SPOT Peptit Diziler Protein Lizin Methyltransferases Özgünlüğü Analizi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, protein lizin metil transferazların veya PK mts'nin substrat özgüllüğünü araştırmaktır. Bu, bir başlangıç substratının tanımlanması ve bu substratın farklı pozisyonlarda tek amino asit değişimleri içeren birkaç varyantı ile peptit dizilerinin hazırlanması ile elde edilir. İkinci bir adım olarak, peptit dizisi, radyoaktivitenin karşılık gelen peptit noktasına aktarılmasıyla peptit metilasyonunun saptanmasına izin veren bir radyoaktif metil grubu donörü varlığında PKMT ile inkübe edilir.

Daha sonra, dizi bir x-ışını filmine maruz bırakılır ve peptitlerin her birindeki metilasyon aktivitesini belirlemek için kantitatif olarak analiz edilir. Ve PKMT'nin özgüllük profilini tanımlamak için, sonuçlar, substrat peptidindeki hangi amino asitlerin PKMT tarafından metilasyonu için kritik olduğunu gösterir. Bu tekniğin veya tek tek peptitlerin metilasyonu gibi mevcut yöntemlerin ana avantajı, bir dizi farklı peptitin tek bir deneyde uygun maliyetli bir şekilde test edilebilmesidir.

Bu yöntem, PK mtss'nin daha önce bilinmeyen yeni substratlarının spesifikasyonu gibi protein lym metilasyon alanındaki anahtar soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Dolayısıyla bu yöntem, PK mts'nin özgüllüğü hakkında fikir verebilir. Ayrıca protein kinazlar, diğer protein yöntemi, transferazlar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir veya transferazlara eklenebilir.

Bu yöntem için ilk olarak, peptit spot sentezi kullanarak makul maliyetlerle büyük özel peptit dizileri hazırlama olasılığına aşina olduğumda aklıma geldi Bu prosedüre başlamak için, çoklu pep gözcü yazılımını kullanarak sentez için peptit dizileri tasarlayın. Peptit dizilerini, bu ön şişmeyi takiben spesifik amino asidi, uçta amino peg işlevselleştirilmiş nokta zarını, 10 dakika boyunca uç dimetilformamid veya DMF'yi tanımlayan tek bir harf kodu olarak girin. Bitirdiğinizde, ıslak zarı herhangi bir hava kabarcığı veya kırışıklık olmadan nokta sentezleyici çerçevesine yerleştirin.

Sentez programına başlamadan önce zarı en az 10 dakika tamamen kurulayın. Membran üzerindeki serbest amino grubu ile amid bağı oluşturmak için membranı %100 etanol ile üç kez yıkayın. Amino asit türevine DIC ve etil hidroksi amino sino asetat ekleyerek gelen amino asidin karboksi grubunu aktive edin.

Aktivasyonu takiben, programlanabilir robotu kullanarak amino peg işlevselleştirilmiş membran üzerinde istenen hacimlerde aktif amino asitleri tespit edin. İlk aktive edilmiş amino asidin daha iyi bağlanmasını sağlamak için önceki adımı üç kez tekrarlayın. Membranı 20 dakika inkübe ettikten sonra, kuruduktan ve serbest amino gruplarını bloke ettikten sonra bağlanmamış amino asitleri çıkarmak için DMF ile yıkayın.

Membranı DMF ile dört kez yıkayın ve ardından FM koruma grubunu çıkarmak için DMF'de% 20 piperin ile 20 dakika inkübe edin. Membranı yıkadıktan ve kuruttuktan sonra, istenen peptit uzunluğu elde edilene kadar lekelenme ve F MOC giderme adımlarını tekrarlayın. Son F MOC grup D korumasını takiben, membranı DMF ve% 100 etanol ile yıkayın.

Daha sonra zarı DMF'de %0.02 brom fenol mavisi ile tamamen maviye dönene kadar en az beş dakika tedavi edin. Membranı yıkadıktan ve kuruttuktan sonra, sentezleyiciden çıkarın ve kimyasallara dayanıklı bir kutuya koyun. Amino asit yan zincirlerini modifikasyondan korumak için yan zincir koruma gruplarını ve süpürücü reaktifleri parçalamak için %95 trikloroasetik asitten oluşan 20 ila 25 mililitre yan zincir D koruma karışımı ile muamele edin.

Derin koruma karışımının zarı kapladığından emin olduktan sonra, kutuyu tamamen kapatın ve inkübasyondan sonra hafifçe çalkalayarak bir ila iki saat inkübe edin. Membranı altı kez, her biri iki dakika boyunca 20 ila 25 mililitre di kloro metan ile yıkayın. % 100 etanol ile iki kez yıkadıktan sonra, zarı gece boyunca kurutun.

Daha sonra, peptit dizisi zarını, enzim içermeyen ilgili metilasyon tamponunu içeren kapalı bir plastik torba içinde önceden inkübe edin ve radyoaktif olarak etiketlenmiş metil grubu ile amet 10 dakika boyunca, ön inkübasyon tamponunu atın ve zarı, ilgili PKMT'yi içeren sekiz mililitre metilasyon tamponunda bir ila iki saat inkübe edin. Bunu takiben, metilasyon tamponunu bir radyoaktif atık kabına atın ve peptit dizilerini, bağlı proteini çıkarmak için 100 milimolar amonyum bikarbonat ve% 1 STS içeren 20 mililitre tampon ile beş kez yıkayın. Radyoaktif atık kabındaki son yıkama tamponunu attıktan sonra, zarı 10 mililitre amplifiye edici çözelti içinde beş dakika inkübe edin.

Ardından, organik çözücüler için radyoaktif atık kabındaki yükseltici çözeltiyi atın. Peptit dizisini plastik bir torbaya koyun ve bir oto radyografi kasetine koyun. Oto radyografi filmini karanlık bir odada peptid üzerine yerleştirin.

Ardından kaseti dikkatlice kapatın. Filmi eksi 80 santigrat derecede pozladıktan sonra, sonuçları analiz etmek için geliştirin. Son olarak, güçlü şekilde metillenmiş peptit substratlarının doygunluğunu önlemek için görüntüyü farklı pozlama süreleriyle birkaç kez yakalayın.

Bir peptit dizisinin NSD ile metilasyon reaksiyonunun bir örneği burada gösterilmiştir. Yatay eksen, peptit dizisini ve dikey yönde temsil eder. Değiştirilmiş amino asit, nsd ile metilasyonu gösterir, biri spesifik olarak H üç K 36 üzerinde etkili olduğunu ve NSD'nin üç peptit dizisi deneyinin hedef lizin konsolidasyonunun her iki tarafında üç ila dört amino asit kalıntısını tanıdığını gösterir.

Peptitlerin yaklaşık% 85'i artı veya eksi %20'den daha küçük standart sapmalar gösterir ve peptitlerin %97'sinden fazlası artı veya eksi %30'dan daha küçük standart sapmalar gösterir Hesaplanan ayrım faktörü verileri, NSD'nin eksi iki pozisyonunda aromatik kalıntıları tercih ettiğini göstermektedir. Eksi bir ve artı iki bölgelerde, hidrofobik atik kalıntıları tercih eder. Ve artı bir sitede, arginin, lisin, glutamin veya asparagin tercihi vardır.

Potansiyel yeni peptit substratları, insan proteomunun veri tabanı aramalarıyla bulunabilir. Bu peptitlerin bazılarının bazı peptitlerle güçlü metilasyonu, yeni NSD bir peptit substratları olarak kimliklerini doğrular. Bu prosedürü denerken, bu prosedürü takiben en uygun ilk alt tabakayı kullanmayı unutmamak önemlidir.

Proteinlerin substrat olarak kabul edilip edilmediğini öğrenmek için in vitro ve hücrelerde karşılık gelen proteinlerin metilasyonu gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu teknik, protein lizin mesilasyonu alanındaki araştırmacıların, birçok PK mt'nin substrat özgüllüğünü tanımlamasının ve birkaç yeni substratı tanımlamasının yolunu açtı. Bu, PK mts'nin önemli biyolojik işlevinin anlaşılmasına yardımcı oldu.

Peptit sentezinde radyoaktivite ve organik çözücülerle çalışmanın iddia edilebileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman uygun önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.