Name: Algılama In Situ Protein-protein kompleksleri Drosophila Larva Nöromüsküler Junction (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Öğrenin Drosophila larva nöromüsküler kavşakta protein-protein etkileşimlerini yerinde tespit etmek için Proximity Ligation Assay yöntemini. Bu teknik sinaptik organizasyonu anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz sinek stokları sağlamak için Bloomington Drosophila Stok Merkezi&#39;ne teşekkür ederiz. Biz de antikorlar sağlamak için Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası ve Dr. Lynn Cooley (Yale Üniversitesi) teşekkür ederim. Özel bir teşekkür yazının üzerine ona yardım için AhHyun Yoo gider. Bu çalışma Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Konseyi (Krieger), William ve Ada Isabelle Çelik Fonu (Krieger) ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (Harden) hibe ile desteklenmiştir.

1. Vücut Duvar Hazırlık . NOT: Daha önce Brent ve arkadaşları 10, ya da Ramachandran ve Budnik ağacının 11,12 tarif edildiği gibi (vücut duvarı kasları innerve NMJs bir çalışma için), üçüncü evre larvaların gövde duvarları hazırlanması ancak bazı tadilatlar ile, gerçekleştirildi. <ol><li> Teşrih <ol><li> Standart prosedürler kullanılarak 13 beş-altı gün boyunca 25 ° C'de sinek stokları ve haçlar kaldırın. </li><li> İnce forseps kullanarak şişeleri ya da şişe Üçüncü dönem larva tarama seçin. </li><li> Herhangi bir gıda parçacıkları çıkarmak için fosfat tamponlu salin (PBS) ihtiva eden küçük bir Petri kabındaki larvaları yıkayın. </li><li> Sylgard diske tek larva yerleştirilir ve buz soğukluğunda PBS birkaç damla içinde bırakın. Buz gibi soğuk PBS işlemek için daha kolay hale larva stun yardımcı olacaktır kullanma. Diseksiyon boyunca, hazırlık her zaman kurumasını önlemek için PBS batmış olduğundan emin olun. </li><li> La yerleştirindorsal tarafı, iki trakea yolları bir mikroskop (Şekil 2A) altında görünür şekilde yukarı bakacak şekilde RVA. Forseps kullanarak, bir minutien pimi kavramak spiracles (Şekil 2B) yakınında arka ucunda larva aşağı pin. Başka bir iğne ile, ağız kanca yakın ön ucundaki manikür delip. Yavaşça, sonra boyuna larva germek (Şekil 2B) aşağı pin. </li><li> Mikrodissek- makas kullanarak, küçük bir açıklık oluşturmak için pin yakın arka ucunu çimdik. kesi sadece manikür geçmesine yeterli yüzeysel olmalıdır. </li><li> İki trakea yolları (Şekil 2C) arasındaki dorsal orta hat uzunluğu boyunca kesilmiş, kesi içine makas alt bıçak ucu yerleştirilmesi. Ventral vücut duvarı kasları zarar vermemek için keserken hafifçe yukarı doğru makas bıçakları yöneltin. </li><li> Biraz mesaja ön bir küçük yatay kesi yapmakeriorly yerleştirilmiş pim (Şekil 2C). Benzer başka bir kesi biraz öne yerleştirilmiş pim (Şekil 2C) posterior olun. kesiler sadece manikür geçmelidir. NOT: Bir benzemelidir kombine adımlar 1.1.7 ve 1.1.8 üç kesiler " <img fo:content-width="0.09in" src="/files/ftp_upload/52139/52139_letter_I.jpg" width="15px"> Tamamlandığında ", yani, larva vücudunun sırt tarafında bir sol ve sağ kanat imal edilmelidir. </li><li> Dikkatle forseps ile iç organları dışarı temizleyin. PBS birkaç damla kuvvetli ekleme, larva vücut dışına organları yerinden böylece daha kolay bunları kaldırmak için yapım yardımcı olacaktır. Vücut duvarı kasları zarar verir gibi larva vücudu alay kaçının. </li><li> Açık larva vücudu fora ve aşağı köşeleri (Şekil 2B) pin. Iğneleme zaman eşit olarak gerilmiş bir dikdörtgen oluşturmak üzere yatay ve dikey olarak gövde duvarını streç (see Şekil şekil için 2G), dikkat çekici sürecinde vücut duvarı kasları gözyaşı değil. </li><li> Kalan iç organları (Şekil 2E) kaldırarak bitirin. </li></ol></li><li> Sabitleme ve Permeabilization <ol><li> Bouin Çözüm birkaç damla tutturulmuş beden duvarları daldırın. Buz üzerinde 15 dakika süreyle inkübe edin. Seçenek olarak ise, alternatif bir sabitleyici olarak% 4 paraformaldehit (PFA) kullanır; 30 dakika kuluçkada bırakın. </li><li> Triton Fosfat Tamponu Tuzlu Su (PBT) ile üç kez yıkayın. </li><li> Ince forseps kullanarak, dikkatli işaretçilerine kaldırmak ve bir silikonlu 0.65 ml mikrosantrifüj tüp içine köşesinden beden duvarları aktarın. </li><li> PLA için hazır olana kadar 4 ° C'de PBT gövde duvarı saklayın. En iyi sonuçlar için, bir gün veya diseksiyon iki içinde beden duvarları immün başlar. NOT: reaktif tasarruf etmek ve tüm vücut duvarları tahlil sırasında eşit muamele sağlamak için, farklı genotip tek yerleştirilebilirtüp. Genotipleri (örnekler için Şekil 2F bakınız) farklı beden duvarları köşelerini keserek ayırt edilebilir. </li></ol></li></ol> 2. İmmünohistokimya Not:. Üçüncü instar larva gövde duvarlarının immün önce Brent ve diğerleri, 14 ve Ramachandran ve Budnik ağacının 11'de tarif edildiği gibi gerçekleştirildi, ancak bazı değişiklikler 11,14 ile yapıldı. NOT: Aksi belirtilmedikçe, oda sıcaklığında ve yumuşak çalkalama ile tüm adımları. <ol><li> Bloke etme <ol><li> 10 dakika her PBT ile üç kez vücut duvarları yıkayın. </li><li> 1 saat süre ile% 1 Sığır Serum Albümini (BSA) ile bloke edin. </li></ol></li><li> Immün <ol><li> İlgili iki proteinlere karşı fare, tavşan, birincil antikorlar ile gövde duvarı inkübe, oda sıcaklığında 2 saat, ya da gece boyunca 4 ° C'de (% 1 BSA içinde seyreltilmiş). 250 tavşan a: Bu durumda, 01:10 Fare anti-Dlg 1 kullanımınti-HtsM 15,16. Olmayan fare ya da tavşan yapılır markerlere karşı antikorlar da dahil edilebilir - örneğin 1 kullanın: 200 keçi anti-HRP nöronal membranları araştırmak. </li><li> 10 dakika her PBT ile üç kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat, ya da gece boyunca 4 ° C'de (% 1 BSA içinde seyreltilmiş) ile markalama maddeleri tespit etmek için florofor-konjuge sekonder antikor ile inkübe edin. Keçi anti-HRP antikoru saptamak için 200, FITC-konjuge anti-keçi, örn: 1 kullanmak - PLA sinyali, daha sonra kırmızı bir florofor ile görüntülenmiştir, başka bir flüorofor işaretleyici tespit etmek için kullanılmalıdır. Nedeniyle ışığa duyarlı reaktiflerin kullanılması ile, Bu noktadan itibaren karanlıkta tüpleri tutun. NOT: PLA konfokal mikroskobu altında kırmızı kanalda görsel sinyal ile, fare ve tavşan büyüdü primer antikorlar arasında gerçekleştirilecek için kullanılan kiti izin verir. Arzu edildiği takdirde, diğer kitleri deney primadonnanın ile yapılması için izin vardırry antikorlar diğer türlerde kaldırdı, ve sinyal diğer kanallar görsel. </li></ol></li></ol> 3. Proximity ligasyon Testi NOT: Aksi belirtilmedikçe, oda sıcaklığında ve yumuşak çalkalama ile tüm adımları. <ol><li> PLA Sondalar <ol><li> 10 dakika her PBT ile üç kez vücut duvarları yıkayın. </li><li> 37 ° C'de 2 saat süre ile (5 seyrelti,% 1 BSA içinde, her biri 1) PLA probları ile inkübe edin. Bu durumda, 5-10 gövde duvarlarının doğru daldırma ve karışmasını sağlamak için PLA sistemi anti-fare eksi 40 ul, PLA sistemi anti-tavşan PLUS 40 ul% 1 BSA, 120 ul kullanın. PLA bir prob 1:25 seyreltme kadar devam (bu deney için, yani,) uygun bir sinyal-gürültü oranı elde edilmesine neden olabilir. </li></ol></li><li> Ligasyon <ol><li> 5 dakika her biri için iki kez Yıkama Tampon A ile gövde duvarı yıkanır. </li><li> 1 saat için a bağlama çözeltisi (bağlama tamponu içinde Ligase 1:40 seyreltme) ile inkübeT, 37 ° C'dir. Bu durumda, 5-10 gövde duvarlarının doğru daldırma ve karışmasını sağlamak için Ligase 5 ul, 5 ligasyonu tampon maddesi 40 ul ve yüksek saflıkta su 155 ul kullanın. </li></ol></li><li> Amplifikasyon <ol><li> 2 dakika her iki Yıkama Tampon A ile beden duvarları yıkayın. </li><li> 37 ° C'de 2 saat boyunca amplifikasyon solüsyonu (Amplifikasyon tamponu Polimeraz 1:80 seyreltme) ile inkübe edin. Bu durumda, 5-10 gövde duvarlarının doğru daldırma ve karışmasını sağlamak için Polimeraz 2.5 ul 5 Amplifikasyon tamponu 40 ul ve yüksek saflıkta su 157,5 ul kullanın. </li></ol></li><li> Görüntüleme için hazırlık <ol><li> 10 dakika her biri için iki kez Yıkama Tampon B ile gövde duvarı yıkanır. </li><li> 1 dakika boyunca bir kez 0.01x Yıkama Tampon B ile yıkayın. </li><li> Montaj önce en az 30 dakika boyunca monte çözeltisinin bir kaç damlası dengeye ya da 4 ° C'de bir gece boyunca muhafaza ediniz. </li><li> Ince forseps kullanarak, dikkatli bir platformu slayt w üzerine beden duvarları aktarmaki kendi tırnak etlerini aşağı bakacak. Satır ve mountant bir damla ya da iki içinde aynı yönde beden duvarları yerleştirin. Daha sonra şeffaf tırnak cilası ile slayt mühür, hava kabarcıkları üretmek için değil hazırlık alarak bakım üzerinde 22 mm x 40 mm lamel yerleştirin. </li><li> Konfokal görüntüleme için hazır olana kadar -20 ° C'de karanlıkta slaytlar saklayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Woods, D. F., Bryant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discs-large+tumor+suppressor+gene+of+Drosophila+encodes+a+guanylate+kinase+homolog+localized+at+septate+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions.</a> Cell. 66, 451-464 (1991).</li>
<li>Yamanaka, T., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Lgl%2FDlg%2FScribble+in+the+regulation+of+epithelial+junction%2C+polarity+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth.</a> Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).</li>
<li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble%2FDlg%2FLgl+polarity+module%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).</li>
<li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13, 823-835 (1994).</li>
<li>Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolding+proteins+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).</li>
<li>Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+as+a+model+for+scaffold+complexes+at+glutamatergic+synapses%3A+benefits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations.</a> J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).</li>
<li>Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adducin%3A+structure%2C+function+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Adducin: structure, function and regulation.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+adducin+regulates+Dlg+phosphorylation+and+targeting+of+Dlg+to+the+synapse+and+epithelial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane.</a> Dev Biol. 357, 392-403 (2011).</li>
<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+staining+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+Laboratory+Manual%22">Drosophila: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (1989).</li>
<li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+postsynaptic+structure+and+protein+localization+by+the+Rho-type+guanine+nucleotide+exchange+factor+dPix%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix.</a> Neuron. 32, 415-424 (2001).</li>
<li>Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ovhts+polyprotein+is+cleaved+to+produce+fusome+and+ring+canal+proteins+required+for+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis.</a> Development. 134, 703-712 (2007).</li>
<li>Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hts%2FAdducin+controls+synaptic+elaboration+and+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination.</a> Neuron. 69, 1114-1131 (2011).</li>
<li>Spradling, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Berkeley+Drosophila+Genome+Project+gene+disruption+project%3A+Single+P-element+insertions+mutating+25%25+of+vital+Drosophila+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes.</a> Genetics. 153, 135-177 (1999).</li>
<li>Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+p21-Activated+Kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biology of the p21-Activated Kinases.</a> Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).</li>
<li>Bahri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+leading+edge+during+dorsal+closure+as+a+model+for+epithelial+plasticity%3A+Pak+is+required+for+recruitment+of+the+Scribble+complex+and+septate+junction+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation.</a> Development. 137, 2023-2032 (2010).</li>
<li>Albin, S. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+structural+and+functional+synapse+development%3A+postsynaptic+p21-activated+kinase+independently+specifies+glutamate+receptor+abundance+and+postsynaptic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology.</a> J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).</li>
<li>Koles, K., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+neuromuscular+junction+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in neuromuscular junction development.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li>
<li>Packard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Wnt%2C+wingless%2C+provides+an+essential+signal+for+pre-+and+postsynaptic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.</a> Cell. 111, 319-330 (2002).</li>
<li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assays%3A+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).</li>
<li>Thymiakou, E., Episkopou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+signaling+effector-complexes+downstream+of+bmp4+using+PLA%2C+a+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Maglione, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+forest+tree+by+tree%3A+super-resolution+light+microscopy+meets+the+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences.</a> Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-regulated+Drosophila+adducin+is+a+determinant+of+synaptic+plasticity+in+a+complex+with+Dlg+and+PIP2+at+the+larval+neuromuscular+junction%0A++%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Open%22%5BJournal%5D)">Phospho-regulated Drosophila adducin is a determinant of synaptic plasticity in a complex with Dlg and PIP2 at the larval neuromuscular junction
 .</a> Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu rapor PLA Drosophila larva NMJ uygulanabilir gösterilmiştir. Deney NMJ endojen protein-protein etkileşimlerini tespit etmek amacıyla larva vücut duvarı kaslarında gerçekleştirilir. Bu teknik ile, Dlg ve Hts birbirine yakın olması ve bu nedenle, özellikle postsinaptik bölge 27&#39;de, bir kompleks içinde bulunması gösterilmektedir. Bu sonucun desteklemek, bir önceki çalışmada aşağıdaki verileri ile dernek kanıtlar sunmuştur: Dlg ve Hts immünoreaktif dağılımları larva NMJs postsinaptik bölgede üst ü...

Büyük Drosophila Diskler (DLG), plazma membranının belirli bölgelerde büyük protein komplekslerinin montaj orkestra yardımcı proteinleri iskele ve zara bağlı guanilat kinaz ailesinin bir korunmuş üyesidir. Bir tümör baskılayıcı protein, Dlg epitel apicobasal polarite 1,2,3 önemli bir belirleyicisi olarak hizmet gibi Başlangıçta belirledi. Dlg da larva gelişimi 4 sırasında glutamaterjik motor nöron nöromüsküler bileşke (NMJ) bir ana iskele modülü olarak hizmet vermektedir. Dlg larva NMJ farklı roller oynar ve onun pleyotropizm birden proteinler 5,6 ile ilişkilendirmek için kendi yeteneklerine bağlıdır. Böyle bir protein, Hu-Li Tai shao (HTS), esas olarak, 7 hücre iskeleti aktin-spektrin düzenlemedeki rolleri ile ilgili olarak tarif edilmiştir, memeli adducins bir homologudur. Daha önce Dlg ve Hts, in vitro göre birbirleri ile bir kompleks meydana getirebilir gösterilmiştir </em&gt; Bütün yetişkin sinek lizatlarını 8 içeren ko-immünopresipitasyon deneyleri. Bu sonuçların bir eksiklik, ancak, bu karmaşık formlar göstermemektedir olmasıdır. Immünhistokimyasal kullanımı ile, Dlg ve Hts dağılımları larva NMJs postsinaptik membran üst üste görülmektedir, ancak bu bölgede 8 bir kompleks vardır? Son zamanlarda gösterilen ve daha burada ayrıntılı olarak, Proximity ligasyon Testi (PLA) larva NMJ 27 de özellikle Dlg ve Hts arasındaki in situ dernek bir bakmak için kullanılır. PLA çok yerinde 9, protein-protein etkileşimlerini tespit edebilir, hücre ve doku kültürü içinde kullanılan nispeten yeni bir tekniktir. Bu deneyde, ilgi konusu iki protein karşı birincil antikor türe spesifik antikorlarla bir çift tespit edilir, oligonükleotidlere konjüge olduğu PLA problar olarak adlandırılan (Şekil 1A, B). İki protein halindes, bağlı PLA sondaları arasındaki mesafe iki ek bağlayıcı oligonükleotidler (Şekil 1C) melezlenmesi ile köprülenebilir (nanometre bir kaç on içindeki) birbirine yakın temas içindedir. Bu uyum, bağlayıcı oligonükleotidler serbest uçları, her biri bir diğeri ile temas için yeterince yakın olan ve bir kapalı dairesel bir DNA molekülü, in situ ligasyon (Şekil 1D) üzerine oluşturulabilir. dairesel bir DNA molekülü PLA probları (Şekil 1E) konjüge edilmiş oligonükleotidlerin bir kişi tarafından hazırlanmış olan yerinde yuvarlanan çember amplifikasyonu için bir şablon olarak hizmet vermektedir. Elde edilen çoğaltılmış, concatemeric DNA ürününün içinde sekanslar daha sonra floresan etiketli tamamlayıcı oligonükleotid prob (Şekil 1F) ile görselleştirilebilir. Yükseltilmiş DNA PLA problarının bir protein-protein etkileşimi withi hücre içi lokalizasyonu bağlı kalır yanana doku kolayca tespit edilebilir. Çeşitli yöntemler yaygın olarak, ko-immünopresipitasyon olarak in vitro teknikler de dahil olmak üzere protein-protein etkileşimlerini tespit (-aşağı çekme deneyleri ve maya iki-hibrid eleme ve bu Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) ve Biyomoleküller Floresan tamamlama gibi in vivo teknikler kullanılır BiFC). In vitro teknikler hatadır etkileşimi endojen nerede oluştuğunu Anılan in vivo teknikleri kendi endojen meslektaşları yerli davranışını yansıtmıyor olabilir füzyon proteinlerinin yapay ifadesini içerir iken onlar, tespit kalmamasıdır. PLA bir avantaj da FR karşılaştırılabilir olan bir sinyal üretmek için gerekli olan yakınlık derecesine sahip, bir doku içinde, birbirine çok yakın olan ve büyük olasılıkla bir kompleks oluşturan endojen protein uygulayıcı hücre içi lokalizasyonu belirleme kapasitesine sahip olmasıdırET ve BiFC. PLA nedeniyle antikor tanıma ve DNA amplifikasyonu bağlanması yüksek özgüllük ve duyarlılık ile etkileşimleri algılayabilir. Böylece, tahlil etkileşim kesin konumunu ortaya puncta şeklinde ayrık, parlak sinyaller üretebilir. Buna ek olarak, zor görülen antijenler tespit edilebilir. Son olarak, PLA gerçekleştirmek için nispeten basit bir tekniktir ve tamamlamak için standart bir immünohistokimyasal prosedürde daha uzun sürer. Bu nedenle, PLA genellikle uzun hazırlık süreleri ve kapsamlı sorun giderme ile boğulmuş diğer protein-protein etkileşimleri deneyleri üzerinde bir teknik avantaj sağlar. Bu protokol, PLA yerinde endojen protein-protein etkileşimlerini tespit etmek amacıyla, Drosophila larva NMJ uygulanabilir gösterilmiştir. Burada, PLA Dlg ve Hts gerçekten NMJs postsinaptik bölgede bir kompleks var olduğu gösterilmiştir larva vücut duvarı kas hazırlıkları yapılır. PLA önce larva NMJ incelemek için kullanılan olmamıştır, ve Drosophila dokusunda bu testte kullandık yayınlanan bildiri sadece bir avuç şu anda vardır. Bu Drosophila topluma PLA daha pozlama başka, daha yaygın olarak kullanılan protein-protein etkileşimleri deneyleri tamamlamak için ek bir araç olarak artan kullanımı neden olacağı ümit edilmektedir.

<table><tbody><tr><td>Forseps (ince # 5)</td> <td>Almedic</td><td>A10-704</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Disc</td><td>World Hassas Aletler</td><td>SYLG184</td><td>Elastomer tabanı ve kürleme maddesini 10:1 oranında karıştırın. 30 dk için ayarlayın. Bir kalıba dökün (örn. 12 oyuklu bir hücre kültürü plakası kullanın). En az 24 saat kürlenmeye bırakın. Diseksiyon sırasında 60 x 15 mm'lik bir Petri kabı kapağının kapağına yapıştırın.</td></tr><tr><td>Minutien Pimleri (0.0125&nbsp; mm uç çapı)</td><td>İnce Bilim Aletleri</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodiseksiyon Makası (ultra ince)</td><td>İnce Bilim Aletleri</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>Platform Slaytları</td><td></td><td></td><td>İki adet 22 x 22 mm2 lamelleri şeffaf oje ile bir mikroskop lamı üzerine yapıştırın, bir < Numune montajı için arada 20 mm boşluk.</td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>3605</td><td></td></tr><tr><td>hts01103</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>10989</td><td>Hisse senedi, bir GFP dengeleyici üzerinde yeniden dengelendi, böylece homozigot mutantlar GFP sinyalinin yokluğuna bağlı olarak seçilebilir.</td></tr><tr><td>1x PBS (Fosfat Tamponlu Salin): 3&nbsp; mM NaH2PO4, 7&nbsp; mM Na2HPO4, 130&nbsp; mM NaCl, pH 7.0</td><td></td><td></td><td>NaH2PO4 (Caledon Laboratuvarları - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>Bouin'in Çözümü</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132</td><td></td></tr><tr><td>%4 PFA (Paraformaldehit): 1x PBS'de %4 PFA</td><td></td><td></td><td>PFA (Anakimya Bilimi - 66194-300). Çözümün nasıl yapılacağına ilişkin talimatlar için doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006'ya bakın.</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>1x PBT (Tritonlu Fosfat Tamponlu Salin): %0.01 Triton</td><td></td><td></td><td>Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)</td></tr><tr><td>%1 BSA (Sığır Serum Albümini) ile 1x PBS: 1x PBT</td><td></td><td></td><td>BSA'da %1 BSA (Bioshop Canada - ALB001). 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>fare anti-Dlg (Büyük diskler)</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hybridoma Bank</td><td>4F3</td><td>%1 BSA'da 1:10 seyreltmede kullanın.</td></tr><tr><td>tavşan anti-HtsM (Hu-li tai shao)</td>Dr. Lynn Cooley (Yale Üniversitesi) <td></td><td></td><td>tarafından sağlanmıştır. % 1 BSA'da 1:250 seyreltmede kullanın.</td></tr><tr><td>tavşan anti-Pak (p21 ile aktive edilmiş kinaz)</td>Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser Üniversitesi) <td></td><td></td><td>tarafından sağlanmıştır. % 1 BSA'da 1:500 seyreltmede kullanın.</td></tr><tr><td>fare anti-Wg (Kanatsız)</td> <td>Gelişimsel Çalışmalar Hybridoma Bank</td><td>4D4</td><td>%1 BSA'da 1:5 seyreltmede kullanın.</td></tr><tr><td>keçi anti-Hrp (Yaban turpu peroksidaz)</td><td>Jackson&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ImmunoResearch</td><td>123-065-021</td><td>% 1 BSA'da 1:200 seyreltmede kullanın.</td></tr><tr><td>FITC konjuge eşek anti-keçi</td><td>Jackson&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ImmunoResearch</td><td>705-095-003</td><td>% 1 BSA'da 1:200 seyreltmede kullanın.</td></tr><tr><td>Duolink Yerinde PLA Probu anti-fare EKSİ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Yerinde PLA Probu anti-tavşan ARTI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Yerinde Algılama Reaktifleri Kırmızı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92008</td><td></td></tr><tr><td>1x Yıkama Tamponu A: 0.01&nbsp; M Tris, 0.15&nbsp; M NaCl, %0.05 Tween 20, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)</td></tr><tr><td>1x Yıkama Tamponu B: 0.2&nbsp; M Tris, 0.1&nbsp; M NaCl, pH 7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>0.01x Yıkama Tamponu B: 2&nbsp; mM Tris, 1&nbsp; mM NaCl, pH 7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratuvarları - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr>DAPI <td>Sigma-Aldrich</td> <td>ile Duolink Yerinde Montaj Ortamı</td><td>DUO82040</td><td></td></tr></tbody></table>

algılama in situ protein-protein kompleksleri drosophila larva nöromüsküler junction

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg), membranla ilişkili guanilat kinaz ailesinin korunmuş bir üyesidir ve Drosophila'daki larva nöromüsküler kavşakta (NMJ) ana iskele proteini olarak görev yapar. Önceki çalışmalar, Dlg'nin larva NMJ'deki postsinaptik dağılımının, memeli addusinlerine bir homolog olan Hu-li tai shao'nunkiyle (Hts) örtüştüğünü göstermiştir. Ek olarak, Dlg ve Hts'nin, tüm yetişkin sinek lizatlarını içeren ko-immünopresipitasyon deneylerine dayanarak birbirleriyle bir kompleks oluşturduğu gözlenmiştir. Bununla birlikte, bu deneylerin doğası gereği, bu kompleksin larva gelişimi sırasında özellikle NMJ'de var olup olmadığı bilinmiyordu.
Proximity Ligation Assay (PLA), protein-protein etkileşimlerini yerinde tespit edebilen, daha çok hücre ve doku kültüründe kullanılan yeni geliştirilmiş bir tekniktir. Bu tahlilde, numuneler, standart immünohistokimyasal prosedürler kullanılarak ilgilenilen iki proteine karşı birincil antikorlarla inkübe edilir. Birincil antikorlar daha sonra, PLA probları olarak adlandırılan, özel olarak tasarlanmış bir oligonükleotid konjuge ikincil antikor çifti ile tespit edilir ve bu, yalnızca iki prob birbirine yakın bağlandığında bir sinyal üretmek için kullanılabilir. Böylece, bir kompleks içinde bulunan proteinler görselleştirilebilir. Burada, PLA'nın Drosophila larva NMJ'sindeki in situ protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir. Teknik, NMJ'lerin postsinaptik bölgesinde Dlg ve Hts arasında bir kompleksin gerçekten var olduğunu göstermek için larva vücut duvarı kas preparatları üzerinde gerçekleştirilir.

Yabani tip Üçüncü dönem larva NMJs ise, Dlg ağırlıklı tipi boutons mı daha Dlg immünoreaktivite düzeyleri tip Ib boutons daha belirgin olmak, tip I glutamaterjik boutons postsinaptik membranda bulunan (Şekil 3A) 4. Hts kas boyunca mevcut ama Hts immünoreaktivite düzeyleri hem tip I boutons eşit görünen ile postsinaptik bölgede yoğunlaşır ve aynı zamanda (Şekil 3A ') 8,17 presynaptically bulunur. Dlg ve Hts dağılımları ölçüde postsinaptik bölgede (Şekil 3A '...

Bu protokol Proximity ligasyon Testi Drosophila larva nöromüsküler kavşakta yerinde protein-protein etkileşimleri tespit etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. Bu teknikle, Diskler, büyük ve Hu-li tai shao postsinaptik bölgede bir kompleks, daha önce birlikte immunoprecipitation ile tespit dernek kurma gösterilmiştir.

Algılama In Situ Protein-protein kompleksleri Drosophila Larva Nöromüsküler Junction

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, drosophila larva NMJ'deki endojen protein protein etkileşimlerinin hücre altı lokalizasyonunu tespit etmektir. Bu, ilgilenilen iki proteine karşı birincil antikorlara bağlanan PLA probları olarak adlandırılan bir çift oligonükleotid konjuge ikincil antikor kullanılarak immünofloresan gerçekleştirilerek elde edilir. Daha sonra, PLA probları arasındaki boşluk, iki konektör oligonükleotidinin hibridizasyonuyla köprülenir.Sadece iki protein birbirine yakın olduğunda ve in situ ligasyon üzerine kapalı dairesel bir DNA molekülü oluştuğunda, daha sonra tamamlayıcı floresan etiketli oligonükleotidlerle tespit edilen kapalı dairesel DNA molekülü içindeki dizileri amplifiye etmek için in situ yuvarlanan daire amplifikasyonu gerçekleştirilir. Bu nedenle, her bir amplifikasyon ürününden üretilen elde edilen floresan sinyali, konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülendiğinde belirgin bir parlak nokta olarak kolayca görülebilir. Bu nedenle, bu tekniğin E iki hibrit çökeltme ve tehdit gibi diğer mevcut yöntemlere göre ana avantajı, PLA'nın doku içinde birbirine yakın lokalize olan ve muhtemelen bir kompleks oluşturan endojen proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu tespit edebilmesidir.Bu yöntem, özellikle de larva ve mj'de meydana gelen protein-protein etkileşim ağları hakkında bilgi sağlar. Ayrıca diğer jolo sistemlerine de uygulanabilir. Embriyolarda ve hayali disklerde epitel dokuları önerin.Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan iki teknisyen olan Hel Yu ve Ha King olacak. Drosophila kültürlerini beş ila altı gün boyunca 25 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, larvaları yıkamak için şişelerden veya şişelerden sürünen üçüncü instar larvalarını toplamak için ince forseps kullanın. Bunları PBS içeren küçük bir Petri kabına aktarın.Daha sonra yıkanmış larvalardan birini bir S puro diskine yerleştirin ve onu engellemek için birkaç damla buz gibi soğuk PBS'ye batırın, böylece manipüle etmeyi kolaylaştırın. Larvaları, sırt tarafı yukarı bakacak şekilde, iki trakeal iz diseksiyon mikroskobu altında görünecek şekilde konumlandırın. Daha sonra, bir mnuchin pimini kavramak için forsepsleri kullanarak, larvaları spirallerin yakınındaki arka uçta sıkıştırın, başka bir pimle ağız kancalarının yanındaki ön uçtaki kütikülü delin ve larvaları sabitlemeden önce uzunlamasına hafifçe gerin.Daha sonra, mikro diseksiyon kullanarak, makas küçük bir açıklık oluşturmak için arka ucu pimin yakınında sıkıştırır, kesi sadece kütikülden geçecek kadar yüzeysel olmalıdır. Daha sonra makasın alt bıçağının ucunu insizyona yerleştirin ve alttaki kaslara zarar vermemek için makas bıçaklarını hafifçe yukarı doğru tutarken, iki trakeal yol arasındaki dorsal orta hattın tüm uzunluğu boyunca kesin. Şimdi, kütikülün hemen içinden, arkaya yerleştirilen pimin biraz önünde küçük bir yatay kesi yapın.Ardından, öne yerleştirilen pimin hafifçe arkasında benzer bir kesi daha yapın. Larva gövdesine birkaç kuvvetli damla PBS ekledikten sonra, iç organları dikkatlice temizlemek için forsepsleri kullanın. Vücuda zarar vereceği için larva gövdesini dürtmekten kaçının.Duvar kasları larva gövdesini açar ve köşeleri aşağı sabitlemek için vücut duvarını hem yatay hem de dikey olarak gererek eşit şekilde gerilmiş bir dikdörtgen oluşturur. Dokuyu sabitlemek için yapılan işlemlerde vücut duvarı kaslarını yırtmamaya özen göstermek. Sabitlenmiş vücut duvarlarını birkaç damla boan çözeltisine batırın ve sabitlemeyi takiben 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.Dokuyu üç kez durulamak için PBT kullanın. Daha sonra reaktiflerden tasarruf etmek ve test sırasında tüm vücut duvarlarının eşit şekilde muamele görmesini sağlamak. Onları ayırt etmek için her genotipin köşelerini farklı şekilde kesin.Pimleri ince forsepslerle çıkardıktan sonra, hepsini aynı silikonlu, 0.65 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Dokuya nüfuz etmek için, vücut duvarlarını her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkamak için PBT kullanın. Son yıkamayı çıkardıktan sonra, numuneleri bloke etmek için %1 BSA ekleyin ve bir saat inkübe edin.İmmünokstain'in yanında, vücut duvarları, ilgilenilen iki proteine karşı fare ve tavşan birincil antikorları ekler ve iki saat boyunca inkübe eder. Bu durumda, %1 BSA'da bir ila 10 fare anti DLG ve bir ila 250 tavşan anti HTS kullanılır. İnkübasyondan sonra belirteçlere karşı antikorlar da eklenebilir.Vücut duvarlarını her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkamak için PBT kullanın. Daha sonra% 1 BSA'daki herhangi bir belirteçlere karşı floro dört etiketli ikincil antikor ekleyin ve ertesi sabah gece boyunca karanlıkta dört santigrat derecede inkübe edin. Vücut duvarlarını her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkamak için PBT kullanın.Teste en az 200 mikrolitrede bir ila beş seyreltme ile başlamak için. Vücut duvarlarına% 1 BSA'da hem PLA probu, hem anti fare eksi hem de PLA probu anti tavşan artı'nın toplam hacmi, vücut duvarlarını iki kez beş dakika boyunca yıkamak için yıkama tamponu A'yı kullandıktan sonra 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Kuluçka işleminden sonra 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Amplifikasyon çözeltisine bir ila 80 polimeraz seyreltmesi eklemeden önce vücut duvarlarını her biri iki dakika boyunca iki kez yıkamak için yıkama tamponu A'yı kullanın.Numuneleri görüntülemeye hazırlamak için 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Gövde duvarlarını her biri 10 dakika boyunca iki kez yıkamak için yıkama tamponu B'yi kullanın. Ardından, bir dakika boyunca son bir yıkama yapmak için 100 x seyreltme yıkama tamponu B kullanın.İnce forseps kullanarak vücut duvarlarını en az 30 dakika boyunca birkaç damla montaj solüsyonunda dengeleyin. Gövde duvarlarını, kütikül aralıkları aşağı bakacak şekilde dikkatlice bir platform kızağına aktarın. Bunları, bir veya iki damla montaj çözeltisi içinde aynı yönde sıralar halinde yerleştirin.Hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat ederek müstahzarın üzerine 22 milimetreye 40 milimetrelik bir kapak kızağı yerleştirin. Ardından slaytı kapatmak için şeffaf oje kullanın. Slaytları konfokal görüntüleme için hazır olana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın.Burada yabani tip larva njs'de gösterildiği gibi, DLG ağırlıklı olarak tip bir glutamaterjik bhuton'un postsinaptik membranında bulunur ve seviyeler tip bir B'de tip bir'den daha belirgindir S bs HTS kas boyunca bulunur, ancak postsinaptik membranda yoğunlaşır ve seviyeler her iki tip bir Bhuton'da eşittir, DLG ve HTS, bir kompleks içinde DLG ve HTS'nin var olup olmadığını belirlemek için postsinaptik bölgede büyük ölçüde örtüşür. N-M-J-P-L-A'da burada görüldüğü gibi anti DLG ve anti HTS antikorları ile yapıldı. İki protein arasındaki PLA sinyali, özellikle vahşi tip NMJ'de gözlenir, sinyal çoğunlukla HRP ile işaretlenmiş presinaptik membrana çevresel olarak lokalize olur.Bu nedenle, DLG ve HTS birbirine yakındır ve muhtemelen post-sinaptik bölgede bir kompleks oluşturur. Sonuç, eksik olan HTS mutantlarını içeren negatif bir kontrol olarak spesifiktir. HTS İmmünoreaktivitesi gözlemlenebilir bir PLA sinyali göstermez, BNS'nin yüksek büyütme görüntüleri, DLG ve HTS İmmünoreaktivitesinin post-sinaptik membranda büyük ölçüde örtüştüğünü gösterir.Buna karşılık, iki protein arasındaki PLA, toplam DLG ve HTS proteinlerinin yalnızca bir alt kümesinin kompleks içinde olduğunu gösteren ayrı PUNCTA ile sonuçlanır. Bu tekniğin tamamlanması standart bir immünohistokimyasal prosedürden daha uzun sürmez. Bu videoyu izledikten sonra, larva NMJ'de meydana gelen endojen protein protein etkileşiminin hücre altı lokalizasyonunu tespit etmek için PLA'nın nasıl kullanıldığını iyi anlamış olmalısınız.

detection-situ-protein-protein-complexes-at-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada kemik morfogenetik protein (BMP) sabit hücreler sinyal görselleştirmek için antikor kombinasyonu ile yakınlık ligasyon Assay (PLA), nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu teknik bize BMP4 uyarımı altında efektör-kompleksleri aktif endojen BMP nükleer birikimi takip etmek ve zaman içinde bunların seviyelerini ölçmek için izin verdi.

Efektör-Kompleksleri kullanarak BMP4 Mansabında Sinyal Algılama In situ PLA, Proximity ligasyon Testi

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

Bu video, nematod hücrelerinde in situ protein-protein etkileşimlerini incelemek için yakınlık ligasyon testini açıklar. İlgilenilen proteinlerin yakınlığı, ikincil bir antikora bağlı bir PLA probu yardımıyla dairesel DNA şablonunu oluşturur. Prob, hücrelerde protein-protein etkileşimlerinin lokalizasyonunu sağlayan uzun tek sarmallı bir DNA ve ardından dedektör probunun hibridizasyonunu üreten amplifikasyon çözeltisi kullanılarak daha da büyütülür.

Yerinde Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Yakınlık Ligasyon Testi

Bu video, Yakınlık Ligasyon Testi (PLA) kullanılarak Drosophila nöromüsküler kavşakta (NMJ) protein-protein etkileşimlerinin görselleştirilmesini göstermektedir. Vücut duvarlarını izole ettikten sonra, etkileşen proteinler birincil antikorlar ve PLA ile konjuge ikincil antikorlar ile incelenir. Etkileşen proteinlerin yakınlığı, probların konektör oligonükleotidleri ile bağlanmasını kolaylaştırır, dairesel DNA oluşturur ve bu daha sonra yuvarlanan daire amplifikasyonu ile amplifiye edilir.

Drosophila Larvalarında Protein-Protein Etkileşimlerinin Yakınlık Ligasyon Testi Kullanılarak Saptanması

Burada, sabit hücrelerde endoplazmik retikulum ve mitokondri arasındaki endojen etkileşimleri görselleştirmek ve yüksek hassasiyet ile ölçmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Protokol, bir mitokondri ilişkili zar arayüzünde inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü / glukoz-regüle proteini 75 / voltaj bağımlı anyon kanalı / siklofilin D kompleksi hedefleyen in situ yakınlık ligasyonu deneyinde optimize özellikleri.

Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi Sabit Hücrelerde

Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) 'nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

İşte, bir yakınlık ligasyonu tahlil (PLA) ile yüksek hassasiyet MST1/MST2 heterodimerization sabit hücrelerdeki görselleştirmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

Bu protokol, C. elegans germline yerinde protein-protein etkileşimleri için prob yakınlık ligasyon test kullanımını göstermektedir.

Yakınlık Ligasyon Tayini kullanılarak C. elegans Germline Ribonükleoprotein Kompleksi Montaj Yerinde Algılama

DetectSyn, tedaviler veya hastalık durumları arasında göreceli sinaps (sinaptik öncesi ve sonrası) sayısındaki değişiklikleri ölçen tarafsız, hızlı bir floresan testidir. Bu teknik, hem kültürlü nöronlarda hem de sabit dokuda kullanılabilen bir yakınlık ligasyonu tekniği kullanır.

DetectSyn: Sinaps Yoğunluğundaki Değişiklikleri Tespit Etmek için Hızlı, Tarafsız Bir Floresan Yöntemi

Burada, nöromüsküler kavşaklar ve kas hücrelerindeki mikrotübül ağlarını görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Drosophila melanogaster'in güçlü genetik araçlarıyla birleştiğinde, bu protokol, sinir sistemindeki mikrotübül ağı düzenleyici proteinlerin rolü için genetik taramayı ve mikrotübül dinamiği analizini büyük ölçüde kolaylaştırır.

Mikrotübül Ağını Görselleştirmek için Drosophila Larva Nöromüsküler Kavşak ve Kas Hücrelerini Kullanma

Öğrenin Drosophila larva nöromüsküler kavşakta protein-protein etkileşimlerini yerinde tespit etmek için Proximity Ligation Assay yöntemini. Bu teknik sinaptik organizasyonu anlamak için değerlidir.

Algılama In Situ Protein-protein kompleksleri Drosophila Larva Nöromüsküler Junction

Daha fazla video keşfet