Name: Kullanımı Akson Kargo Hareketli Moleküler Motors Kompozisyon karakterize Kargo Haritalama Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Öğrenin, fare hipokampal nöronlarında mikroakışkan cihazlar ve canlı görüntüleme kullanarak kargo hareket yönü ile kinesin ve dinein gibi moleküler motor protein kompozisyonu arasındaki ilişkiyi haritalama yöntemini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yük haritalama analizlerini ölçmek için yazılımın uyarlanması ve geliştirilmesi konusundaki yardımları için Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman ve Daniel Whisler'e ve mikroakışkan cihazların yapımındaki yardımları için Emily Niederst'e teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen LBBG ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü'ne AG032180 NIH-NIA hibesi ile desteklenmiştir. LES, kısmen NIH Biyoinformatik Eğitim Hibesi T32 GM008806 tarafından desteklenmiştir, SEE, Damon Runyon Kanser Araştırma Vakfı Bursu, NIH Nöroplastisite Eğitim Hibesi AG000216 tarafından desteklenmiştir ve Ellison Tıp Vakfı Yaşlanmada Yeni Akademisyen Ödülü'nden bir hibe ile G.E.C, NIH / NCATS 1 TL1 ödül TR001114 ve Üniversite Bilim İnsanları Vakfı için Başarı Ödülleri tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneyler onaylı protokolleri takip ve araştırma hayvanların insancıl bakımı için kurumsal kurallarına göre yapılmıştır. Yenidoğan farenin dekapitasyon yoluyla kurban edilmiştir. Hücre Kültürü için mikroakışkan Cihazlar 1. Hazırlık <ol><li> Harris ve arkadaşları, 17-19 tarafından tarif edildiği gibi hipokampal nöronlar büyümesi için polidimetil siloksan (PDMS) mikroakışkan cihazlar hazırlayın. Aşağıda kargo haritalama protokole uyarlanmıştır bazı değişiklikler vardır. Not: mikroakışkan aygıtları da (Malzeme listesi) ticari olarak temin edilebilir, bir üretim tesisi, böylece erişim gerekli değildir. </li><li> Olanağına% 100 etanol ile üç kez su ve üç kez, ardından aseton ile üç kez yıkanarak No 1 ½ kapak bardak (24 x 40 mm) hazırlayın. Kullanılana kadar 4 ° C sıcaklıkta su içinde saklayın lamelleri. Bu tedaviler lamelleri cel ekilmesin- ile etkileşebilir enkaz temiz olduğundan emin olun yardımcıls, kirlenme ve hayatta. NOT: Aseton ve etanol inhalasyon, yutma, yanıcı ve göz teması (irritan) cilt teması (tahriş edici), durumunda tehlikeli. Resmi yönetmeliklere göre imha ediniz. </li><li> Ne zaman, kullanmak mikroakışkan cihaz başına 60 mm hücre kültürü çanak bir cam kapak yerleştirin ve kuru hava kirlenmesini önlemek için bir biyogüvenlik kabini içinde 45 dakika boyunca ortaya izin vermek için hazır. </li><li> Cihazları ustaları dışarı kesilir ve zımbalar rezervleri oluşturmak için kesilmiş sonra (Şekil 1A, B), sterilizasyon için 45 dakika için bir UV lambası ile donatılmış bir biyogüvenlik kabini içinde mikroakışkan kanalları yan-up ile koyun. NOT: en fazla 2 saat süreyle UV tedavi altına cihazları bırakmak PDMS bütünlüğünü etkileyebilir. </li><li> Mikroakışkan kanallar aşağı bakacak şekilde 60 mm plastik hücre kültürü çanak içinde her cam kapak üzerine bir cihaz yerleştirerek cihazlarını monte. Üst o hafif bir basınç uygulayınCihazın F, kapak camın için cihazın bir daimi olmayan bir sızdırmazlık temin etmek üzere (mikrokanallar dokunmaktan kaçının). Bir kapak ile, her 60 mm hücre kültürü çanak örtün. </li><li> Bir mikropipet kullanılarak, suyun akmasına izin vererek, üst iki mikroakışkan rezervuar (Şekil 1A, 1 ve 2), hücre kültürü dereceli su eklemek suretiyle aygıtları hidrat. Mikropipet, suyu buharlaştırmak ve mikro-akışkan haznesi 1 (200 ul) ve 2 (100 ul) içinde 1 mg / ml poli-L-lisin ekleyin. Hacim diferansiyel mikro (Şekil 1A, B) içinden akması için poli-L-lisin sağlayacaktır. </li><li> 60 mm&#39;lik hücre kültür kapları içinde cihazları 37 ° C inkübatör içinde devrilmesine emin olmak için, bir 150 mm plastik hücre kültürü kabı içine cihazları içeren üç ila 60 mm hücre kültür kaplarına yerleştirin ve bir kapak ile yemek kapsamaktadır. % 5 CO2 içeren bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde O / N inkübe edin. Tipik olarak kanal% 90&#39;dan daha fazla cihaz başına kullanılabilir ve mutlakaherhangi bir hava kabarcığı ya da fiziksel tıkanma içermez. </li><li> Ertesi gün su ile poli-L-lisin yerine ve en az 1 saat boyunca kuluçka makinesi içinde cihazı bırakın. Bu yıkamanın üç kez tekrarlayın. Suyu çıkarmak ve her cihaza (2% B-27 takviyesi ve 500 ıLl glutamax içeren) Neurobasal-A besi ekleyin. % 5 CO2 içeren bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde O / N bırakın. </li><li> Aşağıda tarif edildiği gibi bir sonraki gün, hipokampal hücreleri plaka. </li></ol> Mikroakışkan Cihazlar Fare Hipokampal İlköğretim Nöronlar 2. Kaplama Not: Yeni doğmuş farelerin kültürlenmiş hipokampal nöronlar hazırlanması daha önce Jüpiter 25 yayınlanmıştır. Aşağıda mikroakışkan cihazlarda levha fare hipokampal nöronlar için adapte edilmiştir bazı değişiklikler olduğunu ve Transfeksiyonlar için uygun olmuştur. <ol><li> Fare beyni diseksiyon, daha önceden sıcak Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)% 10 fetal bovin serumu(FBS; antibiyotikler olmadan), A Karışımı (125 mg DL-sistein, 125 mg büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve fosfat tamponlu salin (PBS), 500 ml, D-glikoz 3,125 g, filtre, bir 0.22 um filtre ile steril edilmiş) bir 37 ° C su banyosu içinde: ve bir çözeltisi (50 DNase I&#39;inin mg ve 100 ml Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) filtresinde 1.2 M MgSO 4 çözeltisi, 0.5 mi, 0.22 um&#39;lik bir filtreden steril bir DNase) deoksiribonükleaz. <ol><li> % 5 CO2 içeren bir 37 ° C inkübatör içine önceden sıcak Neuro temelli-bir büyüme ortamı pH dengelenmesi için akmaktadır. </li></ol></li><li> Oluşturulan protokollerle 26 göre 1-3 gün eski yenidoğan farelerden hippocampi teşrih. Buz üzerinde (10 mM HEPES pH 7.4, 50 mM glükoz, 100 E / ml penisilin ve / ml streptomisin, 100 ug içeren HBSS), 10 mi diseksiyon tampon ihtiva eden bir 15 ml konik bir tüp içinde hipokampları tutun. 15 ml konik tüp başına 4 Hipokampuslardan kadar koyun. </li><li> Kalan protokol gerçekleştirmek steril koşullarda olduğunuBir biyogüvenlik kabini içinde s. </li><li> Mixture A, girdap 5 ml papain 45 birimleri seyreltin ve papain toz çözünene kadar 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edilir. DNase I çözeltisi 1 ml ilave edilir. 0.22 mikron şırınga filtre ünitesi sayesinde karışımı süzün. </li><li> 15 ml konik tüp içeren Hipokampuslardan gelen Dikkatlice aspire HBSS &#39;. Ekleyin, 10 ml soğuk (4 ° C) HBSS hipokampi ve bunları tüpün dibe sağlar. Dikkatle 15 ml konik tüp dan HBSS aspire. </li><li> Ben 4 Hipokampuslardan kadar karıştırılır ve 37 ° C&#39;de 20-30 dakika süreyle inkübe 1 mi Papain / DNase ekleyin. Konik tüpü karışımı ile hippocampi yıkanmak için her 5 dakikada eğin. Alternatif olarak hafifçe çalkalama (~ 100 rpm) ile 37 ° C su banyosu çalkalayıcısına hipokampları yerleştirin. </li><li> Aspire Papain / I karıştırma ve% 10 FBS ihtiva eden, önceden ısıtılmış DMEM (37 ° C) hipokampi iki kez yıkayın, DNase. </li><li> İkinci yıkamadan sonra, 2 Hipokampuslardan,% 10 FBS ihtiva eden, önceden ısıtılmış DMEM ml ve pipetleme el çiğnemek hipokampları ekleyukarı ve nöronlar ayırmak için 1 ml pipet kullanarak 10-12 kat ~ aşağı. </li><li> Bu non-ayrışmış nöronlar konik tüp altına yerleşmek için izin verecek gibi çiğnemek ~ 1 dakika dinlendiriniz. Tüpün alt kısmında yerleşmiş olan büyük doku transferi kaçınarak, yeni bir 15 ml konik tüp ayrışmış nöron içeren süpernatant aktarın. </li><li> 2 dakika süreyle 1000 xg&#39;de hücreleri Spin ve dikkatle hücre pelet bozmadan süpernatant kaldırmak. Hafifçe pipetleme 80 ul Neuro temelli-bir büyüme ortamında süspansiyon hücreleri. </li><li> Mikroakışkan rezervuar 1 ve 1 &#39;orta çıkarın. Mikroakışkan rezervuar 1 hücrelerin 20 ul (~ 275.000) uygulayın ve onları dolaşmasını sağlar. 20 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör yerleştiriniz. </li><li> Hücreler, kapak camın yapışmış sağlamak için mikroskop altında bakın. Tüm depoları kapalı dön Neurobasal-A besi ekleyin. % 5 CO ile 37 ° C inkübatör hücreleri ile cihazını geri <sub&gt; 2. </li><li> Aygıtları her ~ (glutamax olmadan) Neurobasal-A içeren% 2 B-27 takviyesi ile 2-3 gün ve kapalı üst rezervuarlar önlemek için buharlaşma kontrol edin. Nöronlar sonra kaplama ~ microfluidic kanallardan 2-3 gün aksonları uzatmak başlar. Konu nöronlar kaplama sonra genellikle 7-10 gün transfeksiyona. </li></ol> Mikroakışkan Aygıt Yetiştirilen Hipokampal Nöronlar 3. Transfeksiyonu <ol><li> Cihaz başına, 30 ul, Neuro temelli-A 1.2 ul Lipofektamin 2000 bir karışımı ve 30 ul Neuro temelli-A içerisinde 0.5 ug floresan yük füzyon plazmidinin bir karışım oluşturmak ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. DNA karışımına Lipofektamin karışımı ilave edin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. DNA% 4 B-27 takviyesi içeren Neurobasal-A 60 ul ekleyin / Lipofektamin karıştırın ve tüp hafifçe karıştırın. </li><li> &#39;Mikroakışkan rezervuar 2 ve 2&#39;den tüm ortamları çıkarın ve dikkatli bir orta int dökülüp olmadan% 2 B-27 takviyesi içeren Neurobasal-A ile kuyu doldurmakdiğer bölmelere O. </li><li> Mikroakışkan rezervuar 1 ve 1 &#39;bulunan ortamı çıkarın. DNA&#39;nın 120 ul ekleyin / Lipofektamin mikroakışkan rezervuar 1 karıştırın ve akıtın. 3-4 saat için% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör cihazı dönün. </li><li> &#39;Mikroakışkan rezervuar 1 ve 1 tüm ortamları çıkarın ve 24 saat Neurobasal-A içeren% 2 B-27 takviyesi ile değiştirin (ya da hazır olana kadar görüntüye). Tipik olarak, mikro yoluyla büyümek 5-7 aksonlar yaklaşık hipokampus kültürlü hücrelerde 26 için yayınlanan verimliliği ile tutarlı% 1-3 transfeksiyon etkinliğini temsil eden koşullar altında transfekte. </li></ol> 4. &quot;Kargo Mapping&quot; Analizleri <ol><li> Kargo hareketinin Canlı Görüntüleme <ol><li> 37 ° C inkübatör ve CO 2 kontrol odası ile donatılmış bir ters Epifloresans ışık mikroskobu görüntüleme gerçekleştirmek. </li><li> Bir MICR yetiştirilen hipokampalinden ile lamel monte edinMikroskop sahneye ofluidic cihaz. Nöron ölümünü önlemek için, daha uzun bir süre, 1 saat boyunca mikroskopla örnekleri korumak için süratle çalışır. </li><li> Yüksek çözünürlüklü bir hedefi (100 X) kullanarak, mikroakışkan bölmelerin kanalları boyunca uzanan ve transfekte akson bulundu edildiği kanalların sayısını kaydetmek transfekte edilmiş hücrelerin aksonlar bulabilirsiniz. Bir el taksitli sayacı kullanarak kanal sayısını. <ol><li> Canlı hareket ve daha sonra ko analiz optimal kayıt için, çoğu kesecikler bu görüntüleme odak gerçekleştirilebilir, böylece kanaldan nispeten düz bir büyümeye aksonlar seçin. </li></ol></li><li> Bir tane 1 ml&#39;lik plastik bir transfer pipeti ile rezervuar 2 ve 2 &#39;den sıvı ortamı en iyi çıkarın. Kymographs üzerinde hareket yörüngeleri sabit görüntülerin ardından hizalamayı kolaylaştırmak için, görüntüleme (Şekil 1B, C) ​​sırasında görüş alanı ile mikrokanalların sağ kenarına hizalayın. </li><li> Yerleştiğinde kolaylaştırmakgörüntüleme sırasında örneklerin g, iki kişi ile canlı görüntüleme gerçekleştirmek. Canlı görüntüleme tek bir kişi tarafından gerçekleştirilen Alternatif olarak, eğer, sürüklenme düzeltme ile donatılmış bir mikroskop sistemi kullanın. </li><li> (Şekil 2 ve Malzeme Listesi efsanesi belirtilen YFP-PrP C görüntüleme için mikroskop özellikleri ve ayarları) time-lapse analiz edilen kargo taşıma dinamikleri özgü özellikleri ile görüntüleme canlı kargo hareketi başlatın. </li><li> Yeterli canlı hareketi verileri toplanmıştır sonra, bir kişi PBS içinde önceden ısıtılmış% 4 paraformaldehid hücreleri düzeltmek için 0,04 g / ml sükroz içeren &#39;rezervuarları 2 ve 2 doldurmak zorunda. Bu canlı görüntüleme odağı bozacak gibi, mikroakışkan cihaz dokunmaktan kaçının. Fiksatif ilave edilirken diğer kişinin odağı ayarlamak var. Hareketin acil durdurma gözlendiğinde sabitleme başarılı. Sonra 1 ve 1 &#39;rezervuar Fiksatif ekleyin. NOT: Geçici photobleakargo floresan ching da gözlenen olabilir, ancak motor proteinlerin IF boyama (bir sonraki adımı) tamamlandıktan sonra floresan devam. NOT: Paraformaldehyde cilt ile temasında, solunduğunda zararlıdır ve yutulduğunda. Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş edicidir. Resmi yönetmeliklere göre imha ediniz. </li></ol></li><li> IF ko analizi için motor proteinlerinin aktif boyanması Not: tek tek hareket eden yük ile bağlantılı motor proteinlerinin nispi seviyeleri (antikor lekeleme ile tespit edildiği üzere), nicelendirilmesi için, doğrulamak ve antikor-antijen bağlanma doymuş olduğundan emin olmak için antikorlar titre edilir. Bu, söz konusu protein, ya nakavt edilmiş olduğu nöronlar ya sersemleyen kullanılarak antikorun özgünlüğünü belirlemek suretiyle yapılır, ve gerçekleştirerek, antikor konsantrasyonları artan analizi. Negatif kontroller için, nöronların Primer antikor yokluğunda ikincil antikor ile boyandı. Daha detaylıAntikor doğrulama tanımı Encalada et al., 16, ve Szpankowski ve diğ., 20 bulunabilir. <ol><li> Mikroskop sahneden mikroakışkan cihaz yetiştirilen hipokampalinden ile lamel çıkarın. Mikrokanallardır canlı ve sabit görüntüleri eklemek için bozulmadan kalması gerekir gibi, lamel mikroakışkan cihazı çıkarmayın. Bir nemlilik bölmesi içinde, aşağıdaki adımları. </li><li> Mikrokanalların içine çözümlerin akışını sağlamak için, en az 30 ul &#39;, 2, ve 2&#39; rezervuar 1, 1 arasında bir tampon hacim farkı korumak. sonraki tüm basamaklarda. Örneğin, &#39;mikroakışkan rezervuar 1, 1, ve 70 ul ortam hacminin&#39; mikroakışkan rezervuar 2, 2 100 ul medya sesini ekleyin. </li><li> Mikroakışkan cihazın odalarından Fiksatif çıkarın ve PBS yıkar arasında 10 dakika bekledikten hücreleri üç kez yıkayın. </li><li> % 0.1 Triton X-100, Dilu ekleyerek hücreleri geçirgenleştirmektüm haznelere, 5 dakika boyunca PBS içinde monte edilir. </li><li> Bütün barajlar çözüm çıkarın ve PBS ile yıkayın. Yıkamanın yıkamalar arasında 10 dakika bekledikten üç kez tekrarlayın. </li><li> Tüm haznelerden çözeltisini çıkarın ve PBS içinde% 10 normal eşek serumu ve% 3 proteaz serbest ve immünoglobulin G (IgG) içermeyen BSA ihtiva eden tampon bloke uygulanır ve oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edilir. </li><li> 5 dk çökeltileri kaldırmak için 20,000 xg birincil antikor stok solüsyonu Spin. Bloke edici tampon içinde, uygun bir konsantrasyona kadar seyreltilir antikor. Antikor çözeltisi ile mikro-akışkan cihazdan bloklama tamponunu değiştirin. 4 ° C&#39;de, oda sıcaklığında ya da O / N C&#39;de 2 saat boyunca örnekleri inkübe edin. </li><li> Tüm haznelerden çözeltisi çıkarın ve yıkamalar arasında 10 dakika bekleme, üç kez PBS ile yıkayın. </li><li> 5 dk çökeltileri kaldırmak için 20,000 xg ikincil antikor stok solüsyonu Spin. Bloke edici tampon içinde, uygun bir konsantrasyona kadar seyreltilir antikor. İkincil antikor solüsyonu PBS ile değiştirin. Kuluçkaya yatmakoda sıcaklığında 1 saat süre ile örnekler. </li><li> Tüm haznelerden çözeltisi çıkarın ve yıkamalar arasında 10 dakika bekleme, üç kez PBS ile yıkayın. </li><li> Doğrudan rezervuara bağlayan kanalların açıklığı içine montaj ortamı pipetle 10-20 ul montaj orta ~ PBS ile değiştirin. Oda sıcaklığında 1 saat -, 20 dakika boyunca ortam kuru olarak monte olsun. </li><li> Boyama iki gün (en fazla bir hafta) olan ışıkla bilmek ışıktan korumalı 4 ° C&#39;de saklayın cihazlar ve görüntü aksonlar. </li><li> Boyama tamamlandıktan sonra, mikroskop sahneye mikroakışkan cihaz yetiştirilen hipokampalinden ile lamel monte edin. Adım 4.1.1-4.1.7 görüntülü transfekte akson bölgesini bulun. </li><li> Yüksek çözünürlüklü hedefi (örneğin, yüksek bir sayısal diyafram yağ veya su objektif) kullanılarak, kargo, motor 1, motor, 2: üç kanalın her biri için Z-yığın görüntüleri (300 nm adım) edinin. NOT: aksonlar genellikle mükemmel düz büyümek yok gibi Z-yığınlarının kazanılması önemlidirTüm floresan puncta Mikrokanallarda ve bu nedenle değil, aynı odak düzlemi vardır. </li></ol></li><li> Kargo Haritalama <ol><li> Görüntü analiz yazılımı kullanılarak yük hareketinin kymograph oluşturur. Rietdorf ve Seitz (EMBL) tarafından geliştirilen ImageJ eklentisi kymographs üretmek için tavsiye edilir (indirmek için bakınız Malzemeler Listesi). NOT: ImageJ Sağlık 27,28 National Institutes geliştirilen bir kamu alanı, Java tabanlı görüntü işleme programı (indirme Malzeme Listesi için bakınız). </li><li> (Malzemeler, tespitin noktası (Şekil 2A, B) kymograph yörüngeler konumu üzerine onları atma piyasada mevcut grafik programı kullanılarak elle (adım 4.2.14 oluşturulan) floresan kargo sabit görüntüleri hizalamak Liste). Elle ilk kymograph üzerine sabit kargo görüntüyü atma ve elle belirli bir yörünge karşılık kargo puncta seçerek hizalamakymograph. En iyi hizalama sonucu almak için, eşleştirilmiş kargo için en iyi odakta Z dilim kullanın. Çeşitli Z, dilim kullanılabilir. </li><li> XY koordinatları ve kurulmuş bir algoritma kullanarak her floresan puncta için yoğunluğu genlikleri temsil noktası yayılma işlevine 2D Gauss uyacak şekilde belirlemek, her Z-yığını içinde görüntü (adım 4.2.14 üretilen kargo motor 1 ve motor 2) için üç kanal 16,20,21 (Şekil 2D) her birinde her bir nokta kaynağı. NOT: Jaqaman, Danuser ve meslektaşları 21-23 tarafından geliştirilen Gauss uydurma algoritması içermektedir XY koordinatlarını, 16,20 geliştirilen &quot;Motor kolokalizasyon&quot; adında bir özel inşa MATLAB yazılım paketi, elde etmek. Kullanımı için yazılım paketi ve ayrıntılı talimatlar talep üzerine temin edilebilir. </li><li> Kymograph üzerinde mobil veya sabit bir yörünge üzerinde haritalanmıştır tek tek yük puncta her biri için, T seçmeko &quot;Motor kolokalizasyon&quot; programı sonuçlarından koordinatları ve yoğunluk aralığı (bu kargolar tek tek Şekil 2B&#39;de etiketli) xy. Farklı odak düzlemleri üzerinde bulunan daha fazla kargo Haritayı adım 4.2.14 edinilen birkaç Z-yığın görüntüleri) kullanın. </li><li> Bireysel XY benzeri Z dilim (Şekil 2B) &#39;de, motor kanalın her biri için elde edilen değerler ile eşlenmiş kargo için koordinatları Karşılaştırması. Belirleyin ve kargo 300 nm yarıçapı içinde XY motorlu koordinatlarını seçin. Yük ve aynı odak düzlemi içinde sinyal var motorlar için, 300 nm yarıçapında bulunan puncta belirlemek için &quot;Motor kolokalizasyon&quot; yazılım paketi kullanın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+and+the+delivery+of+pre-synaptic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).</li>
<li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+and+dynein+superfamily+proteins+and+the+mechanism+of+organelle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport.</a> Science. 279, 519-526 (1998).</li>
<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+in+neurons%3A+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function%2C+development%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68, 610-638 (2010).</li>
<li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+transport+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bidirectional transport along microtubules.</a> Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).</li>
<li>Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+transport+of+organelles%3A+unity+and+struggle+of+opposing+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors.</a> Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).</li>
<li>Gross, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hither+and+yon%3A+a+review+of+bi-directional+microtubule-based+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport.</a> Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).</li>
<li>Gross, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+and+regulation+of+molecular+motors+in+Xenopus+melanophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores.</a> J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).</li>
<li>Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+opposite-polarity+microtubule+motors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordination of opposite-polarity microtubule motors.</a> J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).</li>
<li>Kural, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+and+dynein+move+a+peroxisome+in+vivo%3A+a+tug-of-war+or+coordinated+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement.</a> Science. 308, 1469-1472 (2005).</li>
<li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li>
<li>Shubeita, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1107 (2008).</li>
<li>Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tug-of-war+between+dissimilar+teams+of+microtubule+motors+regulates+transport+and+fission+of+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).</li>
<li>Verhey, K. J., Hammond, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+control%3A+regulation+of+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Traffic control: regulation of kinesin motors.</a> Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).</li>
<li>Hendricks, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+Coordination+via+a+Tug-of-War+Mechanism+Drives+Bidirectional+Vesicle+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biol%22%5BJournal%5D)">Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport.</a> Current Biol. 20, 697-702 (2010).</li>
<li>Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -h, Goldstein, L. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+kinesin+and+dynein+assemblies+drive+the+axonal+transport+of+mammalian+prion+protein+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles.</a> Cell. 144, 551-565 (2011).</li>
<li>Harris, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-plasma+Bonding+of+PDMS+for+Inexpensive+Fabrication+of+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices.</a> J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).</li>
<li>Harris, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+Microfluidic+Device+for+the+Compartmentalization+of+Neuron+Soma+and+Axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons.</a> J Vis. Exp. 7 (261), (2007).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).</li>
<li>Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpixel+colocalization+reveals+amyloid+precursor+protein-dependent+kinesin-1+and+dynein+association+with+axonal+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).</li>
<li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).</li>
<li>Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+fluorescent+tag+localization+II%3A+Improvement+in+super-resolution+by+relative+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking.</a> J. Microsc. 211, 230-248 (2003).</li>
<li>Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+fluorescent+tag+detection+in+3D+with+super-resolution%3A+application+to+the+analysis+of+chromosome+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement.</a> J. Microsc. 208, 49-64 (2002).</li>
<li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224, 213-232 (2006).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+P0+Newborn+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats.</a> J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Moore, D. S., McCabe, G. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoore%2C+DS+%22Introduction+to+the+Practice+of+Statistics%22">Introduction to the Practice of Statistics</a>. , 5th edition, W.H. Freeman. New York, NY. (2005).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada sunulan protokol canlı nöronların göreli türü ve ilgili motor proteinlerin miktarı ile bireysel floresan mikrotübül tabanlı hareket eden kargo parçacıkların hareketinin yönlülük korelasyon sağlar. Daha önce, aksonal veziküler yüklerin toplam motorlu kompozisyon biyokimyasal olarak arıtılan veziküllerin ve organellerin 9,15 heterojen toplumlarda denendi. Ancak, hücre içi kargo tek bir türü için karakterize motorlu kompozisyon, çünkü homojen vezikül popülasyonları arındırılması...

Hücre içi ulaşım çeşitli hücresel etki 1 Proteinlerin, membranlar, organeller ve sinyal moleküllerinin verilmesi için tüm hücre tiplerinde önemlidir. Nöronlar son derece eleştirel çeşitli aksonal microdomains onların uzun mesafe teslimat için gerekli yüklerin içi ulaşım bağlıdır uzun, polarize projeksiyonlar hücreleri uzmanlaşmıştır. Iki büyük moleküler motor proteinlerinin aileleri - - Bu taşıma kinesinlerin ve dyneins aracılık kargolara bağlanan ve sırasıyla ileriye ve retrograd yönlerde polarize mikrotübüllerinde boyunca izleyebilirsiniz. Geriye hareket esas olarak dinein aracılık ederken, ileriye doğrultuda hareket kinesin motorlarının büyük bir işlev olarak zengin etti kolaylaştınlır. Sonuç olarak, aksonal yüklerin ileriye taşıma kinesin&#39;in süperailesinin 1-5 çeşitli aile üyeleri tarafından aracılık olabilir. Bazı yüklerin her iki yönde, m ısrarla hareket olsaost kargolar çift yönlü taşımak ve nihai hedeflere 1,5-13 yolunda sık sık ters. Ayrıca, gösterilmiştir ki, Yükün aynı anda yön önlisans karşıt yüklerin düzenlenmiş hareketi ters kutupluluk motorlar 5-7 koordine olarak nasıl soru yükselterek motorlar. Birlikte, aksonal yüklerin taşınması motorlar ve bu da çeşitli adaptörleri ve düzenleyici bağlama ortakları 14 bağlıdır kendi özel biyokimyasal faaliyetleri, bileşimin düzenlenir uyumlu bir süreçtir. Sadakatle Belirli bir kargo için aksonal taşıma mekanizmasını tanımlamak ve bu ulaşım yatan düzenlenmesini ortaya çıkarmak için, onların canlı taşıma sırasında bireysel yüklerin ile ilişkili motor proteinlerin ve onların düzenleyici bağlama ortaklarından kompozisyonunu belirlemek için her şeyden önemlidir. Diğer yöntemler, örneğin biyokimyasal yaklaşımlar, ortalama mot tahminleri sağlamakya da saflaştırılmış heterojen vezikül popülasyonları üzerindeki kompozisyonlar, ancak bu tahminler türünü veya tek hareketli kesecikler ilişkili motorların miktarlarda ortaya çıkarmak değil. Aynı zamanda, in vitro olarak, önceden monte edilmiş mikrotübüller boyunca vezikül taşıma yeniden yapılandırılması tek vezikül seviyesinde 15 motorun bir tipinin miktarının ölçülmesi sağladı. Bununla birlikte, bu deneyler, doğrudan bu veziküllerin taşıma vasıfları olan motorlara miktarı korele olur ve hücre düzenleyici faktörler yokluğunda taşıma ölçülen değildi. Endojen olarak ölçüm (IF) verileri, motor proteinleri ifade, bağışıklık tek tek hareket veziküllerin motor bileşimi (tip ve motorlar göreceli miktarı) belirler ve nöronlarda aynı veziküllerin canlı taşınması için bu parametreleri ilişkilendirir, burada sunulan bir protokol 16. Bu yöntem IF-to-live kargo hareketi verilerinin hassas haritalama gerektirir. Bu growin ile gerçekleştirilmektedirmikroakışkan cihazlarda g hipokampal fare nöronları protokolleri 17-19 kurdu aşağıdakiler. Bu cihazlar, sabit ve canlı ışık mikroskobu modaliteleri akson ve tek hareketli yüklerin tanımlanması ve korelasyon (&quot;haritalama&quot;) (Şekil 1) için izin verir. Kültürlü nöronların, taşıma kymographs çizilir ayrıntılı hareket bilgilerini almak için yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte görüntülü floresan etiketli kargo proteinleri ile aktarılır. Görüntüleme sırasında, nöronlar paraformaldehit ile sabitlenmiştir ve daha sonra endojen motor proteinlerinin karşı antikor ile boyanmıştır. Sabit kargo ve motor görüntüleri hareketi 16 yörüngeleri canlı kargo onları &quot;map&quot; (colocalize) canlı hareket kymographs üzerine bindirilmiş. Motor proteinlerinin dernek ile yüklerin canlı hareketini korelasyon, kolokalizasyon &quot;Mo adlı bir özel yapılmış MATLAB yazılım paketi kullanılarak analiz edilirtor kolokalizasyon &quot;16,20. Floresan etiketli kargolar ve motorlar üst üste kısmen olabilir kırınım-sınırlı noktasal özellikleri oluşturmak. Puncta örtüşen konumunu gidermek için, yazılım ilk otomatik olarak hassas XY alt-piksel konumunu belirlemek için, bireysel floresan puncta temsil eden her bir nokta yayılım fonksiyonu Gauss fonksiyonları uyuyor koordine ve yoğunluğu 21-23 genliği. Motorlar ve yük pozisyonları Daha sonra ko 16,20 belirlemek için birbirleri ile karşılaştırılmıştır. Bu yüzden, bu yöntem, daha doğrusu diğer yöntemlerle 24 ile karşılaştırıldığında floresan puncta arasındaki ko atar. Bu yöntemin gücü canlı hareketi yörüngeleri (örneğin, yön ise bu tespitin anda hareket edilmiştir) kyt edilmiş olan sabit hücrelerin tek tek yük motorlarda ko değerlendirmek için yeteneğidirorded. Bu yöntemle, kinesinler ve dyneins (PrP Cı -Hücresel) çift yönlü hareket eden ya da akson 16 sabit olarak kalan bir nöronal olarak zenginleştirilmiş yük, normal prion proteinini yapmak vesiküller eş zamanlı olarak ilişkilendirmek için bulunmuştur. Bu analiz kargo ile ilişkili iken anterograde (kinesin) ve retrograd (dinein) motorlar iki yönde veziküllerin hareket etmek veya sabit kalması amacıyla faaliyetlerini koordine edildiği PrP C vezikül hareketinin düzenlenmesi için bir çalışma modeli formülasyonunu izin . Bu yöntemin diğer bir gücü herhangi diğer ilgi protein (ler) ile birlikte, hemen hemen herhangi bir hücre tipi içinde hareket birçok floresan işaretli Yükün ko / ilişkiyi karakterize etmek için potansiyel, geniş uygulanabilmesidir. Bu nedenle, bir çok canlı / sabit bir ilişki potansiyel geçici protein yük etkileşimleri saptanması için izin verebilir, hareketli parçalardan etiketli birçok bireysel flüoresan istenen bir p fazla analiz edilebilirzaman dönemdedir. Geniş uygulanabilirliği ve bu yöntem hitap edebilecek sorular tipi göz önüne alındığında, bu protokol nöronlar veya diğer hücre tiplerinde bu eğitim kaçakçılığı ve ulaşım dahil olmak üzere hücre biyologlar geniş bir kitleye ilgi olacaktır.

<table><tbody><tr><td>poli-L-lizin</td><td>Sigma</td><td>P5899-20mg</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM (Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium) Yüksek Glikoz, L-Glutaminli, Sodyum Pirüvatsız (1x)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Sığır Serumu)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Neurobazal-A Ortamı (1x)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Serum Ücretsiz Takviye Edici Gıda</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX I Takviyesi (100x)</td><td>Hayat </td><td>HBSS 35050061</td><td></td></tr><tr><td>Teknolojiler (1x) (Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Sağ, Magnezyum yok, Kalsiyum yok (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin (100x)</td><td>Corning</td><td></td> Cellgro 15140122 <td></td></tr><tr><td>Hücre Kültürü için Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT46000CM</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>USB Corporation</td><td>19925</td><td></td></tr><tr><td>DL-sistein HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9768</td><td></td></tr><tr><td>BSA (sığır serum albümini)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>D-glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I derece II</td><td>Roche Uygulamalı Bilimler</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>&nbsp; </td><td></td>11668027</tr><tr><td>Formaldehit Çözeltisi% 16 EM Sınıfı</td><td>Fisher Scientific</td><td>50980487</td><td>Dikkat: Solunduğunda, cilt ile temasında ve yutulduğunda zararlıdır. Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder. Resmi düzenlemelere göre atın.</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>Normal Eşek Serumu</td><td>Jackson İmmüno Araştırma</td><td>017-000-0121</td><td></td></tr><tr><td>BSA yağ asidi ve IgG içermez</td><td>Jackson İmmüno Araştırma</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2403-4</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Altın antifade reaktifi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Camı 1 1/2. 24 x 40 mm</td><td>Corning</td><td>2980-244</td><td></td></tr><tr><td>Eksen mikroakışkan cihazı, 450 ve mikro; m</td><td>Millipore</td><td>AX450</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coolsnap HQ fotoğraf makinesi&nbsp;</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm hücre kültürü kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-95</td><td></td></tr><tr><td>150 mm hücre kültürü kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-100</td><td></td></tr><tr><td>Kullanılan Antikorlar:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Anti-Kinesin hafif zincir, V-17</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>SC-13362</td><td>özgüllüğü KLC1-/- nöronlar kullanılarak doğrulandı (Ref. 16), önerilen seyreltme 1:100.</td></tr><tr><td>Anti Dynein Ağır Zincir 1, R-325</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>sc-9115</td><td>özgüllüğü, DYN1HC1'ye karşı shRNA kullanılarak doğrulanmıştır (Ref. 16), önerilen seyreltme 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Eşek Anti-Tavşan IgG Antikoru</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A10042</td><td>&nbsp; Önerilen seyreltme 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L) Antikor</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A31573</td> <td>ve nbsp; Önerilen seyreltme 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Eşek Anti-Keçi IgG (H + L) Antikoru IgG Antikoru</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11057</td> <td>ve nbsp; Önerilen seyreltme 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Eşek Anti-Keçi IgG (H + L) Antikor</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A21447</td><td>&nbsp; Önerilen seyreltme 1:200.</td></tr><tr><td colspan="4">Eklentiler ve Makrolar</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/index.html">&nbsp; http://imagej.nih.gov/ij/index.html.&nbsp; </a></td></tr><tr><td>ImageJ Kymograph Eklentisi</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html">http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.</a></td></tr></tbody></table>

kullanımı akson kargo hareketli moleküler motors kompozisyon karakterize &quot;kargo haritalama&quot; analizi

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Moleküler motorlar nöronların içindeki veziküler kargoları taşımak faaliyetlerini koordine hangi mekanizmaların anlaşılması tek kese düzeyde motor / kargo derneklerin kantitatif analizini gerektirir. Bu protokolün amacı, aynı yük ile ilgili motorların bileşim ve ilgili miktarları (&quot;harita&quot;) ilişkili olduğu canlı yük hareket konumunu ve yönünü kantitatif floresan mikroskobu kullanmaktır. &quot;Kargo haritalama&quot; canlı canlı hareket kaydı sırasında kimyasal sabitleme takip microfluidic cihazlar üzerinde kültüre akson hareket floresan etiketli yükün görüntüleme, ve motorlar karşı antikorlar ile aynı aksonal bölgelerin sonraki immünoflüoresans (IF) boyama oluşur. Yükün ve bunların ilişkili motorlar arasındaki kolokalizasyon alt-piksel pozisyonunu atayarak değerlendirilir kırınım-li uydurma Gauss fonksiyonları tarafından, motorlu ve kargo kanalları koordinatlarıBireysel floresan nokta kaynaklarını temsil eden kişilere sınırsız bir puan farkı fonksiyonları. Sabit kargo ve motor görüntüleri sonradan izlenen yörüngeleri onları &quot;harita&quot;, kargo hareket araziler için bindirilmiş. Veri canlı hücrelerde veziküler yüklerin taşınmasını hem kaydetmek ve bu aynı kesecikler ilişkili motorları belirlemek için IF Bu protokolün gücü canlı bir birleşimidir ve. Bu teknik, bu yöntemler tek hareketli yüklerin hakkında kompozisyonlar ortaya yok gibi, saflaştırılmış heterojen toplu vezikül nüfusun ortalama motorlu bileşimini belirlemek için biyokimyasal yöntemleri kullanmak önceki zorlukların üstesinden gelir. Ayrıca, bu protokol protein bileşimi ile tek tek hücre içi yapıların hareketini ilişkili diğer hücre tiplerinde başka nakil ve / veya değiş tokuş yollarına analizi için adapte edilebilir. Bu protokol sınırlamaları nedeniyle kültürlü düşük transfeksiyon verimliliği için nispeten düşük verimlilik vardırBirincil nöronlar ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kullanılabilir kısıtlı bir bakış alanı. Gelecekteki uygulamaları floresan etiketli yüklerin ifade nöronların sayısını artırmak için yöntemleri içerebilir.

Şekil 1 hipokampal nöronlar büyümek için kullanılan mikroakışkan cihazın bir bakış gösterir (Şekil 1A, B). Nöronlar kanalların uzunluğu aksonal bölmeye tüm yol geçen dendritik projeksiyonlar engellerken mikro büyüklüğü aksonal bölmesine hücre gövdeleri (soma) difüzyonunu önlemektedir rezervuar 1'de plakalanır. Kültürde ~ 2-3 gün sonra, nöronlar aksonal bölmesine (Şekil 1B, C) ​​içine Mikrokanallarda karşısında aksonları uzanan başlar. Sarı floresan protein (YFP PrP <sup...

Veziküller veya organeller gibi yüklerin hücre içi taşınması, polarize mikrotübüller üzerinde izlenen moleküler motor proteinler tarafından gerçekleştirilir. Bu protokol, nöronların içinde hareket eden bireysel kargo parçacıklarının taşınma yönlülüğünün, ilişkili motor proteinlerin nispi miktarı ve türü ile korelasyonunu tanımlar.

Kullanımı Akson Kargo Hareketli Moleküler Motors Kompozisyon karakterize &quot;Kargo Haritalama&quot; Analizi

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Kargo haritalamanın genel amacı, veziküler yüklerle ilişkili olan ve onları hareket ettiren moleküler motor proteinlerin nispi miktarını ve türünü belirlemek ve bu motor bileşimini canlı kargo hareketinin yönlülüğü ile ilişkilendirmektir. Bu, ilk olarak mikroakışkan cihazlarda birincil fare hipokampal nöronlarının büyütülmesiyle gerçekleştirilir, böylece aksonlar nispeten düz büyür ve geçici olarak transfekte edilmiş nöronların aksonlarında floresan olarak etiketlenmiş kargo proteinlerinin canlı hücre içi hareketini kaydeder. İkinci adım, canlı kargo görüntüleme sırasında nöronları sabitlemek ve ardından aksonları kinesin ve dinler gibi moleküler motor proteinlere karşı antikorlarla boyamak ve ardından immünofloresan mikroskopi görüntülemesidir.Daha sonra, sabit kargo ve motor görüntüleri, canlı kargo hareketini immünofloresan boyama ile belirlenen lekeli ilişkili motorlarla ilişkilendirmek için krafts olarak da adlandırılan, zaman içindeki kargo hareketi grafiklerine hizalanır. Son adım, motor kolokalizasyon adı verilen özel olarak geliştirilmiş bir MATLAB yazılım paketi kullanarak kargo ve motor proteinlerinin alt piksel konumlarını belirlemektir. Bu yazılım, her bir kargo ve motor konumunun kesin XY koordinatlarının yanı sıra yükler ve motorlarla ilişkili nispi floresan yoğunluklarını sağlar.Sonuç olarak, canlı ve sabit yüklerin ve motorların floresan mikroskobunun alt piksel çözünürlük seviyesindeki korelasyonu, hareketin yönlülüğünün bilindiği belirli yüklerle ilişkili motor türleri hakkında bilgi sağlar. Dolayısıyla bu yöntem, ekzon taşıma mekanizması hakkında bilgi sağlar. Mikrot tubal dinamikler sırasında Proteinlerin mikrotubiallerle ilişkisi veya endositoz sırasında proteinlerin toplanması gibi yaşam mikroskobunu immünofloresan boyama ile ilişkilendiren diğer çalışmalara uygulanabilir.Bu yöntemin görsel gösterimi, özel bir kurulum gerektirdiğinden öğrenmesi zor olabilecek görüntüleme fiksasyonu ve analiz adımlarının gerçekleştirilmesine yardımcı olacaktır. Bu prosedür için fare hipokampal primer nöronları, protokol metninde belirtildiği gibi hazırlanır ve nöro bazal yumurta büyümesinde yeniden süspanse edilir. Mikroakışkan cihazdaki nöronları plakalamak için orta.Ortamı mikroakışkan rezervuardan bir ve bir prime çıkarın. Mikroakışkan rezervuara 20 mikrolitre hücre uygulayın ve akmalarına izin verin. Cihazı 20 dakika boyunca% 5 CO2 içeren 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin.Hücrelerin kapalı cama yapıştığından emin olmak için mikroskop altına bakın. Tüm rezervuarları doldurmak için bir büyüme ortamı olan nöro bazal ekleyin. Cihazı hücrelerle birlikte dokuzuncu güne kadar inkübatöre geri koyun.Kültürde, nöronlar aksonları mikro kanallar boyunca uzatır ve floresan proteinlerin ekspresyonu için transfeksiyona hazırdır. Transfekte edilmiş fare hipokampal primer nöronlarının canlı görüntülemesi, 37 santigrat derece inkübatör ve bir CO2 kontrol odası ile donatılmış, ters çevrilmiş bir epi floresan ışık mikroskobu üzerinde gerçekleştirilir. Bu prosedüre başlamak için 100 x yağ hedefini seçin.Objektife yağ sürün ve mikroakışkan bir cihazda büyütülen hipokampal nöronlarla kapak kızağını mikroskop sahnesine monte edin. Nöronal ölümü önlemek için, numuneleri mikroskopta bir saatten fazla tutmamak için hızlı bir şekilde çalışın. Mikroakışkan odanın kanalları boyunca uzanan transfekte edilmiş hücrelerin aksonlarını bulun.Transfekte edilmiş aksonun bulunduğu kanalların sayısını kaydedin. Canlı hareketin en iyi şekilde kaydedilmesi ve ardından kolokalizasyon analizi için bir el uyarı sinyali sayacı kullanarak kanal sayısını sayın. Kanallar boyunca nispeten düz büyüyen aksonları seçin, böylece çoğu vezikülün görüntülenmesi odakta gerçekleştirilebilir.Sabit görüntülerin chm grefti üzerindeki hareket yörüngeleri ile daha sonra hizalanmasını kolaylaştırmak için. Görüntüleme sırasında mikro kanalların sağ kenarını görüş alanıyla hizalayın. Canlı görüntüleme sırasında hücreleri başarılı bir şekilde sabitlemek için, prosedür en iyi şekilde iki kişi ile, bir kişi sabitleyici eklemek ve odağı ayarlamak için başka bir kişi ile gerçekleştirilir.Tüm reaktiflerin hazır ve erişilebilir olması da önemlidir. Bir mililitrelik plastik transfer pipeti kullanarak. Ortamın çoğunu ikinci ve ikinci rezervuarlardan çıkarın Prime, analiz edilen yükün taşıma dinamiklerine özgü zaman atlamalı özelliklerle canlı kargo hareketini görüntülemeye başlayın.Yeterli canlı hareket verisi toplandıktan sonra, bir kişinin ikinci ve iki numaralı rezervuarları ön ısıtma fiksatifi ile doldurmasını sağlayın. Canlı görüntülemenin odağını bozacağı için mikroakışkan cihaza dokunmaktan kaçının. Sabitleyici eklenirken diğer kişinin odağı ayarlamasını sağlayın.Aynı şekilde, rezervuarları bir ve bir astar ile doldurun, fiksatif fiksasyon ile hareketin hemen durması gözlendiğinde başarılı olur. Daha sonra, sabit nöronlar endojen motor proteinlere karşı antikorlarla boyanır ve protokol metninde tarif edildiği gibi görüntülenir. Kargo haritalamaya başlamak için, görüntü analiz yazılımını kullanarak kargo hareketinin bir kromografını oluşturun.Rich Dorf Insights tarafından geliştirilen Image J eklentisi, ticari olarak mevcut grafik yazılımını kullanarak Kraft'ın üretilmesi için önerilir: kargonun immünofloresan görüntüsünü kargo hareketinin CHM grafiğine manuel olarak hizalayın, kargo punktasını chm grafiğindeki yörüngelerin konumuna yerleştirin, böylece her bir kargo punktası CHM grafiğindeki belirli bir yörüngeye karşılık gelecek şekilde sabitleme noktasında. En iyi hizalama sonuçları için, eşlenen kargo için en iyi odakta olan Z dilimini kullanın. Z yığınındaki her görüntü için birkaç Z dilimi kullanılabilir.2B gaussları üç kanalın her birindeki nokta kaynaklarını temsil eden nokta yayılma işlevine sığdırmak için yerleşik bir algoritma kullanarak her floresan puncta için XY koordinatlarını ve yoğunluk genliklerini belirleyin. XY koordinatlarını elde etmek için, Yakima DONA ve meslektaşları tarafından mobil veya sabit yörüngelere haritalanan her bir kargo noktası için geliştirilen bir Gauss uydurma algoritmasını içeren, motor kolokalizasyonu adı verilen özel olarak oluşturulmuş bir MATLAB yazılım paketi geliştirildi. Kog grafiğinde, motor kolokalizasyon programının sonuçlarından XY koordinatlarını ve yoğunluk genliklerini seçin.Farklı odak düzlemlerinde bulunan daha fazla kargoyu haritalamak için birkaç Zack görüntüsü kullanın. Eşlenen kargo için bireysel XY koordinatlarını, ilgili Z dilimindeki motor kanallarının her biri için elde edilen koordinatlarla karşılaştırın. Aynı odak düzlemi içinde sinyal veren kargolar ve motorlar için kargonun 300 nanometre yarıçapı içindeki XY motor koordinatlarını belirleyin ve seçin.300 nanometre yarıçapı içinde bulunan punktaları belirlemek için motor kolokalizasyon yazılım paketini kullanın. Sarı floresan proteini veya Y-F-P-P-R-P-CC ile etiketlenmiş normal prion proteini taşıyan veziküllerin taşınmasını aksonlarda nispi miktarlarda kinesin ve din motorları ile ilişkilendirmek için kargo haritalaması kullanıldı. Bu grafik F-P-P-R-P-C vezikül hareketini gösterir ve noktalı çizgi canlı görüntüleme sırasında fiksasyon zamanını gösterir.Sabit Y-F-P-P-R-P-C veziküllerinin floresan görüntülerinin yanı sıra Kinesin hafif zincir bir ve dine'nin karşılık gelen immünofloresan görüntüleri kromografa hizalanır. Bu genişleme, 2D gian fonksiyon atamaları ile üç kanalın her birinin immünofloresan sinyallerini gösterir. Bu grafik, Y-F-P-P-R-P-C vezikülleri, kinesin hafif zincir bir ve vahşi tip nöronlarda ve KİNESİN ağır zinciri olmayan nöronlarda dine arasındaki KOLOKALIZASYONUN nicelleştirilmesini temsil eder.Y-F-P-P-R-P-C vezikülleri ile ilişkili Kinesin hafif zincir bir ve dinin nispi miktarı Gauss genliklerinden elde edilir ve nispi motor miktarlar ile hareketin yönlülüğü arasındaki olası korelasyonları incelemek için çizilir. Vahşi tip nöronlardan alınan bu örnek, hareketli veya sabit olan Y-F-P-P-R-P-C veziküllerinin KINESIN hafif zincir bir veya dine veya her ikisi ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu teknikte ustalaşıldıktan sonra üç gün içinde gerçekleştirilebilir. Mikro fillik cihazların ve birincil nöronun yaklaşık 10 günlük EM öncesi görüntüleme hazırlığına ek olarak, üç gün içinde immünofloresan boyama ve veri analizinin canlı görüntüleme görüntülemesini gerçekleştirebileceksiniz.Bu videoyu izledikten sonra, mikroakışkan cihazlarda yetiştirilen floresan etiketli kargoların ve nöronların canlı hareketinin nasıl kaydedileceğini iyi anlamış olmalısınız. Görüntüleme sırasında C hücrelerinin nasıl düzeltileceği, alt piksel çözünürlüğü olarak kolokalizasyonun nasıl analiz edileceği ve bir yükün ve moleküler motor proteinlerin kolokalizasyonunun kargo hareketi ile nasıl ilişkilendirileceği.

characterizing-composition-molecular-motors-on-moving-axonal-cargo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Fonksiyonlu mikrotübül üzerinde kayma yüzeyi yapıştırılır kinesin motorlu proteinlerinin nano ölçekli bir taşıma sistemi olarak hizmet verebilir oluşan Moleküler mekik. Burada, tipik bir servis sistemi montaj açıklanmıştır.

Kinesin Powered Moleküler minibüsleri üzerine Kargo Yükleniyor

Burada, bir protokol kinesin-1 yükleri belirlemek için sunulmuştur. Kinesin-1 ağır zincir (KIF5B) bir motorsuz mutant sitoplazmasında agrega ve kargoların agregasyonunu uyarır. Her iki agrega floresan mikroskobu altında tespit edilir. Benzer bir yöntem, diğer motor proteinlerinin yükleri tespit edilmesi için kullanılabilir.

Floresan mikroskobu kullanarak kinesin-1 Cargos Tanımlanması

Burada, organellerin hücre içi naklini ve murine astrositlerinde plazma membran proteinlerinin ticaretini görselleştirmek için in vitro canlı görüntüleme yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol aynı zamanda kargo taşımacılığı güzergahları ve kinetik belirlemek için bir görüntü analizi metodolojisi sunar.

Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi

Bu protokolün amacı, DNA origami nanoyapılar üzerinde moleküler motor toplulukları oluşturmak ve toplam iç yansıma floresan mikroskopisi kullanarak topluluk hareketliliğini gözlemlemektir.

Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi

Bozulmuş mitokondriyal taşıma ve morfolojisi çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda rol oynamaktadır. Sunulan protokol, kalıtsal spastik paraplejide mitokondriyal taşıma ve morfolojiyi değerlendirmek için indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı ön beyin nöronlarını kullanır. Bu protokol, aksonların boyunca mitokondriyal ticaretinin karakterizasyonuna ve nörodejeneratif hastalıkların incelenmesini kolaylaştıracak morfolojilerinin analizine olanak sağlamaktadır.

Kalıtsal Spastik Paraplejide İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronlarda Mitokondriyal Taşıma ve Morfolojinin Analizi

Fotoaktive nörofilament proteinini ifade eden transgenik farelerden periferik sinirlerin tek miyelinli aksonları içinde nörofilamentlerin aksonal naklini analiz etmek için floresan fotoaktivasyon yöntemlerini tanımlıyoruz.

Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi

Çift yönlü mitotik kinesin-5 Cin8, hareketlilikleri sırasında bölünen ve birleşen kümelerde birikir. Kümelerdeki birikim ayrıca Cin8'in hızını ve yönlülüğünü de değiştirir. Burada, saflaştırılmış Cin8-GFP ile motilitesi tahlilleri ve tek moleküllerin ve Cin8 kümelerinin hareketli özelliklerinin analizi için bir protokol açıklanmaktadır.

Tek Moleküllerin Motilitesi ve S. cerevisiae Hücrelerinden Saflaştırılmış Çift Yönlü Kinesin-5 Cin8 Kümeleri

Transgenik floresan fareler kullanılarak, canlı hayvanlarda bozulmamış siyatik sinirin motor ve duyusal aksonları içinde sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin in vivo aksonal taşınımını değerlendirmek için ayrıntılı protokoller tanımlanmıştır.

Aksonal Taşımacılığın In Vivo Görüntülemesi için Araç Kitinin Genişletilmesi

Bu çalışma, kinezin-3 ailesinin bir üyesi olan KIF1A'nın (1-393LZ) Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak saflaştırılmasını detaylandırmaktadır. Bu saflaştırılmış motorların in vitro tek moleküllü ve çok motorlu kayma analizi, memeli hücre lizatından elde edilen motorlarla karşılaştırılabilir sağlam hareketlilik özellikleri sergilemiştir. Bu nedenle, Sf9-bakülovirüs sistemi, ilgilenilen motor proteini ifade etmek ve saflaştırmak için uygundur.

Sf9 Saflaştırılmış Süperprosesif Kinesin-3 Ailesi Motorlarının Tek Moleküllü Analizi

Makale, canlı bir nematoda tek nöron çözünürlüğünde endojen etiketli kargoların aksonal taşınmasını görselleştirmek için floresan mikroskobu edinim parametrelerinin optimizasyonunu açıklamaktadır.

Canlı Caenorhabditis elegans'ta Floresan Mikroskobu ile Endojen Yükün Aksonal Taşınmasının Görüntülenmesinin Optimize Edilmesi

Öğrenin, fare hipokampal nöronlarında mikroakışkan cihazlar ve canlı görüntüleme kullanarak kargo hareket yönü ile kinesin ve dinein gibi moleküler motor protein kompozisyonu arasındaki ilişkiyi haritalama yöntemini.

Kullanımı Akson Kargo Hareketli Moleküler Motors Kompozisyon karakterize "Kargo Haritalama" Analizi

Daha fazla video keşfet