Name: Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Öğrenin, peptit dizisi tarama yöntemiyle still ve CHFR proteinleri arasındaki etkileşim bölgelerini haritalamayı. Bu yüksek verimli analiz, kanser tedavisi için yeni terapötik hedeflerin belirlenmesine yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AF Avrupa Topluluğu Yedinci Çerçeve Programı kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi bir başlangıç ​​hibe ile desteklenmiştir (FP7 / 2007-2013) / ERC Hibe sözleşmesi n 203.413 ° ve karmaşık systems.HA Bio-hibrid ve AI için Minerva Merkezi tarafından desteklenen Kudüs İbrani Üniversitesi&#39;nde ileri derecesi olan öğrenciler için Dalia ve Dan Maydan Kardeşliği tarafından.

1. Peptid dizisi Tasarımı <ol><li> Kısmen, 10-20 kalıntıları çakışan peptidler halinde hedef proteinin dizisini bölün. Belirli bir deney üzerinde örtüşme miktarı ve performans laboratuar kaynakları, ancak ilke olarak uzun örtüşme iyi Vary. Peptidler etkileşiminden sorumlu olabilir protein hesap bilinen ikincil yapı elemanları içine alır tasarımı. </li><li> Ticari satıcıları aracılığıyla tasarlanmış peptid dizisi sipariş. Burada kullanımı peptidler kovalent olarak C-terminali dizi haline bağlandı. </li></ol> Cilt 2. Engelleme Non-spesifik <ol><li> % 0.05 Tween 20 (TBST / PBST) içeren bir 50 mM Tris veya fosfat tampon çözeltisi oluşturunuz ve (tam iyonik kuvvet öğrenmek amacıyla) HCI veya NaOH, ölçülü bir miktarı ve NaCl ile arzu edilen iyonik gücü ile istenen pH değerine ayarlamak . Burada, 7.5 bir pH değerine ve 150 mM arasında bir iyonik gücünü kullanır. </li><li> Bir bloke edici çözelti yapmak% 2.5 (ağırlık / hacim) TBST / PBST içinde yağsız süt tozu. </li><li> Spesifik olmayan bağlanma, önlemek için, bloke etme çözeltisi 5 ml dizi bırakın. 2-4 saat oda sıcaklığında karıştırıldı ve gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C&#39;de için dizi inkübe edin. </li></ol> 3. protein ile kuluçkalanarak <ol><li> Oda sıcaklığında, bir çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca 5 ml TBST&#39;ye / PBST ile iki kez, daha sonra 30 saniye için çözüm engelleme ve 5 ml ilk dizi yıkayın. </li><li> (Ağırlık / hacim), spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için kaymağı alınmış süt tozu% 2.5 ihtiva eden His-takılı protein çözeltisinin 5 ml&#39;si ile yıkanmıştır dizi inkübe edin. Burada tarif edilen bloke çözeltisi içinde çözülmüş protein çözeltisinin 4.5 uM (Stil 500-650) kullanın. Not: Genellikle 5-10 uM proteininin taranması için kullanılır, ancak protein konsantrasyonu, bağlama eğilimi ve yerel dizi bağlanmış peptidlerin konsantrasyonları (etkinliğine bağlı olarak, daha düşük 2-3 uM olabilir sentezi). Tampon hangi proteinin,değişebilir çözündürüldü, ancak yukarıda tarif edilen engelleme çözeltisi kullanılarak protein seyreltilmesi yaygın olan bir virüstür. </li><li> Oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de 3-8 saat için protein çözeltisi içinde dizi inkübe edin. </li></ol> 4. antikorla enkübe <ol><li> 5 ml TBST&#39;dir / PBST&#39;yle dizi üç kez yıkayın. Birinci yıkama, oda sıcaklığında bir karıştırıcı üzerinde iki adet 5 dakikalık yıkama ve ardından 30 saniye içindir. </li><li> Oda sıcaklığında, bir çalkalayıcı üzerinde 1 saat süre ile, bloklama çözeltisi olarak aynı konsantrasyonlarda ile aynı katkı maddeleri ihtiva eden bir kültür ortamı tamponunda: seyreltilmiş HRP ile konjüge edilmiş antikor, 5 ml (1.500 1) ile yıkandı, dizi inkübe edin. Antikor, hedef proteini ya da etiketi ya da bağlanabilmektedir. </li><li> Ste olmadan aynı protokol tekrarlayarak dizi hedef proteinin (örneğin, oligomerizasyonu çalışmaları) peptidler ihtiva ettiği takdirde, dizideki peptidler ile antikorun etkileşimi test kontrol deneyleri gerçekleştirmekp = 3, bir protein ile kuluçkalanarak. </li><li> 5 ml TBST&#39;dir / PBST&#39;yle dizi üç kez yıkayın. Birinci yıkama, oda sıcaklığında bir karıştırıcı üzerinde iki adet 5 dakikalık yıkama ve ardından 30 saniye içindir. </li></ol> 5. Array Okuma <ol><li> Bir ECL batı lekeleme substrat kiti ile bir kemiluminesens geliştirme yürütmek. </li><li> Bir parlak görüntü analiz cihazı ile algılamayı gerçekleştirin. </li><li> Sonuçlarını analiz. Dizi hem çiftleri aynı sinyalleri gösterir, bu yüzden sonuçların güvenilir olduğundan emin olun. Protein ortağının yapısı eğer biliniyorsa, bağlama peptidleri için yapısına arama ve bağlanma siteleri için bir nokta. Sekansında uzakta bile peptidler üçüncül yapı birbirine yakın olacak ve bağlama sahası oluşturabilir. </li></ol>

<ol><li>Benyamini, H., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+peptides+to+study+protein%E2%80%93protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using peptides to study protein–protein interactions.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).</li>
<li>Geysen, H. M., Wagner, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope+or+mass+encoding+of+combinatorial+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Isotope or mass encoding of combinatorial libraries.</a> Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).</li>
<li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot-synthesis%3A+an+easy+technique+for+the+positionally+addressable%2C+parallel+chemical+synthesis+on+a+membrane+support%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron%22%5BJournal%5D)">Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support.</a> Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).</li>
<li>Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein-protein+interactions+using+peptide+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Studying protein-protein interactions using peptide arrays.</a> Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).</li>
<li>Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Mapping+of+Linear+Antibody+Epitopes+in+Human+Serum+Albumin+Using+High-Density+Peptide+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays.</a> PLoS ONE. 8 (7), (2013).</li>
<li>Uecker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+substrate+peptide+for+the+FLT3+receptor+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase.</a> British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).</li>
<li>Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+studies+using+peptide+arrays%3A+the+example+of+HIV-1+Rev-integrase+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction.</a> Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).</li>
<li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SPOT-synthesis+technique%3A+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports%E2%80%94principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications.</a> Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).</li>
<li>Innovative Peptide Solutions. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.jpt.com">http://www.jpt.com</a> (2014).</li>
<li>PEPSCAN shaping peptides to perfection. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.pepscan.com">http://www.pepscan.com</a> (2014).</li>
<li>Intavis Bioanalytical Instruments. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.intavis.com">http://www.intavis.com</a> (2014).</li>
<li>Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+and+Small+Molecule+Microarray+for+High+Throughput+Cell+Adhesion+and+Functional+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays.</a> Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).</li>
<li>Castiel, A., Danieli, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stil+protein+regulates+centrosome+integrity+and+mitosis+through+suppression+of+Chfr%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr.</a> Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).</li>
<li>Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STIL+protein+contains+intrinsically+disordered+regions+that+mediate+its+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions.</a> Chemical Communications. 50, Cambridge, England. 5245-5247 (2013).</li>
<li>Izraeli, S., Lowe, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SIL+gene+is+required+for+mouse+embryonic+axial+development+and+left-right+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification.</a> Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).</li>
<li>Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+SIL+gene+is+correlated+with+growth+induction+and+cellular+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation.</a> Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).</li>
<li>Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -D., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Cell-cycle-regulated+expression+of+STIL+controls+centriole+number+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells.</a> Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).</li>
<li>Tang, C. J., Lin, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+microcephaly+protein+STIL+interacts+with+CPAP+and+is+required+for+procentriole+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation.</a> Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).</li>
<li>Vulprecht, J., David, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIL+is+required+for+centriole+duplication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">STIL is required for centriole duplication in human cells.</a> Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).</li>
<li>Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sil+phosphorylation+in+a+Pin1+binding+domain+affects+the+duration+of+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint.</a> Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).</li>
<li>Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCL%2FTAL1+interrupting+locus+derepresses+GLI1+from+the+negative+control+of+suppressor-of-fused+in+pancreatic+cancer+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell.</a> Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).</li>
<li>Chaturvedi, P., Sudakin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chfr+regulates+a+mitotic+stress+pathway+through+its+RING-finger+domain+with+ubiquitin+ligase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity.</a> Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).</li>
<li>Olaussen, K. a, Commo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+proapoptotic+effects+of+the+two+tyrosine+kinase+inhibitors+pazopanib+and+lapatinib+on+multiple+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines.</a> Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).</li>
<li>Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Vif%E2%80%93A3G+interaction+using+peptide+arrays%3A+A+basis+for+anti-HIV+lead+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).</li>
<li>Katz, C., Benyamini, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+interaction+between+the+antiapoptotic+Bcl-2+family+proteins+and+the+proapoptotic+protein+ASPP2%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).</li>
<li>Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Basis+of+the+Interaction+between+Proapoptotic+Truncated+BID+%28tBID%29+Protein+and+Mitochondrial+Carrier+Homologue+2+%28MTCH2%29+Protein%3A+KEY+PLAYERS+IN+MITOCHONDRIAL+DEATH+PATHWAY%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).</li>
<li>Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+characterization+of+myosin+IIC+tailpiece+and+its+effect+on+filament+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Peptid dizisi tarama ortaklarının bir hedef proteinin bağlanma mevkilerinin belirlenmesi için mükemmel bir araçtır. Bu testin gerçekleştirilmesi için, hızlı ve kolay ve sonuçlar, bir veya iki gün içinde elde edilebilir. Peptid dizisi tarama çok yönlüdür ve birçok amaç için kullanılabilir. Bu fosforilasyon gibi post çeviri modifikasyonlar tanımlanması ve kinazların alt tabakaların tanımlanması için de kullanılabilir. Örneğin: miyeloid lösemi, akut ilgilidir FLT3 kinaz, bir peptit dizisi 6 tarama tarafından bul...

Protein-protein etkileşimleri canlı hücrenin içinde işlemlerinin çoğunun aracılık eder. Engelliler protein etkileşimleri protein etkileşimlerini önemli ilaç hedeflerini, yapım hastalığına neden olabilir. Bu, moleküler seviyede, bu etkileşimleri anlamak için bu nedenle çok önemlidir. Protein etkileşimleri, hücresel ve biyokimyasal tahlilleri kantitatif biyofiziksel deneylerinde değişen çeşitli teknikler kullanılarak incelenmiştir ve bu protein alanları ile ya da peptidler ile, tam uzunlukta proteinler ile gerçekleştirilebilir. Peptidler protein etkileşimleri çalışmak için mükemmel araçlar hizmet vermektedir. Peptidler kolayca sentezlenebilen ve bir taraftan ve diğer taraftan 1,2 üzerinde yüksek verimli bir şekilde birden fazla protein hedefleri üzerinde belirli bir etkileşim sitesi odaklanarak izin edilebilir olmasıdır. Peptid dizisi tarama bir hızlı, kısa bir süre 3 çok sayıda ortakları ile bir hedef protein etkileşimleri ile ilgili verilerin büyük miktarda elde edilmesi için bir metodu gerçekleştirmek için kullanımı kolay. Protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve analiz etmek için diğer biyokimyasal ve biyofiziksel yöntemlerden farklı olarak, peptid dizi tarama protein çok düşük bir konsantrasyonu gerektirir ve nihai çok zayıf algılayabilir. Peptid dizileri enzim aktivitelerini 6 ve yüksek verim inceleyerek, protein-protein ya da reseptör-ligand etkileşim bölgeleri 4, homo veya hetero-oligomerizasyon arayüzleri eşleme gibi peptid-protein etkileşimleri birçok uygulama için karakterize edici antikorlar 5 epitoplar kullanılabilir Yapısal aktivite ilişkisi (SAR) 7 inceler. Peptit dizisi tarama hakkında derinlemesine bir inceleme için Katz ve arkadaşları bkz. 4 Peptid dizilerin çeşitli tipleri şu anda mevcuttur. Peptidlerin sentezi esas olarak spot tekniği 4,8 kullanarak, doğrudan katı destek üzerindeki peptit, katı destek veya sentezine tutturulmadan önce: peptid dizilerini hazırlamak için, iki büyük sentetik stratejiler vardır.peptidler, 9-florenilmetiloksikarbonil (FMOC) 8, genellikle katı bir destek üzerinde sentezlenir. Yaygın sentetik şemalarda arasında Cı ucu yoluyla peptid N ucu yoluyla bağlantı (ör JPT pepstar dizileri 9) ve peptit bağlanma (örneğin, PepScan pepchip dizileri 10, JPT pepspot diziler 9 ve INTAVIS celluspot dizileri 11) 4. Katı destek değişir ve böylece kendisine peptit bağlama kimyasını neden olmamaktadır. Cys-sonlu peptidler tiol grubu 12 ile cam slaytlar bağlı olabilir. Bir peptidin N sonu bir birlik oluşturacak amino asidin esterifikasyonu yoluyla selüloz zar üzerinde bir hidroksil grubuna bağlı olabilir 8 eklenmiş. Burada, protein-protein etkileşimlerini incelemek için olan bir yöntem olarak peptid dizileri taranması için ayrıntılı bir protokol sunmaktır. Biz kullanılan dizi büyük amo içeren bir mikro-dizi Celluspots dizidirBir cam slayt tarafından desteklenen küçük bir selüloz zarı üzerine noktalar (384 noktalar çiftleri) ve unt. Bu düşük protein hacmi ve antikorlar ile çalışan ve tek bir deneyde başına veri önemli miktarda elde edilmesini mümkün kılmaktadır. Bu dizi aynı zamanda düşük bağlanma afinite algılanmasını sağlayan yüksek peptid yoğunluğu içerir. Dizi, normal hücre çoğalması 13 kontrol etmek için son derece önemli olan Stil-CHFR etkileşim haritalama için kullanılmıştır. İki protein arasındaki Kontrolsüz etkileşim kanser gelişimine yol açabilir. Bu etkileşimi haritalama biz spesifik bağlanma yeri ve artıklarını 14 bağlayıcı bulundu. Bu, protein-protein etkileşimini inhibe rasyonel inhibitörleri tasarımı için önünü açıyor.

<table><tbody><tr><td>Peptit dizisi</td><td>INTAVIS Biyoanalitik Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>His-probe Antikoru (H-3) HRP</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-8036 HRP</td><td></td></tr><tr><td>EZ-ECL Kiti</td><td>Biyolojik endüstriler</td><td>20-500-120</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız Süt</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>LAS-3000 kamera&nbsp;</td><td>FUJI filmi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

peptit diziler protein-protein etkileşim siteleri belirlenmesi

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein etkileşimleri, organizmanın canlı hücresi ve kontrol homeostazında işlemlerinin çoğunun aracılık eder. Engelliler protein etkileşimleri protein etkileşimlerini önemli ilaç hedeflerini, yapım hastalığına neden olabilir. Bu, moleküler seviyede, bu etkileşimleri anlamak için bu nedenle çok önemlidir. Protein etkileşimleri, hücresel ve biyokimyasal tahlilleri kantitatif biyofiziksel deneylerinde değişen çeşitli teknikler kullanılarak incelenmiştir ve bu protein alanları ile ya da peptidler ile, tam uzunlukta proteinler ile gerçekleştirilebilir. Peptitler peptitler kolaylıkla sentez edilebilir çünkü protein etkileşimleri çalışma ve belirli etkileşim siteleri odaklanarak izin olarak mükemmel araçlar hizmet vermektedir. Peptid dizileri tedavi amacıyla hedef proteini bağlanan peptidleri, iki protein arasındaki etkileşim bölgeleri tespitine olarak elenmesini sağlamak. Onlar da yüksek kapasiteli SAR çalışmaları sağlar. Bağlanma yerleri, bir tipik ola tanımlanması içinCal peptid dizisi genellikle, kısmen istenilen hedef proteinin bir veya daha fazla ortak proteinlerin tam dizilerinden türetilen 10-20 kalıntıları çakışan peptidler içerir. Hedef bağlama proteini için bir dizi tarama proteinin sadece az miktarda kullanarak kolay ve hızlı bir yöntem ortak proteinlerin bağlanma bölgeleri, karşılık gelen bağlanan peptitleri göstermektedir. Bu yazıda, bir hedef protein ve ortakları arasındaki etkileşim siteleri haritalanması için peptid dizileri taranması için bir protokol açıklar. Peptid dizisi hesaba kendi ikincil yapılar alan ortak proteinlerin dizileri temel alınarak tasarlanmıştır. Bu protokolde kullanılan diziler INTAVIS Biyoanalitik Instruments tarafından hazırlanan Celluspots diziler vardı. Dizi özgül olmayan bağlanma ve üzerinde çalışılan protein ile kuluçkaya önlemek için bloke edilir. Bir antikor kullanılarak saptanması, proteinler arasındaki özel etkileşim sahalarına karşılık gelen bağlanan peptitleri göstermektedir.

Stil, çok önemli centrosomal proteindir. 19 - Normal hücre bölünmesi ve hücre proliferasyonu 13,15 denetler. STİL çeşitli proteinlerin 18,20,21 ile etkileşime girer ve bu etkileşimlerin en doğası gereği düzensiz bölgesi (IDR) 14, merkezi bölümü aracılığıyla meydana gelir. Biz STİL bağlayıcı protein CHFR türetilen peptidlerin oluşan bir dizi tasarlanmıştır. CHFR stres 22 mitotik yanıt olarak oluşturulan bir tümör bastırıcıdır. CHFR en STİL bağlanma alanının yapısı an...

Peptit dizisi taraması, protein-protein etkileşim bölgelerini tanımlamak için yüksek verimli bir testtir. Bu, bir hedef proteinin çoklu etkileşimlerinin haritalanmasına izin verir ve bir proteini hedef alan inhibitörler için bölgeleri belirlemek için bir yöntem olarak hizmet edebilir. Burada peptit dizilerini taramak ve analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Bu prosedürün genel amacı, iki protein veya protein alanı arasındaki etkileşimi haritalamaktır. Bu durumda, kanserle ilişkili protein alanları hala ve CHFR üzerinde çalışılır. Bu prosedürün genel amacı, iki protein veya protein alanı arasındaki etkileşimi haritalamaktır.Bu durumda, kanserle ilişkili protein alanları hala ve CHFR üzerinde çalışılır. İkinci adım, CHFR peptit dizisini, bağlayıcı ortağı olan hareketsiz protein ile inkübe etmektir. Daha sonra, dizi yıkanır ve at turpu peroksidaz, konjuge antikor ile inkübe edilir.Dizi daha sonra bağlanmayı tespit etmek için kimyasal lüminesans algılamasına tabi tutulur. Son adım, sonuçları analiz etmek ve proteinler arasındaki bağlanma bölgelerini belirlemektir. Bu çalışma, kontrolsüz etkileşimi kanser gelişimine yol açabilen hala CHFR bağlanmasının rasyonel inhibitörlerinin tasarlanmasının yolunu açmaktadır.Bu yöntem, protein etkileşimi araştırmalarında, meditasyon yapan spesifik bölgelerin neler olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir: İki protein arasındaki etkileşim, Hedef proteinin dizisini 10 ila 20 kalıntı peptide bölün. Bu kısmen örtüşüyor. Örtüşme miktarı değişebilir, ancak prensip olarak, örtüşme ne kadar uzun olursa o kadar iyidir.Peptitleri tasarlarken, proteindeki etkileşimden sorumlu olabilecek bilinen ikincil yapı elemanlarını dikkate alın. Tasarlanan peptit dizisi ticari satıcılar aracılığıyla sipariş edilebilir. Bu deney için, CHFR alan kalıntıları 4 24 ila 6 62'den gelen peptitler, C terminali aracılığıyla diziye kovalent olarak bağlanır.Tasarlanan diziyi aldıktan sonra, spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için önce bloke ederek deney için hazırlayın. Hacim başına ağırlık% 2,5'lik bir engelleme çözeltisi yapın. Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için% 0.05 Tween 20 veya TBST içeren tris tampon çözeltisinde yağsız süt tozu.Diziyi beş mililitre engelleme çözeltisine daldırın. Diziyi oda sıcaklığında iki ila dört saat veya bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Diziyi önce beş mililitre bloke edici solüsyonla 30 saniye boyunca yıkayın.Daha sonra diziyi oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde beş dakika boyunca beş mililitre TBST ile iki kez yıkayın. Daha sonra, yıkanmış diziyi hacim başına% 2.5 ağırlık içeren beş mililitre poli histidin etiketli protein çözeltisi ile inkübe edin. Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için yağsız süt tozu.Burada, 500 ila altı 50 arasında durgun protein kalıntılarından oluşan 4.5 mikromolar bir çözelti kullanılır. Daha sonra diziyi protein çözeltisi içinde oda sıcaklığında üç ila sekiz saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Protein çözeltisinde inkübasyonu takiben.Diziyi beş mililitre TBST ile oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda 30 saniye boyunca yıkayın, ardından iki tane daha beş dakikalık yıkama yapın. Şimdi yıkanmış diziyi beş mililitre seyreltilmiş at turpu peroksidaz konjuge antikoru ile aynı bileşenleri içeren bir inkübasyon tamponunda oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde bir saat boyunca bloke edici çözelti ile inkübe edin, antikor hedef proteini veya etiketi bağlayabilir, kontrol deneyleri yapabilir, aynı protokolü ayrı bir dizi üzerinde tekrarlayarak antikorun dizi üzerindeki peptitlerle etkileşimini test edebilir Dizileri okumadan önce protein ile inkübe etmeden kaydırın. Onları daha önce olduğu gibi beş mililitre TBST ile yıkayın.Gelişmiş bir kemilüminesans batı lekeleme substrat kiti ile kemilüminesans geliştirmeyi gerçekleştirin. Algılamayı, Fuji film LAS 3000 kamera gibi ışıldayan bir görüntü analizörü ile gerçekleştirin. Sonuçların güvenilir olması için dizideki her iki kopyanın da aynı sinyalleri gösterdiğinden emin olarak sonuçları analiz edin.Protein ortağının yapısı biliniyorsa, bağlayıcı peptitlerin yapısını araştırın ve bağlanma bölgelerini arayın. Dizide uzak olan peptitlerin üçüncül yapıda bir arada olabileceğini ve bir bağlanma bölgesi oluşturabileceğini unutmayın. Örneğimizde, hala normal hücre bölünmesini kontrol eden ve hücre proliferasyonunu kontrol eden son derece önemli bir Centro Somal proteini, içsel olarak düzensiz bölgesi aracılığıyla hala birkaç proteinle etkileşime girer.Tasarlanan peptit dizisi kullanılarak, tümör baskılayıcı CHFR'deki hala bağlanma bölgeleri ortaya çıkarıldı. Dizideki her siyah nokta, her bir peptidin çift olarak var olduğu için iki kez göründüğünü not etmek zorunda olan ACHFR'den türetilmiş peptidi temsil eder, bu da sonuçların güvenilirliğini doğrular. Peptit dizisi taraması, 500 ila altı 50 arasında hala içsel olarak düzensiz bölge kalıntılarına bağlanan yedi CHFR türevi peptit ortaya çıkardı.Bu sonuçlar, hala CHFR üzerindeki bağlanma bölgesini haritalamamızı sağladı. Bu yedi peptidin CHFR primer dizisi üzerindeki mesafesine rağmen. Hala CHFR üçüncül yapısında için iyi tanımlanmış bir bağlanma bölgesi oluştururlar.Bu yöntem, bu prosedürü takiben her protein protein etkileşimini karakterize etmek için geçerlidir. Peptit girişini doğrulamak ve ölçmek için floresan ve izotop veya ITC gibi kantitatif yöntemler kullanılmalıdır.

identifying-protein-protein-interaction-sites-using-peptide-arrays

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tandem afinite saflaştırma proteinlerine bağlanma ortaklarının belirlenmesi için sağlam bir yaklaşımdır. Kavramı kanıtı olarak, bu metodoloji konak hücre faktörü için inisiyasyon dahil eş-tortu ile iyi karakterize çevirisi başlatma faktörü eIF4E uygulanmıştır. Bu yöntem, kolaylıkla bir hücre ya da viral proteini için uyarlanmıştır.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

Bu videoda, hücre içi protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için biyotinile hücreye nüfuz eden peptitlerin kullanıldığı bir teknik gösterilmektedir. Hücreye nüfuz eden peptitler, konjuge peptitin bir hücreye girmesini ve spesifik olarak etkileşen proteinlerine bağlanmasını kolaylaştırır. Biotin, avidin'e bağlandıktan sonra, etkileşen proteinlerin kompleksinin bir hücre lizatından saflaştırılmasına izin verir.

Protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için biyotinile hücreye nüfuz eden peptit probu

Bu video, histon peptitleri üzerindeki translasyon sonrası modifikasyonları (PTM'ler) tanıyan antikorların özgüllüğünü profillemek için peptit mikrodizi teknolojisini uygulayan bir tekniği göstermektedir. Bilinen PTM kombinasyonlarına sahip hareketsizleştirilmiş florofor konjuge histon peptitleri içeren bir mikrodizi slaytı, hedef PTM'ye özgü antikorlarla muamele edilir. Bu işlem, antikorun hedef için özgüllüğünü ve hedef olmayan PTM'lerle potansiyel çapraz reaktivitesini tanımlamaya yardımcı...

Antikorların Özgüllük Profili için Bir Peptit Mikroarray Teknolojisi

Exosomes HIV-1 Nef salgılanmasını altında yatan mekanizmaları incelemek için teknikler tarif edilmiştir. Nef ve protein transfeksiyon elde edilen özel kısa peptitler yapısı, işlevi, ve Nef en Salgı Değişiklik Bölgesi bağlayıcı ortakları belirlemek için istismar edildi. Bu prosedürler birçok mekanik çalışmalar genel ilgisi var.

Fonksiyonel Motifler ve Bağlama Ortaklar peptid bazlı Kimlik

Protein etkileşimleri: SILAC immunopresipitasyon deneyler yeni proteini keşfetmek için güçlü bir araç temsil eder. Sağlayarak kontrol ve test örnekleri, gerçek etkileşim hem de protein bolluğu doğru nispi miktar kolaylıkla deneysel kirletici ayırt edilebilir ve düşük afiniteli etkileşimler daha az sıkı tampon koşullarında kullanımı yoluyla korunur.

SILAC-immunoprecipitation Kantitatif PROTEOMİK kullanma Memeli Hücrelerde Protein Etkileşim Ortakların Kimlik

Neredeyse tüm S. içeren protein mikrodiziler kullanarak cerevisiae proteom paralel protein-protein etkileşimleri, binlerce hızlı tarafsız sorgulama için incelenir. Bu yöntem, protein-küçük molekül, translasyon sonrası modifikasyon ve yüksek verimlilik Diğer tahliller için kullanılabilecektir.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

SPOT yöntemiyle sentezlenen peptit dizileri, Protein lizin metiltransferazların (PKMT'ler) substrat özgüllüğünü analiz etmek ve biyolojik rollerini anlamak için PKMT'lerin substrat spektrumunu tanımlamak için kullanılabilir. Bu protokol, peptit dizilerinin nasıl sentezleneceğini, PKMT'lerle nasıl metilleneceğini ve sonuçların nasıl analiz edileceğini açıklar.

SPOT Peptit Diziler Protein Lizin Methyltransferases Özgünlüğü Analizi

Bu el yazısı, histonları ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını tanıyan antikorların spesifiklik profiline peptid mikroarray teknolojisinin uygulanması için yöntemleri açıklamaktadır.

Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi

Burada, içinde yüksek üretilen iş ekran ekstraselüler protein microarrays kimliği roman reseptör-ligand etkileşimleri için bir iletişim kuralına mevcut. Ayrıca protein-microbead kompleksleri kullanarak geçici protein-protein etkileşimlerinin algılama geliştirmek için bir yöntem açıklar.

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Burada, kimyasal problar ve kütle spektrometrisi kullanarak doğal hücrelerden ve dokulardan hastalığa özgü protein-protein etkileşimlerinin yakalanmasını ve tanımlanmasını sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Ortaya çıkan etkileşim veri kümeleri, dinamik ağ işlev bozukluklarını ve hastalıkla bağlantılı yol değişikliklerini ortaya çıkarmak için özel bir web tabanlı platform aracılığıyla analiz edilir.

Hastalıkta İşlevsel Olmayan Protein-Protein Etkileşimlerinin Haritalanması

Öğrenin, peptit dizisi tarama yöntemiyle still ve CHFR proteinleri arasındaki etkileşim bölgelerini haritalamayı. Bu yüksek verimli analiz, kanser tedavisi için yeni terapötik hedeflerin belirlenmesine yardımcı olur.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Daha fazla video keşfet