Normal ve Hastalıklı Devletleri'nde Fibrin pıhtısı Yapıları incelenmesi için deneysel ve Görüntüleme Teknikleri

Bu işlemin genel amacı, simüle edilmiş diyabetik pıhtılar için hastalık durumları olan diyabet ve orak hücreli anemide ortaya çıkan anormal pıhtı yapılarındaki morfolojik farklılıkları incelemektir. Bu, orak hücreli hastalardan alınan kan örnekleri için konfokal mikroskopi ile glikasyonlu pıhtı yapılarının görüntülenmesiyle gerçekleştirilir. Kırmızı kan hücreleri içeren fibrin pıhtıları gerçek zamanlı konfokal olarak görüntülenir.

Daha sonra normal ve glikasyonlu pıhtı yapıları üzerindeki fibrinoliz oranlarını değerlendirmek için mikroskopi analizi yapılabilir. Sonuç olarak, bu gerçek zamanlı analiz, ortaya çıktıkları hastalık durumlarına yanıt olarak anormal pıhtı yapılarında meydana gelen morfolojik farklılıkları değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yöntem, tromboz ve hemostaz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin diyabet veya orak hücre hastalığı olan hastalarda fibrin pıhtı yapıları nasıl farklıdır?

Simüle edilmiş diyabetik pıhtıları konfokal mikroskopi ile değerlendirmek için, önce insan fibrinojenini ve ısıtılmış çözeltiler insan fibrinojenine ve fibrinojen konjugatına bir glikoz trik sodyum klorür çözeltisi içinde karıştırıldığında 37 santigrat derecede floresan olarak işaretlenmiş %10 floresan etiketli insan fibrinojen konjugatını çözün ve çözeltiyi 37 santigrat derece su banyosunda 48 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun sonuna yaklaşırken, bir oda yapmak için bir cam mikroskop lamının iki tarafına ince bir yapıştırıcı yapıştırmak için sıvı olmayan bazlı bir yapıştırıcı kullanın, daha sonra oda sıcaklığı faktörü 13 ve trombin ile bir fibrinojen solüsyonunu 50 mikrolitrelik bir nihai hacme karıştırın ve hemen 30 mikrolitre fibrin solüsyonunu mikroskop lam odasına aktarın. Şimdi, yapıştırıcının üzerine 15 milimetre kalınlığında bir nokta ile 22 x 22 milimetrelik bir cam kapak fişi yerleştirin ve yapıştırıcının pıhtı ile etkileşime girmemesine dikkat ederek haznenin açık taraflarını şeffaf bir yapıştırıcı ile kapatın.

Fibrin pıhtılarının iki saat boyunca 21 ila 23 santigrat derecede polimerize olmasına izin verin. Daha sonra orak hücreli hastalardan alınan pıhtıları değerlendirmek için 40 x objektif ve 488 nanometre argon lazer kullanarak pıhtıların konfokal mikroskopi görüntülerini elde edin. İlk olarak, kırmızı kan hücresi örneğini serum serbest hücre kültürü ortamında mililitre başına 1 milyon hücrede seyreltin ve hücreleri nazikçe pipetleme ile uygun hücre etiketleme çözeltisinin beş mikrolitresi ile karıştırın.

37 santigrat derecede 20 dakika sonra, hücreler santrifüjde iken hücreleri 37 santigrat derece ortamda üç kez yıkayın, taze hazırlanmış fibrinojen çözeltisi faktör 13 ve trombini az önce gösterildiği gibi karıştırın. Daha sonra etiketli kırmızı kan hücrelerinin 10 mikrolitresini fibrin çözeltisine aktarın ve hemen 30 mikrolitre hücre çözeltisini yapışkan bir odaya dağıtın. Bir cam mikroskop lamında, fibrinin iki saat sonra 21 ila 23 santigrat derecede polimerize olmasına izin verin, floresan etiketli fibrin ve kırmızı kan hücrelerini uyarmak için sırasıyla 488 nanometre ve 633 nanometre dalga boylarına sahip uyarma lazerleri kullanarak pıhtıların konfokal görüntülerini elde edin.

Fibrinoliz oranlarını ve glikasyonlu pıhtı yapılarını değerlendirmek için önce bu sefer gösterildiği gibi glikasyonlu pıhtıları hazırlayın. Bununla birlikte, fibrin pıhtı çözeltisini yapışkan hazneye dağıttıktan sonra, haznenin uçlarını kapatmayın. Bunun yerine, dehidrasyonu önlemek için pıhtıların 250 mililitre su içeren kapalı bir muhafaza içinde 21 ila 23 santigrat derecede polimerize olmasına izin verin.

Bir buçuk saat sonra, az önce gösterildiği gibi konfokal mikroskopi ile pıhtıların görüntülerini elde edin. Daha sonra haznenin açık ucuna 25 mikrolitre plazmin pipetleyin ve plazminin kılcal hareketle pıhtı boyunca dağılmasına izin verin. Son olarak, konfokal mikroskop yazılımının zaman serisi özelliklerini açın, edinme moduna tıklayın ve zaman serisini seçin.

Ardından, plazmin kaynaklı pıhtı lizizinin gerçek zamanlı video görüntülerini yakalamak için döngü sayısını ve kayıt zaman aralığını seçin Normal ve glikasyonlu pıhtıların analizi, pıhtı polimerizasyonu sırasında faktör 13 ilavesi olsun ve olmasın, glikasyonlu pıhtıların normal pıhtılardan daha küçük gözeneklerle daha yoğun olduğunu ortaya koymaktadır. Gerçekten de, BM glikasyonlu pıhtılarda, daha yüksek bir fibrin konsantrasyonu içeren glikasyonlu pıhtılarda gözlenenden daha az yoğun bir yapı oluşturan daha düşük bir fibrin konsantrasyonu vardır. Orak hücreli hastalardan elde edilen fibrin pıhtıları, kırmızı kan hücreleri içerir ve bu bireylerde artan fibrinojen konsantrasyonu nedeniyle sağlıklı fibrin pıhtılarından daha yoğun yapılar sergiler.

Ayrıca, orak hücreli hastalardan alınan kırmızı kan hücrelerinin agregalar ve cinsiyetler, fibrin ağına iç içe geçen kırmızı kan hücrelerinin kümeleri oluşturma eğilimi, morfolojide normal hastalarda gözlenenlerden belirgin şekilde farklı olan anormal pıhtı yapılarının oluşumuna neden olur. Son olarak, normal ve glikasyonlu pıhtıların fibrinoliz oranlarının analizi, simüle edilmiş diyabetik pıhtıların yeterli plazmin yokluğunda fibrin yapma yeteneğinin önemli ölçüde bozulduğunu göstermektedir. Bu araştırma, özellikle orak hücre hastalığı ve diyabetin bir sonucu olarak komorbid patolojiler geliştiren hastalar için tromboz ve hemostaz alanındaki araştırmacıların önünü açmaya yardımcı olacaktır.