Name: Transkripsiyonal Analiz Büyük ölçekli Zebra balığı Embriyonik Kalp Diseksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Öğrenin zebra balığı embriyonik kalp diseksiyonu ile kardiyak spesifik RNA izolasyonunu. Bu yöntem transkripsiyonel analiz ve kalp gelişimi genetik araştırmaları için yüksek kaliteli örnek sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu saflaştırma protokolünün temel ilkesini ana hatlarıyla belirttikleri için C. Burns'e, C. McRae'ye ve bu yöntemin laboratuvarımızda ilk kez uygulandığı için F. Priller'e teşekkür ederiz. S.A.-Ş. Deutsche Forschungsgemeinschaft'ın (DFG) Heisenberg profesörlüğü tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma DFG hibesi SE2016/7-1 ile desteklenmiştir.

Bu protokol Alman ve Berlin eyalet yasasının hayvan bakım kurallarına şöyle; Zebra balığı işleme hayvan koruma (LaGeSo, Berlin-Brandenburg) yerel otorite tarafından izlendi. 1. Kalp Ekstraksiyon için Zebra balığı Embriyolar Alınması <ol><li> Transgenik hat 9 twu34 Kalbe spesifik GFP ile embriyolar elde etmek için: bu tür Tg (EGFP myl7) halinde çapraz kalp raportör zebra balığı. </li><li> İstenilen embriyonik aşamada 10,11 yılına kadar 28.5 ° C&#39;de yumurta suda embriyolar koruyun. Toplanan embriyo nüfus gen ifadesi değişikliklerini sınırlamak için hem genetik ve gelişimsel aşamada homojen olduğundan emin olun. </li><li> Elle embriyolar Dechorionate. </li></ol> 2. Kesme Zebra balığı Embriyonik Kalpler NOT: buz üzerinde tüm çözümleri tutun. Mümkünse, takım çalışması yapın: Bir kişi emb gelen kalpleri masayaryos başka bir kişi floresan stereomikroskop altında kalpleri sıralar ise. Bu, birkaç saat içinde embriyo yüzlerce işlenmesine olanak tanır. <ol><li> 1.5 ml santrifüj tüpüne yaklaşık 100 embriyolar transfer. Tricaine embriyo (E3 ortamı içinde 0.16 mg / ml) anestezisi. Embriyolar açıkça anestezi kez devam edin (onlar yüzmek ve tüpün dibine tortu, ama yürekleri hala yenerek değil). </li><li> Tricaine / E3 çözeltisini çıkarın ve 1 ml L-15/10% FBS ortamı ile bir kez embriyolar yıkama ve buz üzerinde muhafaza. NOT: L-15 /% 10 FBS orta kalpleri RNAlater veya Trizol içine devredilmiştir kadar tüm diseksiyon işlemi sırasında canlı organ ve hücreleri tutmak önemlidir. </li><li> Sarısı tamamen bozulur kadar Yuvarlak Jel Yükleme İpucu yukarı ve aşağı embriyolar ve pipet 5-8 kez 1 ml L-15 /% 10 FBS orta ekleyin. Embriyolar damla damla çözeltinin yüzeyine açılan patlama böylece pipet veEmbriyolar hafifçe bozulur. NOT: yukarı pipetle ve aşağı, yani daha pipet geç evrelerde (örneğin 56 hpf) ihtiyaç olduğu, embriyoların gelişim aşamasında bağlıdır edilecek Nasıl şiddetle ve ne sıklıkta embriyolar var. </li><li> Çok hafifçe pipetle, bazı kalpleri embriyoların takılı kalabilir çünkü disseke embriyoların ilk parti için, embriyoların bütünlüğünü ve bir stereo mikroskop altında disseke kalpleri oranını değerlendirmek. Buna göre diseksiyon sonraki tur için pipetleme şeklini ayarlayın. NOT: plastik yapışmasını kalpleri en aza indirmek için düşük tutma pipet uçları ve mikrosantrifüj tüpleri kullanın. </li><li> 50 ml&#39;lik santrifüj tüpüne yerleştirilen 100 mikron filtre üzerine numuneyi uygulayın; 1 ml L-15/10% FBS ortamı ile 1.5 mi tüp durulama ve sonra, (bir kupa tüpün duvarlarına yapışmasını olabilir) örnek kaybını en aza indirmek amacıyla, filtreye, bu geçerlidir. 1 ml L, iki kez filtre yıkayın-15/10% FBS. Bu adımda, kalpler filtre içinden geçer ve 50 ml&#39;lik bir tüp içinde toplanmıştır. </li><li> 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne yerleştirilir, 30 mikron filtre üzerine akış yoluyla uygulanır ve 1 ml L-15/10% FBS ortamı ile bir kez durulayın. Bu ikinci filtrasyon adımında, kalpler filtre muhafaza edilir ve küçük çöp yıkanır. </li><li> Baş aşağı çevirin ve filtreyi 1 ml L-15/10% FBS ile arka arkaya üç yıkar uygulayarak% 1 agaroz kaplı petri içine filtre dışarı kalpleri yıkayın. </li><li> Elle floresan stereomikroskop altında forseps bir çift ile nonfluorescent embriyonik enkaz (örn göz mercekleri) GFP-pozitif kalpleri ayırmak ve yemeğin ortasında onları konsantre. Adım 3&#39;e göre onları toplayın. NOT: embriyolar daha eski 24 hpf iseniz, kalpler, dayak dokular hala fizyolojik normal olduğunu belirten olmalıdır. </li></ol> 3. Dissec mRNA izoleted Kalpler <ol><li> (Buz üzerinde) ve 0.75 ml RNAlater ihtiva eden 1.5 ml&#39;lik bir tüp içine mümkün olan en küçük hacimde kalpleri (örneğin, 10 | il) ve pipet toplayın. Hiçbir kalpler bir floresan stereomikroskop altında görüntüleyerek pipet kalır emin olun. </li><li> Alternatif olarak, bir kimyasal başlık floresan mikroskop hemen yakınında varsa, kimyasal başlık altında Trizol (DİKKAT) toplanır kalpleri aktarmak. Bu pipet ve aynı zamanda kalplerin santrifüj sırasında yapışmasını kalplerin olası kaybını circumvents (3.4, 3.5 ve 3.7 adımları). Trizol ile aynı tüpe izolasyon birkaç tur kalpleri havuzu ve 3.8 adıma doğrudan gitmek; Nihai hacim orijinal Trizol hacminin% 10 geçmemelidir. NOT: Kullanmadan önce Trizol Malzeme Güvenlik Bilgi Formu (MSDS) okuyun. Bir başlık altında Trizol reaktif Kulp ve Kişisel Koruyucu Ekipman tavsiye aşınma. Cilt, göz ve clothi ile temastan kaçınınng. Tüm tutuşma kaynaklarını uzaklaştırın. </li><li> RNA izolasyonu etkinliği toplanan doku miktarı ile iyileştikçe, (buz üzerinde) RNAlater aynı tüp içine tecrit birkaç tur kalpleri havuzda toplayın. Toplam örnek hacmi, orijinal RNAlater hacminin% 10&#39;unu aşması halinde, (buz üzerinde) depolama için 0.75 ml RNAlater ile ek bir tüp kullanın. </li><li> Kalpleri çökeltmek için 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 15.700 x g&#39;de örnekleri santrifüjleyin. </li><li> Flöresanlı bir stereomikroskop altında, 3 ml L-15/10% FBS ortamı içeren bir% 1 agaroz kaplı petri içine mümkün olduğu kadar çok dikkatli bir şekilde süpernatan toplamak ama santrifüj tüpünün tabanına tabakalandığı kalpleri rahatsız yoktur. Kalpleri% 15 e kadar bağlı RNAlater yüksek bir viskoziteye sahip süpernatan içinde kalabildiği için aşama 3.7&#39;de tarif edildiği gibi, bunları almak. </li><li> Bir kimyasal Kaputun altında, sedimante kalpleri içeren tüp 0.5 ml Trizol ekleyin ve buz üzerinde tutmak. </li><li> Floresan microsco altındaPE, sulandırmak için 3 ml L-15/10% FBS ile bir% 1 agaroz-kaplanmış çanak içine RNAlater / l-15/10% FBS çözeltisi ihtiva eden,% 1 agaroz-kaplanmış çanak (adım 3.5 den) kalpleri aktarmak RNAlater dışarı. Petri kasesinin ortasına kalpleri toplamak ve kimyasal bir başlık altında Trizol tabakalandığı kalplerin tüp içine, küçük bir hacim içinde aktarın. </li><li> Girdap Trizol kalpleri ihtiva eden 1.5 ml&#39;lik bir tüp kalpleri bozabilir ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübasyona. </li><li> Bir kimyasal Kaputun altında, 100 ul kloroform (DİKKAT) ekleyin, iyice karıştırın ve (kullanmadan önce maksimum hızda santrifüj 30 sn) 1.5 ml önceden bükülmüş PLG tüp Trizol / kloroform çözüm aktarın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca inkübe edin. NOT: Kullanmadan önce kloroform MSDS okuyunuz. Bir başlık altında kloroform reaktif Kulp ve Kişisel Koruyucu Ekipman tavsiye aşınma. Deri, göz ve giysilere dokunmayınız. Alkaliler, metal gibi uzak Uygunsuz maddelerden tutunuz. </li><li> Santrifüjge 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 15.700 x g&#39;de numune ve yeni bir 1.5 ml&#39;lik bir tüp içine, sulu faz aktarılır. </li><li> 5-10 mikrogram glikojen ve izopropanol (-20 ° C&#39;de) soğutulmuş 250 ul ekleyin; iyice karıştırılır ve -20 ° C &#39;de gece boyunca inkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 15,700 x g&#39;de santrifüjleyin ve süpernatant atılır. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 15.700 x g&#39;de 1 mi% 75 etanol, santrifüj ile pelet yıkayın ve süpernatant atılır. </li><li> Bu (10-15 dakika, örneğin), beyaz hale gelinceye kadar oda sıcaklığında pelet kurutulmasıyla etanol buharlaşmasını olsun. </li><li> Pelet 20 ul RNase içermeyen GKD 2 O ekleyin ve RNA çözmek üzere 55 ° C de 10-15 dakika inkübe edilir; Daha sonra buz üzerinde tutmak. </li><li> Absorbans ölçümü RNA konsantrasyonu ve saflığı değerlendirin. Bir% 1 agaroz jeli üzerinde örneği çalışmadan RNA bütünlüğü değerlendirin. </li></ol>

<ol><li>Stainier, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+the+formation+and+function+of+the+cardiovascular+system+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo.</a> Development. 123, 285-292 (1996).</li>
<li>Chen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+the+cardiovascular+system+and+other+internal+organs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish.</a> Development. 123, 293-302 (1996).</li>
<li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).</li>
<li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends Genet. 10, 73-74 (1994).</li>
<li>Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+real+time+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A novel method for real time quantitative RT-PCR.</a> Genome Res. 6, 995-1001 (1996).</li>
<li>Epstein, C. B., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+technology+-+enhanced+versatility%2C+persistent+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge.</a> Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).</li>
<li>Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+Technology+and+Its+Application+in+Fish+Transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22OMICS%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics.</a> OMICS. 18, 98-110 (2014).</li>
<li>Burns, C. G., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hearts+from+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Purification of hearts from zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 40, 274-278 (2006).</li>
<li>Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transmission+of+a+myocardium-specific+GFP+transgene+reveals+critical+regulatory+elements+in+the+cardiac+myosin+light+chain+2+promoter+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish.</a> Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th, University of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Veerkamp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilateral+dampening+of+Bmp+activity+by+nodal+generates+cardiac+left-right+asymmetry%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry).</a> Dev Cell. 24, 660-667 (2013).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li>
<li>Brownlie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+embryonic+globin+genes+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish.</a> Dev Biol. 255, 48-61 (2003).</li>
<li>Marvin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+patterns+of+the+zebrafish+small+heat+shock+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins.</a> Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).</li>
<li>Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain.</a> Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li>
<li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li>
<li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokol gen ifadesi için Zebra balığı Embriyonik kalp dokusunun hızlı zenginleşme analizleri verir. RNA arıtma sadece yeterli çalışır çünkü, kalplerin kaybı protokolü her aşamasında önlenir, ilk numune miktarı büyük ölçüde artırıldı: kardiyak spesifik RNA örnek miktarı ve kalitesi büyük ölçüde bir kaç önemli adımlar bağlıdır başlangıç ​​malzemesi. İkinci olarak, deneyi ile tamamen bağlıdır numune saflığı, sıralama ve sıkı bir şekilde diğer dokuları hariç tutulduğunda petri çanağı içinde kalpleri toplayarak tespit ed...

Balığı (Danio rerio), yaygın küçük olması nedeniyle ve floresan proteinleri dokuya-özel ifadesi transjenik raportör hatları durumu ile birleştirilmiş olan, hızlı, şeffaf ve rahim dışı embriyonik gelişme, in vivo olarak organogenez çalışma gelişim biyolojisi kullanılır. Bu küçük omurgalı, özellikle de erken Zebra balığı embriyonun oksijenlenme, kalp atışı ve kan akımı dayanmaz çünkü kalp gelişimini incelemek için uygundur; Bu özellikler kardiyovasküler mutantların 1,2 sayıda karakterizasyonu izin ve zebra balığı artık kalp hastalıkları 3 incelemek için yaygın olarak tanınan bir model organizmadır. Embriyo gelişimi esnasında gen ekspresyonunu incelemek için, transkriptler genellikle tüm montaj in situ melezleşme (VVISH) 4 ile analiz edilmiştir, RT-qPCR 5, mikrodiziler 6, ya da bir sonraki nesil sıralama (RNA Dizi) 7. SüreWISH analiz tüm embriyo olan gen ifadesinin uzamsal ve zamansal analizi, transkript seviyeleri, genellikle, RT-qPCR mikrodizilerdeki ya da RNA-Seq yaklaşımlarla değerlendirilir sağlar. Bununla birlikte, bu yöntemler, belirli bir gen ekspresyonu profillemesi doku zenginleştirme gerektirir. Zebra balığı Embriyonik kalp tüm embriyo küçük bir kısmını temsil ettiğinden dolayı, kalp gelişimi sırasında transcriptome çalışmaları diseksiyon ve kalpleri zenginleştirilmesi için bir protokol gerektirir. Buna ek olarak, fizyolojik olarak ilgili veri elde etmek için, bu RNA ekstraksiyonu kadar tam olarak işlevsel kalp dokusunu muhafaza etmek önemlidir. Burada, biz hızla fizyolojik, normal izole ve verimli bir şekilde ileri analizler için yüksek kaliteli RNA örnekleri elde etmek için Zebra balığı embriyolarının yüzlerce kalpleri yenerek bir protokol açıklar. Bu yöntem Burns ve MACRAE 2006 8 tarafından bildirilen protokol dayanmaktadır. Kalp dokusunun zenginleşmesi için, her iki yöntem bir transgenik miyokard muhabiri hattını kullanmakve diğer dokulara karşı Zebra balığı embriyonik kalpleri diferansiyel yapışma özelliklerine yararlanmak. Kısaca, dar bir pipet ucu ile yukarı ve aşağı doğru çok sayıda embriyolar pipetleme, kalpler aynı embriyonik gövdelerinden serbest bırakılır ve daha sonra, iki hızlı bir filtreleme adımlarından embriyonik enkaz ayrılır; floresan etiketli kalpler sonra el kalan enkaz sıralanır ve daha fazla işlem için toplanır.

<table><tbody><tr><td>Balık yetiştirmek ve yumurta toplamak için donatım&nbsp;</td><td></td><td></td><td>ayrıntılar için Zebra Balığı Kitabı11 bakın</td></tr><tr><td>Floresan stereomikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı Mikrosantrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Spektrofotometre</td><td></td><td></td><td>örn. Thermo Scientific Nanodrop 2000</td></tr><tr><td>Nükleik asit elektroforez odası</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları 4 cm &Oslash;, E3 ortamında</td><td></td><td></td><td></td>%1 agaroz ile kaplanmıştır</tr><tr><td>Mikropipetler ve uçlar (P20, P100, P1000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml santrifüj tüpleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml ve 50 ml santrifüj tüpleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forseps</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>çiftiExactaCruz ve ticaret; Steril rafta yuvarlak jel yükleme uçları, 1-200 & mu; l&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-201732</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m filtresi (BD Falcon 100 mm Hücre Süzgeci)</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu; m filtre (Ön Ayırma Filtreleri-30 & mikro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Faz kilitli jel, ağır, 1.5 ml tüpler ve nbsp;</td><td>Prime</td><td>2302810</td><td></td></tr><tr><td>Yumurta suyu ortamı</td><td></td><td></td><td>60 &mu; g/ml ddH2O'da Anlık Okyanus Deniz Tuzları, %0.00001 (a/h) Metilen Mavisi</td></tr><tr><td>E3 orta&nbsp;</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl<alt>2</alt>, 0.33 mM MgSO<alt>4</alt></td></tr><tr><td>Trikain (3-amino benzoik asitilester)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td>4 mg/ml Trikain stok çözeltisi, pH 7</td></tr><tr><td>%1 agaroz (E3 ortamında)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%1 agaroz jel (TBE tamponunda)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz ve akut; s L-15 orta&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Sığır Serumu)</td> <td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>1559606</td><td></td></tr><tr><td>Glikojen ve nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10814-010</td><td>20 ve mikro; g/&mikro; l RNaz içermeyen su</td></tr><tr><td>kloroform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>izopropanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%75 etanol (DEPC-ddH2O'da)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Nükleaz içermeyen su veya sterilize edilmiş DEPC ile muamele edilmiş ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroforez</td> için nükleik asit yükleme tamponu <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBE (Tris/Borat/EDTA) tamponu</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transkripsiyonal analiz büyük ölçekli zebra balığı embriyonik kalp diseksiyon

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Zebra balığı Embriyonik kalp tüm embriyonun sadece küçük bir kısmını temsil eden, sadece birkaç yüz hücrelerden oluşur. Bu nedenle, genel embriyonik transcriptome tarafından maskelenen kardiyak transcriptome önlemek için, ayrıca analiz için kalpleri yeterli sayıda toplamak için gereklidir. Zebra balığı kalp geliştirme hızla devam Dahası, kalp toplanması ve RNA ekstraksiyonu yöntemleri numunelerin homojen olmasını sağlamak için hızlı olması gerekir. Burada, biz Zebra balığı embriyolarının fonksiyonel / yenerek kalpleri toplamak için hızlı manuel diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu transcriptome analizleri ile bu kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) halinde, kalp-özgü gen ekspresyon seviyelerini belirlemek için daha sonra, kalp-özel RNA ekstraksiyonu için bir temel oluşturur. yöntem, diğer dokulara göre zebra balığı embriyonik kalp diferansiyel yapışma özellikleri dayanmaktadır; Bu hızlı laşılmakla sağlarakışkan kesme kuvveti bozulması, aşamalı filtrasyon ve transgenik floresan etiketli kalplerin manuel toplama bir kombinasyonu ile dışı dokusundan kalp ceği ayrılması.

Sadece miyokardın (. Şekil 1) içinde twu34 transgenik hattı 9, yeşil floresan proteininin (GFP) ifade eder: Burada, biz zebrabalıkları Tg (GFP myl7) kullanarak bir temsilci kalp diseksiyon deneyi tarif. Biz disseke kalpleri ve kalp numunenin saflığını değerlendirmek için elde edilmiştir hangi embriyolar hem topladı. Kısaca, homozigot Tg (myl7 GFP) twu34 zebra balığı 9, embriyonik kalpleri GFP etiketli ki, vahşi tip ile çaprazlanırlar. Yaklaş...

Zebra balığı kalp gelişimi sırasında kalp gen ekspresyon profillerini analiz etmek, toplam RNA izole kalpleri elde edilecek olan. Burada, biz kalp-özel mRNA elde etmek Zebra balığı embriyolarının gelen hızlı manuel diseksiyon ile işlevsel / yenerek kalpleri toplamak için bir protokol mevcut.

Transkripsiyonal Analiz Büyük ölçekli Zebra balığı Embriyonik Kalp Diseksiyon

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Bu prosedürün genel amacı, kardiyak spesifik Mr.NA.Bu, kalpleri aynı anda embriyonik cisimlerden serbest bırakmak için dar bir pipet ucundan yukarı ve aşağı olmak üzere birçok anestezi uygulanmış embriyo olan canlı zebra balığı embriyolarından hızlı manuel diseksiyon ile kalpleri toplamaktır. Daha sonra, disseke edilen kalpler iki hızlı filtrasyon adımında embriyonik kalıntılardan ayrılır. Daha sonra floresan etiketli kalpler, kalan kalıntılardan manuel olarak ayrılır.Son olarak, toplanan kalplerden kardiyak spesifik RNA çıkarılır. Sonuç olarak, kalp diseksiyon protokolü, transkriptom analizi yapmak için yeterli miktarda embriyonik kalp toplamak için kullanılır. Bu yöntem, farklı gelişim aşamalarında kalp içinde hangi transkriptlerin ifade edildiği gibi gümüş balığı kalbi gelişim alanında anahtar soruların sorulmasına ve ayrıca vahşi ve mutant kalp ifadelerinin karşılaştırılmasına yardımcı olacaktır Kalp ekstraksiyonu için zebra balığı embriyoları elde etmek için, stereo mikroskop altında transgenik mil yedi EGFP gibi kalpte bir floresan proteini eksprese eden çapraz yetişkin transgenik balıklar.Embriyoların gelişimini izleyin. Kalplerin gerçekten floresan olarak etiketlendiğini doğrulayın ve embriyolar istenen aşamaya ulaştığında embriyoları manuel olarak kaplayın. Yaklaşık 100 embriyoyu 1.5 mililitrelik bir füge tüpüne aktarın ve onları uyuşturmak için E üç besiyerinde mililitre trica başına 16 miligram nokta ekleyin.Tüpü buzun üzerine koyun. Trica solüsyonunu çıkarın ve embriyoları yıkamak için bir mililitre buz gibi L 15 %10 FBS ortamı kullanın ve buz üzerinde tutun. Bu yıkamayı çıkardıktan sonra, bir mililitre L 15 FBS ekleyin ve sarıları tamamen bozmak için embriyoları beş ila sekiz kez yukarı ve aşağı pipetlemek için yuvarlak bir jel yükleme ucu kullanın, embriyoları solüsyonun yüzeyine damla damla pipetleyin, böylece damla patlar ve embriyolar nazikçe bozulur.Stereo mikroskop altında diseke edilmiş embriyoların bu ilk partisi için, bütünlüklerini ve disseke edilmiş kalplerin oranını değerlendirin ve pipetleme şeklini buna göre ayarlayın. Sonraki partiler için, 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 100 mikrometrelik bir filtre yerleştirin ve embriyonik numuneyi uygulayın. Ardından, füge tüpünü rinlemek için bir mililitre L 15 FBS kullanın ve filtrede kalan kalpleri temizlemek için solüsyonu filtreye uygulayın.İki kez yıkamak için L 15 FBS kullanın. Daha sonra, 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 30 mikrometrelik bir filtre yerleştirin ve kalbi içeren akışı uygulayın. Kalpleri tutan ve daha küçük kalıntıları yıkayan bu filtreyi durulamak için L 15 FBS kullanın.Daha sonra 30 mikrometre filtreyi agros kaplı bir Petri kabı üzerinde ters çevirin ve kalpleri filtreden çıkarmak için üç mililitrelik L 15 FBS ortamı yıkaması uygulayın Floresan mikroskop altında, GFP pozitif kalpleri floresan olmayan dokulardan manuel olarak ayırmak için bir çift forseps kullanın ve bunları tabağın ortasına yoğunlaştırın. Diseksiyondan sonra hala atmaya devam ettikleri için kalplerin fizyolojisi normal görünür. Prosedür. mRNA'yı kalplerden izole etmek için, onları mümkün olan en küçük hacimde toplayın ve 0,75 mililitre RNA içeren buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüpe pipetleyin.Daha sonra floresan mikroskobu altında. Pipet ucuna yapışmış kalp kalmadığını doğrulamak için pipet ucunu görüntüleyin. Kalpleri birkaç tur izolasyondan RNA tüpüne çektikten sonra, metin protokolüne göre, santrifüj örnekleri 15, 700 Gs ve 20 dakika boyunca dört santigrat derecede tutulur.Daha sonra, bir floresan mikroskobu altında, mümkün olduğu kadar çok doymayı dikkatlice toplayın ve üç mililitre L 15 %10 FBS ortamı içeren %1 agros kaplı bir Petri kabına aktarın. Daha sonra, kimyasal bir başlık altında, çökelmiş kalpleri içeren tüpe 0,5 mililitre triol ekleyin ve buz üzerinde tutun Floresan mikroskop altında, süpernatantta kalan kalpleri, RNA'yı daha sonra seyreltmek için L 15 %10 FBS ile taze% 1 agros kaplı bir kaba aktarın, bu çok viskozdur. Daha sonra kalpleri küçük bir hacimde toplayın ve kalpleri bozmak için triol halinde tortulaşmış kalplerin tüpüne aktarın, tüpü girdap haline getirin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Daha sonra kimyasal bir kaputun altına 100 mikrolitre kloroform karışımı ekleyin ve çözeltiyi 1.5 mililitrelik bir PrepU, PLG tüpüne aktarın, oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin, bir numuneyi 15, 700 Gs ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin ve sulu fazı yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. Daha sonra beş ila 10 mikrogram glikojen ve 250 mikrolitre önceden soğutulmuş izopropanol ekleyin. İyice karıştırın ve ertesi gün eksi 20 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin.Numuneleri 30 dakika boyunca 15, 700 Gs ve dört santigrat derecede santrifüjleyin ve parçayı atın. Palet santrifüjünü yıkamak için bir mililitre% 75 etanol uygulayın ve snat'ı atın. Kalan etanolün, pelet beyazlaşana kadar oda sıcaklığında peletten buharlaşmasına izin verin.Pelete 20 mikrolitre RNA serbest, çift damıtılmış su ekleyin ve RNA'yı çözmek için 55 derecede 10 ila 15 dakika inkübe edin. Ardından tüpleri buzun üzerine yerleştirin. RNA konsantrasyonunu ve saflığını belirlemek için bir spektrofotometre kullanın ve RNAA'nın bütünlüğünü değerlendirmek için% 1'lik bir agros jeli üzerinde bir numune çalıştırın Kalp numunelerinin döllenmeden 56 saat sonra embriyonik kalıntılardan ayırmadan önce karşılaştırılması ve döllenmeden 36 saat sonra burada gösterilmiştir.Döllenmeden 56 saat sonraki embriyolar, 56 HPF kalp örneğinin saflığını belirlemek için filtrasyonu takiben döllenmeden 36 saat sonra döllenmeden daha fazla embriyonik kalıntı verdi, kardiyak ve ekstra kardiyak transkriptlerin ekspresyon seviyeleri R-T-Q-P-C-R ile karşılaştırıldı. Bu jel, izole edilmiş kalplerden ve kalpleri olmayan bozulmuş embriyolardan ekstrakte edilen RNA'yı gösterir. Absorbans ölçümleri, 300 kalbin yaklaşık 660 nanogram RNA verdiğini ortaya koydu.Bu, 20 mikrolitrelik bir son hacimde mikrolitre başına 33 nanogramdır. Bağıl gen ekspresyon seviyeleri, burada gösterilen belirteçler için R-T-Q-P-C-R deneyleri ile hesaplanmıştır. Beklendiği gibi, yedinci mil, burada görüldüğü gibi, kalp örneği olmayan embriyoya kıyasla kalp örneğinde oldukça zenginleştirildi.Endotel hücre belirteci KDRL kalpte orta derecede zenginleştirilmiştir. Eritrosit belirteci hemoglobin beta embriyonik 1.1, diseksiyondan sonra kalpler hala atıyor olsa bile, kalp örneğinde aşırı temsil edildi, bu da kırmızı kan hücrelerini kalpten atmalıdır. Buna karşılık, lens markörü alfa A kristali ve CNS markörü, GFAP seviyeleri kalp örneğinde önemli ölçüde azalmıştır.Bu sonuçlar, kalp diseksiyon protokolünün bütün zebra balığı embriyolarından yüksek kaliteli kardiyak spesifik RNA verdiğini göstermektedir. Bu deney için, diseksiyon prosedürü sırasında kalp kaybını önlemek için numuneyi izlemek önemlidir.

large-scale-zebrafish-embryonic-heart-dissection-for-transcriptional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Birden fazla gelişim evreleri zebrafish kalp diseksiyonu ve izolasyon için açık, standart bir yöntem açıklanmıştır. Annotation ve miktar teknikler de tartışılmaktadır.

Larvaların Kalp Diseksiyon, Çocuk ve Yetişkin Zebra balığı, Danio rerio</em

Zebra balığı embriyonik kalp immün yapmak için hızlı bir şekilde açıklanmıştır. Tüm montaj immün yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, çok daha az işlem süresi içinde kalp hücre / hücre içi yapıları ortaya yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde sağlayan antikorlar, penetrasyon önemli ölçüde artırır.

Zebra balığı Embriyonik Kalp Dissected, immün

Bu videoda, kardiyak gelişim, olgunlaşma ve yaşlanmayı incelemek için birden fazla gelişim aşamasında kalbi bir zebra balığından izole etme tekniği açıklanmaktadır.

Kalp Diseksiyonu: Zebra Balığı Kardiyak Gelişimini Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Kardiyovasküler araştırmalar için zebra balığının kullanımı, yetişkin kalpleri üzerinde yapılan araştırmalara doğru genişliyor. Bu uygulamalar için, kalp dokularının hızlı ve basit bir şekilde izole edilmesi, ölüm sonrası değişikliklerden kaçınmak ve yeterli sayıda numune elde etmek için anahtardır. Burada, yetişkin zebra balığı kalplerini incelemek için hızlı ve tekrarlanabilir bir yöntem açıklıyoruz.

Yüksek verim Uygulamaları Yetişkin Zebra Hearts Kurtarma

Bu protokol, zebra balığı embriyolarından tek hücreleri izole etmek, ilgilenilen hücreleri zenginleştirmek, mikroakışkan tabanlı tek hücreli multipleks sistemlerde zebra balığı hücrelerini yakalamak ve tek hücrelerden gen ekspresyonunu değerlendirmek için bir yöntemi tanımlar.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

Burada, zebra balığı 4-boyutlu (4 D) kalbimizde geliştirme görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Işık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM), üzerinden 4-D görüntüleme gelişmekte olan kalpleri yeniden oluşturmak için zaman içinde 3 boyutlu (3-D) görüntüleri alır. Nitelik ve nicelik endocardial çentik kardiyak trabeculation teşvik odası geliştirme sırasında sinyal kesme stres etkinleştirir gösteriyoruz.

Yamultma stres gelişmekte olan zebra balığı kalp oransal etkileri 4 boyutlu görüntülerini yakalamak için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Bu protokolün amacı, embriyonik zebrabalıklarında segmental kardiyak fonksiyonun hem fizyolojik hem de patolojik koşullarda değerlendirilmesi için yeni bir yöntemin ayrıntılarını vermektir.

Miyokardiyal Mekanik Deformasyonun Yer Değiştirme Analizi (DIAMOND) Embriyonik Zebrabalığında Kardiyak Fonksiyonun Segmental Heterojenliğini Ortaya Çıkarır

Zebra balığı kalbinin in vivo ışık tabakası floresan mikroskopisi ile incelenmesi için optimize edilmiş araçlar açıklıyoruz. Özellikle, parlak kardiyak transgenik çizgiler öneriyoruz ve gelişimsel ve kalp kusurlarını önleyen yeni nazik gömme ve hareketsizleştirme teknikleri sunuyoruz. Kardiyak görüntülemeye uyarlanmış olası bir veri toplama ve analiz boru hattı da sağlanmaktadır.

Zebra Balığı Embriyolarında Hızlı Kardiyak Dinamiklerin Işık Tabakası Mikroskopisi

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında kardiyak morfolojiyi ve işlevi değerlendirmek için düşük maliyetli bir ışık mikroskobu yöntemini açıklar ve gelişmiş görüntüleme sistemlerine ihtiyaç duymadan gelişimsel kardiyotoksisitenin tekrarlanabilir değerlendirmesini sağlar.

Zebra Balığı Embriyolarında Standart Mikroskopi ve Video Analizi Kullanılarak Fonksiyonel Kardiyak Görüntüleme: Çevresel ve Biyomedikal Araştırmalarda Uygulamalar

Bu çalışma, bireysel zebrafish embriyonik kalplerinde küresel DNA metilasyonunu nicelikten ölçemek için hassas bir immünoflüoresans tabanlı görüntüleme yöntemi oluşturmaktadır. Bu yaklaşım, sınırlı doku materyali zorluğunu aşar ve bisülfit dönüşümü ihtiyacını atlar.

Zebrafish Larvalarının Kalplerinde Küresel DNA Metilasyonu Tespiti

Öğrenin zebra balığı embriyonik kalp diseksiyonu ile kardiyak spesifik RNA izolasyonunu. Bu yöntem transkripsiyonel analiz ve kalp gelişimi genetik araştırmaları için yüksek kaliteli örnek sağlar.

Transkripsiyonal Analiz Büyük ölçekli Zebra balığı Embriyonik Kalp Diseksiyon

Daha fazla video keşfet