Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

Bu prosedürün genel amacı, drosophila pupil göz gelişimi için canlı görüntüleme filmleri oluşturmak için etkili bir yöntem göstermektir. Bu, önce göz bebeği kutusunun O permasının çıkarılması ve bir gözün nöro epitelini ortaya çıkarmak için yan tarafın yırtılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, bir görüntüleme teçhizatı monte etmek ve pupayı küçük bir vazelin boncuğu üzerine monte etmektir.

Yapışma kemeri bölgesindeki nöro epitelin sonraki seri bölümleri, standart bir floresan mikroskobu kullanılarak elde edilir. Son adım, standart görüntü düzenleme yazılımında çekimi sabitlemek ve renk ayarlamaları yapmaktır. Sonuç olarak, drosophila nöro epitelinin canlı hücre görüntülemesi, bu model oluşturan hücre davranışlarını aydınlatmak için kullanılır.

Bu yöntemin gözle görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü bir pupa'nın kısmen diseksiyonu ve daha sonra görüntüleme donanımına doğru bir şekilde monte edilmesi zor olabilir, çünkü pupiler bu aşamada oldukça kırılgandır. Ayrıca pupanın doğru yönlendirilmesi ve örtü tabakasının göz epitelinin üzerine doğru yerleştirilmesi başarılı görüntüleme için kritik öneme sahiptir. Prosedürü göstermek laboratuvarımızdan Mark Hellerman olacaktır.

Deneye başlamak için, daha önce çaprazlanmış genotiplerden beyaz pre puy seçin ve bunları 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine yerleştirin. Ardından, damıtılmış suya batırılmış 10 santimetre karelik bir doku parçasını temiz bir plastik uç kutusuna yerleştirin. Mikro santrifüj tüplerini uç kutusuna yerleştirin.

Islak doku, pupinin kurumasını önleyecek, daha sonra 17 ila 25 saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edecektir. Kuluçkadan sonra, siyah bir puro diseksiyon kabına bir parça taze çift taraflı bant yerleştirin. Pupa sırt tarafını bant üzerine yerleştirin ve pupanın göğüs ve karın bölgelerine yapışmadan pupa başının çift taraflı banda takıldığından emin olun.

Forseps kullanarak, göz bebeği başını ortaya çıkarmak için A permasını dikkatlice kaldırın ve çıkarın. Ardından, öğrenci kasasının yan tarafını yırtın. Bir gözün etrafındaki alanı ortaya çıkarmak için, göz bebeğini yapışkan banttan nazikçe çıkarın.

Kurutma kağıdından 15 milimetre karelik küçük çerçeveyi oluşturun ve ortasına beş milimetrelik bir delik açın. Çerçeveyi ve damıtılmış suyu daldırın ve bir mikroskobun ortasına yerleştirin. 30 cc'lik bir şırınga ile kaydırın.

Kurutma kağıdı çerçevesini çevrelemek için düzgün bir vazelin halkası sıkın. Ardından, doğrudan slaydın üzerine küçük bir boncuk vazelin ekleyin. Pupayı dikkatlice yan yatırın ve vazelin boncuğu ile destekleyin.

Vazelin halkasının üzerine, gözün üzerindeki epitel ile temas edecek şekilde bir kapak fişi yerleştirin. Kapak fişini vazelin içine karşı kapatmak için preparatı nazikçe sıkıştırın ve göz bebeği göz bölgesi ile kapak fişi görüntüsü, göz bebeği hazırlığı arasında küçük bir düz temas yüzeyi oluşturun. Bir floresan mikroskobu kullanarak, gözün AAL alanı, yapışma kavşağı bölgesindeki nöro epitel boyunca her yedi dakikada bir seri kesitler yakalayın.

Her Zack dosyası ve L-A-S-A-F yazılımı için arka planı azaltmak ve seri bölüm görüntülerinin kontrastını artırmak için uygun evrişim giderme yazılımı kullanın. Araçlar paneline gidin. 3D evrişimi çözmeyi seçin ve uygula'ya tıklayın.

Her biri için maksimum bir projeksiyon veya MP görüntüsü oluşturun de kıvrımlı yığın dosyası. Tek tek hücre davranışlarını vurgulamak ve organizma büyümesinin neden olduğu dikkat dağıtıcı unsurları azaltmak için her MP görüntüsünü hizalayın. Ana menünün dosya sekmesinden Photoshop CS five'daki yerleşik algoritmaları kullanarak komut dosyalarını açın ve dosyaları yığına yükle'yi seçin.

Ardından, MP görüntü dosyalarını yükleme katmanları paneline aktarın. Kaynak görüntüleri otomatik olarak hizalamayı dene seçeneğinin işaretli olmadığından emin olun. Aksi takdirde, görüntü verileri bozulabilir.

Tüm MP dosyaları katmanlar bölmesine yüklendikten sonra, tüm görüntülerin kronolojik sırada olduğunu ve en erken zaman noktasının katmanın en üstünde olduğunu kontrol edin. Doğru şekilde sıralanana kadar bunları yığınlayın, sürükleyip bırakın. Gerekirse, katmanları otomatik hizala'yı seçin.

Yeniden konumlandırmayı seçin ve Tamam'a tıklayın. Odak dışında, ilk MP görüntüsünün bölgeleri, odakta eşit bir retina alanı elde etmek için düzeltilebilir. Görüntü işlemeye başlamak için LAS'ta kırpma işlevini kullanın.

Saf, ilk ve son dilimleri manuel olarak kısıtlar, böylece başlangıçta odak dışı kalan bölge içinde yalnızca yapışma kayışını kaplarlar. Bu bölge için en iyi duruma getirilmiş yeni bir yığın dosyası oluşturmak için uygula'ya tıklayın. Ardından, yerel olarak optimize edilmiş yığın için yeni bir maksimum projeksiyon oluşturun ve bunu Photoshop'ta bir TIF dosyası olarak dışa aktarın.

Komut dosyalarını açın ve dosyaları yığına yükle'yi seçin. Ardından ilk MP dosyasını ve optimize edilmiş MP dosyasını yükleme katmanları paneline girin. Yine, kaynak görüntüleri otomatik olarak hizalama girişimi seçeneğinin işaretli olmadığından emin olun ve Tamam'ı seçin.

Her iki katmanı da seçin ve tek tip odakta bir retina alanı oluşturmak için katmanları otomatik karıştır'ı seçin. Bu bileşik görüntüyü bir TIF dosyası olarak kaydedin. Görüntüleri, retinanın dorsal ventral ekseni film karesinin Y eksenine hizalanacak şekilde döndürmek için bir dönüştürme aracı kullanın.

Hücre zarı ile hücre gövdesi arasındaki kontrastı artırmak için tek tek karelerin seviye ayarını kullanın. Ardından, görüntüleri bir filme dönüştürmek için katmanlardan çerçeveler oluştur'u seçin. Katmanların, yığının en altından başlayarak sıralı olarak animasyon bölmesine eklendiğini unutmayın.

Yığınların sırasını tersine çevirmek için, tüm kareleri seçin ve ardından ters kareleri seçin. Her kare için 0,8 saniyelik kare gecikme süresini seçin ve QuickTime'ı seçin. İstediğiniz video formatını dışa aktarın ve seçin.

Son olarak, oluşturma seçenekleri altında, özel olarak belirlenecek kare hızını seçin ve 15 kare hızı girin. Ardından oluştur'u tıklayın. Bu teknikle göz boyunca belirgin bir gelişimsel gradyan gözlendi ve bu da göz deseninin ayrıntılı açıklamalarına yol açtı.

Birincil sarma sırasında, stabil bağlantılar oluşturmak için birbirine bağlanan fotoreseptör demetlerini hızla çevreleyen iki hücre primer olarak işe alındı. Farklılaşmamış intero materyal hücreleri, primerler sarılır ve mühürlenirken düzensiz bir düzende uzanır. Her fotoreseptör demeti yerel hücre hareketleri yeniden düzenlenir.

İnial hücreler her bir oma'nın dorsal ve ventral taraflarında gruplandırılmıştır. Hücreler arası interkalasyon, hücreleri iki satırdan tek bir satıra yeniden düzenledi. Interkalasyonun ardından üçüncül rekabet mikroskop altında yakalandı.

Rakip hücreler, yer değiştirmeden önce beş ila 10 dakika boyunca üçüncül nişi işgal etti. Sonunda, tek bir hücre kararlı üçüncül nişi kurdu. Son budama sırasında, bir apoptoz dalgalanması, ICS sayısını, bileşik göz boyunca verimli bir şekilde bir giriş materyali hücre kafesi oluşturmak için gereken minimuma indirdi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, KKD'nin görüntülenmesi doğru yapılırsa dört saat içinde yapılabilir. Sonraki görüntü işleme yaklaşık bir saat sürer.