MALDI-TOF Kütle Spektrometresi ve Özel Veritabanı kullanımı Benzersiz Mağarası Çevre (Kartchner mağaraları, AZ, ABD) Yerli Bakteriler niteleyin için

Bu prosedürün genel amacı, kütle spektrometresine MALDI kullanarak kütüphane tabanlı bakteri tanımlaması için ayrıntılı bir prosedür geliştirmek, uygulamak ve göstermektir. Bu, önce bir maloff kütle spektrometresi kullanılarak bakterilerin kütle spektrumlarının elde edilmesiyle gerçekleştirilir. Bu çalışmada, kostik bir ortamdan izole edilen 15 bakterinin kütle spektrumları, analiz edilen bakterilerin elde edilen tepe noktaları, karakteristik desenleri veya parmak izleri toplanmıştır.

Bu kütle spektrumları daha sonra yazılıma aktarılır ve bir model veritabanı oluşturulur. Daha sonra, model veritabanındaki referans kütle spektrumları, küme analizi, tepe eşleştirme ve istatistiksel analiz kullanılarak işlenir ve analiz edilir. Son olarak, bu 15 bakteriden rastgele seçilen kör kodlu bakterilerin kütle spektrumları tekrar toplanır ve tanımlama sonuçları için model veri tabanındaki referans spektrumlarla karşılaştırılır, bakterilerin benzerlik katsayılarına veya potansiyel biyobelirteçlere ve tepe sınıflarına dayalı olarak doğru bir şekilde tanımlanabileceğini gösterir.

Bu prosedüre, canlı hücre içermeyen bir mikrolitre protein ekstraktının paslanmaz çelik bir maldi hedef plakasına bırakılmasıyla başlayın ve kurumasını bekleyin. Daha sonra kurutulmuş protein ekstraktını bir mikrolitre matris çözeltisi ile kaplayın ve kurumasını bekleyin. Daha sonra kuruduktan sonra hedef plakaya bir mikrolitre CBR standardı koyun, CBR'yi bir mikrolitre matris çözeltisi ile kaplayın ve kurumasını bekleyin.

Son olarak, negatif kontrol olarak hedef plakaya iki mikrolitre matris çözeltisi bırakın. Nitrojen lazerle donatılmış ve Bruker flex kontrol yazılımı kullanılarak çalıştırılan çoklu kütle spektrometresini kullanın. 100 atış artışlarıyla 500 lazer atışı biriktirerek her bir kütle spektrumunu pozitif doğrusal modda toplayın.

İyon kaynağını bir voltajı 20'ye, kilovoltu iyon kaynağına, iki voltajı 18.15 kilovolta ve lens voltajını 9.05 kilovolta ayarlayın. Bu parametreler cihaza özeldir ve optimizasyon gerektirebilir. Otomatik spektrum değerlendirmesi için kütle şarj aralığını şarj başına iki ila 20 kilodalton arasında ayarlayın.

Ardından minimum çözünürlük eşiğini 100 olarak ayarlayın. OID tepe algılama algoritmasını seçin. Sinyal-gürültü oranı eşiğini ikiye ve minimum yoğunluk eşiğini 100'e ayarlayın.

Son olarak, veritabanı tasarımı için tepe birikimini 500 olarak ayarlayın. Yeni veritabanı sihirbazını kullanarak bio numerics 7.1'de yeni bir veritabanı oluşturun. Ardından, deney türleri panelindeki komutları kullanarak maldi gibi bir spektrum deneyi türü oluşturun.

Ardından, veritabanı tasarım panelini kullanarak seviyeleri oluşturun, veritabanı menüsüne gidin ve burada seviye yeni seviye ekle komutunu kullanarak yeni seviyeler ekleyin. Tür seviyesi, biyolojik replikasyon seviyesi ve teknik seviye oluşturun. Ham kütle spektrumlarını içe aktarmak için.

İlk olarak, dosya menüsünde gezinerek ve kütle spektrumunu dışa aktar komutunu tıklatarak esnek analizi kullanarak ham kütle spektrumlarını metin dosyaları olarak dışa aktarın. Daha sonra ham kütle spektrumlarını teknik kopyalar düzeyinde veritabanına aktarın. İkinci dereceden bir uydurma algoritması kullanarak içe aktararak ve yeniden örnekleyerek ham kütle spektrumlarını önceden işleyin.

Ardından, 50 punto boyutunda bir yuvarlanan disk kullanarak bir taban çizgisi çıkarma işlemi gerçekleştirin, sürekli dalgacık dönüşümü veya CWT kullanarak gürültü hesaplayın. Pencere boyutu 20 nokta ve beta 10 nokta olan bir Kaiser penceresi kullanarak spektrumları düzeltin. Ardından, 200 punto boyutunda bir yuvarlanma diski kullanarak ikinci bir taban çizgisi çıkarma işlemi gerçekleştirin.

Son olarak, tepe boyutları, tepe yoğunlukları ve sinyal-gürültü oranını içeren tepe listeleri gibi her bir kütle spektrumunun güvenli karakteristik modellerini önceden işledikten sonra, minimum 10 sinyal-gürültü oranıyla CWT'yi kullanarak tepe noktalarını tespit edin. Bir sonrakinde, analiz menüsündeki özetlenen komutu kullanarak önceden işlenmiş spektrumlardan kompozit kütle spektrumları oluşturun. Hedef seviye olarak biyolojik çoğaltmayı seçin. Burada.

Aynı koloninin 10 teknik kopyasının kütle spektrumlarını birleştirin ve o koloni için bir kompozit kütle spektrumu elde edin, bu da biyolojik replikat seviyesinde bu izolat için üç kompozit kütle spektrumu ile sonuçlanır. Son olarak, tür düzeyinde bu izolat için bir kompozit spektrum oluşturmak için üç kompozit spektrumu özetleyin. Benzerlik tabanlı küme analizi ve çok boyutlu ölçekleme yapmak için renklerle gruplar oluşturun.

İlk olarak, üç biyolojik bileşik kütle spektrumunu seçin ve ilgili izolat için bir grup oluşturmak üzere grubun menüsündeki seçimden yeni grup oluştur komutuna tıklayın. Daha sonra bu üç kütle spektrumu için otomatik olarak kullanılan bir renk tasarlayın. Kümeleme menüsünde gezinerek ve küme analizini hesapla komutunu tıklatarak küme analizi gerçekleştirin.

Karşılaştırma ayarlarında, birinci sayfada, Pearson korelasyonunu seçin ve diğer parametreleri varsayılan olarak bırakın. İkinci sayfada, aritmetik ortalama ile ağırlıksız çift grubu yöntemini seçin. Ardından bitir'i tıklayın.

Tepe eşleştirmeyi gerçekleştirmek için istatistikler menüsündeki çok boyutlu ölçeklendirme komutunu kullanarak çok boyutlu bir ölçeklendirme grafiği elde edin. Deneyler panelinde spektrum türü maldi'ye tıklayın. Ardından düzeni seçin.

Görüntüyü göster, spektrumların bireysel zirveleri gösterilir. Ardından, tepe sınıflarını tanımlamak için spektrum menüsündeki do tepe eşleştirme komutunu kullanarak tepe eşleştirmesi gerçekleştirin, istatistik matrisine tıklayarak iki yönlü kümeleme gerçekleştirin. Madencilik. Tepe sınıflarıyla eşleşen tepe noktalarının yoğunluğu, benzerlik katsayısına dayalı yöntem kullanılarak bakterileri tanımlamak, bir karşılaştırma oluşturmak ve küme analizi için gerçekleştirilen teknik kopya düzeyinde kütle spektrumlarına dayalı bir rogram oluşturmak için bir ısı haritası olarak temsil edilir, benzerlik karşılaştırması için rogramı kaydedin.

Bilinmeyen bir kütle spektrumu seçin ve analize tıklayın. Seçili girişleri tanımlayın. Kimlik iletişim kutusu görüntülenir.

Karşılaştırma tabanlı sınıflandırıcı türünü seçin ve ileri'ye tıklayın. Sonraki sayfada, referans karşılaştırması olarak kaydedilen gramı seçin ve ardından İleri'ye tıklayın. Bir tanımlama yöntemi olarak temel benzerliği seçin ve tekrar ileri'ye tıklayın, puanlama yöntemi olarak maksimum benzerliği seçin.

Her parametre için uygun eşik değerlerini ve en küçük fark değerlerini yazın ve ardından ileri'yi tıklatın. Hesaplamalar tamamlandıktan sonra, sonuçlar panelinde tanımlama penceresi görünür. Veritabanının bilinmeyenle en iyi eşleşen üyeleri listelenir.

Kümeleme analizine dayalı bir rogram, veritabanındaki her bir izolat arasında bir benzerlik gösterir. Veri seti, her tür için üç kompozit spektrum ile 15 farklı türün spektrumlarını içerir. İki yönlü küme analizi, araştırmacıların bir tür veya bir tür içindeki suşlar için potansiyel biyobelirteçleri belirlemelerine yardımcı olabilir.

Burada en yüksek yoğunluk renklerle, yeşil düşük yoğunluk ve kırmızı yüksek yoğunluk ile temsil edilir. Son olarak, bu analizlere dayanarak, bir bilinmeyenin kütle spektrumu gram ile karşılaştırılabilir ve benzerlik katsayısına dayalı bir tanımlama elde edilir.