Name: Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Öğrenin, Drosophila pupa göz nöroepitelinde canlı görüntüleme yöntemiyle hücre davranışlarını ve gelişimsel desenlemeyi inceleyin. Bu protokol, hücre sınırlarının net görselleştirilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, canlı Drosophila pupa gözünü görüntülemek için orijinal protokolü geliştirdiği için David Larson'a teşekkür eder. Canlı görüntüleme sinek hatlarımızı oluşturmak için bir araya getirdiğimiz transgenik sinekleri geliştiren meslektaşlarımız Richard Carthew, Shoichiro Tsukita ve Matthew Freeman'a teşekkür ederiz. Brittany Baldwin-Hunter, el yazması hakkında faydalı yorumlar yaptı. Bu çalışma, Wesleyan Üniversitesi tarafından Ruth Johnson'a verilen başlangıç fonları ile desteklenmiştir.

Şekil 3 deney prosedürünün bir özetini gösterir. 1. Doku Hazırlanması <ol><li> C iki kez aşağıdaki çapraz kurmak ilgi konusu bir genin değiştirilmiş ekspresyon sonuçlarını, tespit etmek ve 25 ° C&#39;de korumak için: UAS transgen (erkek) X, GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (bakire kadın) NOT: Kontrol doku çapraz UAS-lacZ edinmek için GMR-GAL4&#39;e erkekler; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP kadın. β-galaktosidaz retina hücre davranışında kusurları yaratır. </li><li> RNAi transgenlerin etkinliğini artırmak için, çapraz UAS RNAi GMR-GAL4, UAS-DCR-2 erkek; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b bakire kadın. Not: ektopik DCR-2 gözlenmiştir ifade retinae hücre davranışında sıra kusurları (veriler gösterilmemiştir). Teyakkuz Bu yaklaşım kullanarak, eğer tavsiye edilir. </li><li> S1.5 ml mikrosantrifüj tüpler seçilen beyaz uygun genotiplerin ön-pupa ve yer. Pupa DCR-2 ifade ederse, erkek veya kadın pupa seçin: UAS-DCR-2, X kromozomu üzerinde bir ekleme, ifadesi erkeklerde güçlüdür. Pupa pupa halinde pigmentasyonu önce 0 saat APF de cinsiyetli olmalıdır - erkek gonadlar pupa (posterior yaklaşık üçte biri) yan tarafta büyük saydam küreler gibi görünür. </li><li> 25 ° C&#39;de temiz bir plastik ucu-kutusunda, pupa içeren mikrosantrifüj tüpleri inkübe. Pupa yer ucu kutu içine damıtılmış su içinde ıslatılmış bir doku, 10 cm 2 parça, kurumayı önlemek için. NOT: ucu-kutusunda nem çok yüksek olursa pupa durum daha sonraki adımlarda incelemek için hantal ve zor olabilir. </li><li> Uygun bir süre için inkübe edilir. Yaklaşık 17 saat APF, 20 saat APF veya 24 saat AP de görüntüleme için pupa hazırlamak, göz desenlendirme ile ilişkili hücre davranışlarını yakalamak içinF. spesifik hücre davranışları en iyi şekilde gözlenen ne zaman daha fazla tartışma için Temsilcisi Sonuçları gör. </li><li> Siyah sylgard diseksiyon çanak üzerine taze çift taraflı bant bir parça yerleştirin. Çift taraflı bant (Şekil 1A) yapıştırılmış pupa başkanı ile, kadar pupa, dorsal yüzü yerleştirin .try çift taraflı bant pupa toraks ve batın bölgeleri bağlı değil. Forseps ile dikkatlice kaldırın ve pupa kafa maruz kapakçık çıkarın. Bir göz çevresini maruz pupa halinde kenarı boyunca gözyaşı. </li><li> Yavaşça yapışkan bant pupa çıkarın. Pupa yapışık kalırsa, yapışma zayıflatmak için pupa halinde ve bant arasındaki kavşak distile su küçük bir hacim uygulayın. </li></ol> 2. Montaj <ol><li> Kurutma kağıdından küçük 15 mm2 çerçeve inşa ve middlethat bir delik çapı 5,5 mm (Şekil 1B) &#39;dir. Damıtılmış su ve yer daldırınBir mikroskop lamı merkezi. Vazelin düzgün bir halka sıkmak, 30 cc şırınga kullanarak kurutma kağıdı çerçevesini çevreleyen. Vazelin halka pupa genişliğinden daha ve halka çapı bir kapak kayma genişliğinden daha marjinal az olduğunu marjinal yüksek olduğundan emin olun. </li><li> Vazelin boncuk (Şekil 1D) tarafından desteklenen yüzü üzerinde, .Carefully pupa düzenlemek kurutma kağıdı (Şekil 1C) içine sokulur deliğe doğrudan slayt üzerine vazelin küçük bir boncuk ekleyin. </li><li> Vazelin halkasının üstüne bir lamel yerleştirin temas göz neuroepithelium (Şekil 1D) Yukarıdaki epitel böylece. Yavaşça vazelin karşı lamel mühür ve pupa göz bölgesi ve kapak arasında bir küçük düz temas yüzeyi oluşturmak için hazırlık sıkıştırmak. </li></ol> 3. Floresans Görüntüleme <ol><li> Image kullanarak pupa hazırlıkfloresan mikroskop. Her 7 dk yakalama adherens kavşak bölgesinde göz neuroepithelium apikal etki yoluyla seri bölümleri. NOT: a) Uygun bir seri kesitler genellikle 4-5 0.2 mikron z-adımlardan oluşur z-yığını başına bulunmaktadır. b) hafif darbelere ve kıvrımlar dahil epitel topolojisinde, düzensizlikler, doku büyük bölgelerin içinde odak görüntüleri elde etmek için bu zorlu hale getirebilir. Görüntüleme yaparken, bir odakta olması için ilgi alanı bölümünü bulabilirsiniz, ve bir komşu bölge dışı odak olmak. Pupa göz ve lamel arasında distile su küçük bir damlacık da dahil olmak üzere pupa göz morfolojilerinden erken aşamalarında hafif düzensiz topoloji karakteristiği bazı akut doku kat değil ortadan kaldırabilir. Bu durumlarda odakta dilimleri tüm alan için edinilen kadar z-yığını uzatarak doku oversample. c) Her 7 dk önemli Redu olmadan 3 saat 4 için canlı görüntüleme etkinleştirmeniz gerekir seri bölümleri yakalamagörüntü kalitesini bozabilir GFP floresan yoğunluğu ction. Daha kısa zaman aralıkları-görüntüleme toplam süresini azaltabilir. </li><li> 3-4 saat için görüntüleme devam edin. Pupa büyüme ve hemolimf pompalama retina ve konumunu taşır yana birçok floresan mikroskoplar geçerli bir otomatik odaklama ve zaman işlevini kullanmak etmeyin uyanık yeniden odaklama her 14-21 dakikada gereklidir. Yavaş veya göz morfojenezini durak olabilir 4 saat ötesinde görüntüleme NOT. </li><li> Arka plan azaltmak ve seri bölüm resimlerin kontrastını artırmak için uygun Dekonvolüsyonun yazılımını kullanın. Her z-yığın dosyası için, (Malzeme Tablo) LAS AF yazılımında aşağıdakileri gerçekleştirin: Araçlar paneline gidin, 3D Dekonvolüsyon seçin ve Uygula&#39;yı tıklatın. </li><li> Her deconvoluted yığın dosyası için maksimum projeksiyon (MP) görüntü oluşturun: Araçlar paneline gidin, 3D Projeksiyon seçin ve Uygula&#39;yı tıklatın. NOT: Maksimum Projeksiyon algoritması üniforma oluşturmak için başarısız olabiliroversampled olan doku ly odakta görüntü. Out-of-odak bölgelerini bileme için bir tekniktir adım 5.2&#39;de özetlenmiştir. </li></ol> 4. Pupa Rescue and Fenotip Doğrulaması sonrası görüntüleme <ol><li> Forseps lamel kaldırmak ve gıda temiz bir şişeye aktarın pupa kullanarak: eserler tanıtıldı veya görüntüleme sırasında zarar pupa, dikkatli görüntüleme teçhizat gelen pupa kaldırmak olup olmadığını ele almak. Oda sıcaklığında saklayın veya 25 ° C yetişkin sinek çıkıncaya kadar. </li><li> Dikkatle yetişkin göz fenotip incelemek ve özgün sinek çapraz çıkan erişkin sinek gözlerine karşılaştırın. </li></ol> 5. Görüntü İşleme <ol><li> Otomatik Görüntü Ayarı: NOT: Canlı Drosophila doku vardiya ve görüntüleme süreci boyunca büyüyecek. Sonuç olarak, görüntülerin merkezleri Drosophila dokusunda aynı noktaya uygun olmayabilir ardışık zaman noktalarında toplandı. Ek olarakTüm retina disk ~ 21 ve 23 saat APF arasında yaklaşık 30 ° döner. Bireysel hücre davranışlarını vurgulamak ve organizma büyüme nedeniyle dağıtıcı unsurları azaltmak, bu elle yapılabilir, her milletvekili image.While, burada kullanılan resim düzenleme yazılımı hizalamak için süreci hızlandırmak yerleşik algoritmaları vardır (Malzeme Tablo). <ol><li> Stack içine ana menüde, açık Scripts basıp Yük Dosyaları Dosya sekmesinde. </li><li> Yük Katmanlar paneline MP görüntü dosyalarını içe ve Tamam seçeneğini seçin. Otomatik Kaynak Görüntüler seçeneğini hizalayın girişimi seçili olmadığından emin olun. NOT: Bu seçenek seçilirse, yazılım görüntü verilerini bozan bir hizalama algoritması kullanabilirsiniz. </li><li> Tüm MP dosyaları Katmanlar bölmesine yüklenen sonra, tüm görüntüler erken zaman noktası katman yığınının üstünde olacak şekilde kronolojik sırayla olduğundan emin olun. Katmanlar, doğru düzen, sürükle değildir ve onlar sipariş kadar onları bırakın Eğerdoğru. </li><li> Ana menüde Düzenle sekmesinden Otomatik Hizala Katmanlar seçin. Konumlandırmak seçin ve Tamam &#39;ı tıklatın. </li><li> Otomatik Hizala algoritması ilgili bir odak noktasına çerçeveleri yönlendirmek için başarısız olursa, Taşı aracını kullanarak küçük ayarlamalar yapmak. </li></ol></li><li> Kompozit Bileme: NOT: Bir başlangıç ​​milletvekili görüntünün Out-of-odak bölgeleri &#39;kırpma&#39; LAS AF yazılım gelen deconvoluted yığını ile bilenmiş edilebilir. Bir yığın dosyası Kırpma bir el Maksimum Projeksiyon algoritması tabi z-yığını aralığını sınırlamak için olanak sağlar. <ol><li> (Süreç sekmesi altında) Araçlar panelinde Kırpma işlevi bulun. Elle onlar başlangıçta out-of-odak bölgesi içinde sadece yapışma kemer kapsayan şekilde ilk ve son dilim kısıtlamak. Bu bölge için optimize edilmiş yeni bir yığın dosyası oluşturmak için Uygula&#39;yı tıklatın. </li><li> TIFF dosyası olarak yerel optimize yığını ve ihracat için yeni bir Maksimum Projeksiyon oluşturun. </li><li> The resim düzenleme yazılımı (Malzeme Tablo), Stack içine (ana menüde Dosya sekmesinde bulunur) açık Script seçin ve Dosyaları Yükle. </li><li> Yük Katmanlar paneline belirli bir zaman noktası için başlangıç ​​MP görüntü dosyası ve yerel optimize MP dosyasını alma ve Tamam seçeneğini seçin. Otomatik Kaynak Görüntüler seçeneğini hizalayın girişimi seçili olmadığından emin olun. </li><li> Katmanlar bölmesinde iki katmanı seçin ve ardından bir muntazam retina alanı içinde odak veren, otomatik iki görüntü uygun bölgeleri maskelemek için (ana menüde Düzenle sekmesinde bulunur) Otomatik Karıştır Katmanlar seçin. TIFF dosyası olarak bu kompozit görüntü kaydetme. </li><li> Tekrar tüm bırakıyorsa MP görüntüler için 5.2.5 ile 5.2.1 adımları. </li></ol></li><li> Ek Ayarlar: Döndürme, kırpma ve ayarlama Film Katmanlar Düzeyleri: <ol><li> Tüm katmanları seçili retinanın dorsal-ventral eksen hizalanmış böylece, görüntüleri döndürmek için Transform aracı (Edit&gt; Free Transform) kullanınFilm çerçevesinin y-eksenine. </li><li> Gerekirse, istenen boyut ve şekline görüş alanını azaltmak için Kırpma aracını kullanın. </li><li> Hücre zarı ve hücre gövdesi arasındaki kontrastı artırmaya yardımcı olmak için (bireysel kare) seviyesi ayarını kullanın. </li><li> Üslup amaçlar için ve her çerçevenin ilgi noktaları vurgulamak için yanlış renk tanıtmak, belirli bir hücre davranışlarını vurgulamak için. </li></ol></li><li> Animasyon: Bir Film içine Görüntüler dönüştürün: <ol><li> Ana menüde Windows sekmesinden Animasyon bölmesini açın. Animasyon bölmesinin sağ üst köşesinde bulunan menüden Katmanlar Kareleri yapın seçin. </li><li> Tabakalar yığının altından başlayarak sırayla animasyon bölmesine eklenir unutmayın. İlk kare, tüm seçin ve ardından Animasyon bölmesi menüsünden Kareleri Ters seçin, kare sırasını tersine çevirmek için. </li><li> Çerçeve başparmak altındaki açılır menüyü kullanarak her kare için bir çerçeve gecikme süresini seçinTırnak. Not: 1 Bu yazıda sunulan 4 Filmler çerçeve gecikmesi 0.8 sn. </li><li> Ve ana menüye, açık İhracat Dosya sekmesinde video Render seçin. Dosya Seçenekleri altında QuickTime Dışa seçin ve istenen video biçimini seçin. Seçenekler Özel olarak Frame Rate set Render altında, 15 bir kare hızı girin ve Render tıklayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).</li>
<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+adherens+junctions+during+Drosophila+embryonic+epithelial+morphogenesis+revealed+by+a+Dalpha-catenin-GFP+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein.</a> Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).</li>
<li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li>
<li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+specification+in+the+developing+Drosophila.+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Suppl%22%5BJournal%5D)">Cell fate specification in the developing Drosophila. retina.</a> Dev Suppl. , 19(1993).</li>
<li>Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolff%2C+T+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1277-1325 (1993).</li>
<li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+behavior+in+the+developing.+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina.</a> Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).</li>
<li>Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+death+zone%3A+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).</li>
<li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+Drosophila+Dicer-1+and+Dicer-2+in+the+siRNA%2FmiRNA+silencing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways.</a> Cell. 117, 69-81 (2004).</li>
<li>Zitserman, D., Roegiers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+sensory+organ+precursor+cells+in+intact+Drosophila+pupae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae.</a> J. Vis. Exp. (51), 2706(2011).</li>
<li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).</li>
<li>Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waves+of+differentiation+in+the+fly+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Waves of differentiation in the fly visual system.</a> Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).</li>
<li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).</li>
<li>Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+simulation+of+cellular+patterning+within+the+Drosophila+pupal+eye%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000841(2010).</li>
<li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).</li>
<li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+is+required+for+successive+cell+decisions+in+the+developing+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina.</a> Genes Dev. 1099, 1112(1989).</li>
<li>Miller, D. T., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+induction+of+patterning+and+programmed+cell+death+in+the+developing+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina.</a> Development. 125, 2327-2335 (1998).</li>
<li>Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+argos+in+regulating+cell+fate+decisions+during+Drosophila+eye+and+wing+vein+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development.</a> Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).</li>
<li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+of+signals+regulating+effector+and+initiator+caspases+in+the+developing+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye.</a> Development. 129, 3269-3278 (2002).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tugging+force+regulates+the+size+of+cell-cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).</li>
<li>Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+tension+is+required+for+correct+recruitment+of+adherens+junction+components+and+zonula+occludens+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation.</a> Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

yabani tip geliştirme (yukarıda) açıklaması RNAi desenleme olayları veya aşırı ekspresyonu genotip karşılaştırmalar için temel oluşturur. Hücre davranışları ilgi protein tarafından düzenlenir hangi kesin belirlerken canlı doku gelişiminin Karşılaştırmalar paha biçilmezdir. Bundan başka, burada tarif edilmeyen, canlı hücre görüntüleme bir desen göz olaylarda ilgi konusu bir genin rol kalitatif ve / veya kantitatif tanımlama yapmak mümkün kılar. 30-32 saat APF en pigment hücreleri istikrarlı pozisyonları elde etmiş ve apo...

Bileşik Drosophila göz aksesuar pigment hücrelerinin 4,5 olan bir petek-kafes ile ayrılmış olan ~ 750 ommatidia kalıplaşmış düzenleme ile karakterizedir. Yerel hücre hareketleri, hücre büyümesinin, hücre şeklinde değişikliklere, ve apoptoz: Bu pigment hücreleri etkinlikleri koordine kombinasyonu ile desenli. Bu epitel Canlı görselleştirme biri bir fizyolojik ilgili ve soğukkanlı üç boyutlu bağlamda bu olayları destekleyen moleküler mekanizmaları çalışma sağlar. Daha önceki protokollarda 6,7 tersine, burada anlatılan teknik görüntüleme işlemi çıkartılabilir olamaz yabancı doku hareketini stabilize edilmesi için etkili bir yöntem içermektedir. Görüntüleme boyunca, büyür dönen bir doku ve vardiya - Bu yöntem gelişmekte Drosophila pupa göz epitel hücre davranış çalışmaları geliştirir. Ayrıca hareket istikrar tekniği de içindeBurada tarif yabancı hareket meydana başka bağlamlarda hücreleri üzerinde çalışmak için yararlı olacaktır. Göz özgü sürücü GMR-GAL4 1-3 kontrolü altında GFP: GFP yanı sıra UAS-α-katenin: Drosophila retina alanında hücre sınırlarını görselleştirmek için, transgenik sinek hatları ubi-DE-Kadherin ifade oluşturulur edildi. İki GFP-etiketli membran belirteçlerin kullanımı düşük yoğunlukta ışık hücre sınırlarının görselleştirme sağlar. Bu yüksek enerjili dalga boylarına tekrarlanan maruz kalma, artan sağlayan kare hızı ve film süresine doku hasarı ve photobleaching en aza indirir. UAS DCR-2, aynı zamanda, ikinci bir uçucu hattı 8 dahil edildi RNAi transgenlerinin etkinliğini geliştirmek için. Önceki protokollerden üçüncü güncellemesinde, kolayca en laboratuarlarda monte basit bir görüntüleme teçhizat açıklanmıştır. Bu cihaz özel bir görüntüleme r olması gerektiğini ortadan kaldırırig bir üniversitenin &#39;makine dükkanı&#39; veya benzer hizmeti tarafından oluşturulan. Bu görüntüleme kulesi görüntü diğer pupa dokulara 9,10 için kullanılan benzer. Doğrudan 17-42 saat puparium oluşumu (hr APF) sonra ~ den göz dokusuna katkıda morfogenetik olayları değerlendirmek için kullanılabilecek basit bir canlı hücre görüntüleme protokolü burada sundu. Spesifik olarak, bu protokol, pupa gelişimi esnasında gen ekspresyonunu modifiye sonuçlarını belirlemek için bir olanak sağlar.

<table><tbody><tr><td>GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b</td> Yazarlardan <td></td><td></td><td>istek üzerine temin edilebilir</td></tr><tr><td>UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b&nbsp;</td>Yazarlardan <td></td><td></td><td>istek üzerine temin edilebilir</td></tr><tr><td>Scotch çift yapışkanlı bant</td><td>3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Siyah Sylgard diseksiyon kabı</td><td></td><td></td><td>Cam petri kabını Sylgard (ince öğütülmüş kömür tozu ile siyah renkli) veya Sylgard 170 ile kenarına kadar doldurun;</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard (Black)</td><td>Dow Corning'i polimerize etmek için 24-48 saat oda sıcaklığında bırakın</td><td></td><td></td>SYLG170</tr><tr><td>Cam petri kabı</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 x 1 mm cam mikroskop lamı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 mm cam lamel</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td></td></tr><tr><td>Forseps&nbsp;</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3mm Kromatografi Kağıdı</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-713-336</td><td></td></tr><tr><td>Vazelin</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086-291</td><td>Veya yerel eczaneden satın alın.</td></tr><tr><td>30 ml şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7510-30</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 DM mikroskobu</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF Sürüm 2.6.0.7266 mikroskop yazılımı</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

canlı-görüntüleme drosophila pupa göz

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Drosophila pupa gelişme doğasında süreçleri vardiya ve canlı hücre görüntüleme sırasında izlemek için bireysel hücre davranışı zorlaştıran şekilde göz epitel bozabilir. Bu süreçler şunları içerir: Retina döndürme, hücre büyümesini ve organizma hareketinin. Pupa zorlu bir tek odak düzlemi birkaç ommatidia fazla in-odak görüntüleri elde etmek için yapmak, görüntüleme için hazırlanan Ek olarak, ince darbelere ve dahil epitel topolojisinde, düzensizlikler genellikle tanıtıldı kıvrımlar. iş akışı Drosophila pupa göz gelişimi sırasında hücresel süreçlerin kolay analizini sağlayan, Çareleri burada bu konuları sıraladı. Bu duruma uygun şekilde kademeli pupa kolayca en laboratuvarlarda monte edilebilir bir görüntüleme teçhizat düzenlenmiş Ubikuitin DE-kaderin:., GFP ve GMR-GAL4 -sürümlü UAS-α-katenin GFP göz epitel 1 hücre sınırlarını görselleştirmek için kullanılır -3. Dekonvolüsyon sonraBirden fazla odak düzlemleri yakalanan floresan görüntülere uygulanan maksimum projeksiyon görüntüleri her zaman noktası için oluşturulan ve görüntü düzenleme yazılımı kullanılarak geliştirilmiştir. Hizalama algoritmaları izlemek için tek tek hücre davranışı kolaylaştıran, hızlı bir şekilde gereksiz hareket stabilize etmek için kullanılırlar.

Pupa göz Canlı görüntüleme neuroepithelium desenlendirme katkıda hücre davranışlarını gözlemlemek için başarılı bir strateji. Belirli proteinlerin rolü kolayca göz gelişimi sırasında protein düzeylerini değiştirmek transgenleri ifade ile tespit edilebilir. Bu GMR-GAL4 yapmak için morfogenetik oluktan arkasında transgen ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılır. Bu ilk iki larva dönemi boyunca göz alanını kurmak önceki olayları bozucu değil avantajı sunuyor. Ayrıca birçok RNAi transgenleri etkin bir (veri göste...

Bu protokol, canlı Drosophila pupa göz nöroepitelini görüntülemek için etkili bir yöntem sunar. Bu yöntem, doku hareketini ve düzensiz topolojiyi telafi eder, birden fazla GFP etiketli bağlantı proteininin kullanılması yoluyla hücre sınırlarının görselleştirilmesini geliştirir ve kolayca monte edilebilen bir görüntüleme teçhizatı kullanır.

Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Bu prosedürün genel amacı, drosophila pupa göz gelişiminin canlı görüntüleme videolarını oluşturmak için verimli bir yöntemi göstermektir. Bu işlem, öncelikle pupa kılıfının O perm kısmının kaldırılması ve bir gözün nöroepitelyumunu açığa çıkarmak için yan taraftan yırtılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise bir görüntüleme düzeneği kurmak ve pupayı küçük bir vazelin damlası üzerine yerleştirmektir.Adhezyon kuşağı bölgesindeki nöroepitelyumun sonraki seri kesitleri standart bir floresan mikroskobu kullanılarak alınır. Son adım, standart görüntü düzenleme yazılımı ile görüntülerin stabilize edilmesi ve renk ayarlamalarının yapılmasıdır. Nihayetinde, drosophila nöroepitelyumunun canlı hücre görüntülemesi, bu örüntüyü oluşturan hücre davranışlarını aydınlatmak için kullanılır.Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir; çünkü pupanın kısmen diseke edilmesi ve ardından görüntüleme düzeneğine doğru şekilde yerleştirilmesi, pupaların bu evrede oldukça kırılgan olması nedeniyle zor olabilir. Ayrıca, başarılı bir görüntüleme için pupanın doğru yönlendirilmesi ve lamelin göz epitelyumunun üzerine doğru yerleştirilmesi kritiktir. Prosedürü laboratuvarımızdan Mark Hellerm

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada, glial hücreler göç GFP etiketli glial hücreler ile eşleştirilmiş canlı mikroskobik analizi ile gelişmekte olan Drosophila göz içine incelemek için bir protokol açıklar.

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Mezoskopik floresan tomografi doku kesit floresan mikroskopi penetrasyon sınırları ötesinde faaliyet göstermektedir. Tekniği çok projeksiyon aydınlatma ve foton bir taşıma açıklamasına dayanmaktadır. Biz, in vivo morfolojilerinden tüm vücut 3B görselleştirme, GFP ifade kanat hayali diskler...

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

Bu video, canlı hücre görüntüleme asimetrik sağlam duyu organı progenitör hücreleri ve epidermal hücrelerin bölünmesi için bir metodu...

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Source: Hellerman, M. B., et al. Drosophila Pupa Gözünün canlı görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2015)Video, bir Drosophila melanogaster pupasında göz desenini incelemek için canlı görüntüleme tekniğini göstermektedir. Yeşil floresan proteini (GFP) etiketli belirteçler, gelişmekte olan göz yapısının oluşumu sırasında hücresel organizasyonun ve farklılaşmanın görselleştirilmesini sağlar.

Floresan mikroskobu kullanılarak Drosophila pupa gözünün canlı görüntülenmesi

Domates / GFP-FLP / FRT yöntem Drosophila canlı mozaik fotoreseptör hücreleri görselleştirme içerir. Bu, gün veya hafta içinde retinada fotoreseptör hücre tek kaderlerini takip etmek için kullanılabilir. Bu yöntem, retinal dejenerasyonu ve nörodejeneratif hastalıklar, fotoreseptör hücre geliştirme çalışmaları için idealdir.

Mozaik Yetişkin Canlı Görüntüleme Domates / GFP-FLP / FRT Yöntemi<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreseptör Hücreler

Bu kağıdı doğrudan puparium aracılığıyla görüntü hücre davranışı hızlı bir tarama konfokal mikroskop kullanımını gösterir. Sağlam pupa davayı bırakarak, bu yöntem doğrudan çalışma zordur Drosophila bir gelişme aşamasında gözlem ve dinamik hücre süreçlerinin ölçülmesini sağlar.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Bu protokol uzun vadeli ex vivo kültür ve Drosophila hayali diskin canlı görüntüleme için ayrıntılı bir yöntem tarif etmektedir. Göz diskin canlı görüntüleme 10 saat süre içinde fotoreseptör farklılaşma ve ommatidial dönüşünü gösterir. protokol basit ve pahalı kurulum gerektirmez.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Burada, pupa evresinde Drosophila bacağının uzun süreli canlı görüntülenmesi için pupariumun tamamen çıkarılmasını içeren bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol diğer dokulara da uygulanabilir.

Puparium çıkarıldıktan sonra Drosophila pupa bacak gelişiminin uzun süreli canlı görüntülenmesi

Öğrenin, Drosophila pupa göz nöroepitelinde canlı görüntüleme yöntemiyle hücre davranışlarını ve gelişimsel desenlemeyi inceleyin. Bu protokol, hücre sınırlarının net görselleştirilmesini sağlar.

Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

Daha fazla video keşfet