Saf olmayan Arındırıcı: Sıralama Metagenomes ve Metatranscriptomes Kompleksi Hayvan ilişkili Örneklerinden

Bu prosedürün genel amacı, metagenomik ve meta transkriptomik yaklaşımlar kullanarak viral ve mikrobiyal toplulukları incelemek için kistik fibrozis balgam gibi karmaşık konakçı ilişkili örnekleri toplamak ve işlemektir. Bu, önce deneğin bir nebülizör aracılığıyla% 7 hipertonik salin soluması ve ardından 30 dakikalık bir süre boyunca indüklenen balgam örneklerinin toplanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, numune hemen homojenize edilir ve viral metagenom, mikrobiyal metagenom, meta transkriptom ve ekstra balgam olarak etiketlenmiş dört tüpe eşit olarak dağıtılır.

Daha sonra meta transkriptom tüpü kapatılır, yatay olarak yerleştirilir ve balgam 10 dakika boyunca orta hızda homojenize edilir. Son olarak, metagenomik çalışmalar için nükleik asit izolasyonundan önce viral veya bakteriyel hücreleri izole etmek ve saflaştırmak için bireysel alikotlar ayrı ayrı işlenir. Sonuç olarak, izole edilen nükleik asitler, metagenomik ve meta transkriptomik kütüphaneler oluşturmak için yüksek verimli dizileme kütüphanesi hazırlığı için kullanılır.

Bu prosedürün ana avantajı, DNA ve RNA düzeyinde viral ve bakteriyel toplulukların incelenmesi için karmaşık konakçı ilişkili numuneyi işlemek için kapsamlı bir iş akışı sağlamasıdır. Viral ve mikrobiyal hücre saflaştırma adımlarının öğrenilmesi zor iken numune ön işlem adımları, numunenin uygun şekilde işlenmesini sağlamak için önemli olduğundan, bu prosedürün görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir Prosedürdeki karmaşıklık nedeniyle, numune toplamadan önce, numune başına dört adet 15 mililitrelik tüpü, ilki viral metagenom ile aşağıdakilerle etiketleyin: ikincisi, meta transkriptom ile üç numaralı mikrobiyal metagenom ve ekstra balgam olarak dört numaralı tüp. Meta transkriptom etiketli tüpe iki mililitre 0.1 milimetre silika boncuk ekleyin, ardından altı mililitre gine izotiyosiyanat bazlı RNA lizis tamponu veya GITC lizis tamponu ekleyin.

Metin protokolünde belirtilen numune toplama prosedürünü takip ederek ve pre wade numune kaplarını kullanarak, numune alımından sonra kabı tartarak numune hacmini tahmin edin ve boş kabın ağırlığını çıkarın. Kalan ağırlık için bir gram, bir mililitre numuneye eşdeğer olacaktır. Numunenin hacmi sekiz mililitreden azsa, nihai hacmi sekiz mililitreye çıkarmak için uygun hacimde 0,02 mikrometre filtrelenmiş bir XPBS ekleyin.

Daha sonra, balgam içinde görünür bir topak kalmayana kadar numuneyi homojenize etmek için hemen üç mililitrelik bir şırınga kullanın, aynı şırıngayı kullanarak hemen iki mililitre balgam çekin ve silika boncukları ve GITC lizis tamponu içeren mikro transkriptom tüpüne enjekte edin. Kapağı kapatın ve kapağı güvenli bir şekilde kapatmak için para film kullanın Sızıntıyı önlemek için, balgamı 10 dakika boyunca orta hızda hemen homojenize etmek için bir girdap kullanın efendim. Aynı şırınga alikotunu kullanarak, her biri iki mililitre balgam, vira metagenom ve mikrobiyal metagenom olarak etiketlenmiş tüplere ve kalan balgamı balgam kabından ekstra balgam etiketli tüpe aktarın.

Tüm tüpleri dört santigrat derecede veya buz üzerinde saklayın ve gerekirse viral bir metagenom oluşturmak için laboratuvara taşıyın. Tampon ve çözeltilerin hazırlanmasını takiben. Toplam altı mililitrelik bir hacme 0.02 mikrometre filtrelenmiş tuzlu magnezyum tamponu ekleyerek numuneleri ön işlemden geçirin.

Mukus çözünmesine yardımcı olmak için, her numuneye altı mililitre 6.5 milimolar DTT ekleyin. Karıştırmak için kuvvetlice girdap yapın ve 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Kuvvetli bir şekilde girdaplandıktan sonra, numuneler tekrar 3056 Gs ve 10 santigrat derecede 15 ila 20 dakika döndürün.

Her süpernatanı 15 mililitrelik yeni bir tüpe toplayın. Daha sonra, süpernatanları yeni 15 mililitrelik tüplere filtrelemek için bir şırınga üzerine monte edilmiş bir nokta 45 mikrometre filtre kullanın. 100 mikrolitre numuneyi bir mikro fuge tüpüne çıkarın ve ardından kloroform tedavisi yapın.

Süpernatanı çıkarın ve DN one tedavisi uygulayın. Numuneyi sabitlemek için eşit hacimde %4 para formaldehit ekleyin. Epi floresan mikroskobu için, her şeyi kapsayan viral partikül zenginleştirme yaklaşımı için metin protokolüne bakın.

Aksi takdirde, taze hazırlanmış sezyum klorür çözeltileri kullanarak, her bir tüpe mililitre sezyum klorür çözeltisi başına bir mililitre 1.7 gram yükleyerek bir sezyum klorür gradyanı oluşturun, ardından mililitre başına bir mililitre 1.5 gram, bir mililitre mililitre mililitre başına 35 gram ve son olarak, mililitre sezyum klorür çözeltisi başına bir mililitre 1.2 gram. Son olarak, altı ila sekiz mililitre numuneyi ayrı gradyan tüplerine yükleyin. Her bir fraksiyonun konumunu belirtmek için tek tek katmanları işaretleyin.

Sonra her bir karşıt iki çiftini bir miligram içinde dengeleyin. Her tüpü dikkatlice sıkma kovasına kilitleyin. Rotora yükleyin ve iki saat boyunca 82, 844 Gs ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Santrifüjlemeyi takiben, üç mililitrelik bir şırıngaya bağlı 18 gauge iğne ile yoğunluk gradyanlarını bozmadan tüpleri tutucudan dikkatlice çıkarın. İğnenin açık ucunun yukarı baktığından emin olun. Tüpü mililitre başına 1,5 gram yoğunluk katmanının hemen altına delin ve şırıngaya yavaşça yaklaşık 1,5 mililitre çözelti çekin.

İğneyi yavaşça çıkarın ve tüpte kalan fraksiyonun delinme yoluyla 15 mililitrelik yeni bir tüpe damlamasına izin verin. Bunu üst fraksiyon bel olarak etiketleyin: V ps'yi içeren şırıngadaki solüsyonu iki yeni mikro füj tüpüne aktarın. Tamponlar ve çözeltiler hazırlandıktan sonra, metin protokolüne göre, bir XPBS filtrelenmiş beş hacim nokta 22 mikrometre ekleyin Her bir homojenatı kimyasal bir başlık altında seyreltmek için, hacimce nihai konsantrasyona %2'lik bir hacim nihai konsantrasyonuna beta MAR kapta etanol ekleyin ve karışımı inkübasyonu takiben iki saat boyunca oda sıcaklığında sallayın.

Numuneyi 3056 GS ve 10 santigrat derecede 15 dakika döndürün. Süpernatanı attıktan sonra, peleti yeniden süspanse etmek için 10 mililitre moleküler dereceli su kullanın ve yıkamayı tekrarlamadan önce oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Son bir döndürmeden sonra ve SUP natin atıldıktan sonra, 15 mikrolitre ds eklemeden önce peleti yeniden süspanse etmek için beş mililitre bir XDNA tamponu kullanın.

Numunenin mililitresi başına bir tane: İki saat boyunca tekrarlanan karıştırma ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Numuneleri döndürdükten ve sintiyi attıktan sonra, peleti yeniden süspanse etmek için 10 mililitre SE tamponu kullanın. Ardından numuneyi döndürün ve yıkamayı tekrarlayın.

Peleti yeniden süspanse etmek için iki mililitre SE tamponu kullanın ve süspansiyonu iki mikro fuge tüpüne aktarın. Daha sonra tüpleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 16.000 GS'de döndürün. Son olarak, süpernatanı çıkardıktan sonra, gram pozitif bakteriler için talimatları izleyerek bir genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanın.

DNA'yı izole etmek için, viral metagenomlar oluşturmak için önceki sonuçlar burada özetlenmiştir. Viromlar, %70 insan DNA örneği içeren yalnızca bir örnek ile çok az insan kaynaklı diziler içerir CCF dört A, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme adımından çıkarılmıştır ve sonuç olarak, %97'den fazla insan türevli diziler içermektedir. Bu şekil, yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjlemeden önce ve sonra tipik bir CF balgam örneğinin floresan görüntüsünü göstermektedir.

Burada görülen yoğunluk gradyan ayrımını takiben büyük parçacıkların yokluğunda net vlp gözlendi. Oral antibiyotik başlanan tek bir kistik fibrozis hastasından günde yedi balgam örneği toplandı. Toplamanın üçüncü gününden sonra, her bir numuneden toplanan hipotonik lizis türetilmiş veya HL DNA'nın toplam verimi, her numune için oluşturulan Illumina dizileme Kütüphanelerinden 210 nanogram ila beş mikrogram arasında değişmektedir.

Biri hariç tüm kitaplıklar 1 milyondan fazla dizi verdi ve veri ön işlemenin ardından %85'ten fazla yüksek kaliteli dizi korundu. Baskı sıralama yazılımı kullanılarak, insan kaynaklı dizilerin toplam miktarı %14 ile %46 arasında değişmektedirBurada gösterildiği gibi, alt numunelerin mikrobiyal profilleri, iki hipotonik lizis işleminden sonra numunelere oldukça benzerdir. Ek olarak, ikinci hipotonik lizis, insan olmayan dizilerin fraksiyonunu metagenomlar içinde% altı ila 17 oranında arttırır.

Klinik numuneler ve potansiyel patojenlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Numune işleme sırasında her zaman kişisel koruyucu ekipman kullanılmalıdır. Kontaminasyon olmamasını sağlamak için bu prosedürü gerçekleştirirken iyi moleküler biyoloji ve mikrobiyoloji teknikleri gereklidir.

Bu prosedürü takiben, viral ve mikrobiyal metagenomik çalışmaların yanı sıra KF balgamı gibi karmaşık örneklerden meta transkriptomik çalışmalar yapabilmeniz gerekir.