Name: Içinde Mikrotubul Dynamics Tedbir plusTipTracker Yazılım Kullanma Xenopus laevis Büyüme Konileri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Öğrenin, Xenopus laevis büyüme konilerinde mikrotübül dinamiklerini plusTipTracker yazılımı ile otomatik olarak analiz etme yöntemini. Bu protokol EB1-GFP kuyruklarının hızlı izlenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Gaudenz Danuser'e ve laboratuvarının üyelerine, plusTipTracker yazılımını oluşturdukları ve yazılımın kullanımıyla ilgili yararlı tartışmalar için, özellikle Maria Bagonis ve Sebastien Besson'a teşekkür ederiz. Videonun oluşturulması ve düzenlenmesindeki yardımları ve destekleri için Boston College Media Center'a özellikle teşekkür ederiz. Ayrıca, yararlı tartışmalar ve yapıcı eleştiriler için Lowery Lab üyelerine ve el yazmasını düzelttiği için Abigail Antoine'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, LAL'e verilen bir NIH R00 MH095768 ödülü ile finanse edildi.

Bu protokol ve video daha ayrıntılı 4 yazılım paketi açıklayan orijinal kağıda bir arkadaşı, yanı sıra Danuser Lab web sitesinde yazılım indirme ile birlikte Teknik Rapor olarak hizmet içindir. Okuyucular yazılımını kullanarak ilgili ek sorular varsa dikkatle bu belgeleri inceleyecek teşvik edilmektedir. 1. öncesinde Görüntü Analizi <ol><li> TIFF (Tagged Image File Format) görüntü dosyaları bir dizi halinde her zaman atlamalı film dönüştürün. Birden fazla büyüme konileri / hücreleri belirli bir film varsa, ilk hasat her büyüme konisinin / hücre kendi resim dizisini oluşturmak için. Not: Bu gerekli değildir, her bölge-faiz (ROI) plusTipTracker içinde seçilebilir gibi. Ancak, daha küçük görüntü boyutlarını kullanarak hesaplama işleme hızını artırır, böylece görüntüde belirgin boşluk varsa, bu adım önerilir. </li><li> Kendi her TIFF serisi kaydetMATLAB erişmek için ayarlanmış bir yol içindeki &quot;resim&quot; olarak adlandırılan klasör (&quot;images&quot; harf duyarlı olduğunu unutmayın). &quot;Geçerli Klasör&quot; penceresinde ilgili dosya dizini, yeni bir yol eklemek gezinmek için, dizin simgesine sağ tıklayın ve &quot;Yol Ekle - Seçilmiş Klasörler ve Alt-Klasörler&quot; seçeneğini seçin. Bu plusTipTracker yazılım klasörü yanı sıra, Path ilave edilmesi önemlidir. </li></ol> 2. plusTipGetTracks Not: görüntü analizinde ilk adım, EB1-GFP kuyrukluyıldızların tespit parça halinde kuyruklu yıldızlar bağlantı ve mikrotübül dinamikleri parametrelerinin belirlenmesidir. Bu komut &quot;plusTipGetTracks&quot; 4 ile elde edilir. <ol><li> Analizi, açık MATLAB uygulamaya başlamak ve komut penceresi içine &quot;plusTipGetTracks&quot; yazın. Bu yeni bir iletişim kutusu görünmesine neden olur. </li><li> &quot;Up Yeni Projeler Set&quot; üzerine tıklayın ve bir (veya mor seçine) Uygun &quot;görüntüleri&quot; klasörünü (veya &quot;görüntü&quot; klasörler) içeren dizinleri seçerek önceki TIFF görüntü serisi. Bu aşamanın tamamlanmasından sonra, bir dosya dizin (roi_1) (&quot;resimler&quot; tutan aynı klasörde) oluşturulur gelecekteki veri dosyalarını içerecek. Not: &quot;Set Up Yeni Projeler&quot; adım, ayrı bir oturum sırasında, vaktinden tamamlanabilir. </li><li> &quot;Son nokta üzerinde sağ tıklayın, bir çokgen seçin ve &#39;Mask oluşturun&#39; üzerine tıklayın&quot;: Yeni bir pencere açılacaktır. &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. Seçilen görüntü serisinin ilk görüntü ekrana gelecektir. Tıklayın ve büyüme konisinin bütününü kapsayan bir çokgen oluşturmak için fareyi kullanın. Çift poligonu kapatmak için fareyi tıklayın. </li><li> Poligon kapatıldı edildikten sonra, bir iletişim kutusu belirir: &quot;Başka bir ROI seçmek istiyor musunuz?&quot; Görüntü &quot;Evet&quot; seçeneğini analiz için başka bir büyüme konisi varsa; aksi halde sseçilen &quot;Hayır&quot;. </li><li> Hemen analiz edilecek projeleri seçin. &quot;Projeleri Seç&quot; tıklayın ve analiz etmek klasörü (roi_X) seçin. </li><li> Bir listSelectGUI ekranı görünecektir. Ekranın sol tarafında proje (ler) seçin ve ekranın sağ tarafında bunları üzerinde taşımak. &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. Proje listesi kaydetmek ve &quot;Kaydet&quot; butonuna tıklayın için bir konum seçin. </li><li> &quot;Algılama&quot;, &quot;İzleme&quot; ve &quot;Post-Processing&quot; seçeneğini seçin. Bu seçimler yapıldıktan sonra, iletişim kutusunun sağ tarafında yapılandırılabilir olacak. Her seçeneği yapılandırın. <ol><li> Bu parametreler MT parça halinde tespit kuyruklu yıldızlar bağlamak için kullanılır. Takibi için bu kontrol parametrelerini seçmek için Ayrıntıları sayfalarında yazılım paketi indir eşlik Teknik Rapor PDF 9-10 dahil edilir; problemlerle karşılaşıldığında dikkatli eğer bu raporu okudum. EB1 Xenop olarak GFP kuyrukluyıldızları izleme amaçları içinBizi büyüme konileri, kullanmak laevis&#39;den aşağıdaki Takip Ayarlar: Arama Radius Aralığı (piksel) 5-12, Minimum Alt Parça Uzunluğu (kare) 3; Maksimum Boşluk Uzunluğu (kare) 8; Maksimum Çekme Faktörü 0.8, Max açısı İleri 50, Max açı Geriye 10, dalgalanma Radius 2.5. Bu ayarlar, Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir. </li></ol> Not: Max Küçülme Factor &quot;geri boşluklar&quot; olarak tespit &quot;geri boşluklar&quot; sayısını azaltmak için ayarlanır parça bağlantılarda kalabalık koşulları ve olası hataları verilen, büyüme konilerinin bağlamında analiz etmek yararlı değildir. Büyüme konisi MTS büyümeleri ve çekinti ilave olarak, sık sık küçük translokasyon sergilemektedir ve bu kontrol ayarları artan bağlanma adımı sırasında bu artan hareket etmesini sağlar Buna ek olarak, her iki Çok İleri açı olarak Dalgalanma yarıçapı nispeten yüksek bir değere ayarlanmaktadır. <ol><li> İstediğiniz belirli görüntü alma ayarlarına bağlı Post-Processing Ayarlar doldurun. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Ayarları düzenlendikten sonra, &quot;Başlat&quot; üzerine tıklayın. Yazılım seçilmiştir hangisi ayarları çalışacaktır. Bu seçilen projeler ve bunların boyutları sayısına bağlı olarak, saat dakika sürebilir. Komutanlığı Pencere her fonksiyon için kalan tahmini süresini gösterir. PlusTipGetTracks adım tamamlandığında, Command Window &quot;bitirdi!&quot; Görüntüleyecektir Not: mikron (MT dinamikleri belirli parametreleri artık bu yazılım tarafından hesaplanmıştır uzun bir listesi (detaylar için Referans 4), ancak büyüme konileri MT dinamiklerinin analizi için, incelemek için en yararlı parametreler MT büyüme izleme hızı vardır / dakika), saniyede büyüme parça ömrü (), ve mikron büyüme hat uzunluğu (). </li></ol> 3. plusTipSeeTracks Not: Şimdi mikrotübül parçaları tanımlanmış olduğundan, fonksiyon &quot;plustipSeeTracks&quot; iz görselleştirme 4 için kullanılır. Bu fonksiyon,mekansal MT dinamikleri haritalar ve hız filmler dahil görselleştirme için çoklu çıktıları sağlar, ancak burada, odak büyüme konisinin resimlerin üzerine bindirilir MT parçalarını göstermek için &quot;Track Filmler&quot; kullanarak yanlızca yapabilirsiniz. PlusTipGetTracks bir anda birden fazla film analiz ederken, plusTipSeeTracks bir seferde sadece tek bir film analiz edebilirsiniz. <ol><li> Komut penceresine &quot;plusTipSeeTracks&quot; yazın. </li><li> Iletişim kutusu yüklendikten sonra, &quot;Select Project&quot; üzerine tıklayın. Görselleştirmek ve &quot;Klasörü Seç&quot; butonuna tıklayın projeyi içeren ana dizini seçin. Yeni bir pencere açılacaktır: &quot;görselleştirmek istediğiniz projeyi seçin&quot;. Görselleştirmek ve &quot;Tamam&quot; tıklayın dosyayı seçin. </li><li> Sonra, &quot;Select Kayıtlı ROI&quot; üzerine tıklayın. Önceki adımda seçilen biri olarak aynı roi_X klasöre gidin ve &quot;roiYX&quot; adlı dosyayı seçin. </li><li> W belirtmek için &quot;Çıkış Dizin Seç&quot; tıklayınBurada MATLAB parça görselleştirme dosyaları kaydeder. Not: Biz verilerin geri kalanını içeren aynı klasörü kullanmanızı öneririz. </li><li> Seç &quot;Parça Film Yap&quot; ve ekran + TIP kuyruklu hesaplanan parça plusTipGetTracks tüm görüntüleyen görünecektir. Bu adım dosyasındaki &quot;allTracks_X_X_X&quot; in, bir film formatında izlenen zaman serisi kaydeder. Bir AVI olarak film kaydetmek için bir seçenek aksi varsayılan biçim bir Quicktime.mov dosyası olarak, orada. </li></ol> 4. plusTipGroupAnalysis Not: Bu son fonksiyon analizi ve MT yol parametrelerinin karşılaştırılması için filmler grupları oluşturmak için kullanılır. <ol><li> Komut penceresine &quot;plusTipGroupAnalysis&quot; yazın. Elle karşılaştırmak için gruplarını seçmek için, ilk &quot;hiyerarşi Auto grubu&quot; de-seçin. Sonra, &quot;Select projeler&quot; üzerine tıklayın. Tüm roi_X klasörleri içeren ana dizinleri gidinanaliz etmek. </li><li> Bir listSelectGUI ekranı görünecektir. Ekranın sol taraftan gruplar içerir ve ekranın sağ tarafına onları taşımak için tüm projelerinin seçin. &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. Proje listesi kaydetmek ve &quot;Kaydet&quot; butonuna tıklayın için bir konum seçin. </li><li> Bir pencere çıkacaktır: &quot;listeden birinci grubu seçiniz&quot;. &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. ListSelectGUI penceresi tekrar gösterecektir. Bu kez, bir araya toplanmış olmalıdır ilk gruba karşılık sadece bu dosyaları seçin. &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> Ardından, grup adını girin ve &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. Buna göre cevap ve grupları seçmeye devam &quot;başka bir grup seçin?&quot;: Bir pencere açılacaktır. Bir pencere çıkacaktır: &quot;grup listesini kaydetmek için bir konum seçin&quot;. Konuma gidin ve &quot;Kaydet&quot; butonuna tıklayın. </li><li> Çıkış klasörler nerede olacak seçmek için &quot;Select Output Directory&quot; üzerine tıklayınsaklanır. </li><li> Yapmak için grup analizi hangi tür seçin - MT parça yapılmalıdır her grup veya hücre analizi başına toplanmış olup olmadığını. Önerilen istatistiksel testler zaten belirlenir. Analizinde tüm parçaları dahil etmek de-seçin &quot;filminin başında / sonunda parça çıkarın&quot;. Aksi halde, seçilen bu kutuyu sahip film başladığı ve bittiği gibi sürecinde herhangi MT büyüme şarkıları kaldırır. </li><li> Grup Analizi Seçim yapıldıktan sonra, &quot;gruplarını karşılaştırma&quot; seçeneğini seçin. </li></ol>

<ol><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+%28end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit%2FMAST%2FCLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li>
<li>Purro, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+regulates+axon+behavior+through+changes+in+microtubule+growth+directionality%3A+a+new+role+for+adenomatous+polyposis+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).</li>
<li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((plusTipTracker%3A+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).</li>
<li>Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Explant+Cultures+from+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neural Explant Cultures from Xenopus laevis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232(2012).</li>
<li>Long, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+analysis+of+CLASP-interacting+protein+functions+during+interphase+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics.</a> Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).</li>
<li>Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+ECM+mechanosensing+pathways+regulate+microtubule+dynamics+to+control+endothelial+cell+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).</li>
<li>Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+microtubule+growth+dynamics+identifies+MARK2+as+a+regulator+of+leading+edge+microtubules+downstream+of+Rac1+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells.</a> PLoS One. 7, e41413(2012).</li>
<li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+ends%3A+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).</li>
<li>Schuyler, S. C., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+%27plus-end-tracking+proteins%27%3A+The+end+is+just+the+beginning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning.</a> Cell. 105, 421-424 (2001).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li>
<li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).</li>
<li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+tracking+by+CLIP-170+requires+EB1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EB1+promotes+microtubule+dynamics+by+recruiting+Sentin+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells.</a> The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).</li>
<li>Maurer, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li>
<li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li>
<li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+development%22%5BJournal%5D)">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22(2013).</li>
<li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+%28XCLASP1%29+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

PlusTipTracker hızlı ve otomatik olarak, bir hücre ya da büyüme konisinin hemen hemen tüm görünür EB1-GFP kuyrukluyıldızların tespit parça halinde kuyruklu yıldızlar bağlantı ve MT parametreleri hesaplamak için basit bir grafik kullanıcı arabirimi sağlar. Diğer yayınlar (. Örneğin, Marx ve ark büyüme konileri 18 etiketlendi EB1 dinamikleri de kullanılan kantitatif analiz) yazılımları benzer tipte tasarımı bildirdi. Ama bu yazılım özgürce, açık kaynak tasarlama konusunda uzmanlaşmış Danuser Lab web si...

Bu yöntemin amacı, kantitatif mikrotübül (MT) ile ilgili bilgi, artı sona izleme proteini (+ uç) büyüme konileri canlı dinamikleri elde etmektir. MT + ipuçları MTS 9,10 artı uçları lokalize bir protein grubudur. Onlar polimerizasyon, felakete ve kurtarma oranları dahil olmak üzere MT dinamik istikrarsızlık 11, parametrelerini düzenlemek için fonksiyonları bir dizi yapmak. MT dinamiklerini analiz etmek için bir iyi kullanılan bir yöntem büyüyen MT spesifik olarak bağlanan artı-biter 1,12 + TIP EB1, davranışlarını takip etmektir. EB1 büyüyen MT birkaç diğer proteinleri işe bilinen artı-biter MT büyüme ve afet frekansı 15,16 hem teşvik, 13,14, ve son zamanlarda MT olgunlaşma faktörü 15 olarak kurulmuştur edilir. Büyüme konilerinin içindeki MT dinamikleri pek çok çalışma EB1 localizati gibi, zaman içinde 1-3 EB1-GFP dinamikleri değişiklikleri ölçmek için el-izleme yöntemlerini kullanmışlardırMT ile artı uçları MT polimerizasyonu için bir markör olarak kullanılabilir. MT büyüme için bir vekil olarak EB1-GFP kuyrukluyıldızların incelenmesi için bir anahtar yararı MT dinamikleri bile önemli MT örtüşme bölgelerinde ölçülebilir olmasıdır. El-izleme EB1-GFP kuyrukluyıldızların yöntemi MT yararlı açılımlar sağlamıştır iken, zaman alıcı ve önyargılı olabilir, 1-3 davranışları. Önemli bilgileri kaçırabilir Ayrıca, anormal büyüme gibi koni davranışlar olasılıkla (el-izleme olduğunda genellikle gerekli) MTS sadece küçük bir alt kümesini analiz sitosköletal dinamikleri dakika vardiya, sonucudur. Böylece, yüksek çözünürlüklü, kültürlü embriyonik büyüme konileri 5 etiketlendi EB1 canlı görüntülerin kazanılmasından sonra, yazılım paketi, plusTipTracker 4 kullanarak küresel MT dinamiği parametreleri ölçmek. Danuser Lab geliştirilen bu yazılım, çeşitli hücre tipleri 6-8 MT dinamikleri karakterize çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır. Bu, bize bir açık-kaynaker-dostu, floresan etiketli + ipuçları filmler için otomatik algılama, izleme, görselleştirme ve analiz içerir MATLAB tabanlı bir paket. MT dinamikleri belirli parametreler bu yazılım tarafından hesaplanan uzun bir listesi (detaylar için Referans 4), ancak büyüme konileri MT dinamiklerinin analizi için, en yararlı parametreler (mikron / dakika) MT büyüme izleme hızı vardır, büyüme parça (saniye olarak) ömür boyu, ve (mikron) büyüme hat uzunluğu. Yazılım (&quot;Software&quot; altında) Danuser Lab web sitesinden doğrudan indirilebilir. Danuser Lab şu anda orijinal, stand-alone yazılım mevcut kalacak bir yazılım paketi olarak adlandırılan u-track 2.0, içine dahil edilmiştir + TIP izleme analizi için yeni bir arabirimi destekler iken. İki program arasındaki temel algoritmalar arayüzü ve analiz çıkışların tek bir farkla, (en azından 2014 gibi) aynıdır. Biraz MATLAB ve / veya hesaplama analizleri tecrübeleri acemi kullanıcı içinence, plusTipTracker otomatik istatistiksel parametre çıkışlar dahil olmak üzere daha kullanıcı dostu özelliklere sahiptir. Burada, biz kültürlü Xenopus laevis büyüme konisi EB1-GFP dinamikleri görüntüleri analiz etmek için adımları açıklar. Bu protokol MT dinamikleri 17 inceleyen bir son kağıt kullanılmıştır. Ayrıca Lowery ve ark bakın. 2.012 5 EB1-GFP ifade kültürleme büyüme konileri ilişkin ayrıntılı talimatlar için. Bu kağıt öncelikle büyüme konisi EB1-GFP dinamikleri incelenerek odaklanırken, aynı protokol diğer hücre tipleri 17 için kullanılabilir. Tüm hücre tipleri için, çerçeveler arasındaki zaman aralığının en uygun + TIP takip 0.5-2 saniye arasında olmalıdır. Çerçeveler arasındaki kadar 4 saniyelik bir zaman aralığı mümkündür, ancak bu ek izleme hataları zaman aralığı sonuçları artmıştır.

<table><tbody><tr><td>plusTipTracker yazılımı</td><td>Danuser Lab</td><td><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td><td>Bu yazılım gelecekte başka bir web sitesi tarafından barındırılabilir.&nbsp; Listelenen site yoksa, siteyi bulmak için bir web arama motorunda "Danuser Lab Yazılımı" araması yapın.</td></tr><tr><td>MATLAB yazılımı</td><td>Mathworks</td><td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td><td></td></tr></tbody></table>

içinde mikrotubul dynamics tedbir plustiptracker yazılım kullanma xenopus laevis büyüme konileri

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Mikrotubul (MT) artı-son-izleme proteinler (+ TIPler) MTS büyüyen artı uçlarına lokalize ve MT dinamiklerini 1,2 düzenler. MT dinamiklerini analiz etmek için en iyi bilinen ve + yaygın kullanılan ipuçları biri büyüyen tüm MT artı uçları bağlanır Sonu Binding Protein, EB1, ve böylece, MT polimerizasyonu 1 için bir göstergedir. Büyüme konilerinin içindeki EB1 davranışı bir çok çalışmalar bireysel MTlerin 1-3 analiz zaman tüketen ve önyargılı bilgisayar destekli, el-izleme yöntemlerini kullandık. Bizim yaklaşımımız, yüksek çözünürlüklü, kültürlü embriyonik büyüme konileri 5 etiketlendi EB1 canlı görüntülerin satın Aşağıdaki yazılım paketi, plusTipTracker kullanarak 4 MT dinamikleri küresel parametrelerini ölçmek için olduğunu. Bu yazılım floresan etiketli + ipuçları filmler için otomatik algılama, izleme, görselleştirme ve analiz birleştiren bir MATLAB tabanlı, açık kaynak, kullanıcı-dostu paketidir. Burada, biz plusTipT kullanmak için protokol mevcutkültürlü Xenopus laevis büyüme konisi floresan etiketli + TIP kuyrukluyıldızların analizi için racker. Bununla birlikte, bu yazılım, çeşitli hücre tipleri 6-8 MT dinamiğini karakterize etmek için kullanılabilir.

Burada anlatılan canlı hücrelerin + TIP dinamiklerini ölçmek birkaç bilgi dosyaları sağlayacak bu yazılımı kullanarak. Bu fonksiyon plusTipGetTracks (Şekil 1 'de gösterilen örnek ayarlar kullanılarak) parçaları tanımlar ve ardından + TIP parçaları ile ilgili parametreleri içerir. Yazılım elde ettiği bilgileri görüntülemek için, adım 2.2 oluşturulan roi_X dizine gidin. "Ustalık" klasörü tespit kuyrukluyıldızların gösteren görüntülerin bir dizi olan, "overlayImages" içerir. Ku...

MATLAB tabanlı, açık kaynak yazılım paketi, plusTipTracker, mikrotübül dinamiklerini ölçmek için floresan etiketli + ipuçları görüntü serilerini analiz etmek için kullanılabilir.

Içinde Mikrotubul Dynamics Tedbir plusTipTracker Yazılım Kullanma Xenopus laevis Büyüme Konileri

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Bu prosedürün amacı, yazılım paketi artı uç izleyici kullanarak Mikrotübül artı uç izleme proteini veya artı uç dinamikleri ve canlı büyüme konileri hakkında nicel bilgi elde etmektir. Burada, EB one GFP dinamiklerinin ve kültürlenmiş XUS lavis büyüme konilerinin görüntülerini analiz etme adımlarını açıklıyoruz, ancak benzer bir protokol, etiketli EB one ve kültürlenmiş embriyonik büyüme konilerinin yüksek çözünürlüklü canlı görüntülerinin elde edilmesini takiben diğer hücre tipleri için de kullanılabilir. Prosedürdeki ilk adım, komut artı ucunu kullanmak, EB one GFP kuyruklu yıldızlarını tespit etmek için izler almak, kuyruklu yıldızları parçalara bağlamak ve mikrotübül dinamiğinin parametrelerini belirlemektir.İkinci adım, büyüme konisi görüntülerinin üzerine bindirilmiş mikrotübül izlerini görselleştirmek için komut artı uç C izlerini kullanmaktır. Son adım, film gruplarının mikrotübül iz parametrelerini analiz etmek ve karşılaştırmak için artı uç grubu analizini kullanmaktır. Bu tekniğin, bireysel artı ipucu izlerini analiz etmek için el izlemeyi kullanmak gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu yöntemin hızlı ve otomatik algılama, izleme, görselleştirme ve analize izin vermesidir.Görüntü analizinin ilk adımı, EB one GFP kuyruklu yıldızlarını tespit etmek, kuyruklu yıldızları parçalara bağlamak ve mikrotübül dinamiğinin parametrelerini belirlemektir. Bu, komut artı ipucu ile elde edilir. Görüntü analizinden önce parçaları alın.Her zaman aralıklı filmi bir dizi TIFF görüntü dosyasına dönüştürün ve her seriyi görüntüler adı verilen kendi klasörüne kaydedin. Görüntülerin büyük/küçük harfe duyarlı olduğunu unutmayın. Analize başlamak için MATLAB uygulamasını açın ve komut penceresine artı tip get tracks yazın.Bu, yeni bir iletişim kutusunun görünmesine neden olur. Tıklayın, yeni projeler oluşturun ve uygun görüntüler klasörünü seçerek önceki TIFF görüntü serilerinden birini veya daha fazlasını seçin. Bu adımın tamamlanmasının ardından bir Dosya dizini oluşturulacaktır.Tıklayın, tamam. İlk görüntü görüntülendikten sonra, tıklamak ve bir çokgen oluşturmak için fareyi kullanın. Sonra büyüme konisinin tamamını kapsar.Çokgeni kapatmak için fareye çift tıklayın. Görüntüde başka bir büyüme konisi varsa bir iletişim kutusu görünecektir. Analiz etmek için evet'i seçin.Aksi takdirde, hayır'ı seçin. Bir sonraki adım, hemen analiz edilecek projeleri seçmektir. Projeleri seç'e tıklayın ve klasörü seçin.Bir listeyi analiz etmek için, yapışkan ekranı seçin. Ekranın sol tarafından projeleri seçin ve sağ tarafa taşıyın. Tıklayın, tamam.Proje listesini kaydetmek için bir konum seçin ve kaydet'e tıklayın, algılama, izleme ve son işlemeyi seçin. Bu seçimler yapıldıktan sonra, diyalog kutusunun sağ tarafı yapılandırılabilir hale gelecektir. İşlem sonrası ayarları doldurun.İstenen özel görüntü alma ayarlarına bağlı olarak, başlat'a tıklayın. Yazılım daha sonra hangi adımları girilmişse onu çalıştıracaktır. Komut penceresi, her işlev için kalan tahmini süreyi görüntüler ve adımın çalışmasının ne zaman tamamlandığını gösterir.Artık mikro tüp izleri tanımlandığına göre, fonksiyon artı uç C izleri, iz görselleştirme ve büyüme konisi görüntülerinin üzerine bindirilmiş mikro tüp izlerini görüntülemek için kullanılır. Bu, komut penceresine komut artı uç C izleri türü artı uç C izleri ile elde edilir. Diyalog kutusu yüklendikten sonra proje seç'e tıklayın.Görselleştirmek için projeyi içeren üst dizini seçin ve klasör seç'e tıklayın. Pencere göründüğünde, görselleştirilecek dosyayı seçin ve üzerine tıklayın. Tamam, sonra, kaydedilmiş ROI'yi seç'e tıklayın, önceki adımda seçilenle aynı ilgi bölgesi klasörüne gidin ve R-O-I-Y-X adlı dosyayı seçin.MATLAB'ın parça görselleştirme dosyalarını nereye kaydedeceğini belirlemek için çıktı dizinini seç'e tıklayın ve ardından parça filmi yap'ı seçin. Tüm parçaları gösteren bir ekran görünecektir. Artı ipucu, artı ipucu yorumlarından hesaplanan parçaları alın.Adım, parça zaman serisini bir film formatında kaydeder. Son işlev, mikro tüp izi parametrelerinin analizi ve karşılaştırılması için film grupları oluşturmak için kullanılır. Bu, komut artı uç grubu analizi ile elde edilir.Bir kez artı ipucu al parçaları birden fazla film için çalıştırıldı ve farklı veri alt kümeleri karşılaştırma için hazır. Komut penceresine artı ipucu grubu analizi yazın: Önce karşılaştırılacak grupları manuel olarak seçmek için, hiyerarşiden otomatik grup seçimini kaldırın. Ardından proje seç'e tıklayın.Tüm ROI klasörlerini içeren üst dizinlere gidin. Bir listeyi analiz etmek için, GUI Penceresi görünecektir. Ekranın sol tarafından gruplara dahil edilecek tüm projeleri seçin ve sağ tarafa taşıyın.Tıklayın, tamam. Ardından proje listesini kaydetmek için bir konum seçin ve kaydet'e tıklayın, bir pencere görünecektir. Tıklamak.Tamam, ve liste seçici yapışkan pencere görüntülenecektir. Yine, yalnızca bir araya getirilmesi gereken ilk gruba karşılık gelen dosyaları seçin ve üzerine tıklayın. Tamam. Grup adını girin ve tıklayın, tamam.Bir pencere açılacak, buna göre cevap verin ve grupları seçmeye devam edin. Ardından grup listesini kaydetmek için bir konum seçin ve kaydet'e tıklayın. Çıktı klasörlerinin nerede saklanacağını seçmek için çıktı dizinini seç'e tıklayın.Son olarak, hangi tür grup analizinin yapılacağını seçin. Burada tüm hücrelerden ve gruplardan havuz verilerini seçiyoruz. Grupları karşılaştır'a tıklayın.Bu görüntü, fonksiyon artı tip git izlerinden elde edilen Mikro tüp dinamiğinin parametrelerini gösterir. Bu film, fonksiyon artı uç C izlerinden elde edilen mikrotübül izlerini göstermektedir. Son olarak, bu görüntü, fonksiyon artı uç grubu analizinden elde edilen mikrotübül parametrelerini göstermektedir.Bir elektronik tablo uygulaması kullanma. Farklı film gruplarından elde edilen bu parametreler, bir işleme programı kullanılarak kutu çizimleri olarak da incelenebilir. Bu videoyu izledikten sonra, fonksiyonlar artı uç git izleri artı uç C izleri ve artı uç Grup analizini kullanarak mikrotübül artı uç dinamikleri ve canlı büyüme konileri hakkında nicel bilgi elde etmek için artı uç izleyicinin nasıl kullanılacağını iyi anlamalısınız.

using-plustiptracker-software-to-measure-microtubule-dynamics-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mikrotübüller doğal kararsız polimerler, büyüme ve kısalması arasında kendi anahtarlama stokastik ve kontrol etmek zordur. Burada photoablatable stabilize kapaklar ile segmentli mikrotübülleri kullanarak protokolleri açıklar. Parçalara Mikrotübüllerin depolimerizasyonu böylece sökmeden mikrotübül uçları ile hareketleri analizi yardımcı, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile tetiklenebilir.

Sökme Mikrotubul saplı tarafından Driven Hareketleri Eğitim için Segment Mikrotübüller hazırlanması

İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücresi (HUVEC) kültürü için protokoller, mikrotübül büyümesinin floresan işaretli belirteçlerinin geçici transfeksiyonu, canlı hücre görüntüleme ve interfaz mikrotübül büyüme dinamiklerinin otomatik analizi detaylandırılmıştır.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

Dinamik hücresel çıkıntıların uzunluğu boyunca göreli protein yoğunluğunun yarı otomatik olarak izlenmesi için bir yazılım çözümü sunmaktayız.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Burada canlı hücre dönen disk konfokal mikroskopisi ve MATLAB tabanlı görüntü işleme kullanarak prometafazda senkronize hücrelerde mikrotübül dinamiği analizinin sağlam ve ayrıntılı bir yöntemini sıyoruz.

Monopolar Mitotik İğlerde Dönen Disk Mikroskobu ile Mikrotübül Dinamiğinin Ölçülmesi

Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Bu protokol, birincil hücre kültüründeki dinamik özelliklerini incelemek için EB3 protein transfeksiyonu ile mikrotübül artı-uç görselleştirmesine adanmıştır. Protokol, Huntington hastalığı hastalarından elde edilen insan primer deri fibroblastları üzerinde uygulandı.

İnsan Primer Cilt Fibroblastlarına Dayalı Huntington Hastalık Modelinde Mikrotübül Artı-Uç Dinamikleri Görselleştirmesi

Bu protokol, yayılan hücrelerin kenarındaki çıkıntıların dinamik parametrelerini (çıkıntılar, geri çekmeler, fırfırlar) ölçmeyi amaçlamaktadır.

Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi

İlerlemek için, büyüme konileri dış ortama karşı çekiş kuvvetleri uygulamalıdır. Çekiş kuvvetlerinin üretimi akin dinamiklerine ve debriyaj kavramasına bağlıdır. Bu çalışmada büyüme konisi ilerlemesi için akin dinamiklerini, debriyaj kavramasını ve çekiş kuvvetlerini analiz etme yöntemleri açıklanmaktadır.

Büyüme Konisi İlerlemesi için Actin Dynamics, Debriyaj Kavrama ve Çekiş Kuvveti Analizleri

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Dinamik mikrotübüllerin ve floresan olarak etiketlenmiş mikrotübülle ilişkili proteinlerin eşzamanlı görüntülenmesi için girişim-yansıma mikroskobu ve toplam-iç-yansıma-floresan mikroskobu uygulamak için bir protokol sunuyoruz.

Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu

Öğrenin, Xenopus laevis büyüme konilerinde mikrotübül dinamiklerini plusTipTracker yazılımı ile otomatik olarak analiz etme yöntemini. Bu protokol EB1-GFP kuyruklarının hızlı izlenmesini sağlar.

Içinde Mikrotubul Dynamics Tedbir plusTipTracker Yazılım Kullanma Xenopus laevis Büyüme Konileri

Daha fazla video keşfet