Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, iki protein veya protein alanı arasındaki etkileşimi haritalamaktır. Bu durumda, kanserle ilişkili protein alanları hala ve CHFR üzerinde çalışılır. Bu prosedürün genel amacı, iki protein veya protein alanı arasındaki etkileşimi haritalamaktır.

Bu durumda, kanserle ilişkili protein alanları hala ve CHFR üzerinde çalışılır. İkinci adım, CHFR peptit dizisini, bağlayıcı ortağı olan hareketsiz protein ile inkübe etmektir. Daha sonra, dizi yıkanır ve at turpu peroksidaz, konjuge antikor ile inkübe edilir.

Dizi daha sonra bağlanmayı tespit etmek için kimyasal lüminesans algılamasına tabi tutulur. Son adım, sonuçları analiz etmek ve proteinler arasındaki bağlanma bölgelerini belirlemektir. Bu çalışma, kontrolsüz etkileşimi kanser gelişimine yol açabilen hala CHFR bağlanmasının rasyonel inhibitörlerinin tasarlanmasının yolunu açmaktadır.

Bu yöntem, protein etkileşimi araştırmalarında, meditasyon yapan spesifik bölgelerin neler olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir: İki protein arasındaki etkileşim, Hedef proteinin dizisini 10 ila 20 kalıntı peptide bölün. Bu kısmen örtüşüyor. Örtüşme miktarı değişebilir, ancak prensip olarak, örtüşme ne kadar uzun olursa o kadar iyidir.

Peptitleri tasarlarken, proteindeki etkileşimden sorumlu olabilecek bilinen ikincil yapı elemanlarını dikkate alın. Tasarlanan peptit dizisi ticari satıcılar aracılığıyla sipariş edilebilir. Bu deney için, CHFR alan kalıntıları 4 24 ila 6 62'den gelen peptitler, C terminali aracılığıyla diziye kovalent olarak bağlanır.

Tasarlanan diziyi aldıktan sonra, spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için önce bloke ederek deney için hazırlayın. Hacim başına ağırlık% 2,5'lik bir engelleme çözeltisi yapın. Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için% 0.05 Tween 20 veya TBST içeren tris tampon çözeltisinde yağsız süt tozu.

Diziyi beş mililitre engelleme çözeltisine daldırın. Diziyi oda sıcaklığında iki ila dört saat veya bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Diziyi önce beş mililitre bloke edici solüsyonla 30 saniye boyunca yıkayın.

Daha sonra diziyi oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde beş dakika boyunca beş mililitre TBST ile iki kez yıkayın. Daha sonra, yıkanmış diziyi hacim başına% 2.5 ağırlık içeren beş mililitre poli histidin etiketli protein çözeltisi ile inkübe edin. Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için yağsız süt tozu.

Burada, 500 ila altı 50 arasında durgun protein kalıntılarından oluşan 4.5 mikromolar bir çözelti kullanılır. Daha sonra diziyi protein çözeltisi içinde oda sıcaklığında üç ila sekiz saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Protein çözeltisinde inkübasyonu takiben.

Diziyi beş mililitre TBST ile oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda 30 saniye boyunca yıkayın, ardından iki tane daha beş dakikalık yıkama yapın. Şimdi yıkanmış diziyi beş mililitre seyreltilmiş at turpu peroksidaz konjuge antikoru ile aynı bileşenleri içeren bir inkübasyon tamponunda oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde bir saat boyunca bloke edici çözelti ile inkübe edin, antikor hedef proteini veya etiketi bağlayabilir, kontrol deneyleri yapabilir, aynı protokolü ayrı bir dizi üzerinde tekrarlayarak antikorun dizi üzerindeki peptitlerle etkileşimini test edebilir Dizileri okumadan önce protein ile inkübe etmeden kaydırın. Onları daha önce olduğu gibi beş mililitre TBST ile yıkayın.

Gelişmiş bir kemilüminesans batı lekeleme substrat kiti ile kemilüminesans geliştirmeyi gerçekleştirin. Algılamayı, Fuji film LAS 3000 kamera gibi ışıldayan bir görüntü analizörü ile gerçekleştirin. Sonuçların güvenilir olması için dizideki her iki kopyanın da aynı sinyalleri gösterdiğinden emin olarak sonuçları analiz edin.

Protein ortağının yapısı biliniyorsa, bağlayıcı peptitlerin yapısını araştırın ve bağlanma bölgelerini arayın. Dizide uzak olan peptitlerin üçüncül yapıda bir arada olabileceğini ve bir bağlanma bölgesi oluşturabileceğini unutmayın. Örneğimizde, hala normal hücre bölünmesini kontrol eden ve hücre proliferasyonunu kontrol eden son derece önemli bir Centro Somal proteini, içsel olarak düzensiz bölgesi aracılığıyla hala birkaç proteinle etkileşime girer.

Tasarlanan peptit dizisi kullanılarak, tümör baskılayıcı CHFR'deki hala bağlanma bölgeleri ortaya çıkarıldı. Dizideki her siyah nokta, her bir peptidin çift olarak var olduğu için iki kez göründüğünü not etmek zorunda olan ACHFR'den türetilmiş peptidi temsil eder, bu da sonuçların güvenilirliğini doğrular. Peptit dizisi taraması, 500 ila altı 50 arasında hala içsel olarak düzensiz bölge kalıntılarına bağlanan yedi CHFR türevi peptit ortaya çıkardı.

Bu sonuçlar, hala CHFR üzerindeki bağlanma bölgesini haritalamamızı sağladı. Bu yedi peptidin CHFR primer dizisi üzerindeki mesafesine rağmen. Hala CHFR üçüncül yapısında için iyi tanımlanmış bir bağlanma bölgesi oluştururlar.

Bu yöntem, bu prosedürü takiben her protein protein etkileşimini karakterize etmek için geçerlidir. Peptit girişini doğrulamak ve ölçmek için floresan ve izotop veya ITC gibi kantitatif yöntemler kullanılmalıdır.