Name: Alt klonlama Artı Ekleme (SPI) - Gen Hedefleme Vektörler Rapid İnşaat için Yeni Bir Yöntem Recombineering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Öğrenin, E. coli'de alt klonlama artı ekleme (SPI) yöntemiyle gen hedefleme vektörlerinin hızlı inşasını. Bu teknik, tek bir reaksiyonda vektör oluşturarak transgenik model geliştirmeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

T.R.R projeyi tasarladı, deneyler tasarlayıp gerçekleştirdi ve el yazmasını hazırladı. E.J.K ve S.E.M deneyler yaptı. Tüm yazarlar son el yazmasına entelektüel olarak katkıda bulundular. Bu çalışma, Leicester Üniversitesi SEM'e İnovasyon Bursu ve SMC'ye Birleşik Krallık Tıbbi Araştırma Konseyi (MRC) Kıdemli Araştırma Bursu (MR / J009202 / 1) tarafından finanse edilmiştir. DNA dizilimi, Leicester Üniversitesi, Çekirdek Biyoteknoloji Hizmetleri Merkezi, Protein ve Nükleik Asit Laboratuvarları (PNACL) tarafından gerçekleştirildi. Rox ve Dre plazmitlerini sağladığı için A. Francis Stewart'a teşekkür etmek istiyoruz. pL451 ve pL452 plazmitleri Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI), Frederick, ABD'den elde edildi.

Tasarım Hedefleme 1. Gen <ol style="margin-left: 40px;"><li> Ilgi genomik bölgeyi kapsayan uygun bir BAC klonu Sipariş. Bu, örneğin değiştirilebilir ES hücre tipine izogenik olduğundan emin olun, gen için RPCI-23 ve RPCI-24 BAC klonları, C57BL / 6 ES hücreleri hedefleme. </li><li> Hedefleme vektör tasarımı hedefleme ölçütlerini geleneksel geni uygulayın. Anahtar parametreler değişiklik intronik kasetleri bir gen nakavt stratejisi ve aralık ve yerleştirme silinmek üzere kritik eksonları (CE) tanımlayan, kurucu veya koşullu olarak gerekli olup olmadığını içerir. NOT: Bu her yerde, 10 ayrıntılı olarak ele alınmıştır. </li><li> Hedef modifikasyon sitesi kuşatan 5-6 kb Her genomik bölgeleri seçin. NOT: Üst limit p15A gibi plazmid subklonlama düşük kopya ile 80 kb gibi yüksek olabilir, ancak alt klonlanmış insert büyüklüğü, bu nedenle genellikle 10-12 kb, pBR322 vb bir BAC ile 200 kbVektör. </li></ol> 2. Multiplex Recombineering Oligolar <ol style="margin-left: 40px;"><li> Plazmid omurgasından (alt klonlama plazmid) ve seçilebilir bir marker (yerleştirme kaset) için tasarım oligolar. 180 bp&#39;lik bir HA yan genomik hedef alan ve ekleme kaset ya da alt-klonlama plazmid (Şekil 2) spesifik hazırlama dizisinin 20 bp içerir, öyle ki her bir oligo tasarlar. Not: Homoloji kolları herhangi bir tekrar eden elemanları içermemelidir, tekrar eden elemanın varlığı, yanlış hedefleme ve alt-klonlama neden olur. Tekrarlanan unsurlar gibi &#39;&#39; Masker tekrarlayın &#39;gibi web tabanlı araçları kullanılarak tespit edilebilir. </li><li> ES hücresi (Şekil 2) hedefleme için gen hedefleme vektörü lineer bir vektör oligo biri benzersiz bir sınır enzimi (RE) sitesi içerir. </li><li> Bir oligo analizör programı kullanılarak oligo parametrelerini kontrol edin. Hazırlama bölgede ikincil yapıları önlemek için özens. </li><li> Ekleme kasetinin kısa HA (50 bp), tolere edilen ve yeniden bileşenler alt numarasını verir, ancak alt-klonlama plazmid HA daha uzun (180 bp), her zaman temin edilmektedir. </li><li> &#39;&#39; CloneDB &#39;&#39; gibi web tabanlı araçları kullanarak belirli BAC klonu genomik DNA ucun yönünü belirleyin. BAC kütüphane yapımında kullanılan BAC plazmid omurgası haritasını kontrol ederek Oris gelen çoğaltma yönünü oluşturulması. Not: ORIS yaygın olarak kullanılan tüm BAC plasmidler için Kloramfenikol (Chl) marker transkripsiyon yönüne zıt genellikle. </li><li> BAC klonu üzerinde replikasyon yönüne zıt olan oligo 5 &#39;ucuna iki uç fosforotioat (PTO) bağlar ekleyin. Ters oligo (Şekil 2) bir 5 &#39;fosfat modifikasyonu ekleyin. NOT: Kırmızı sindirim üzerine asimetrik phosphorothioated PCR kaset ki can başbakan kalmış iplik bir ssDNA ara üretirreplikasyon çatalının. NOT: Maksimum multipleks rekombinasyon frekansı gecikmeli iplikçik korumalı kasetleri ile görülmektedir. Lider iplik korumalı veya çift korumalı kasetleri bazı loci eşdeğer rekombinasyon verimliliği üretmek olmayabilir. </li><li> PAGE veya HPLC saflaştırma ile oligoları Sipariş. </li></ol> PSC101 BADgbaA Recombineering Plazmid 3. BAC klon dönüştürülmesi. <ol style="margin-left: 40px;"><li> E. yapmak için yetkin BAC Recombineering taşıyan E. coli suşu, Kırmızı genlerini içeren 16 pSC101 BADgbaA plazmid ile dönüşümü. Not: pSC101 BADgbaA plazmid arabinoz uyanlabilir araC&#39;nin p kötü promoteri, bir tetrasiklin, seçim işaretleyicisi ve sıcaklığa duyarlı pSC101 replikon kontrolü altında kırmızı ve RecA gen içermektedir. <ol><li> BAC Agar kültür içinde bir steril pipet bıçakla ve lizojeni suyu 5.0 mi inoküle (LB) 12,5 ihtiva eden, pH 8.056 g mi -1 Chl. 5 saat 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de büyütülmüştür. </li><li> % 10 (h / h) gliserol çözeltisi, mikrosantrifüj tüpleri ve buz üzerinde elektroporasyon küvetler soğutun. 4 ° C&#39;ye kadar soğutulmuş bir büyük santrifüj ve mikrosantrifüj soğutun. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, kültürün optik yoğunluğu (OD) tespit edilmesi ve 600 nm&#39;de absorbans ölçümü. 0,3-0,8 olan bir OD 600 okuma ulaşıldığında (aşağıda tarif edildiği gibi), elektro-hücre hazırlayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1216 x g&#39;de büyük santrifüj içinde bir 50 mL santrifüj tüpüne hücreleri dönerler. </li><li> Soğutulmuş% 10 gliserol, 1 ml hücre yıkayın ve 4 ° C&#39;de 20 saniye 17949 x g&#39;de hücreleri aşağı dönerler. Yıkama 3 kez toplam adım gerçekleştirin. </li><li> % 10 gliserol, 50 ul toplam hacim içinde hücrelerin yeniden süspanse edin ve pSC101 BADgbaA Recombineering plazmid 10-200 ng ekleyin. Pipetleme ile tek bir hücre süspansiyonu elde ediliryukarı ve birkaç kez aşağı ve daha sonra önceden soğutulmuş 1 mm&#39;lik bir açıklık elektroporasyon küvetine hücreleri aktarın. </li><li> 1.8 kv, 25 jxF ve 200 Ω bir ortamda hücreleri electroporate. NOT: elektroporatörü her marka için doğru ayarları kontrol edin. En az 4 elektroporasyon bir zaman sabiti tuz ve diğer yabancı maddelerin varlığına işaret etmektedir. </li><li> Hemen LB 1 ml hücreleri kurtarma ve 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne hücreleri aktarın. </li><li> 2 saat 200 rpm&#39;de çalkalanarak 30 ° C&#39;de BAC gbaA kültür büyütün. Not: hücreler, sıcaklığa duyarlı REPE çoğaltma faktörünün etkinliğinin durdurulmasına 37 ° C&#39;de büyütüldüğünde elde pSC101 BADgbaA plazmid kaybolur. Recombineering fonksiyonlarını korumak için 30 ° C&#39;de gbaA hücreleri büyütün. </li><li> 12.5 mikrogram ml -1 Chl ve 4 mg ml -1 Tetrasiklin (Tet) kazanılan BAC gbaA kültürüne içeren LB 9 ml ekleyin. BüyümekBAC gbaA kültür O / N 30 de &#160; ° C, 200 rpm &#39;de çalkalanarak. Not: süper sarılmış gbaA plazmidi elektroporasyon bir dönüşüm etkinliği, sıvı ortamda doyma büyüme O / N olanak sağlamak üzere yeterince yüksektir. </li></ol></li></ol> Yerleştirme Kasetleri ve Altklonlaması Plazmidlerinin 4. Hazırlık <ol style="margin-left: 40px;"><li> Aşağıda tarif edildiği gibi, uzun modifiye oligolar kullanılarak (PCR), ekleme kaset (ler) ve alt-klonlama plazmid içine HA dahil polimeraz zincir reaksiyonu yapmak. <ol><li> İsteğe bağlı: Recombineering reaksiyonu içine plazmid taşınmasını önlemek için, ekleme kasetini yükseltmek için R6K kökeni veya benzeri dar ana aralığı plazmid şablonu kullanın. </li><li> Seçenek olarak ise, bir RE digest (Tablo 2) kullanılarak plazmid şablonu linearize. PCR amplifikasyon bölge dışındaki keser ve ısı inaktive bir RE seçin. Manuf tarafından tavsiye edilen ısı RE inaktiveacturer. </li><li> Yüksek sadakat sıcak başlama DNA polimeraz sistemi kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ayarlayın. (Tablo 3) ayrıntılı olarak bir PCR ana karışımı hazırlayın. (Tablo 3) gösterildiği gibi termal bisiklet gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Agaroz jel elektroforezi ile, PCR ürünlerini analiz edin. Yük 1-5% 1 üzerine her PCR ul, 0.5 mg mi -1 etidiyum bromür (EtBr) içeren agaroz jeli (w / v). Not: spesifik olmayan amplifikasyon ürünlerinin varlığı Recombineering reaksiyonunda karışmaz. Bununla birlikte, bazı durumlarda, astar dimerler Recombineering verimliliğini düşürür. </li><li> PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünleri saflaştırılır. <ol><li> İsteğe bağlı PCR, temizlenmesi ve ardından DpnI ile muamele ile PCR&#39;den gelen plazmid şablonu kaldırmak. (Üretici tarafından tavsiye edildiği gibi), steril iyondan arındırılmış sudan oluşan bir minimal hacimde Elute DNA. Not: DpnI ilavesi th bölünme düşük verimlilik PCR reaksiyonları sonucu saflaştırılmamış içinE metillenmiş plazmid DNA şablonu. </li></ol></li><li> DNA standartları, örneğin, λ Hindlll ile sindirilmiş, bilinen bir dizi karşı veya NanoDrop spektrofotometre kullanılarak, agaroz jel analizi ile PCR ile amplifiye edilmiş DNA miktarı belirlenir. </li></ol> 5. Altklonlaması Artı Yerleştirme <ol style="margin-left: 40px;"><li> 10 ml LB + Chl + Tet 200 ul ekleyerek O / N BAC gbaA kültürü 50 kat sulandırmak. 30 büyüyecek &#160; ° C de 1 saat 50 dakika süre ile, 200 rpm&#39;de çalkalanarak. Bir örnek dahil negatif kontrol olarak kullanılır. </li><li> Aşama 3.1.2 tarif edildiği gibi, 4 ° C, tüm Recombineering malzeme ve ekipmanlar soğutun. </li><li> LB agar pH alt klonlama vektörü (Tablo 4) seçimi için hem de eklenir DNA fragmanının seçimine olanak tanır uygun seçici antibiyotik (ler) doğru bir konsantrasyonunu ihtiva eden 8 plakaları dökün. Not: bazı antibiyotikler, pH duyarlıdır. Kullanım LBBir kural olarak, agar, pH 8. </li><li> L-Arabinoz çözeltisi (ağırlık / hacim), 10% hazırlayın. 0.2 um&#39;lik bir şırınga filtreden geçirilerek sterilize filtre. Not: Arabinoz gbaA plazmidinden Recombineering proteinlerinin ekspresyonuna neden olur. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak BAC gbaA kültürünün OD kontrol edin. Takip eden aşamada tarif edildiği gibi 0,25-0,3 600 ulaşıldığında bir OD sonra, Recombineering proteinleri neden olur. </li><li> % 0.2 Arabinoz bir son konsantrasyon elde etmek için BAC kültürü, 10 ml% 10 arabinoz çözeltisi 200 ul ekle. (Arabinoz olmadan) indüklenmemiş kültürü dahil negatif kontrol olarak kullanılır. </li><li> Bir 37 BAC kültürü aktarın &#160; Cı çalkalanarak kuluçka ° ve 45 dakika 230 rpm &#39;de çalkalanarak Red ifadesini teşvik eder. Not: Kırmızı proteinlerin sentezlenmesi, 30 ° C &#39;de verimsizdir. </li><li> Hücreleri Spin ve aşama 3.1.5 tarif edildiği gibi,% 10 gliserol ile 3 kez yıkayın. </li><li> , 600-1 ekle000 alt-klonlama plazmid ve Recombineering reaksiyona sokma kaset (ler) inin her ng. Vektör ve kaset rekombinasyon yeterlilik ve bütünlüğünü kontrol etmek için sadece vektör ve vektör artı tek ekleme kontrolleri ekleyin. </li><li> Yukarı ve aşağı pipetleme ile tek bir hücre süspansiyonu elde edilir. BAC vektörleri için 3 saat boyunca 37 ° C &#39;de, çok kopya plazmid ya da LB 10 ml, 1 saat boyunca 37 ° C&#39; de, 1 ml LB içinde aşama 3.1.7 ve geri kazanılması tarif edildiği gibi elektroporasyon yapın. </li><li> Geri kazanılan kültür, örneğin,% 90,% 10, 1 çift seçme agar plakaları üzerinde% ve 37 ° C&#39;de büyümeye Levha farklı seyreltme &#160; 16 saat boyunca ° C. </li></ol> Rekombinantlarının 6. Analizi <ol style="margin-left: 40px;"><li> İsteğe bağlı: 6 ila 12 koloniler seçin ve bir HA komşu astar ve bir ekleme spesifik primer kullanarak koloni PCR gerçekleştirin. Alt klonlama plazmid ve ekleme cas dahilsette plazmid hem de negatif kontroller olarak ana BAC klonu. <ol><li> Koloni PCR&#39;ler agaroz jel analizi yapın. Beklenen boyutta parlak bir bant mevcudiyeti ile pozitif klonların belirlenmesi. NOT: SPI klonlama sürecinin yüksek verimlilik çoğunlukla doğru rekombinantlarını üretir. </li></ol></li><li> Seçici antibiyotik içeren 5 ml LB, pH 8 içinde koloniler 37 ° C&#39;de O / N büyür. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre bir sütun saflaştırma kiti kullanılarak DNA miniprepleri hazırlayın. </li><li> Standart bir fenol-kloroform izolasyon veya benzer bir protokol kullanılarak BAC miniprep DNA&#39;sının hazırlanması. </li><li> Miniprep DNA üzerindeki RE digests gerçekleştirin. Agaroz jel elektroforezi ile ayrı bir DNA. Doğru hedefleme vektörü beklenen fragmanları boyutları içeren klonları tanımlamak için RE kalıplarını analiz. Açıkça vektör eksik parçanın (ler) ve eki (ler) içeren vektör arasındaki ayrımcılık bir RE seçin. </li><li> Optional: hala E. mevcut BAC, yoksun hücreleri elde etmek coli recombineering sonra, DH5alpha veya DH10B E. dönüştürmek için miniprep plazmid DNA kullanımı E. coli hücreleri. </li><li> Oligo sentezi hataları kontrol etmek HA ve yerleştirme kaset üzerinde DNA dizi gerçekleştirin. </li></ol>

<ol><li>Dovey, O. M., Foster, C. T., Cowley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+1+%28HDAC1%29%2C+but+not+HDAC2%2C+controls+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 1 (HDAC1), but not HDAC2, controls embryonic stem cell differentiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 8242-8247 (2010).</li>
<li>Harvey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+and+carcinogen-induced+tumorigenesis+in+p53-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Spontaneous and carcinogen-induced tumorigenesis in p53-deficient mice.</a> Nat. Genet. 5, 225-229 (1993).</li>
<li>Waterhouse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoproliferative+disorders+with+early+lethality+in+mice+deficient+in+Ctla-4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4.</a> Science. 270, 985-988 (1995).</li>
<li>Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+by+gene+targeting+in+mouse+embryo-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.</a> Cell. 51, 503-512 (1987).</li>
<li>Hasty, P., Rivera-Pérez, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+length+of+homology+required+for+gene+targeting+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The length of homology required for gene targeting in embryonic stem cells.</a> Mol. Cell. Biol. 11, 5586-5591 (1991).</li>
<li>Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+DNA+sequences+into+the+human+chromosomal+beta-globin+locus+by+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination.</a> Nature. 317, 230-234 (1985).</li>
<li>Hirata, R., Chamberlain, J., Dong, R., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+transgene+insertion+into+human+chromosomes+by+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted transgene insertion into human chromosomes by adeno-associated virus vectors.</a> Nat. Biotechnol. 20, 735-738 (2002).</li>
<li>Szostak, J. W., Orr-Weaver, T. L., Rothstein, R. J., Stahl, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double-strand-break+repair+model+for+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The double-strand-break repair model for recombination.</a> Cell. 33, 25-35 (1983).</li>
<li>Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+germ-line+chimaeras+from+embryo-derived+teratocarcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.</a> Nature. 309, 255-256 (1984).</li>
<li>Fu, J., Teucher, M., Anastassiadis, K., Skarnes, W., Stewart, A. F. A recombineering pipeline to make conditional targeting constructs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFu%2C+J+%22Methods+Enzymol%22">Methods Enzymol</a>. Soriano, P. M., Wassarman, P. M. 477, Academic Press. 125-144 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+logic+for+DNA+engineering+using+recombination+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli.</a> Nat. Genet. 20, 123-128 (1998).</li>
<li>Copeland, N., Jenkins, N., Court, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering%3A+a+powerful+new+tool+for+mouse+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).</li>
<li>Muyrers, J., Zhang, Y., Testa, G., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+modification+of+bacterial+artificial+chromosomes+by+ET-recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1555-1557 (1999).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5978-5983 (2000).</li>
<li>Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering%3A+a+homologous+recombination-based+method+of+genetic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering.</a> Nature Protoc. 4, 206-223 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+recombineering+approach+by+adding+RecA+to+%CE%BB+red+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An improved recombineering approach by adding RecA to λ red recombination.</a> Mol. Biotechnol. 32, 43-53 (2006).</li>
<li>Datta, S., Costantino, N., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+recombineering+plasmids+for+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria.</a> Gene. 379, 109-115 (2006).</li>
<li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RecE+enhances+linear-linear+homologous+recombination+and+facilitates+direct+cloning+for+bioprospecting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting.</a> Nat. Biotechnol. 30, 440-446 (2012).</li>
<li>Muyrers, J., Zhang, Y., Buchholz, F., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecE%2FRecT+and+Redalpha%2FRedbeta+initiate+double-stranded+break+repair+by+specifically+interacting+with+their+respective+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Develop%22%5BJournal%5D)">RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners.</a> Genes Develop. 14, 1971-1982 (2000).</li>
<li>Maresca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+heteroduplex+intermediates+in+lambda+Red+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-stranded heteroduplex intermediates in lambda Red homologous recombination.</a> BMC Mol. Biol. 11, 54(2010).</li>
<li>Mosberg, J. A., Lajoie, M. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambda+Red+recombineering+in+Escherichia+coli+occurs+through+a+fully+single-stranded+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Lambda Red recombineering in Escherichia coli occurs through a fully single-stranded intermediate.</a> Genetics. 186, 791-799 (2010).</li>
<li>Liu, P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+recombineering-based+method+for+generating+conditional+knockout+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations.</a> Genome Res. 13, 476-484 (2003).</li>
<li>Chan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombineering+based+approach+for+high-throughput+conditional+knockout+targeting+vector+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A recombineering based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction.</a> Nucleic Acids Res. 35, e64(2007).</li>
<li>Zhang, Y., Muyrers, J. P. P., Testa, G., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cloning+by+homologous+recombination+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli.</a> Nat. Biotechnol. 18, 1314-1317 (2000).</li>
<li>Lee, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+Escherichia+coli-based+chromosome+engineering+system+adapted+for+recombinogenic+targeting+and+subcloning+of+BAC+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA.</a> Genomics. 73, 56-65 (2001).</li>
<li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li>
<li>Valenzuela, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+engineering+of+the+mouse+genome+coupled+with+high-resolution+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis.</a> Nat. Biotechnol. 21, 652-659 (2003).</li>
<li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoproteomics+profiling+of+HDAC+inhibitors+reveals+selective+targeting+of+HDAC+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chemoproteomics profiling of HDAC inhibitors reveals selective targeting of HDAC complexes.</a> Nat. Biotechnol. 29, 255-265 (2011).</li>
<li>Mulryan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+vas+deferens+contraction+and+male+infertility+in+mice+lacking+P2X1+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reduced vas deferens contraction and male infertility in mice lacking P2X1 receptors.</a> Nature. 403, 86-89 (2000).</li>
<li>Subramanian, K., Rutvisuttinunt, W., Scott, W., Myers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enzymatic+basis+of+processivity+in+lambda+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The enzymatic basis of processivity in lambda exonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 31, 1585-1596 (2003).</li>
<li>Antoch, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+of+the+mouse+circadian+Clock+gene+by+transgenic+BAC+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue.</a> Cell. 89, 655-667 (1997).</li>
<li>Rostovskaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells.</a> Nucleic Acids Res. 40, e150(2012).</li>
<li>Giraldo, P., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+matters%3A+use+of+YACs%2C+BACs+and+PACs+in+transgenic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals.</a> Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).</li>
<li>Hill, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+trimming%3A+minimizing+clone+overlaps%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">BAC trimming: minimizing clone overlaps.</a> Genomics. 64, 111-113 (2000).</li>
<li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36(2005).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR%2FCas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li>
</ol>

T.R.R., multipleks rebirleştirme teknolojisine ilişkin bir İngiliz patent başvurusunun mucididir.

ES hücre hatları ve fare modellerinin yapımı tarihsel değiştirilmiş alel 4 içerdiği plazmid yapıları kullanarak hedef geni dahil etmiştir. Bununla birlikte, bu karmaşık gen hedefleme vektörlerinin yapılışı bu modellerin zamanında üretiminde önemli bir engel olduğu kanıtlanmıştır. Recombineering tabanlı vektör inşaat stratejilerinin geliştirilmesi gelişmiş vektör tasarımları ve daha verimli vektör düzeneğini sağladı. Bununla birlikte, mevcut Recombineering protokolleri hala çok adımları içerir ara plazmid saflaştırmayı gerektirir ve farklı bakteriyel soyları kullanılır. Artı sokulmasını alt-klonlanması yerleşik BAC konakçı suşu bir elektroporasyon durumunda gerçekleştirilebilir vektör yapımı için yeni bir yaklaşım sağlar. Gen hedefleme SPI yarar vektör inşaat çeşitli uygulamalar burada test edilmiştir. Burada incelenen tüm durumlarda, SPI etkili olduğu ve doğru rekombinant plazmidi üretilmiştir.Olguların çoğunluğunda, çok sayıda farklı kasetleri doğru hedefleme vektörüne sokulmuştur. Büyük DNA kasetleri ve vektörleri kolayca SPI protokolü ağırladı ve bu sistemin esnekliği saptandı. SPI uzun homoloji dizileri ve lineer DNA kasetlerinin fosforotioat (PTO) koruma kullanımına dayanır. PTO değişiklik lineer DNA 20,21 ile egzonükleazlardan karşı koruma sağladığını ve uzun HA çoğullamayı izin rekombinasyon verimliliğini artırır. Ancak, uzun oligo dizilerinin sentezi hataları özellikle silmeler biriken şansını artırır. Ancak, protein kodlama bölgelerini kapsar halinde oligo mutasyonlar, özellikle zararlı olabilir. DNA, HA boyunca sıralama ve eklenen kasetin tam uzunlukta kapsayan yüksek bir sekansı değiştirmelerine sahip klonların elimine edilmesi tavsiye edilir. Yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı sisteminin kullanılması da oluşumundan önerilmektediry PCR hataları. alt-klonlama plazmid HA uzunluğu bileşimi ekleme kasetinin bu göre daha kritiktir (veriler gösterilmemiştir). Ekson bölgesinde bir mutasyon tolere edilmez knock vektörleri yapımı gibi özellikle hassas uygulamaları için, ekleme kasetinin HA uzun oligo ile ilgili problemleri önlemek için (50-120 bp), kısaltılabilir. Ekleme kaset de (replikasyon yönünde bilgi mevcut değildir) değiştirilmemiş veya çift phosphorothioated bırakılabilir. Ancak bu durumda çoklayıcı hala uzun HA alt klonlama plasmidlerini korumalı gerektirir. Bu özel stratejinin bir uyarı potansiyel farklı noktalarda SPI klonlama etkileyebilir çoğullama verimlilik düşürücü olduğunu. Ekleme kaseti ve alt klonlama plazmid uzunluğu SPI klonlama başka önemli parametredir. Büyük DNA molekülleri daha az verimli electroporate ve efekt yeniden verilen, birikimliaynı hücrede her kasetleri tanıtmak için gereksinimi (veriler gösterilmemiştir). Çoğullama küçük ekleme kasetleri ile en verimli. DNA, daha büyük 3 kb de 3 kb 30 kadar en verimli Kırmızı aracılı ssDNA işleme bir sınır, yer parçalanır. 3 kb aşan Yerleştirme kasetleri rezeke ikili ve beta bağımsız yolunun 20 üzerinden az verimli recombine. Bu nedenle, doğru klon tanımlamak için yeterli kolonilerin taranmasının, bu durumlarda önemli hale gelmektedir. Rekombinasyon sonrası elektroporasyon daha uzun bir süre de zor SPI egzersizleri doğru klon kurtarma şansını artırır. Dört küçük kasetler (&lt;1.5 kb), çoklayıcı etkinliği her bir ek kaseti ile azalır olsa da, SPI işlemi ile eş zamanlı olarak eklenebilir kadar (veriler gösterilmemiştir). Ancak, bu optimal SPI deney sonucunu yansıtmaktadır ve birçok büyük kasetleri kullanırken çoğullama sınırlarını dikkate önerilir. </p&gt; kümelenmiş düzenli interspaced kısa yineleyen tekrarlar gibi genom düzenleme araçları geliştirilmesi (CRISPR) -cas9 endonükleaz sistemi yeni genom değişikliklerinin oluşturulmasını sağladı ve daha verimli genom mühendisliği 36 yol açmıştır. Ancak, bu yeni teknolojiler gen hedefleme vektörleri tamamlanmaktadır yerine onları supplanted var. Bu CRISPR-cas sistemi antibiyotik seçimi yerini ve daha multipleks Recombineering protokolü rafine ki öngörülmektedir.

Gen hedefleme teknolojilerin geliştirilmesi, farklı biyolojik sistemlerin 1-3 araştırmak için hücre hatları ve fare modellerinin yapımını sağladı. Genomik dizisinin değişimiyle anahtar ilk aşama 4 vektörü hedef gen tasarım ve yapı. Hedefleme vektörler, bir seçim işaretleyici (örn, neomisin) tarafından kapatılması istenen bir değişiklik (ler) i ihtiva eden ilgi aleli taşıyan plazmit ve memeli hücrelerinde 5 verimli homolog rekombinasyon için gerekli olan uzun genomik bölgelerdir. Hassas gen modifikasyonu embriyonik kök hedefleme Vektörün sokulmasıyla (ES) hücreleri üretilmiş 6 ya da somatik hücreler 7 ile elde edilir ve böylece hedef vektör DNA dizisinin aynı uzanan arasında homolog rekombinasyon ve amaçlanan modifikasyon transferinde genomik lokus sonuçları Gen dönüşümü 8 ile genomuna. Bu modifiEd ES hücreleri daha sonra germlin 9 vasıtasıyla modifiye edilmiş bu allel iletebilir yavrular (Khimaira&#39;da) üretilmesi için fare blastokistlerine enjekte edilebilir. Transjenik farelerin üretilmesi için alternatif bir yol, fare genomu 10 vektörün rastlantısal bir bütünleşmesine yol açan tek hücreli fare zigot bir gen ifade vektörü, mikroenjeksiyon içerir. Vektör inşaat Geleneksel yöntemler konvansiyonel yararlanmıştır bir vektör omurgasına farklı seçim işaretleyici ve genomik fragmanları klonlamak için sınırlama enzimleri ve DNA ligaz kullanılarak klonlama &#39;kes ve yapıştır&#39;. Ancak, geleneksel klonlama içsel bir sınırlayıcı faktör konumlandırma ve sınırlama sitelerinin seçimi özellikle uzun DNA dizileri ile vardır. Bu genellikle birden fazla alt klonlama adımları gerektirir ve aynı zamanda sık sık hedef geninin daha düşük bir etkinliğe yol vektörü içine yabancı DNA dizilerini sunmaktadır. Recombineering (rekombinojenik engineering) E. faj rekombinasyon proteinleri aracılığı ile homolog rekombinasyon (HR) kullanarak bu kısıtlamaların üstesinden bir DNA mühendisliği teknolojisi E. coli hücreleri, 11,12. Homolog bir dizinin herhangi bir bölge recombineering bir alt-tabaka olarak hizmet için, restriksiyon siteleri mevcudiyetine kısıtlamaları kaldırılır. Büyük DNA dizileri sorunsuz dolayısıyla yapısal bütünlüğünü 13 koruyarak, doğrudan in vivo modifiye edilebilir. Recombineering kısa bir homoloji (50 bp), 14 ve bu nedenle homoloji kolları (HA), uygun sentetik oligo dizileri dahil edilebilir çok etkilidir. Tipik Recombineering deney, bir oligo veya bir HA ihtiva eden bir çift şeritli DNA (dsDNA) fragmanı olarak Recombineering yetkili E. elektropore edildi kromozom üzerinde veya bir plazmid 15 ya yer alan hedef içeren coli hücreleri. rekombinasyon potansiyeli Kırmızı rec indüklenebilir ifade tarafından verilmektedirombination faj 16,17 proteinler veya rac profajından 18 RecET proteinleri. Kırmızı / rece eksonükleaz sonra ortağı, Kırmızı / Rect, tek damarlı bir tavlama protein (SSAP) 19 ile bağlı olan ara ürün olarak tek kordonlu bir DNA (ssDNA), lineer dsDNA dönüştürür. Uzun bir ssDNA ya da tamamlayıcı bir hedef sekansın kısa bir oligo tavlama replikasyon çatal gecikmeli şeridi üzerinde meydana gelir ve hedef bölgede dizisinin dahil edilmesine yol açar. Strand ssDNA rekombinasyon kalmış recombineering yüksek verimlilik temeli olan ve &#39;beta&#39; rekombinasyon modeli 20,21 ile tarif edilebilir. Tipik bir Recombineering iş akışı bir gen hedefleme vektör aşağıdaki iki yolların birini içerir inşa etmek. Bir yol LoxP rekombinasyon siteleri sıralı ekleme, bir işaretleyici tarafından izlenen bir plasmid içine bir fare BAC klon istenen genomik bölge alt klonlama içerir <syukarı&gt; 22 vb veya alternatif rota 10,23 Recombineering ve daha sonra 24,25 klonlama boşluk tamir bir plazmid içine modifiye odağı alt klonlama birden fazla mermi farklı hedefleme vektör elemanları ile BAC genomik odağı hedef içerir. Bu tema üzerine varyasyonlar büyük fare üretim programlarının 26,27 parçası olarak farklı yüksek verimli Recombineering boru hatlarında kullanılmaktadır. Ancak, bu işlemler, karmaşık ve uzun aşamaları içeren özel vektörler ve E. kullanılmasını gerektirir E. coli suşları (örneğin, Cre hücrelerini tanımlayan) ve vektör DNA, saflaştırma ve yeniden dönüştürme (Tablo 1), bir ya da daha fazla ara adımlar kullanmaktadır. Artı sokulmasını (SPI) alt-klonlanması p rekombinasyona ve tek bir işlem klonlama boşluk onarım (Şekil 1) bir araya getiren bir yeni Recombineering tekniğidir. SPI vektör montaj, basit, hızlı ve esnek ve standart Biraraya getiren önemli bir gelişme sunuyorve Mühendisliği (Tablo 1) yaklaşır. Burada, biz kolaylığı ve standart dışı ve zorlu vektör tasarımları inşa özel bir vurgu ile farklı vektör inşaat uygulamaları için SPI kullanarak programı göstermektedir. Test durumlarda floresan muhabiri çaldığımı vektör inşaat, çift etiketli bir protein ifadesi çaldığımı vektör, bir BAC floresan muhabiri vektör ve bir koşullu nakavt vektörü dahil. Bu çeşitli nükleer protein kompleksi, bir hücre yüzey reseptörü lokalize saflaştırmak için gereksinimi muayene veya koşullu gen ekspresyonunu baskılamak.

<table><tbody><tr><td>Zeocin Sigma hariç antibiyotikler</td><td>: http://www.sigmaaldrich.com</td><td>Ampisilin, A9518-5G; Kloramfenikol, C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamisin, G1264-50MG; Higromisin, H3274-50MG; Kanamisin,: K1876-1G; Tetrasiklin hidroklorür, T7660-5G; Trimetoprim, 92131-1G</td><td></td></tr><tr><td>Zeosin</td><td>İnvivojen:&nbsp;</td><td>ant-zn-1</td><td>Zeocin ayrıca Life technologies/Fisher</td></tr><tr><td>C57BL/6 BAC klonlarından</td> da temin edilebilir<td>: CHORI: https://bacpac.chori.org/&nbsp;</td><td>RPCI-23 veya RPCI-24 BAC</td><td>kütüphaneleri 129/Sv BAC klonları Invivogen veya Life technologies/Fisher</td></tr><tr><td>KOD hotstart DNA polimeraz sisteminden</td> elde edilebilir <td>Millipore: https://www.merckmillipore.com</td><td>71086-3</td><td></td></tr><tr><td>L-Arabinoz</td><td>Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td><td>A3256-25G</td><td></td></tr><tr><td>Uzun oligos</td><td>IDT: https://www.idtdna.com; Gen bağlantısı: https://www.genelink.com</td><td>IDT Ultramerleri veya Gene Link uzun oligoları</td><td>PTO ve Fosfosfat, özel modifikasyonlar olarak mevcuttur. PAGE saflaştırma, uzun oligolar için şiddetle tavsiye edilir.</td></tr><tr><td>MinElute PCR saflaştırma kiti</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&nbsp;</td><td>28004</td><td>Minimum elüsyon PCR saflaştırma kitleri tercih edilmektedir.</td></tr><tr><td>QIAPrep Spin Mini Hazırlık kiti</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&nbsp;</td><td>27104</td><td>Silika kolon veya benzeri matris kitleri tercih edilir.</td></tr><tr><td>Restriksiyon enzimleri</td><td>NEB: https://www.neb.com</td><td>DpnI: R0176L</td><td>RE'nin bir listesi için NEB web sitesine bakın.</td></tr></tbody></table>

alt klonlama artı ekleme (spi) - gen hedefleme vektörler rapid İnşaat için yeni bir yöntem recombineering

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gen hedefleme, homolog rekombinasyon kullanılarak bir genetik lokusun kesin modifikasyonunu ifade eder. Bu yöntemi kullanarak yeni hücre hatlarının ve transgenik fare modellerinin oluşturulması, hedef gene homolog DNA dizileri içeren bir 'hedefleme' vektörünün oluşturulmasını gerektirir ve uzun yıllar boyunca süreçte sınırlayıcı bir adım olmuştur. Vektör yapımı, Escherichia coli hücrelerinde, yeniden birleştirme adı verilen bir teknik kullanılarak faj rekombinazlarının aracılık ettiği homolog rekombinasyon kullanılarak in vivo olarak gerçekleştirilebilir. Yeniden birleştirme, uzun homoloji dizilerini (>4kb) ve bir hedefleme vektörü ile onun akraba genomik lokusu arasındaki verimli alelik değişime aracılık etmek için gerekli olan seçim belirteçleri dahil olmak üzere çeşitli hedefleme elemanlarını alt klonlamak için tercih edilen tekniktir. Tipik yeniden birleştirme protokolleri, hedefleme elemanlarının adım adım entegrasyonunun yinelemeli bir şemasını takip eder ve ara saflaştırma ve dönüştürme adımları gerektirir. Burada, çoklayıcı bir yaklaşım kullanarak vektör montajının yeni bir yeniden birleştirme metodolojisini sunuyoruz. Plazmid boşluğu onarımı, fare Bakteriyel Yapay Kromozom kütüphanelerinden genomik dizinin eşzamanlı olarak yakalanması ve ikili bakteri ve memeli seçim belirteçlerinin eklenmesiyle gerçekleştirilir. Bu alt klonlama artı yerleştirme yöntemi oldukça verimlidir ve doğru rekombinantların çoğunu verir. Bu yöntem kullanılarak oluşturulmuş farklı türdeki koşullu gen nakavt veya knock-in vektörlerinin ve BAC raportör vektörlerinin inşası için veriler sunuyoruz. SPI vektör yapısı, yeniden birleştirme araç kutusunun repertuarını büyük ölçüde genişletir ve bu son derece karmaşık vektörleri oluşturmak için basit, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem sağlar.

Gen hedefleme metodolojileri, nakavt, knock-in ve etiketli alellere sahip transgenik fareler oluşturmak için kullanılabilir. Burada, E. coli'de, özel gen hedefleme vektörlerini hızlı bir şekilde oluşturmak için kullanılabilecek 'alt klonlama artı ekleme' olarak adlandırdığımız gelişmiş bir yeniden birleştirme yöntemini açıklıyoruz.

Alt klonlama Artı Ekleme (SPI) - Gen Hedefleme Vektörler Rapid İnşaat için Yeni Bir Yöntem Recombineering

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, alt klonlama artı yerleştirme kullanarak gen hedefleme vektörleri oluşturmaktır. Bu, e coli içeren sırtın yeniden birleşen bir plazmit ile dönüştürülmesiyle elde edilir. İkinci adım, asimetrik fosforollü yerleştirme kasetlerinin üretilmesini ve polimeraz zincir reaksiyonu ile plazmitlerin alt klonlanmasını içerir.Arabinoz ilavesini takiben, GBAA yeniden birleşen proteinler eksprese edilir ve terminal modifiye insersiyon kaseti ve alt klonlama plazmidi elektroporasyona tabi tutulur. İstenen DNA dizisi aynı anda arkadan esir alınır ve yerleştirme kaseti ile alt klonlama plazmidine modifiye edilir. Bu tekniğin standart yeniden birleştirme gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, gen hedefleme vektör yapımının tek bir reaksiyonda gerçekleştirilebilmesidir.Başlamak için, yerleştirme kaseti ve alt klonlama için oligolar tasarlamak, plazmit, her oligo, genomik hedef bölgeyi çevreleyen 180 baz çifti homoloji kolu ve yerleştirme kaseti veya alt klonlama plazmidi için spesifik bir hazırlama dizisi olan 20 baz çifti içerecek şekilde tasarlayın. Ardından, klon db gibi web tabanlı bir araç kullanarak arka klonun genomik DNA ekinin yönünü belirleyin. Sırtta kullanılan sırt plazmid omurgasının haritasını kontrol ederek veya ES'den replikasyon yönünü belirleyin.Kütüphane yapısı, iki terminal fosfo sekiz bağ ekleyin, böylece oligo'nun beş asal ucu, arka klondaki replikasyon yönünün tersidir. Ardından, ters oligoya beş asal fosfat modifikasyonu ekleyin. Önce steril bir pipet ucunu arka agar kültürüne saplayın ve 5.0 mililitre odin suyunu aşılayın.Kültürü 37 santigrat derecede beş saat boyunca 200 RPM'de çalkalayarak büyütün. Daha sonra, soğutun,% 10 gliserol çözeltisi, mikro santrifüj, tüpler ve elektroporasyon, buz soğutucusunda küvetler, soğutmalı büyük santrifüj ve dört santigrat dereceye kadar mikro santrifüj. İnkübasyondan sonra, bir spektrofotometre kullanarak kültürün optik yoğunluğunu belirleyin.Absorbansın ölçülmesi. 600 nanometrede. 0,3 ila 0,8'lik bir OD 600 okumasına ulaşıldığında elektro yetkin hücreleri hazırlayın.Kültür hazır olduğunda, hücreleri 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde döndürün. Hücreleri bir mililitre soğutulmuş% 10 gliserol ile yıkayın ve tekrar döndürün. Bu yıkama adımlarını toplam üç kez gerçekleştirin.Hücreleri toplam 50 mikrolitrelik bir hacimde yeniden süspanse edin ve 10 ila 200 nanogram rekombine plazmit ekleyin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek tek bir hücre süspansiyonu elde edin ve ardından hücreleri bir soğutma öncesi elektroporasyona aktarın. Vete. Daha sonra, vete'yi bir elektroporasyon cihazına yerleştirin ve hücreleri elektro çalıştırın, hücreleri hemen bir mililitre LB'de geri kazanın ve hücreleri 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.200 RPM'de sallayarak sırt kültürünü iki saat boyunca 30 santigrat derecede büyütün. Bu sürenin sonunda, geri kazanılan kültüre dokuz mililitre LB ekleyin. Homoloji kollarını yerleştirme kasetine ve subc klonlama plazmidine dahil etmek için 200 RPM'de çalkalayarak gece boyunca 30 santigrat derecede büyütün.Daha önce hazırlanmış uzun modifiye oligoları kullanarak PCR gerçekleştirin. Alternatif olarak, plazmit şablonunu doğrusallaştırın Bir kısıtlama enzimi kullanarak, PCR amplifikasyon bölgesinin dışını kesen ve ısıyla aktive edilen birini seçin. PCR'yi yüksek kaliteli bir sıcak başlatma, DNA polimeraz sistemi kullanarak ayarlayın.Bir PCR ana karışımı hazırlayın ve en iyi uygulamalara göre termal döngü gerçekleştirin. Reaksiyondan sonra, PCR ürünlerini AROS jel elektroforezi ile analiz edin. Her PCR'den bir ila beş mikrolitreyi %1'lik bir aros jeli üzerine yükleyin.Ardından, bir PCR saflaştırma kiti kullanarak PCR ürünlerini saflaştırın. PCR ile güçlendirilmiş DNA'yı bilinen bir dizi DNA standardına göre veya bir NanoDrop spektrofotometresi kullanarak ölçün. Bir gece inkübasyondan sonra, arka GBAA kültürünü 50 kat seyreltin ve negatif kontrol için ayrı bir kültür hazırlayın.Seyreltilmiş kültürleri 30 santigrat derecede büyütün ve bir saat 50 dakika boyunca 200 RPM'de çalkalayın. Ardından, yeniden birleştirilen tüm malzemeleri ve ekipmanları daha önce gösterildiği gibi dört santigrat dereceye kadar soğutun. Hacim başına% 10'luk bir OSE çözeltisi hazırlayın ve 0.2 mikronluk bir şırınga filtresinden filtre sterilize edin.Sırt kültürünün OD'si istenen seviyeye ulaştığında, yeniden birleşen proteinleri indüklemeye devam edin. % 0.2'lik bir nihai aose konsantrasyonu elde etmek için% 0.2'lik bir nihai aose konsantrasyonu elde etmek için% 10'luk bir Arap çözeltisinin 200 mikrolitresini ekleyin. Kültürleri 37 santigrat derece çalkalama inkübatörüne aktarın ve 230 RPM'de çalkalama ile 45 dakika boyunca kırmızı ifadeyi indükleyin.Hücreleri döndürün ve daha önce gösterildiği gibi 600 ila 1000 nanogramda üç kez% 10gliserol ile yıkayın. Yerleştirme kasetinin ve yeniden birleştirme reaksiyonuna alt klonlama plazmitinin her biri, vektörün rekombinasyon yeterliliğini ve bütünlüğünü kontrol etmek için yalnızca bir vektör ve vektör artı tek ekleme kontrolü içerir. Ardından, tek hücreli bir süspansiyon elde edin ve hücreleri daha önce gösterildiği gibi elektro çalıştırın.Çok kopyalı plazmitler için bir saat boyunca 37 santigrat derecede LB ortamında veya geri vektörler için üç saat boyunca 37 santigrat derecede 10 lb'de geri kazanıma izin verin. İkili seçimde geri kazanılan kültürle farklı seyreltmeleri tamamlayın. Agar lütfen ve 16 saat boyunca 37 santigrat derecede büyütün.Hazır olduğunda, seçici antibiyotik içeren beş mililitre LB içine kolonileri toplayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Daha sonra, mini hazırlık DNA'sını hazırlamak için bir kolon saflaştırma kiti kullanın, uygun kısıtlama enzimini tanıtın ve ardından jel elektroforezi ile beklenen parça boyutlarını içeren klonları tanımlayın. Son olarak, oli fotosentez hatalarını kontrol etmek için homoloji kolları ve yerleştirme kaseti boyunca DNA dizilimi gerçekleştirin.Bu örnekte, klonlar içeren P iki RX bir EYFP ekinin kısıtlama sindirim analizi, doğru şekilde monte edilmiş vuruntu vektörünü içerdiklerini gösteren beklenen modeli gösterdi. Bu şematik, bact kırpma kavramını göstermektedir. PCR ürünlerinin alt klonlama ve yerleştirme analizi kullanılarak, kasetlerin doğru şekilde dahil edildiğini doğruladı.Ek olarak, uygun restriksiyon enzimi eklendikten sonra pozitif geri klonlar analiz edildiğinde, beklenen patern elde edildi. 12 R SR'nin kısıtlama sindirim analizi, iki SBI klonunun rekombinantların çoğunda doğru vektör montajını gösterdiğini söyledi. Bu videoyu izledikten sonra, alt klonlama artı yerleştirme kullanarak gen hedefleme vektörlerinin nasıl hızlı bir şekilde oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.

subcloning-plus-insertion-spi-novel-recombineering-method-for-rapid

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Homolog rekombinasyon teknikleri büyük ölçüde...

Homolog rekombinasyon Oluşumlar Recombineering<em&gt; Drosophila</em

DNA, düzeneğini kullanarak çok CRISPR vektörleri CRISPR çok sayıda yapı yapım tek klonlama reaksiyonda paralel yapılabilir basit bir işlem vektörleri. Domates kıllı kökleri CRISPR vektörleri doğrulamak ve mutant malzemeleri üretmek için mükemmel bir model sistem.

Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu

Burada daha önce tarif edilen sistemler geliştirir insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) arasında AAVS1 lokusunda RMCE göre hızlı ve etkili bir gen düzenleme yöntemi sunulmaktadır. Bu tekniği kullanarak, izogenik hatları hızlı ve güvenilir hPSCs ile transgenesis aracılı araştırma kolaylaştıran, uygun karşılaştırmalı çalışmalar için oluşturulabilir.

içinde Recombinase aracılı Kaset Borsası tarafından Rekombinant insan pluripotent kök hücreleri hızlı ve verimli Nesil<em&gt; AAVS1</em&gt; Odağı

Bu protokolün amacı, Golden Gate klonlamaya dayalı modüler klonlama sistemini kullanarak çok genli yapıların montajı için ayrıntılı, adım adım bir kılavuz sağlamaktır. Ayrıca, deneyimlerimize göre en iyi montajı sağlamak için kritik adımlar hakkında önerilerde bulunmaktadır.

Modüler Altın Kapı Klonlama Kullanılarak Çok Genli Yapıların Hızlı Montajı

Bu protokol, makrofaj ve T hücre satırlarındaki darbe denemelerini basitleştirmek için floresan muhabirleri ve hücre sıralamasını kullanır. Bu basitleştirilmiş knock-in deneyleri için iki plazmid kullanılır, yani CRISPR / Cas9- ve DsRed2 ifade eden plazmid ve bağışıklık hücrelerindeki Rosa26 lokusunda kalıcı olarak entegre edilen EBFP2'yi ifade eden homolog bir rekombinasyon donör plazmid.

MACROPHAGE ve T Hücre Hatlarında CRISPR/Cas9 ve Hücre Sıralama tarafından Gen Knock-in

Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV), klinik ve preklinik gen iletimi için yaygın olarak kullanılmaktadır. rAAV'ler için yeterince takdir edilmeyen bir kullanım, kültürlenmiş hücrelerin saflaştırmaya gerek kalmadan sağlam bir şekilde aktarılmasıdır. rAAV'ye yeni başlayan araştırmacılar için, transgen kaset klonlama, ham vektör üretimi ve hücre kültürü transdüksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

Saflaştırılmamış Rekombinant Adeno İlişkili Viral Vektörler Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Transgen Ekspresyonu

Burada, eklerin 3' ucunda uygun kısıtlama bölgelerini tanıtarak pVAX1-PRRSV ekspresyon vektörünü elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Homolog rekombinasyon teknolojisi ile vektörü doğrusallaştırabilir ve DNA parçalarını vektöre tek tek birleştirebiliriz.

Domuz Üreme ve Solunum Sendromu Virüs Ekspresyon Vektör Yapısı için Kesintisiz Bir Klonlama Yaklaşımı

DNA parçalarının PCR amplifikasyonuna gerek kalmadan ilgilenilen DNA parçalarının vektörler arasında transferine izin veren yüksek verimli bir klonlama yöntemi olan CRISPR tabanlı mekik klonlama (CRISPRshuttle klonlama) için bir protokol açıklıyoruz.

CRISPR Tabanlı Mekik Klonlama: Yüksek Verimli Bir Klonlama Yöntemi

Yükseltilmiş artı labirent testi, farelerde davranış gibi anksiyete ölçmek için en yaygın kullanılan testler biridir. Burada, test yapılması için ayrıntılı yordamlar gösteren bir film sunuyoruz.

Fareler için Yükseltilmiş Artı Labirent

Üretimi C. elegans Recombineering yoluyla transgenlerin GalK Seçilebilir Marker

Öğrenin, E. coli'de alt klonlama artı ekleme (SPI) yöntemiyle gen hedefleme vektörlerinin hızlı inşasını. Bu teknik, tek bir reaksiyonda vektör oluşturarak transgenik model geliştirmeyi kolaylaştırır.

Alt klonlama Artı Ekleme (SPI) - Gen Hedefleme Vektörler Rapid İnşaat için Yeni Bir Yöntem Recombineering

Daha fazla video keşfet