Alt klonlama Artı Ekleme (SPI) - Gen Hedefleme Vektörler Rapid İnşaat için Yeni Bir Yöntem Recombineering

Aşağıdaki deneyin genel amacı, alt klonlama artı yerleştirme kullanarak gen hedefleme vektörleri oluşturmaktır. Bu, e coli içeren sırtın yeniden birleşen bir plazmit ile dönüştürülmesiyle elde edilir. İkinci adım, asimetrik fosforollü yerleştirme kasetlerinin üretilmesini ve polimeraz zincir reaksiyonu ile plazmitlerin alt klonlanmasını içerir.

Arabinoz ilavesini takiben, GBAA yeniden birleşen proteinler eksprese edilir ve terminal modifiye insersiyon kaseti ve alt klonlama plazmidi elektroporasyona tabi tutulur. İstenen DNA dizisi aynı anda arkadan esir alınır ve yerleştirme kaseti ile alt klonlama plazmidine modifiye edilir. Bu tekniğin standart yeniden birleştirme gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, gen hedefleme vektör yapımının tek bir reaksiyonda gerçekleştirilebilmesidir.

Başlamak için, yerleştirme kaseti ve alt klonlama için oligolar tasarlamak, plazmit, her oligo, genomik hedef bölgeyi çevreleyen 180 baz çifti homoloji kolu ve yerleştirme kaseti veya alt klonlama plazmidi için spesifik bir hazırlama dizisi olan 20 baz çifti içerecek şekilde tasarlayın. Ardından, klon db gibi web tabanlı bir araç kullanarak arka klonun genomik DNA ekinin yönünü belirleyin. Sırtta kullanılan sırt plazmid omurgasının haritasını kontrol ederek veya ES'den replikasyon yönünü belirleyin.

Kütüphane yapısı, iki terminal fosfo sekiz bağ ekleyin, böylece oligo'nun beş asal ucu, arka klondaki replikasyon yönünün tersidir. Ardından, ters oligoya beş asal fosfat modifikasyonu ekleyin. Önce steril bir pipet ucunu arka agar kültürüne saplayın ve 5.0 mililitre odin suyunu aşılayın.

Kültürü 37 santigrat derecede beş saat boyunca 200 RPM'de çalkalayarak büyütün. Daha sonra, soğutun,% 10 gliserol çözeltisi, mikro santrifüj, tüpler ve elektroporasyon, buz soğutucusunda küvetler, soğutmalı büyük santrifüj ve dört santigrat dereceye kadar mikro santrifüj. İnkübasyondan sonra, bir spektrofotometre kullanarak kültürün optik yoğunluğunu belirleyin.

Absorbansın ölçülmesi. 600 nanometrede. 0,3 ila 0,8'lik bir OD 600 okumasına ulaşıldığında elektro yetkin hücreleri hazırlayın.

Kültür hazır olduğunda, hücreleri 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde döndürün. Hücreleri bir mililitre soğutulmuş% 10 gliserol ile yıkayın ve tekrar döndürün. Bu yıkama adımlarını toplam üç kez gerçekleştirin.

Hücreleri toplam 50 mikrolitrelik bir hacimde yeniden süspanse edin ve 10 ila 200 nanogram rekombine plazmit ekleyin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek tek bir hücre süspansiyonu elde edin ve ardından hücreleri bir soğutma öncesi elektroporasyona aktarın. Vete. Daha sonra, vete'yi bir elektroporasyon cihazına yerleştirin ve hücreleri elektro çalıştırın, hücreleri hemen bir mililitre LB'de geri kazanın ve hücreleri 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

200 RPM'de sallayarak sırt kültürünü iki saat boyunca 30 santigrat derecede büyütün. Bu sürenin sonunda, geri kazanılan kültüre dokuz mililitre LB ekleyin. Homoloji kollarını yerleştirme kasetine ve subc klonlama plazmidine dahil etmek için 200 RPM'de çalkalayarak gece boyunca 30 santigrat derecede büyütün.

Daha önce hazırlanmış uzun modifiye oligoları kullanarak PCR gerçekleştirin. Alternatif olarak, plazmit şablonunu doğrusallaştırın Bir kısıtlama enzimi kullanarak, PCR amplifikasyon bölgesinin dışını kesen ve ısıyla aktive edilen birini seçin. PCR'yi yüksek kaliteli bir sıcak başlatma, DNA polimeraz sistemi kullanarak ayarlayın.

Bir PCR ana karışımı hazırlayın ve en iyi uygulamalara göre termal döngü gerçekleştirin. Reaksiyondan sonra, PCR ürünlerini AROS jel elektroforezi ile analiz edin. Her PCR'den bir ila beş mikrolitreyi %1'lik bir aros jeli üzerine yükleyin.

Ardından, bir PCR saflaştırma kiti kullanarak PCR ürünlerini saflaştırın. PCR ile güçlendirilmiş DNA'yı bilinen bir dizi DNA standardına göre veya bir NanoDrop spektrofotometresi kullanarak ölçün. Bir gece inkübasyondan sonra, arka GBAA kültürünü 50 kat seyreltin ve negatif kontrol için ayrı bir kültür hazırlayın.

Seyreltilmiş kültürleri 30 santigrat derecede büyütün ve bir saat 50 dakika boyunca 200 RPM'de çalkalayın. Ardından, yeniden birleştirilen tüm malzemeleri ve ekipmanları daha önce gösterildiği gibi dört santigrat dereceye kadar soğutun. Hacim başına% 10'luk bir OSE çözeltisi hazırlayın ve 0.2 mikronluk bir şırınga filtresinden filtre sterilize edin.

Sırt kültürünün OD'si istenen seviyeye ulaştığında, yeniden birleşen proteinleri indüklemeye devam edin. % 0.2'lik bir nihai aose konsantrasyonu elde etmek için% 0.2'lik bir nihai aose konsantrasyonu elde etmek için% 10'luk bir Arap çözeltisinin 200 mikrolitresini ekleyin. Kültürleri 37 santigrat derece çalkalama inkübatörüne aktarın ve 230 RPM'de çalkalama ile 45 dakika boyunca kırmızı ifadeyi indükleyin.

Hücreleri döndürün ve daha önce gösterildiği gibi 600 ila 1000 nanogramda üç kez% 10gliserol ile yıkayın. Yerleştirme kasetinin ve yeniden birleştirme reaksiyonuna alt klonlama plazmitinin her biri, vektörün rekombinasyon yeterliliğini ve bütünlüğünü kontrol etmek için yalnızca bir vektör ve vektör artı tek ekleme kontrolü içerir. Ardından, tek hücreli bir süspansiyon elde edin ve hücreleri daha önce gösterildiği gibi elektro çalıştırın.

Çok kopyalı plazmitler için bir saat boyunca 37 santigrat derecede LB ortamında veya geri vektörler için üç saat boyunca 37 santigrat derecede 10 lb'de geri kazanıma izin verin. İkili seçimde geri kazanılan kültürle farklı seyreltmeleri tamamlayın. Agar lütfen ve 16 saat boyunca 37 santigrat derecede büyütün.

Hazır olduğunda, seçici antibiyotik içeren beş mililitre LB içine kolonileri toplayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Daha sonra, mini hazırlık DNA'sını hazırlamak için bir kolon saflaştırma kiti kullanın, uygun kısıtlama enzimini tanıtın ve ardından jel elektroforezi ile beklenen parça boyutlarını içeren klonları tanımlayın. Son olarak, oli fotosentez hatalarını kontrol etmek için homoloji kolları ve yerleştirme kaseti boyunca DNA dizilimi gerçekleştirin.

Bu örnekte, klonlar içeren P iki RX bir EYFP ekinin kısıtlama sindirim analizi, doğru şekilde monte edilmiş vuruntu vektörünü içerdiklerini gösteren beklenen modeli gösterdi. Bu şematik, bact kırpma kavramını göstermektedir. PCR ürünlerinin alt klonlama ve yerleştirme analizi kullanılarak, kasetlerin doğru şekilde dahil edildiğini doğruladı.

Ek olarak, uygun restriksiyon enzimi eklendikten sonra pozitif geri klonlar analiz edildiğinde, beklenen patern elde edildi. 12 R SR'nin kısıtlama sindirim analizi, iki SBI klonunun rekombinantların çoğunda doğru vektör montajını gösterdiğini söyledi. Bu videoyu izledikten sonra, alt klonlama artı yerleştirme kullanarak gen hedefleme vektörlerinin nasıl hızlı bir şekilde oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.