Name: Metabolik Profil Gerçek Zamanlı Analizi Ex vivo Fare Bağırsak Crypt organoid Kültürleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Öğrenin fare bağırsak kript organoidlerinde gerçek zamanlı metabolik profil analizi yapmayı. XF 24 ekstraselüler akış analizörü kullanarak oksijen tüketimi ve asitifikasyon oranlarını ölçün.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe RO1 CA 135.561, R01 CA151494, R01 CA174432 ve P3013330 tarafından desteklenmiştir. Biz crypt izolasyon protokolünün geliştirilmesinde değerli yorumlarınız için Michele Houston, Elena Dhima ve Dr. Anna Velcich teşekkür etmek istiyorum. Biz de doğrudan ve sırasıyla, Denizatı tesisi işletmek Diyabet Eğitim ve NIH P60DK20541 tarafından desteklenen Tıp Albert Einstein College Araştırma Merkezi ve Dr. Michael Brownlee ve Dr. Xue-Liang Du, teşekkür ederim.

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu tavsiyeleri doğrultusunda gerçekleştirildi. Protokol Tıp Albert Einstein College Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylandı. 1. Crypt İzolasyon ve Kültürü <ol><li> İnce Barsak gelen Crypts İzolasyonu: <ol><li> Ilgi herhangi bir fare modeli bağırsak kriptaları izole eder. Servikal dislokasyon CO 2 ile fareler öldürülür. </li><li> Uzunlamasına karın aç ve buz soğuğu fosfat tamponlu tuzlu su ile, ince bağırsağa (SI) dolgu PBS (-Ca 2+; -MG 2+) 2x antibiyotik-antimikotik (Anti-anti) ile. Hızla ince bağırsağı izole. </li><li> İyice bir neşter kullanılarak mezenterik yağ içermeyen teşrih. Doku delmek için dikkatli olun - her zaman buz gibi soğuk PBS ile nemli doku tutmak at. Inte açınstine boyuna buz soğuk PBS ile iyice yıkayın ve. </li><li> Önceden soğutulmuş slayt kullanarak villusları kazıyın yavaşça, iki bölüme ince bağırsağı kesilmiş ve ıslak pamuk ucunu kullanarak doğrulmak. Buzla soğutulmuş PBS içinde birkaç kez sert biçimde yıkayın. </li><li> Doku enzimatik olmayan ayrılması için 3 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) /0.5 mM ditiotreitol (DTT), PBS başına 1 x 20 ml 3 dakika kuluçkalayın. </li><li> Önceden soğutulmuş bir sürgü üzerinde bir ustura kullanılmak suretiyle, küçük parçacıklar (2-4 mm) içine doku kesilir. 20 ml buz gibi soğuk PBS içeren 50 ml&#39;lik bir tüp içine parçaları aktarın. </li><li> Pipet yukarı ve aşağı yavaşça 10x 10 ml steril pipet kullanarak. Doku parçaları yerçekimi tarafından sediment edelim. Bir pipet ile süpernatantı. Üç ek kez tekrarlayın; emin süpernatant açık olduğundan emin olun. </li><li> 2 mM kadar EDTA başına 20 ml PBS ilave edin. Girdap ve hafif sallama ile 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Doku tortu edelim ve süpernatant atın. 15 ml buz gibi soğuk PBS ve pipet eklemeyukarı ve 10 ml pipet ile 5x aşağı. Doku parçaları sediment edelim ve Kesir 1 (F1) olarak süpernatant toplamak. F2-F5, ayrı ayrı tutulan her fraksiyonunun tekrarlayın. </li><li> 15 saniye boyunca elle kuvvetli bir şekilde 15 ml buz gibi soğuk PBS ve bu kez sallamak ekleyin. , F8 F6 toplayın ve F7 için tekrarlayın. Doku parçaları yüzer başlarsanız, onlara yerleşmek için dokunun. </li><li> Mikroskop altında her bir fraksiyonun bir kısım kontrol edin. Kriptaları ihtiva eden fraksiyonlar havuzda toplayın. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içinde kriptaları toplayarak, bir 70 um naylon hücre süzgecinden Bir araya toplanan fraksiyonlar geçirin. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüj, bir 15 ml tüp 2x Anti-anti ve transfer kriptlerin 10 ml buz gibi soğuk PBS süpernatan ve tekrar süspansiyon pelet atın. Yıkandıkları bir kez daha tekrarlayın. </li><li> 2x Anti-anti - 10 ml buz gibi soğuk ADF Gelişmiş DMEM / F-12 (Dulbecco&#39;nun &#39;nin Modifiye Eagle Ortamı / Ham &quot;, F-12) ile bir kez kriptaları yıkayın. </li><li> Bir kez kript 10 mi A ile yıkayınDF - anti-anti 1x. </li><li> Hemasitometre kullanarak kriptaları saymak. Crypt çözüm ses seviyesini ayarlama ve yeniden süspanse nihai crypt konsantrasyon jelatinli protein karışımı (Matrıgel) 50 ul başına 100-500 kriptler olacak şekilde 1.5 ml tüp transfer. Jelatinimsi protein karışımı 4 ° C ve tekrar süspansiyon kriptlerin C&#39;de 5 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Levha kriptalarının 50 ul - 24 oyuklu bir plaka içerisinde, oyuk başına, jelatinimsi bir protein karışımı, süspansiyon (büyüme alanı: 2 cm2), dikkatli bir şekilde her bir merkezinde süspansiyonu damla yerleştirilmektedir. Bir CO 2 süspansiyon katılaşan ~ 30 dakika kadar 37 ° C inkübatör plaka koruyun. </li><li> 500 ul buz gibi soğuk tam kültür ortamı (İleri DMEM / 1x anti F12 ekleme anti -, 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), 1 x GlutaMAX, 1 x B27 eki, 1 kez N2 Ek, 1mM N-Asetil-L-Sistein (NAC), 50 ng / ml Epidermal büyüme faktörü (EGF), 100 ng / mlNoggin, 500 ng / ml R Spondin). <ol><li> PBS içinde% 0.1 Sığır Serum Albumin (BSA), büyüme faktörleri sulandırın. </li></ol></li></ol></li><li> Crypt organoid Kültür ve Passage: <ol><li> Passage crypt organoids 14-21 gün sonrası tohumlama (ya da gerektiği gibi) aşağıdaki gibi: <ol><li> Değişim medya her Cuma ve Pazartesi. Çarşamba günleri, taze medya ile yarım ortamı değiştirin. </li></ol></li><li> Kültür ortamı çıkarın. 5 dakikalık aralıklarla, 500 ul PBS ile iki kez örnek yıkayın. </li><li> PBS çıkarın ve yavaşça bir steril P1000 mikro pipet kullanarak jelatinli protein karışımı break up. </li><li> Bir tek yuva, 1 ml tam kültür ortamı ilave edin ve 1 ml&#39;lik ortam maddesi organoids tekrar süspansiyon. </li><li> Yavaşça yukarı pipetleme ve 20-30x aşağı P1000 kullanılarak organoids bozabilir (tutarlı bir teknikle kadar iyi bir crypt verim ile doğru organoid ayrışması için mikroskop altında kontrol geliştirilmiştir). </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüp kriptaları aktarın;4 ° C&#39;de 5 dakika 100 x g&#39;de santrifüj. </li><li> 1 mi tam kültür ortamı ile iki kez pelet yıkayın. </li><li> Oyuk başına 50 ul Matrigel gerekli yeniden süspansiyon haline getirilmesi kript olarak 6: 3 veya 1: 1 oranında ayrıldı. (Bölüm 1.1.16-18) yukarıda açıklandığı gibi devam edin. </li></ol></li><li> Crypt organoid Donma: <ol><li> Kültür ortamı çıkarın. 500 ul PBS içinde örnek yıkayın. </li><li> P1000 pipet kullanarak jelatinli protein karışımı dağıtmak. </li><li> Bir tek yuva, 1 ml ortam ilave edilir ve 1 ml&#39;lik ortam maddesi organoids tekrar süspansiyon. </li><li> Yavaşça aşağı 20-30x yukarı pipetleme ve bir P1000 kullanılarak organoids break up. </li><li> 1.5 ml&#39;lik bir tüpe organoids aktarın. 4 ° C&#39;de 5 dakika 100 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 1 mi tam kültür ortamı ile iki kez pelet yıkayın. </li><li> Medya dondurma 500 ul süspanse kriptler. </li><li> Bir cryotube Transfer kriptler, -80 ° C dondurucu overni bir dondurma kabı ve mağaza tüp yeriGHT. </li><li> Sıvı N 2 tankına kriptaları aktarın. <ol><li> Hızla 37 ° C su banyosunda çözülme dondurulmuş crypt organoids kurtarın. Yukarıda açıklandığı gibi 100 xg, jelatinimsi protein karışımı 5 dakika ve tekrar süspansiyon ve kültüre 500 ul ile tam bir kültür kez medya, santrifüj yıkayın. Daha iyi elde edilmesi için, dondurma ortamına ROCK inhibitörü (Y-27632) ekleyin. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Crypt organoid metabolizma analizlerinde <ol><li> 24 oyuklu plaka hazırlanması: <ol><li> Yalıtmak ve protokol (crypt izolasyon ve kript geçiş için bölüm 1.2 için bölüm 1.1) göre kriptaları saymak. </li><li> Jelatinimsi protein karışımı içinde süspanse kriptler (20 ul başına 100-200 kriptler). </li><li> 24 oyuklu bir deney plakasında Levha kript jelatinimsi-protein karışımının süspansiyonu (her bir örnek için en az üç kez orada emin olun) eklenmiş ve süspansiyon, bir CO2 içinde 37 ° C&#39;de katılaşmaya izininkübatör; sonra 500 ul tam bir kültür ortamı ekleyin. </li><li> (1.1 bölümünde anlatıldığı gibi) ve kriptler tam gelişmiş organoids içine büyümeye kadar mikroskop altında gözlemlemek Kültür kriptler. </li></ol></li><li> Hücre dışı Akı Deneyi: <ol><li> Gece boyunca olmayan bir CO2 hidrat kartuşu (% 0 CO2), 37 ° C&#39;de kuluçka makinesine kondu. </li><li> Kültür Ortamı çıkarın ve 500 ul DMEM ile iki kez organoids yıkayın (olmamak üzere: glikoz, L-glutamin, sodyum piruvat ve sodyum bikarbonat, ile: fenol kırmızı). 5 dakika bekleyin. </li><li> Her bir oyuğa de tahlil ortamı başına (DMEM, 2 mM L-glutamin, 5 mM D-glükoz) ile 675 ul ekleyin. </li><li> Organoids ve jelatinimsi protein karışımının, yıkamadan sonra sağlam olmasını sağlamak için Crypt organoids mikroskobik morfoloji edin. Olmayan bir CO 2 &#39;de 1 saat, 37 ° C inkübatör inkübe edin. </li><li> 10 uM enjekte edilebilir bileşikleri (oligomycin, karbonil siyanit-p-trifloro-metoksi-fenil-hidrazon (FCCP) hazırlayın, rotenone) analiz ortamında. </li><li> Set-up kartuşu kartuş sıralı limanlarına içine 10 mcM enjektabl bileşiklerin 75 ul yüklenerek: Port A - oligomycin; Liman B - FCCP; ve C çıkışı - rotenon (deney sırasında son konsantrasyon 1 uM) olacaktır. </li><li> Kartuş 30 dakika kuluçkalayın - 37 ° C &#39;de 1 saat olmayan bir CO2 inkübatör içinde tutulur. </li><li> Aynı zamanda, XF Analyzer açmak ve tahlil protokol şablonu oluşturun. </li><li> Kartuşu &quot;kalibre&quot; XF Analyzer içine kartuşu ve yardımcı plakası yerleştirin ve çalıştırın. </li><li> Onlar jelatinimsi protein karışımına bağlı emin olmak için mikroskobik crypt organoids edin. </li><li> Enstrüman ve çalışma tahlil protokolü içine yük hücre kültürü plakası. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Jemal, A., et al. CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).</li>
<li>Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eating+patterns+and+risk+of+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Eating patterns and risk of colon cancer.</a> Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).</li>
<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li>
<li>Coles, N. W., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+in+Ehrlich+ascites-carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells.</a> Biochem J. 83, 284-291 (1962).</li>
<li>Medina, M. A., Castro I, N. unezde <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaminolysis+and+glycolysis+interactions+in+proliferant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells.</a> Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).</li>
<li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+changes+in+cancer+cells+upon+suppression+of+MYC%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC.</a> Cancer Metab. 1, 7(2013).</li>
<li>Malmgren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+changes+in+histone+modifications%2C+mRNA+levels%2C+and+metabolite+profiles+in+clonal+INS-1+832%2F13+%CE%B2-cells+accompany+functional+adaptations+to+lipotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 β-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity.</a> J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).</li>
<li>Whitehead, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li>
<li>Roig, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+epithelial+cells+derived+from+human+colon+biopsies+express+stem+cell+markers+and+differentiate+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro.</a> Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+LGR5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
</ol>

Hiçbir açıklama bulunmamaktadır.

Biz bazal hızının ölçülmesi sonra, kript metabolizması oligomycin, karbonil siyanit eklenmesi ile değerlendirildi. Oksijen tüketim oranı (OCR) ve 8 aylık bir fareden izole edilmiş ve organoids eks vivo haline kript hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) test ardışık -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) ve rotenon. 29 dakika boyunca (Şekil 2A ve 2B) - Bazal OCR ve bazal ECAR 0 kaydedildi. 29. dakikada, (bağlantı noktası A) oligomy...

Kolorektal kanser (CRC) Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde kanser ile ilişkili ölümlerin üçüncü önde gelen nedenidir. Sporadik kolon kanseri - yani o yaşamda daha sonra ortaya çıkan (&gt; 50 yaş) ve net bir predispozan genetik faktörler ile - için hesaplar ~ güçlü uzun vadeli beslenme şekilleri 1,2 etkilenir insidansı ile tüm vakaların% 80. Bu tümörler tümör hücre çoğalması 3-5 oranları yüksek izin ve belki de sürücü kısmen (glutaminolysis aracılığıyla) mevcuttur hücresel yapı blokları ve enerji yüksek konsantrasyonlarda yapabilir Warburg etkisi olarak bilinen oksidatif glikoliz bağımlılığı doğru metabolik kayma, sergi . Ince bağırsak kanserleri dahil olmak üzere kolon kanseri Çalışmaları yanı sıra diğer gastrointestinal kanserler tümör oluşumuna neden içine önemli bir bakış açısı sağlamaktadır. Det yardımcı olabilir gastrointestinal organ sistemlerinin normal yanlısı tümörijenik ve tümörijenik devletler arasındaki metabolik farklılıkları incelemektümör gelişimi için rölatif risk yanı sıra neoplazi erken algılama ermination. Ayrıca, mitokondriyal solunum ve glikoliz içeren bioenerjitik metabolizmasını anlamak hücre fizyolojisi, yaşlanma ve hastalık durumu bağırsak homeostazisini bozarak içine nasıl temel fikir verecektir. Dışı akı analizi için biyoenerjetiğin tahlil teknoloji kullanımı gerçek zamanlı 6,7 kültüründe büyüyen hücrelerde aynı anda mitokondriyal solunum ve glikoliz oranlarını değerlendirmek. Yakın zamana kadar, ince barsak, in vitro çalışmalar, iyi huylu veya habis tümörler 8,9 türetilmiş hücre çizgileri ile sınırlı ve normal bağırsak epitel fizyolojisini ve içinde bulundukları mikro-etkisini temsil etmedi. 2009 yılında, Sato ve ark. 10, bir ex vivo kültür üç boyutlu (3D) bir fare bağırsak epitelial organoids büyümeye sistemi ya da epith kişiyedeneysel tanı ve tedavi soruşturma 10,11 uygun Elial &quot;mini-cesaret&quot;. Ayrıca, kalorili sınırlı farelerden izole kript tür kültürlerde 12 organoids olarak değiştirilmiş büyüme özelliklerini korur. Dönüştürülmüş hücre kuşakları ile karşılaştırıldığında, kript Organoid kültürlerin in vivo durumunu anlamak için çok daha iyi bir model öne fizyolojik olarak ilgili verileri oluşturmak için kullanılabilir. Biz bağırsak crypt organoids enerji metabolizmasını tahlil biyoenerjetiğin analiz teknolojisi uyarlanmış. Fare bağırsak crypt organoids sunulan crypt organoid enerji metabolizması çalışmaları geliştirmektir ex vivo kültüre edildi. Oksijen kullanım oranı (OCR) ve kript organoids hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) yokluğunda ve iki farklı metabolik inhibitörler (oligomycin, rotenon) ve iyon taşıyıcısı (karbonil siyanür-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) varlığında ölçüldü. Crypt orgaBu kimyasal bileşiklere noid metabolik yanıt başarıyla değişen ECAR ve OCR değerleri üzerinden yansıtılmıştır. Hücresel bioenerjitik çalışmalar kanser, obezite, diyabet, metabolik bozukluklar ve mitokondriyal hastalıklar metabolik durumu ve hastalık riski ve fenotip arasındaki karşılıklı etkileşimleri aydınlatmak ve translasyonel tıp doğrudan etkisi olan avans tarama yöntemleri yardımcı olacaktır. Burada, biz detaylı bir protokol ince bağırsak kriptaları izole ve kültür kript organoids için açıklamak. Ayrıca, metabolik deneyleri için crypt organoid kültürleri kullanmak için yeni bir yöntem tanıtmak.

<table><tbody><tr><td>BD Matrigel Bodrum Membran Matrisi, GFR, Fenol Kırmızısı içermez, LDEV içermez</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>PBS (fosfat tamponlu salin), magnezyum yok, kalsiyum yok, pH 7.2</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>İleri DMEM/F-12 (1x)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco ve başbakan; s Modifiye Eagle & Prime; s Glikoz, L-glutamin, fenol kırmızısı, sodyum piruvat ve sodyum bikarbonat içermeyen ortam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Fenol kırmızı sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4758</td><td>DMEM'de Nihai Konsantrasyon 15 mg / l (D5030) - <güçlü>adım 2.2.2< / güçlü ></td></tr> <tr><td>Antibiyotik-Antimikotik, 100x, 100 ml</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15240-062</td><td>Nihai konsantrasyon 1x veya 2x</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomisin, sıvı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td>Nihai konsantrasyon 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg; GlutaMAX ve ticaret; ek</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>35050061</td><td>Son konsantrasyon 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg; HEPES (N-2-hidroksietilpiperazin-N-2-etan sülfonik asit), 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Nihai konsantrasyon 10 mM</td></tr><tr><td>N-asetil-L-sistein, 25 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td>Nihai konsantrasyon 1 mM</td></tr><tr><td>100x N-2 takviyesi, sıvı</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Nihai konsantrasyon 1x</td></tr><tr><td>50x B-27 & reg; takviye eksi A Vitamini, sıvı</td><td>Invitrogen</td><td>12587-010</td><td>Nihai konsantrasyon 1x</td></tr><tr><td>Rekombinant Fare R-Spondin 1, CF, 50 & mu; g</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>3474-RS-050</td><td>Nihai konsantrasyon 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinant Murin EGF, 100 & mu; g</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Nihai konsantrasyon 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinant Murin Noggin, 20 & mu; g</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Nihai konsantrasyon 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Gibco&reg; L-glutamin, 200 mM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25030-081</td><td>Nihai konsantrasyon 2 mM</td></tr><tr><td>Gibco&reg; glikoz tozu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15023-021</td><td>Nihai konsantrasyon 5 mM</td></tr><tr><td>Ambion&reg; 0,5 M EDTA (etilendiamintetraasetik asit), pH 8,0</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM9260G</td><td>Nihai konsantrasyon <güçlü>adım 1.1.5</güçlü> için 3 mM; <güçlü>adım 1.1.8</güçlü> için 2 mM</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>DTT (dithiothreitol), 1M</td><td>Life Technologies</td><td>P2325</td><td>Nihai konsantrasyon 3 mM</td></tr><tr><td>Sığır serumundan albümin (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td> PBS Fetal Sığır Serumu (FBS) içinde <td>%0.1</td></tr> <tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>PBS Recovery & trade'de %1</td></tr><tr><td>; Hücre Kültürü Dondurma Ortamı Yaşam</td><td>Teknolojileri</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitörü (Y-27632)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Nihai konsantrasyon 10 & mu; M:</td></tr><tr><td>Oligomisin</td><td>, Sigma-Aldrich,</td><td>O4876</td>, <td>Nihai konsantrasyon: 1 & mu; M</td></tr><tr><td>: Karbonil siyanür-p-trifloro-metoksi-fenil-hidrazon (FCCP)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>Nihai konsantrasyon 1 & mu; M</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Nihai konsantrasyon 1 & mu; M</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td> PBS XF24 Hücre Dışı Akı Analizöründe (XF Analizörü) <td>nihai konsantrasyon 0.1 N</td></tr> <tr><td>Denizatı Biyobilimi</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metabolik profil gerçek zamanlı analizi ex vivo fare bağırsak crypt organoid kültürleri

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Ince bağırsak mukoza iki temel yapıdan organize tekrarlayan bir mimari sergiler: villus, bağırsak lümen içine uzanan ve olgun enterocytes goblet hücreleri ve enteroendokrin hücrelerden oluşan; ve submukozası ve muskularis, barındıran yetişkin kök ve progenitör hücreler ve olgun Paneth hücrelerinin proksimaline yanı sıra stromal ve crypt mikroçevresinin bağışıklık hücrelerini ikamet kriptler. Son birkaç yıl öncesine kadar, ince barsak in vitro çalışmalar, iyi huylu veya kötü huylu ya da tümörlerden türetilmiş hücre çizgileri ile sınırlı olan ve normal bağırsak epitel fizyolojisini ve içinde bulundukları mikro-etkisini temsil etmedi. Burada, Sato et al adapte edilmiş bir metot. (2009), C57BL / 6 farelerinden elde edilen primer fare bağırsak kript organoids kültürlenmesi için göstermektedir. Buna ek olarak, biz tedbir gerçek zamanlı crypt metabolik profili tahlil için crypt organoid kültürlerin kullanımını sunmakBazal oksijen tüketimi, glikolitik oranı, ATP üretimi ve solunum kapasitesinin etkin kılar. Organoids onların kaynağı tarafından tanımlanan özelliklerini korumak ve oksijen tüketimi ve hücre dışı asidifikasyondaki yansıyan onların metabolik adaptasyon yönlerini yitirmemek. Bu crypt organoid kültür sisteminde gerçek zamanlı metabolik çalışmalar crypt organoid enerji metabolizmasını incelemek için güçlü bir araçtır ve nasıl beslenme ve farmakolojik faktörler tarafından modüle edilebilir.

Kript organoids 8 aylık bir C57BL / 6 farelerinden alınan oluşturulmuştur Beslenme 76A (AIN76A) kemirgen diyeti American Institute of arıtıldı yapıyordu. Bağırsak crypt organoids tek bir crypt (Şekil 1A, tek bir kırmızı ok) Uzun süre kültüründe yetiştirilebilir. Organoids kültürde 18-20 gün içinde (Şekil 1B, kırmızı oklar) kript benzeri yapılar büyür. Kriptler her 3 hafta geçirildi ve organoids verimli bir şekilde her geçmesinin ardından kurtarıldı. Hippocam...

Ince bağırsak crypt organoids kök hücreler ve onların niş bağımlı kriptalarının büyümesini özetlediği bir doku kültürü sistemi sağlamaktır ex vivo kültüre. Primer fare kript organoids gerçek zamanlı olarak metabolik profil tahlil etmek için bir yöntem kurulmuştur. Biz organoids onların kaynağı tarafından tanımlanan fizyolojik özelliklerini muhafaza bulundu.

Metabolik Profil Gerçek Zamanlı Analizi Ex vivo Fare Bağırsak Crypt organoid Kültürleri

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Bu prosedürün amacı, birincil fare kript organoidlerinin metabolik profilini gerçek zamanlı olarak analiz etmektir. Bu, önce farenin ince bağırsağının toplanması, ardından Andre'nin matrigel içinde bükülen bağırsak kriptlerinin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, kriptleri tamamen büyümüş kript organoidleri oluşturana kadar kültürlemektir.Bir sonraki adım, metabolik çalışmalar için bir kartuş tahlilinin hazırlanmasıdır. Son adım, kartuşu ve yardımcı plakayı XF 24 hücre dışı akı analizörüne yüklemek ve K kript organoidlerinin oksijen tüketim oranını ve hücre dışı asitlenme oranını ölçmek için hücre dışı akı analizi yapmaktır. Sonuç olarak, bu prosedür, birincil fare bağırsak kript organoidlerinin metabolik profilinin gerçek zamanlı olarak incelenmesine izin verir.Bu tekniğin, metabolik denemeler için hücre kültürü kullanmak gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bağırsak kripto organ metabolizmasını gerçek zamanlı olarak değerlendirmemize izin vermesidir. Organoid kültürler taklit eder, bağışıklık durumunu daha doğru hale getirir ve bu da daha fizyolojik ilgili verilerin üretilmesine yardımcı olur. Teknik, diğer XI 3D organoid kültürlerini analiz etmek için de genişletilebilir.Bu yöntem, tümör oluşumu sırasında ince bağırsak Kripsindeki metabolik değişikliklerin karakterize edilmesi ve normal ve hastalık durumlarının metabolizmasının karşılaştırılması gibi diyabet ve metabolizma araştırmaları gibi kanser alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu işleme başlamak için, ötenazi yapılmış bir farenin karnını uzunlamasına açın. İnce bağırsağı buz gibi soğuk kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ve iki x antibiyotik antimikotik ile doldurun.Daha sonra ince bağırsağı hızla izole edin. Mezenterik yağı bir neşter ile çıkarın. Tüm işlem boyunca dokuyu delmemeye ve buz gibi PBS ile dokuyu nemli tutmaya dikkat edin.Bağırsakları açın ve buz gibi PBS ile iyice yıkayın. Bundan sonra, ince bağırsağı iki bölüme ayırın. Islak bir pamuklu uç kullanarak düzleştirin.Ardından, bir preco slayt kullanarak VII'yi nazikçe kazıyın. Mendilleri buz gibi soğuk PBS'de birkaç kez kuvvetlice yıkayın. Daha sonra üç milimolar EDTA ve 0.5 milimolar DTT ile 20 mililitre bir XPBS'de üç dakika boyunca inkübe edin.Daha sonra, dokuları bir preko slayt üzerinde iki ila dört milimetrelik parçalar halinde kesin. Bir tıraş bıçağı kullanarak, parçaları 20 mililitre buz gibi soğuk PBS içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ardından, 10 mililitrelik steril tek kullanımlık pipet kullanarak 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.Doku parçaları yerçekimi ile yerleştikten sonra, SUP natum'u bir pipetle çıkarın. İşlemi üç kez daha tekrarlayın ve süpernatantın berrak olduğundan emin olun. Şimdi, doku parçalarını iki mili molar EDTA SW ile 20 mililitre PBS içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve karışımı hafifçe sallayarak 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Bundan sonra, dokunun yerleşmesine izin verin ve supinatı atın. 15 mililitre buz kömürü PBS ve boruları beş kez yukarı ve aşağı ekleyin. Doku parçalarının çökelmesine ve supinate'ı bir fraksiyon olarak toplamasına izin verin.İkinci kesirden beşinci kesire kadar toplamak için prosedürleri tekrarlayın ve kesirleri ayrı tutun. Daha sonra, PBS adı verilen 15 mililitre buz ekleyin ve 15 saniye boyunca elinizle kuvvetlice çalkalayın. Altıncı kesri toplayın ve yedinci kesir ve sekizinci kesir için prosedürleri tekrarlayın.Doku parçaları yüzmeye başlarsa, yerleşmelerine yardımcı olmak için tüpe hafifçe vurun. Daha sonra mikroskop altında her fraksiyonun bir alikotunu krips açısından inceleyin. Bu kötü bir kesir örneğidir ve bu iyi bir kesir örneğidir.Crips içerenleri bir araya getirin. Daha sonra, çekilen fraksiyonları 70 mikronluk bir naylon hücre süzgecinden geçirin ve Crips'i 50 mililitrelik bir tüpte toplayın. Daha sonra, numuneyi beş dakika, dört santigrat derece boyunca 100 kez G'de santrifüjleyin, supinatı atın ve PT'yi iki x antibiyotik antimikotik ile 10 mililitre buz gibi soğuk PBS'de yeniden askıya alın.Ardından Crips'i 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve yıkamayı bir kez daha tekrarlayın. Daha sonra, kriptleri bir kez 10 mililitre buz gibi, iki x antibiyotik antimikotik içeren A DF gelişmiş D-M-E-M-F 12 ile yıkayın. Daha sonra, kriptleri bir kez 10 mililitre bir x antibiyotik antimikotik içeren bir DF ile yıkayın.Bundan sonra, bir hemo sitometre kullanarak kriptleri sayın. Kript çözeltisi hacmini ayarlayın ve 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın, böylece yeniden süspanse edildiğinde nihai kript konsantrasyonu 20 mikrolitre jelatinimsi protein karışımı başına 100 ila 200 kript olur. Daha sonra, kript çözeltisini dört santigrat derecede beş dakika boyunca 100 kez G'de santrifüjleyin.Sinamek'i çıkarın ve jelatinimsi protein karışımındaki kriptleri yeniden süspanse edin. Daha sonra, 24 oyuklu bir yardımcı plaka içinde oyuk başına 20 mikrolitre kript jelatinimsi protein karışımı süspansiyonu plakalayın. Plakayı, süspansiyon katılaşana kadar 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir CO2 inkübatöründe tutun.Daha sonra her bir oyuğa 500 mikrolitre buz gibi, tam kültür ortamı ekleyin ve Crips'i tamamen gelişmiş organoidlere dönüşene kadar kültürleyin Bu prosedürde, kartuşu gece boyunca 37 santigrat derecede karbondioksit olmayan bir inkübatörde nemlendirin. Daha sonra kültür ortamını çıkarın ve organoidleri 500 mikrolitre DMEM ile iki kez yıkayın. Beş dakika sonra, her birine 675 mikrolitre tahlil ortamı ekleyin.Öyleyse, kript organoidlerinin mikroskobik morfolojisini, bir saat boyunca 37 santigrat derecede karbondioksit olmayan bir inkübatörde inkübe etmek için kontrol edin. Daha sonra, tahlil ortamında 10 mikromolar enjekte edilebilir bileşik hazırlayın. Kartuşun portlarına sırayla 75 mikrolitre 10 mikromolar enjekte edilebilir bileşik yükleyerek kartuşu ayarlayın.Daha sonra, kartuşu 37 santigrat derecede karbondioksit olmayan bir inkübatörde 30 dakika ila bir saat boyunca inkübe edin. Eşzamanlı olarak, XF analizörünü açın ve tahlil protokolü şablonunu oluşturun. Kartuşu ve yardımcı plakayı XF analizörüne yerleştirin ve çalıştırın kartuşu kalibre edin Bundan sonra, hücre kültürü plakasını cihaza yükleyin ve testi çalıştırın.Burada gösterilen protokol, sekiz aylık bir C 57 siyah altı fareden iki gün veya 18 gün içinde türetilen kript organoidleridir. Kültür. Bu şekil, oksijen tüketim oranının ve hücre dışı asitlenme oranının sunulduğu sekiz aylık C 57 siyah altı fareden türetilen organoidler kullanılarak yapılan metabolik tahlili göstermektedir. Kriptler kırmızı ile gösterilir ve kontrol mavi ile gösterilir.Kartuşa önceden yüklenmiş reaktifler, bir oligo misin, BFCCP ve C rotenon olarak sırayla enjekte edildi. Bu teknik, kanser ve metabolizma alanındaki araştırmacıların hasta kaynaklı kript organoidlerindeki metabolik değişiklikleri keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, bağırsak kriptini, organoid metabolizmasını gerçek zamanlı olarak nasıl ölçeceğinizi iyi anlamalısınız.İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.

real-time-analysis-metabolic-profile-ex-vivo-mouse-intestinal-crypt

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, bir farenin ince bağırsağından tüm kriptoları izole etmek için bir teknik gösteriyoruz. İzole edilmiş bütün kriptler, in vitro olarak uzun ömürlü ve kendi kendini yenileyen 3D organoidleri çoğaltmak için kullanılabilir.

Bağırsak Kriptleri İzolasyonu: Murin Modelinin İnce Bağırsağından Tüm Kriptleri İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Geliştirilmiş görüntüleme teknolojisi, gelişim sırasında organların üç boyutlu görüntülenmesine izin veriyor. Burada, fetal fare bağırsağında gelişmekte olan villusların canlı görüntülenmesine izin veren bütün bir organ kültürü sistemini tarif ediyoruz.

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi Ex vivo Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon

Bu video protokolünde, primer intestinal epitel organoidlerinde lentiviral transdüksiyonun ve bu kültürlerin kantitatif RT-PCR, RNA-mikroarray ve immünohistokimya ile işlenmesi ve aşağı akış analizinin adım adım açıklamasını veriyoruz.

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Burada, hasat korumak ve patojen ilişkili moleküler modelleri (PAMPS) ve Listeria monocytogenes fare ince bağırsak organoids tedavisi için bir protokol da gen ifadesi ve protein için uygun normalizasyon ağırlıklı olarak, tarif edilmektedir.

<em&gt; Ex Vivo</emFare Bağırsak Organoids ve&gt; Kültür ve Desen Tanıma Reseptör Uyarım

Biz adım adım talimatları tarif: 1) etkin bir şekilde bağırsak organoidleri Lenti-veya retroviral dönüştürücü için manyetik nano maddeler kullanarak mühendis ve 2) mühendislik organoidler dondurulmuş bölümler oluşturmak. Bu yaklaşım, akım etkilerinin incelenmesi için organoidlerde gen ifadesini verimli bir şekilde değiştirmek için güçlü bir araç sağlar.

Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma

Bu makale, ex vivo deneyleri için yeni bir bağırsak organ kültürü sistemi kullanarak konak mikrobiyom etkileşimlerini analiz etmek için benzersiz bir yöntem salamaktadır.

Konak-Mikrobiyota Etkileşimlerini Analiz Etmek için Bağırsak Bağırsak Organ Kültürü Sistemi

Mevcut protokol, nitel görüntüleme ve nicel sitometri tahlilleri kullanarak bağırsak murine organoidlerindeki reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu çalışma, seçilen bileşiklerin ROS üzerindeki etkisini test etmek için potansiyel olarak diğer floresan problara genişletilebilir.

Murine Bağırsak Organoidlerinde Reaktif Oksijen Türlerine Duyarlı Florojenik Prob Kullanılarak Oksidatif Stresin Analizi

Bu protokol, bir klodin-7 nakavt modelinde kolonik kök hücrelerin aktivitesini ve işleyişini incelemek için bir murin kolonik organoid sisteminin kurulmasını açıklamaktadır.

Bağırsak Kök Hücre Fonksiyonunu Incelemek için Murin Kolonik Kriptlerinin Üç Boyutlu Kültürü Ex Vivo

3 boyutlu kolonoidlerin gelişimi için murin kolonik kriptlerinin izolasyonunu detaylandıran bir protokol açıklıyoruz. Yerleşik kolonoidler daha sonra, enflamatuar bir meydan okuma almadan veya bir epitelyal tek tabaka oluşturmaya yönlendirilmeden önce konakçı epitelinin hücresel bileşimini yansıtacak şekilde terminal olarak farklılaştırılabilir.

İntestinal İnflamasyonun Yerleşik Murin Kolonoidleri Üzerindeki İn Vitro Epitelyal Etkilerinin İncelenmesi

Murin ince bağırsak kriptlerini ve kültür bağırsak 3D organoidlerini kriptlerden izole etmek için bir protokol tarif ediyoruz. Ek olarak, bir alt epitelyal hücresel nişin yokluğunda tek bir bağırsak kök hücresinden organoidler üretmek için bir yöntem tarif ediyoruz.

Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürlenmesi ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre

Öğrenin fare bağırsak kript organoidlerinde gerçek zamanlı metabolik profil analizi yapmayı. XF 24 ekstraselüler akış analizörü kullanarak oksijen tüketimi ve asitifikasyon oranlarını ölçün.

Metabolik Profil Gerçek Zamanlı Analizi Ex vivo Fare Bağırsak Crypt organoid Kültürleri

Daha fazla video keşfet