometrik Akan Fibrinoliz Testinin (RT-FluFF) birleştirilmesinin yüksek kaliteli, ex-vivo, pıhtı lizisi izleme için nasıl kullanıldığını keşfediyoruz.

Bir İn Vitro Tromboliz Modelinde Kesme Akışı Altında Chandler Döngü Şeklinde Tam Kan Pıhtılarının Fibrinolizinin İzlenmesi

Bu çalışma, kanda trombus oluşumunu tetiklemek için kesme stresi kullanan ve trombü birden fazla boyutlu okuma ile karakterize eden bir mikrofluidik testi tanımlar. Bu test, kan örneklerinin protrombotik eğilimini ölçebilir ve bu nedenle hastalık teşhisi, ilaç keşfi ve trombozla ilgili temel mekanik çalışmalarda faydalıdır.

Trombus Profilleme Testi: Biyomekanik Trombogenezin Kapsamlı Karakterizasyonu İçin Mikrofluidik Tabanlı Bir Platform

Keşfedin diyabet ve orak hücre anemisinde fibrin pıhtı morfolojisindeki farklılıkları konfokal mikroskopi ile. Bu yöntem, glikasyonun fibrinoliz üzerindeki etkilerini değerlendirmeye yardımcı olur.

Normal ve Hastalıklı Devletleri'nde Fibrin pıhtısı Yapıları incelenmesi için deneysel ve Görüntüleme Teknikleri

Daha fazla video keşfet