Toprak Örnekleme ve Entomopatojenik Nematodlar İzolasyonu (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Bu prosedürün amacı, entero patojenik nematodların toprak örneklemesi ve izolasyonu için yaygın olarak kullanılan yöntem ve teknikleri göstermektir. Bu, önce toprak örneklerinin bir transekt yaklaşımıyla veya gösterildiği gibi rastgele bir örnekleme yaklaşımıyla toplanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, entero patojenik nematodları seçici olarak geri kazanmak için toprak örnekleri böceklerle azaltıldı.

Son adım, modifiye edilmiş beyaz bir tuzak kullanarak enfekte olmuş böceklerden nematodları toplamaktır. Sonuç olarak, bu teknikler laboratuvarda entero patojenik nematod kültürlerinin başarılı bir şekilde kurulması için kilit adımları temsil eder ve sonraki biyo-tahliller için temel oluşturur. Toprak örnekleme tekniğinin avantajı, tarlaya gidebilmemiz ve patojenik nematodların olgun aşamalarını toplayabilmemizdir.

Bu nematodlarla enfekte olmuş böcekler için örnekleme yapmak yerine, nadiren karşılaşılır. Kullandığımız rastgele örneklem stratejisi, geniş bir coğrafi bölge veya alandan gelen patojenik nematodların çeşitliliğini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Bu teknik ilk olarak 1975 yılında Accur'da bahis oynayarak tanımlanmıştır.

Serbest yaşam evrelerinin böcek konakçılarına çekileceği ve onları parazitleştireceği öncülüne dayanan seçici bir prosedürdür. Prosedürlerin gösterilmesi Rue Orozco yüksek lisans öğrencisi ve laboratuvarımda araştırma teknisyeni Ming Mingle olacak. Laboratuvar. Numune toplama alanı en az iki metrekarelik bir alana sahip olmalı ve mümkünse dört metrekareden büyük olmalıdır.

Her toprak numunesi için, DM a C numune alanı içinde en az üç küçük alt numune alın. Alt örnekler, çalışmanın amaçlarını karşılıyorsa birleştirilebilir. Toprak örneklerini sıfır ila 15 santimetre derinlikte toplayın.

Her numune 250 gram ila bir kilogram arasında olmalıdır. Toprak CORA'ları, kargalar, el kürekleri veya benzer aletler kullanın ve seçilen her örnekleme alanındaki en az beş rastgele bölgeden toplayın. Her numune çift torbalanmalı ve su geçirmez bir işaretleyici ile etiketlenmelidir.

Etiket, saha, konum, yükseklik, tarih ve habitat tanımı ile ilgili bitki örtüsü ve sahadaki sıcaklık gibi çevresel değişkenler hakkında bilgi içermelidir. Yerel böcekleri ve diğer omurgasız türlerini not edin. Toplama alanları arasında laboratuvarda daha sonra tanımlanmak üzere hemen tanımlanamayan türleri toplayın, toplama araçlarını suyla iyice yıkayın, ardından %70 etanol veya %0,5 çamaşır suyu kullanarak dezenfekte edin.

Toprak örneklerini nakliye için sekiz ila 15 santigrat derece arasında bir soğutucuda saklayın. CES, toprağın bileşimi, dokusu, iletkenliği vb. gibi brüt özelliklerini analiz etmek için numunenin bir bölümünü ayırır. Her toprak örneğinden, seik mikrop kontaminasyonuna yol açabilecek kalıntıları temizleyin.

Daha sonra toprağı suyla nemlendirin, böylece içindeki nematodlar kolayca hareket edebilir. 200 ila 250 gram nemli toprağı kapaklı plastik bir kaba yükleyin. Sonra böcek yemleri ekleyin.

Beş ila 10 böcek yeterli olacaktır. Kapağı takın, kabı ters çevirin ve karanlığa koyun. Her iki ila üç günde bir oda sıcaklığında, ölü böcekleri çıkarın ve gerektiğinde ek ağırlık için bunları sağlıklı böceklerle değiştirin.

Böcek kadavrası kahverengi veya koyu sarı ise, bu Stein ve Nema'nın parazitleyici pariti olduğunu gösterir. Oysa kadavra tuğla kırmızısı ila koyu mor renkteyse, hetero bekleyin. Böcek yemlerini parazitleştiren nematodları toplamak için modifiye edilmiş beyaz bir tuzak kullanın.

İlk olarak, 50 veya 60 milimetrelik bir Petri kabının kapağını 100 milimetrelik bir kabın tabanına yerleştirin. Ardından bir dairesel watman tabakası yerleştirin. Küçük tabakta bir numaralı filtre kağıdı.

Böcek kadavralarını sterilize su ile durulayın ve filtre kağıdına aktarın. Birbirleriyle temas halinde olmayacak şekilde yayın. Sadece daha büyük tabağı yaklaşık 20 mililitre damıtılmış su ile doldurun ve düzeneği daha büyük tabaklarla örtün. Kapak.

Bulaşıkları nematod adı, böcek yemleme tarihi ve tarihi ile etiketleyin. Tuzak kuruldu. Tuzakları oda sıcaklığında tutun ve böcek kadavralarından çıkan enfektif, genç nematodları veya IJ'leri izleyin.

Bu 10 ila 25 gün sürebilir ve tuzağın tutulduğu yerin sıcaklık ve nem seviyesine bağlıdır. Tuzaktaki su seviyesi buharlaştıysa, IJ'li plakalara yeniden doldurduğunuzdan emin olun. Suyu, nematod içermesi gereken daha büyük tabaktan toplayın.

Nematodların birkaç dakika batmasına izin verin ve ardından suyu yavaşça boşaltın. Nematodlar az miktarda suda kaldığında, geri su ekleyerek ve ardından dikkatlice dökerek birkaç kez daha durulayın. Daha sonra nematod popülasyonunu tahmin etmek için seri seyreltmeler yapın.

250 mililitrelik bir kültür şişesinde, nematod konsantrasyonunu mililitre başına bir ila 3000 nematod arasında ayarlayın. Bu süspansiyonu 10 ila 20 santigrat derece arasında saklayın. Genellikle doğada, entero patojenik nematodlar tarafından parazitlenmiş böcekleri bulma şansı çok düşüktür.

Bu nedenle, yem olarak G melanom larvalarını kullanan ana hatlarıyla belirtilen protokol, bu tür nematodları çok daha verimli bir oranda izole etmek için kullanıldı. Beş gün sonra, böcekler enfekte oldu ve kırmızı bir renge sahipti. Modifiye edilmiş beyaz tuzaklar nematod izleri gösterdi.

Bu tuzaklardan 15 gün sonra suda toplanan nematodlar temiz bir görünüme kavuştu ve böcek dokularından arındı. Galyum Melania larvalarını kullanan tek bir ekstraksiyon döngüsü, bir toprak örneğinde bulunan tüm Oma patojenik nematodlarının geri kazanılması için yetersiz olabilir. Bu nedenle, bunu birden çok kez yapmanızı öneririz.

Ayrıca, kullanıcılara Galleria yerine diğer böcekleri düşünmelerini tavsiye ediyoruz, bu da iyileşme şansını artıracaktır. Toprak örneklerinin böceklerle tartışılması, bakteri veya mantar gibi diğer böcek patojenlerinin izolasyonu için de düşünülebilecek bir tekniktir.