Kullanımı Akson Kargo Hareketli Moleküler Motors Kompozisyon karakterize "Kargo Haritalama" Analizi

Kargo haritalamanın genel amacı, veziküler yüklerle ilişkili olan ve onları hareket ettiren moleküler motor proteinlerin nispi miktarını ve türünü belirlemek ve bu motor bileşimini canlı kargo hareketinin yönlülüğü ile ilişkilendirmektir. Bu, ilk olarak mikroakışkan cihazlarda birincil fare hipokampal nöronlarının büyütülmesiyle gerçekleştirilir, böylece aksonlar nispeten düz büyür ve geçici olarak transfekte edilmiş nöronların aksonlarında floresan olarak etiketlenmiş kargo proteinlerinin canlı hücre içi hareketini kaydeder. İkinci adım, canlı kargo görüntüleme sırasında nöronları sabitlemek ve ardından aksonları kinesin ve dinler gibi moleküler motor proteinlere karşı antikorlarla boyamak ve ardından immünofloresan mikroskopi görüntülemesidir.

Daha sonra, sabit kargo ve motor görüntüleri, canlı kargo hareketini immünofloresan boyama ile belirlenen lekeli ilişkili motorlarla ilişkilendirmek için krafts olarak da adlandırılan, zaman içindeki kargo hareketi grafiklerine hizalanır. Son adım, motor kolokalizasyon adı verilen özel olarak geliştirilmiş bir MATLAB yazılım paketi kullanarak kargo ve motor proteinlerinin alt piksel konumlarını belirlemektir. Bu yazılım, her bir kargo ve motor konumunun kesin XY koordinatlarının yanı sıra yükler ve motorlarla ilişkili nispi floresan yoğunluklarını sağlar.

Sonuç olarak, canlı ve sabit yüklerin ve motorların floresan mikroskobunun alt piksel çözünürlük seviyesindeki korelasyonu, hareketin yönlülüğünün bilindiği belirli yüklerle ilişkili motor türleri hakkında bilgi sağlar. Dolayısıyla bu yöntem, ekzon taşıma mekanizması hakkında bilgi sağlar. Mikrot tubal dinamikler sırasında Proteinlerin mikrotubiallerle ilişkisi veya endositoz sırasında proteinlerin toplanması gibi yaşam mikroskobunu immünofloresan boyama ile ilişkilendiren diğer çalışmalara uygulanabilir.

Bu yöntemin görsel gösterimi, özel bir kurulum gerektirdiğinden öğrenmesi zor olabilecek görüntüleme fiksasyonu ve analiz adımlarının gerçekleştirilmesine yardımcı olacaktır. Bu prosedür için fare hipokampal primer nöronları, protokol metninde belirtildiği gibi hazırlanır ve nöro bazal yumurta büyümesinde yeniden süspanse edilir. Mikroakışkan cihazdaki nöronları plakalamak için orta.

Ortamı mikroakışkan rezervuardan bir ve bir prime çıkarın. Mikroakışkan rezervuara 20 mikrolitre hücre uygulayın ve akmalarına izin verin. Cihazı 20 dakika boyunca% 5 CO2 içeren 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin.

Hücrelerin kapalı cama yapıştığından emin olmak için mikroskop altına bakın. Tüm rezervuarları doldurmak için bir büyüme ortamı olan nöro bazal ekleyin. Cihazı hücrelerle birlikte dokuzuncu güne kadar inkübatöre geri koyun.

Kültürde, nöronlar aksonları mikro kanallar boyunca uzatır ve floresan proteinlerin ekspresyonu için transfeksiyona hazırdır. Transfekte edilmiş fare hipokampal primer nöronlarının canlı görüntülemesi, 37 santigrat derece inkübatör ve bir CO2 kontrol odası ile donatılmış, ters çevrilmiş bir epi floresan ışık mikroskobu üzerinde gerçekleştirilir. Bu prosedüre başlamak için 100 x yağ hedefini seçin.

Objektife yağ sürün ve mikroakışkan bir cihazda büyütülen hipokampal nöronlarla kapak kızağını mikroskop sahnesine monte edin. Nöronal ölümü önlemek için, numuneleri mikroskopta bir saatten fazla tutmamak için hızlı bir şekilde çalışın. Mikroakışkan odanın kanalları boyunca uzanan transfekte edilmiş hücrelerin aksonlarını bulun.

Transfekte edilmiş aksonun bulunduğu kanalların sayısını kaydedin. Canlı hareketin en iyi şekilde kaydedilmesi ve ardından kolokalizasyon analizi için bir el uyarı sinyali sayacı kullanarak kanal sayısını sayın. Kanallar boyunca nispeten düz büyüyen aksonları seçin, böylece çoğu vezikülün görüntülenmesi odakta gerçekleştirilebilir.

Sabit görüntülerin chm grefti üzerindeki hareket yörüngeleri ile daha sonra hizalanmasını kolaylaştırmak için. Görüntüleme sırasında mikro kanalların sağ kenarını görüş alanıyla hizalayın. Canlı görüntüleme sırasında hücreleri başarılı bir şekilde sabitlemek için, prosedür en iyi şekilde iki kişi ile, bir kişi sabitleyici eklemek ve odağı ayarlamak için başka bir kişi ile gerçekleştirilir.

Tüm reaktiflerin hazır ve erişilebilir olması da önemlidir. Bir mililitrelik plastik transfer pipeti kullanarak. Ortamın çoğunu ikinci ve ikinci rezervuarlardan çıkarın Prime, analiz edilen yükün taşıma dinamiklerine özgü zaman atlamalı özelliklerle canlı kargo hareketini görüntülemeye başlayın.

Yeterli canlı hareket verisi toplandıktan sonra, bir kişinin ikinci ve iki numaralı rezervuarları ön ısıtma fiksatifi ile doldurmasını sağlayın. Canlı görüntülemenin odağını bozacağı için mikroakışkan cihaza dokunmaktan kaçının. Sabitleyici eklenirken diğer kişinin odağı ayarlamasını sağlayın.

Aynı şekilde, rezervuarları bir ve bir astar ile doldurun, fiksatif fiksasyon ile hareketin hemen durması gözlendiğinde başarılı olur. Daha sonra, sabit nöronlar endojen motor proteinlere karşı antikorlarla boyanır ve protokol metninde tarif edildiği gibi görüntülenir. Kargo haritalamaya başlamak için, görüntü analiz yazılımını kullanarak kargo hareketinin bir kromografını oluşturun.

Rich Dorf Insights tarafından geliştirilen Image J eklentisi, ticari olarak mevcut grafik yazılımını kullanarak Kraft'ın üretilmesi için önerilir: kargonun immünofloresan görüntüsünü kargo hareketinin CHM grafiğine manuel olarak hizalayın, kargo punktasını chm grafiğindeki yörüngelerin konumuna yerleştirin, böylece her bir kargo punktası CHM grafiğindeki belirli bir yörüngeye karşılık gelecek şekilde sabitleme noktasında. En iyi hizalama sonuçları için, eşlenen kargo için en iyi odakta olan Z dilimini kullanın. Z yığınındaki her görüntü için birkaç Z dilimi kullanılabilir.

2B gaussları üç kanalın her birindeki nokta kaynaklarını temsil eden nokta yayılma işlevine sığdırmak için yerleşik bir algoritma kullanarak her floresan puncta için XY koordinatlarını ve yoğunluk genliklerini belirleyin. XY koordinatlarını elde etmek için, Yakima DONA ve meslektaşları tarafından mobil veya sabit yörüngelere haritalanan her bir kargo noktası için geliştirilen bir Gauss uydurma algoritmasını içeren, motor kolokalizasyonu adı verilen özel olarak oluşturulmuş bir MATLAB yazılım paketi geliştirildi. Kog grafiğinde, motor kolokalizasyon programının sonuçlarından XY koordinatlarını ve yoğunluk genliklerini seçin.

Farklı odak düzlemlerinde bulunan daha fazla kargoyu haritalamak için birkaç Zack görüntüsü kullanın. Eşlenen kargo için bireysel XY koordinatlarını, ilgili Z dilimindeki motor kanallarının her biri için elde edilen koordinatlarla karşılaştırın. Aynı odak düzlemi içinde sinyal veren kargolar ve motorlar için kargonun 300 nanometre yarıçapı içindeki XY motor koordinatlarını belirleyin ve seçin.

300 nanometre yarıçapı içinde bulunan punktaları belirlemek için motor kolokalizasyon yazılım paketini kullanın. Sarı floresan proteini veya Y-F-P-P-R-P-CC ile etiketlenmiş normal prion proteini taşıyan veziküllerin taşınmasını aksonlarda nispi miktarlarda kinesin ve din motorları ile ilişkilendirmek için kargo haritalaması kullanıldı. Bu grafik F-P-P-R-P-C vezikül hareketini gösterir ve noktalı çizgi canlı görüntüleme sırasında fiksasyon zamanını gösterir.

Sabit Y-F-P-P-R-P-C veziküllerinin floresan görüntülerinin yanı sıra Kinesin hafif zincir bir ve dine'nin karşılık gelen immünofloresan görüntüleri kromografa hizalanır. Bu genişleme, 2D gian fonksiyon atamaları ile üç kanalın her birinin immünofloresan sinyallerini gösterir. Bu grafik, Y-F-P-P-R-P-C vezikülleri, kinesin hafif zincir bir ve vahşi tip nöronlarda ve KİNESİN ağır zinciri olmayan nöronlarda dine arasındaki KOLOKALIZASYONUN nicelleştirilmesini temsil eder.

Y-F-P-P-R-P-C vezikülleri ile ilişkili Kinesin hafif zincir bir ve dinin nispi miktarı Gauss genliklerinden elde edilir ve nispi motor miktarlar ile hareketin yönlülüğü arasındaki olası korelasyonları incelemek için çizilir. Vahşi tip nöronlardan alınan bu örnek, hareketli veya sabit olan Y-F-P-P-R-P-C veziküllerinin KINESIN hafif zincir bir veya dine veya her ikisi ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu teknikte ustalaşıldıktan sonra üç gün içinde gerçekleştirilebilir. Mikro fillik cihazların ve birincil nöronun yaklaşık 10 günlük EM öncesi görüntüleme hazırlığına ek olarak, üç gün içinde immünofloresan boyama ve veri analizinin canlı görüntüleme görüntülemesini gerçekleştirebileceksiniz.

Bu videoyu izledikten sonra, mikroakışkan cihazlarda yetiştirilen floresan etiketli kargoların ve nöronların canlı hareketinin nasıl kaydedileceğini iyi anlamış olmalısınız. Görüntüleme sırasında C hücrelerinin nasıl düzeltileceği, alt piksel çözünürlüğü olarak kolokalizasyonun nasıl analiz edileceği ve bir yükün ve moleküler motor proteinlerin kolokalizasyonunun kargo hareketi ile nasıl ilişkilendirileceği.