Name: SPOT Peptit Diziler Protein Lizin Methyltransferases Özgünlüğü Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Öğrenin, SPOT peptit dizileri yöntemiyle protein lizin metiltransferazların substrat özgünlüğünü nasıl analiz edebilirsiniz. Bu teknik, PKMT biyolojik rollerini anlamak için kritik amino asitleri belirlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma DFG hibesi JE 252/7 tarafından desteklenmiştir.

Peptit Dizilerinin 1. Hazırlık <ol><li> Peptit Dizilerin Programlama <ol><li> MultiPep gözcü yazılımı kullanılarak sentez için peptid sekansları sunabilirler. Tek harf kodları peptid dizileri girin. Peptid 1: TARKSTGGKA </li><li> Tanımlanmış bir tabakanın tanınması için gerekli önemli amino asitleri ekrana belirli bir komutla (.Kapağı, A) alanin veya arginin yürüyüş kütüphaneleri oluşturun. Aşağıdaki örnekte Örneğin birinci hat yabanıl tip sekans, ikinci hattan bir peptid içinde bulunan her bir amino asit alanin arda değiştirilir. , A yerine TARKSTG Bir -ARKSTG T A -RKSTG TA-A -KSTG TAR A -STG TARK- bir -TG TARKS- bir -G TARKST- A </li><li> Benzer komutları (.Kapağı R kullanın.Tüm doğal mevcut amino asit kalıntısının (sonunda sistein, metionin ve triptofan iptaliyle 1.1.2 tarif edildiği gibi, bu tortuları, oksitlenmeye eğilimlidir ve bazen daha düşük sentez verimi olduğu için), N, vs.) yerine konsensüs saptanması için bir peptit dizisini sentezleme Bir enzim için alt-tabaka dizisi motifi. NOT: Şekil 4A&#39;da gösterildiği gibi, yatay eksen verilen peptit dizisini temsil eder ve dikey eksen ise bir komut için, seçilen amino asitleri temsil eder. 1.1.2 gösterilen sekansına benzer bir şekilde, dikey bir eksen üzerinde bir Ala şekil l&#39;de ilk satırda verilmiştir dizisinin her pozisyonunu değiştirir anlamına gelir. 4A. Benzer şekilde arjinin sekans ve bu başka amino asitler ile ikinci sırada bulunan her bir amino asidi değiştirir. Tam peptid dizisi kütüphaneleri sistematik th ile birlikte gelen peptid alt-tabakası sırayla her bir tortu yerine sentezlenire diğer doğal olarak mevcut amino asit kalıntıları, bu verilen sırada, her pozisyonda her bir kalıntı etkisi anlamaya yardımcı olur. </li><li> Seçenek olarak ise, bilinen ya da tahmin edilen peptit alt tabakasma metilasyonu kolayca pozitif ve negatif kontroller metilasyon ile birlikte PKMT hedef peptidleri ile (metillenmiş bilinen ya da metile olduğu bilinmemektedir örneğin peptitler) peptid kütüphaneleri sentezlenmesi doğrulanabilir. Manuel programlama ile aşağıda gösterildiği gibi hedef lizin metilasyonunu onaylamak için alanin için varsayılan hedef lisin alışverişi peptidler sentez. Yabani tip peptit STGG K PRQFL Mutant peptit STGG bir PRQFL NOT: Yazılım aynı zamanda bir etkileşim için gerekli önemli amino asitleri eşleştirmek için dizinin istenen çerçeve kayması ile epitop haritalama gibi, çeşitli kütüphaneleri oluşturmak için doğal komut vardır. </li></ol></li><li> Membranın hazırlanması, amino asitler, bird Reaktifler <ol><li> 10 dakika boyunca, DMF (N, N-dimetilformamid) SPOT membran Ön kabarma ve bundan sonra da hava kabarcığı ve kırışıklık olmadan yerinde birleştirici çerçeve ıslak membran yerleştirin. </li><li> Membrana% 100 etanol ile üç kez yıkayın. Sentez programına başlamadan önce en az 10 dakika boyunca tamamen membranlar kurulayın. </li><li> Buna paralel olarak, taze NMP içinde çözdürülerek ticari olarak temin edilebilen Fmoc-korumalı amino asitler, 0.5 M çalışma konsantrasyonları hazırlamak ve Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi, aynı zamanda aktivatörü ve baz hazırlar. </li><li> SPOT synthesizer tüm atık çözüm kapları boşaltılması emin olun ve DMF, etanol ve piperidin solvent rezervuarları doldurun. NOT: Şimdi makine sentezi için hazır hale gelir. </li></ol></li><li> Birinci Amino Asit lekelenme <ol><li> Reklam tarafından gelen bir amino asidin karboksi grubunun aktif hale, zar üzerinde serbest amino grubu ile amit bağı oluşturmak içinDing aktivatör (N, N &#39;diizopropilkarbodiimid) ve amino asit türevine baz çözeltisi (Etil hidroksiimino siyanoasetat). </li><li> Programlanabilir robot kullanarak Amino-PEG işlevlendirilmiş membran üzerinde aktif amino asitler istenen hacimleri Nokta. NOT: Bu şekilde, bir amino asit, C-terminali zar amino grubuna birleştirilir. </li><li> İlk aktive amino asitin iyi kavramayı sağlamak için bu adımı üç kez tekrarlayın. Bağlanmamış amino asitlerini ayırmak için DMF ile yıkama, daha sonra 20 dakika boyunca zarın inkübe ve. </li></ol></li><li> Sigara nokta Alanları Ücretsiz Mekanların Engelleme Not: membran amino grubuna tüm peptitlerin birinci C-terminal amino asidin bağlanmasından sonra, lekeler ve ayrıca bir yer alanları içinde amino gruplarının bazıları arasındaki amino grupları, amino asitler ile bağlar oluşturmazlar. <ol><li> Kapama çözeltisi ile inkübe edilerek, bu, serbest amino grubu bloke (DMF içinde% 20 asetik anhidrit)5 dakika karıştırıldı. NOT: Bu membran yerine büyüyen peptid zinciri ile diğer çevrimlerde amino asitlerin bağlanmasını önler. </li></ol></li><li> Fmoc grubunun çıkarılması, <ol><li> Bloke edildikten sonra, DMF ile 4 kez zarın yıkanması ve daha sonra Fmoc koruma grubunun ayrılması için 20 dakika süre ile, DMF içinde% 20 piperidin ile inkübe edilir. NOT: Bu adım, bir amino-koruyucu Fmoc gruplarının bertaraf yol açar ve bu korumanın kaldırılması olarak adlandırılır. </li><li> Daha sonra etanol ile iki kez DMF ile birlikte iki kez, zarı yıkamak ve kurutun. Not: Hemen zar sonraki amino asitleri bağlamak için hazır hale gelir. </li></ol></li><li> Zincir uzama Not: her bir amino asit ilave edilmesi, bir devir denir. Yanı sıra, birinci amino asidin bağlanması ile ilgili çevrim bağlanmış amino asidin N Fmoc grubunun korumasının bozulması ile başlamakta ve büyüyen girişken amino grubuna gelen bir amino asidin aktive edilmiş karboksil grubunun bağlanması izlergelgit zinciri. <ol><li> İstenen peptid uzunluğu elde edilinceye kadar tekrarlayın 1.3 ve 1.5 adımları. </li></ol></li><li> Boyanma NOT: Son devirden sonra, peptid dizileri peptitlerin başarılı bir sentez teyit etmek için bromofenol mavisi ile boyanır. Bromofenol mavisi peptidlerin serbest amino grupları ile bağlanmaktadır. Peptit noktalar boyandıktan sonra açık mavi renk göstermek ama noktalar yoğunluğu peptid dizisi bağlı olarak değişir. Bu boyama peptidlerin renklendirilmesi çünkü piperidin bromofenol mavisi mevcudiyetinde, piperidin tamamen kaldırılması onay sağlar. Buna ek olarak, bu aynı zamanda daha fazla kullanım için peptid dizilerini işaretlemek için yardımcı olur. <ol><li> Son sentez çevriminde Fmoc grubunun korumasının giderilmesinden sonra, DMF ve% 100 etanol ile zarın yıkanması. Bu tamamen mavi olana kadar daha sonra 5 dakikalık bir minimum bromofenol mavisi (DMF içinde% 0.02 bromofenol mavisi) ile membran tedavi. </li><li> Daha sonra, DMF ve ETH ile kesilmesi, zarı yıkamakAnole 10 dakika boyunca kurutuldu. Şimdi synthesizer gelen zarı çıkar ve elle yan zincir Deproteksiyon (bölüm 1.8) gerçekleştirin. Gerekirse, peptid sentezi (Şekil. 2) sonuçlarını belgelemek için membran fotoğraflamak. </li></ol></li><li> Yan zincir korumasının bozulması <ol><li> Yan zincir koruma grupları ve tutucu reaktifler (% 2.5 su ve% 2.5 triizopropilsilan) amino asit yan zincirleri korumak bölmek için% 95 trifloroasetik asit (TFA) &#39;den oluşan bir yan zincir koruma kaldırma karışımının 20-25 ml membranlar tedavi Bu aşama sırasında değişiklik. Tamamen sıkıca kapalı kimyasal dirençli kutusunda zarı kapsamaktadır sağlamak ve yavaşça çalkalayarak 1-2 saat kuluçkaya yatırmaktır için korumayı kaldırma karışımın yeterli bir hacmi al. </li><li> 2 dakika her biri için, DCM (Diklorometan), 20-25 ml, membran altı kez yıkayın ve son olarak iki kez% 100 etanol ile ve gece boyunca bir kurutucu içinde kurutun. NOT: ŞimdiMembran deneyleri için de kullanılabilir. Peptid dizisi bir sentezleme şeması Şekil 1 &#39;de verilmiştir. </li></ol></li></ol> 2. Protein Ekspresyonu ve Saflaştırma <ol><li> GST füzyonları olarak PKMTs Protein Ekspresyonu <ol><li> Standart teknikler kullanılarak GST-füzyon proteini olarak ifade etmek tam uzunluktaki PKMT ya da (pGEX-6p2) gibi bir bakteriyel ekspresyon vektörü içine katalitik domenini kodlayan genin klonlanması. </li><li> BL21 BL21 veya kodon artı E. takın istenen PKMT ile vektör aktarın ısı şoku yöntemi ya da herhangi bir başka yöntem ile coli hücreleri. </li><li> İfade gün Luria-Bertani (LB) ortamı içinde 30 ml bir ön-kültür hazırlanması ve sürekli çalkalanarak 7-8 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Daha sonra, LB ortamı 1 L ihtiva eden bir 2 L&#39;lik büyük saptırma plakalı şişeler içine ön kültür, 10 ml transferi ve 37 ° C&#39;de inkübe Kültür ulaşamayacağı kadar sürekli sallayarak inkübatör ° C600 nm &#39;de tanımlanan bir optik yoğunluk, es. Not: Bu, her bir protein için optimize edilebilir birlikte, rutin olarak yaklaşık 0.8 olan bir OD 600Nm neden olur. indüksiyon sıcaklığı her bir protein için optimize edilmiş olması gerekir, bazı proteinler 22 ° C&#39;de iyi bir ifade göstermektedir ° C ve daha yüksek sıcaklıklarda bir. </li><li> Daha sonra izopropil-p-D-tiyogalaktopiranosid 1 mM; özellikle, 15 dakika boyunca indüksiyon sıcaklığına hücreleri Shift Kültür indüksiyon sıcaklığında 10-12 saat boyunca büyümeye olanak sağlar. </li><li> Daha sonra 15 dakika boyunca 5000 x g&#39;de santrifüj ile hücreler hasat ve son olarak da daha fazla kullanım için -20 ° C &#39;de STE tampon maddesi (10 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCI ve 0.1 mM EDTA) ve mağaza 30 ml pelet yıkayın. </li></ol></li><li> Protein Saflaştırma <ol><li> Hücre topağı çözülme ve sonikasyon tamponu (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCI, 1 mM DTT ve% 5 gliserol) 30 ml yeniden askıya ve sonikasyon ile bozmaktadır. NOT: Bu tampon nEEDS sonuç olarak her bir protein için optimize edilmiş olması. </li><li> 1 saat süre ile 22,000 x g&#39;de hücre lizat santrifüj ve daha sonra süpernatan toplamak ve glutatiyon Sefaroz 4B reçine 600 ul ihtiva eden bir sütun içinden geçer. </li><li> 50 sonikasyon tamponu ml yüksek tuz tamponu (7.5 50 mM Tris pH, 500 mM NaCI, 1 mM DTT ve% 5 gliserol), belirlenmemiş biçimde bağlı proteinleri uzaklaştırmak için 100 ml bir sonraki ile kolon yıkayın. 40 mM glutatiyon içeren yüksek tuz tamponu, 5 ml ile bağlı proteini elüte. </li><li> Düşük gliserol (20 mM Tris pH 7.4, 100 mM KCI, 0.5 mM DTT ve% 10 gliserol), pH 7.4, 2 saat boyunca ve daha sonra 20 mM Tris, 100 mM KCI, 0.5 mM diyaliz tampon maddesinin 2 L Tasfiye edilen proteini Dialyze DTT ve% 70 gliserol 8 saat veya gece boyunca karıştırılmıştır. Tüm saflaştırma tampon, 4 ° C &#39;de olduğundan emin olun ve protein denatürasyonunu önlemek için soğuk bir odada, protein saflaştırma gerçekleştirmek. </li></ol></li></ol> 3. Peptid dizisi Metilasyon <ol><li> Ön incuPeptit Dizilerin lenme <ol><li> Enzim ve pahalı radyoaktif etiketli AdoMet israfını önlemek için uygun büyüklükte bir kutu ya da plastik bir torbaya ya peptit dizisi metilasyon gerçekleştirin. 10 dakika boyunca enzimsiz ilgili metilasyon tampon içeren plastik torba içinde peptid dizisi membran ve etiketlenmiş [metil-3H] -AdoMet önceden inkübe edin. Örnek tam özellik profilini peptid dizisi için metilasyon tamponu 8 ml kullanmak için tampon hacmi, dizinin boyutuna bağlıdır. Her enzim için miktar ve AdoMet konsantrasyonu optimize. </li></ol></li><li> Peptit Dizilerinin metilasyonu <ol><li> Ön kuluçka tamponu atılır ve ilgili PKMT içeren metilasyon tamponu 8 ml membran inkübe ve etiketli [metil-3H] -AdoMet 1 saat ila 2. Not: bir metilasyon reaksiyonu için gerekli olan enzim miktarı belirli PKMT aktivitesine bağlıdır, bizim tarama deneyleri, 50 nM enzim yüzgeç genellikle başlatmaark konsantrasyonu. </li></ol></li><li> Peptit Dizilerinin Yıkama <ol><li> Daha sonra radyoaktif atık konteynerine metilasyon tampon atın ve bağlanmış proteinin ayrılması için 5 dakika için 100 mM amonyum bikarbonat ve% 1 SDS içeren tampon içinde, 20 ml ile 5 kez peptid dizileri yıkayın. Bir radyoaktif atık kabına yıkama tampon atın. </li></ol></li><li> Radyoaktif Sinyal Algılama <ol><li> Yıkamalardan sonra, radyo frekans sinyallerini çözeltisi (NAMP100V), 10 ml, 5 dakika boyunca zarın inkübe edilir. </li><li> Sonra, organik çözücüler için radyoaktif atık kabına güçlendir çözüm atmak bir plastik torba içinde peptit dizisi mühür ve bir otoradyografisidir kasetine koymak. </li><li> Karanlık bir odada peptid dizisindeki otoradyografisi filmi yerleştirin. Dikkatle kaseti kapatın ve en maruz -80 Gerekli süre için C °. Sonra, sonuçları analiz filmi geliştirmek. Farklı Expositio ile kez görüntü birkaç Yakalaman kere kuvvetle metile peptid yüzeylerde doygunluğunu önlemek için. </li></ol></li></ol> 4. Veri İşleme ve Analizi <ol><li> Nokta şiddetler dansitometrik Analizi <ol><li> Geleneksel tarayıcı filmi tarayın ve densitometri spot yoğunluklarını analiz. (Ücretsiz) bu kullanarak ImageJ veya ticari bir program yapın. NOT: Bu görev için Phoretix yazılımını kullanın. </li></ol></li><li> Normalleştirme ve Farklı Membranların gelen Sonuçlarının Ortalaması <ol><li> En az üç kez peptit dizisi metilasyon deneyler. 1.0 gibi bir referans yüzeyde arka plan çıkarma ve aktivitesini ayarlayarak her deney için taranan yoğunluklarını Normale. Bireysel noktalar için veri ortalama ve onlara olarak ortalama değerleri ve standart sapmaları rapor. </li></ol></li><li> Veri Analizi ve Görüntü <ol><li> Göreceli aktivitesini belirtmek için bir gri tonlama veya renk düzeni kullanarak 2D verileri çizilir. Bu wi yapınth Excel veya SigmaPlot burada gösterildiği gibi. Aynı zamanda, veri kalitesi analizi için tekrarlanan deneylerde standart sapmalarının bir dağılım grafiği hazırlanır. </li><li> Karşılaştırarak nicel substrat peptit her bakiyenin tanıma doğruluğu görüntülemek için bir ayrım faktör D 16,17 pozisyonunda x her bir amino asit i PKMT göreli tercih hesaplanır: D X i = &lt;V j ≠ i&gt; / V i - 1 V I pozisyon X ve amino asit i taşıyan peptit varyantının metilasyon oranı Burada &lt;h j ≠ i&gt; de dahil olmak üzere, x konumuna, farklı bir amino asit j ≠ i taşıyan 19 peptitlerin metilasyonu ortalama oranı (bir Vahşi tip sekansı). NOT: Bu tanımlanan ayrımcılık faktörü arka plan düzeyine bağlıdır. Tek Tortu,% 3 bir arka plan, bir ayrım ile belli bir pozisyonda kabul edilirse32,3 faktör elde edilmiştir. Bir pozisyonda hiçbir tercih 0 bir ayrımcılık faktörü sonuçlanır. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure+and+the+inheritance+of+epigenetic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).</li>
<li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+epigenetics%3A+from+mechanism+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li>
<li>Helin, K., Dhanak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+proteins+and+modifications+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromatin proteins and modifications as drug targets.</a> Nature. 502, 480-488 (2013).</li>
<li>Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+methylation+at+the+surface+and+buried+deep%3A+thinking+outside+the+histone+box%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).</li>
<li>Rathert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+lysine+methyltransferase+G9a+acts+on+non-histone+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets.</a> Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).</li>
<li>Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhosphoSite%3A+A+bioinformatics+resource+dedicated+to+physiological+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation.</a> Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).</li>
<li>Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+peptide+arrays+prepared+by+the+SPOT-technology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).</li>
<li>Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPOT+synthesis+as+a+tool+to+study+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions.</a> Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).</li>
<li>Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+kinase+target+phosphorylation+consensus+motifs+using+peptide+SPOT+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays.</a> Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).</li>
<li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SPOT-synthesis+technique.+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports--principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications.</a> Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).</li>
<li>Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+arrays+on+cellulose+support%3A+SPOT+synthesis%2C+a+time+and+cost+efficient+method+for+synthesis+of+large+numbers+of+peptides+in+a+parallel+and+addressable+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion.</a> Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).</li>
<li>Li, S. S., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+peptide+array+to+identify+binding+motifs+and+interaction+networks+for+modular+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains.</a> Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).</li>
<li>Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+peptide+arrays+using+SPOT-technology+and+the+CelluSpots-method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method.</a> Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).</li>
<li>Toepert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+SPOT+synthesis+and+native+peptide+ligation+to+create+large+arrays+of+WW+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).</li>
<li>Volkmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+application+of+peptide+arrays%3A+quo+vadis+SPOT+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem+%3A+a+EuropeanJournal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology.</a> Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).</li>
<li>Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+substrate+specificity+of+the+Dim-5+histone+lysine+methyltransferase+using+peptide+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistr.%2C+%26+biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays.</a> Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).</li>
<li>Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SET8+H4K20+protein+lysine+methyltransferase+has+a+long+recognition+sequence+covering+seven+amino+acid+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues.</a> Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).</li>
<li>Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+analysis-based+identification+of+new+methylation+targets+of+the+SET7%2F9+protein+lysine+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistr.%2C+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase.</a> Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).</li>
<li>Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+analysis+and+novel+substrates+of+the+protein+lysine+methyltransferase+NSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistr.%2C+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1.</a> Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).</li>
<li>Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scansite+2.0%3A+Proteome-wide+prediction+of+cell+signaling+interactions+using+short+sequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs.</a> Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).</li>
<li>Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+design+based+on+an+antibody+complementarity-determining+region+%28CDR%29%3A+construction+of+porphyrin-binding+peptides+and+their+affinity+maturation+by+a+combinatorial+method%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method.</a> Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).</li>
<li>Kramer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot+synthesis%3A+observations+and+optimizations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pept.+Res%22%5BJournal%5D)">Spot synthesis: observations and optimizations.</a> J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).</li>
<li>Stadler, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+synthesis+of+peptide+arrays+with+a+laser+printer%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).</li>
<li>Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+substrates+for+Cdk5+and+new+targets+for+Cdk5+inhibitors+using+high-density+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays.</a> Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).</li>
<li>Mah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+analysis+of+protein+kinase+complex+Dbf2-Mob1+by+peptide+library+and+proteome+array+screening%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening.</a> BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Burada tarif edildiği gibi SPOT sentezi, protein-protein etkileşimi sitesi harita ve peptit değiştirici enzim alt-tabaka tanıma araştırmak için güçlü bir yöntemdir. SPOT yöntemi ile sentezlenmiş peptitler, bu, her bir durumda teyit etmek zordur% 90&#39;dan daha fazla saflığa 21 için rapor edilmiştir, ancak Ancak, SPOT sentezi, hala bazı dezavantajlara sahiptir. Bu nedenle, sonuçlar örneği kullanılarak protein etki ya da standart yöntemlerle sentezlenebilir saflaştırılmış peptidler ile diğer yöntemler ile tekr...

Son iki yılda, çeşitli raporlar hücresel gelişim ve kanser gibi çeşitli hastalıkların, ancak son zamanlarda protein lisin metilasyonu bir başka hayati PTM olarak ortaya çıkmıştır içinde post-translasyonel modifikasyonlar (PTM) önemini göstermiştir. Başlangıçta sübstrat olarak histon lizin metilasyon önemli bir kromatin işareti olarak bulunurken, daha sonra çalışmalar da çeşitli sivil histon proteinler 1-4 lizin metilasyon gösterdi. lizin kalıntılarının ε-amino grubunda ve S-adenosil-L-metionin metil gruplarının bir transferi insan genomunda 60 proteinleri içeren protein Lizin metiltransferaz (PKMTs) olarak adlandırılan bir enzim ailesi tarafından katalize edilmektedir. PKMTs başlangıçta belirli lizin kalıntısı metillenmesi ancak daha sonra raporlar da olmayan histon proteinler 5 metillenmesi olabilir gösterdi histon modifiye enzimler olarak tespit edildi. Şimdiye kadar, yaklaşık 5.000 lizin metilasyon siteleri farklı proteinler 6 tespit edildi </skadar&gt;, ancak bu değişiklikler sorumlu enzimler genellikle tespit edilmez. Bunun bir nedeni, çoğu PKMTs özgünlüğü yoğun çalışılmamıştır olmasıdır. Bu nedenle, tekrar tekrar PKMTs yeni alt-tabakalar tespit edilmesi meydana gelir. PKMTs substrat seçiciliği detaylı bilgi eksikliği biyolojik fonksiyon ve rol anlayış engellemektedir. Ayrıntılı olarak PKMT özgünlüğünü incelemek için, bir veya birkaç amino asitin farklı bir çok peptit alt tabakasma metilasyonu oranları ölçülebilir olmalı ve ideal olarak peptid dizileri kullanılarak yapılır ki, karşılaştırıldı. Elde edilen özgüllük profilleri göre PKMTs potansiyel alt-tabakalar bundan başka incelenebilir olduğu tespit edilebilir. Peptid dizileri yaygın olarak antikorlar, peptid değiştirici enzimler ve protein-protein etkileşim bölgeleri (antikor-antijen, reseptör-ligand), 7-9 haritalama biyokimyasal analizi için kullanılan araçlardır. Peptidlerin birkaç yüz suc için gerekli olanh uygulamaları. Farklı yöntemler onları çok yaygın olarak kullanılan bir reçine üzerinde sentez peptit arasında, peptid sentezi için kullanılabilir, ancak bu verim değeri sınırlıdır ve bu nispeten pahalıdır. Bu sorunlar Frank ve arkadaşları 10 tarafından SPOT sentez yöntemi tanıtımıyla çözüldü. SPOT sentez yöntemi paralel olarak birkaç yüz peptitlerin sentezini sağlar ve ortalama reçine sentezi göre ucuzdur. selüloz zarı üzerinde sentezlenen peptidler zar ayrılır ve çözelti deneylerinde serbest peptidler olarak kullanılabilir ya da peptid mikrodiziler 10-13 hazırlamak için edilebilir çeşitli uygulamalar veya peptidlere doğrudan kullanılabilir. SPOT sentezi katı bir destek olarak bir selüloz zar kullanılır ve standart Fmoc kimyası kullanan 10-13 katı fazlı peptit sentezi, bir çeşididir. Bu nedenle, peptid zincirlerinin sentezlenmesi C-terminal ucunda başlar ve doğru ilerlerRibozomlar biyolojik sentezi aksine N-terminal ucu. Selüloz membranlar ilk olarak aktif amino asitler (Şek. 1) bağlanması için fonksiyonalize edilir. SPOT yöntem otomatik bir pipet sistemi kullanılarak zar üzerinde tanımlanan noktalar için çözücünün bir damlacık içinde aktive edilmiş bir amino asitlerin ardışık doğum dayanmaktadır. sıvı damlacık daha sonra peptit sentezinde kimyasal reaksiyonlar için açık bir reaktör olarak işlev yapan bir dairesel ıslak nokta oluşturur gözenekli zar üzerinde dağıtılır. spot büyüklüğü tevzi hacmi ve membran emme kapasitesi ile belirlenir, bu noktalar katları dizileri olarak düzenlenmiştir. sentez ölçekli nokta büyüklüğü ve membran yükleme kapasitesi ile ilişkilidir. noktalar ve dizilerin yoğunluğu arasındaki mesafe nokta boyutları değişen yönetilmektedir. Selüloz membran peptid sentezinde katı faz olarak bir çok avantajı vardır, bu kullanılan kimyasal için, ucuz toleranslıdırsulu çözeltiler içinde kararlı ve kolay olarak peptid sentezinde kullanılan als. Buna ek olarak, hidrofil bir karakter gösterir çeşitli biyolojik tahlil sistemleri için uygun yapar. SPOT Sentez elle gerçekleştirilir veya peptitler gerekli sayısına bağlı olarak, peptidler (1000&#39;ler için) otomatik hale getirilebilir. INTAVIS (Köln, Almanya) Tam otomatik SPOT sentezleyici bizim uygulamalar için kullanılır. Farklı miktarlarda ve farklı uzunlukta peptit sentezini mümkün kılar. Ayrıca, adım adım sentezi 14,15 hazırlanabilir doğrusal peptidler düzenli 42 amino asidin eklenmesi peptitlerde, 15-20 amino asit uzunluğunda sentezlenir. Bununla birlikte, amino asit sayısının artması peptidlerin kalitesini etkiler genel birleştirme verimi, azalmalara yol açar. Çünkü nokta başına peptidler düşük bir miktarının bu ürünler genel olarak saflaştırılması zor olan ve ayrı ayrı peptitlerin ürünlerin kalitesi daha kolay değerlendirilemez. Bu nedenle, sonuçlar SPOT Pept eldeide dizileri saflaştırılmış ve peptid sentezinde veya arzu edilen peptid dizilerini ihtiva eden proteinlerin sentezlenmesi ile standartlara göre analiz edilebilir büyük ölçekli standart yöntemler ile sentezlenir peptidler ya onaylanmalıdır. Yine, biz son derece güvenilir olması için SPOT sentezini buldum ve tekrarlanabilir olması genellikle sonuçları. SPOT sentez olan peptidler daha önce ve bundan başka son yan zincir koruma grubunun yarılması ve sonra modifiye sağlayan, amino asitler, aynı zamanda sentezi için kullanılabilecek çeşitli ticari olarak temin edilebilen tadil edilmiş amino asitler, proteinojenik ile sınırlı değildir, aynı zamanda dahil edilmesini sağlar fosforile metillenmiş ya da asitile edilmiş amino asitler, 11. SPOT yöntemi ile sentezlenmiş Hareketsizleştirilmiş peptit kolleksiyonları, çok sayıda biyolojik ve biyokimyasal analizler için de kullanılabilir. Bu PKMTs sübstrat spesifitesinin incelenmesi için 300-400 peptidleri içeren peptid dizileri kullanılabilir. Enzimatik modifi için, peptit dizileri, ilgili PKMT ile inkübe edilir ve uygun bir tampon maddesi içinde [metil- 3H] -AdoMet etiketli. ilgili alt-tabaka metilasyon otoradyografi ile peptid alt-tabakaya AdoMet gelen radyoaktif olarak etiketlenmiş metil grubu enzimatik transferi (Şek. 3) aşağıdaki şekilde analiz edilir. Bu prosedür ile, peptid dizileri, aynı zamanda, farklı peptit alt tabakasma metilasyonu çalışma sağlar. Bu yöntemin önemli bir avantajı, tüm peptidler metilasyon kinetiği doğrusal aşamasında, her bir peptidin nispi metilasyon ayrılma sabiti (k cat / K bölü katalitik hız sabiti ile orantılı olacak şekildedir, rekabet metillenmiş olmasıdır İlgili peptid maddesi için, enzim D). Bu nedenle, her bir nokta ile radyoaktivite miktarı, doğrudan belirli bir peptid karşı enzimatik aktivitesi ile ilişkilidir. Kullanmabir peptit dizisi metilasyon deneyin sonuçları, PKMT özgüllüğü profili teyit edilebilecektir, bu yeni yüzeylerde tanımlandığı gibidir ve dayalı olabilir. Peptit diziler peptid düzeyinde yeni yüzeylerde metilasyonu hızlı ve maliyet etkin doğrulama sağlar. Bunun için, dizi hedef bölgelerde yerine Lys Ala ihtiva eden modifiye edilmiş peptidler olarak pozitif ve negatif kontrol peptidleri ile birlikte tahmin edilen yeni alt tabakaların içeren hazırlanır. Son olarak, yeni alt-tabakalar bir araya mutantları ile protein, burada hedef Lys Ala ile değiştirilmiş olduğu ve metilasyon protein seviyesinde doğrulanabilir gibi hazırlanabilir. Sonuçlarına bağlı olarak, bu daha sonra yeni açıklanan protein maddelerinin metilasyonu potansiyel rolleri ele biyolojik çalışmalar takip edilmektedir.

<table><tbody><tr><td>Etanol abs Gradyan Sınıfı HPLC</td><td>Honeywell</td><td>10299901</td><td>Yanıcı</td></tr><tr><td>N, N-Dimetilformamid Peptit Sentezi</td><td>Biosolve</td><td>4193302</td><td>Yanıcı, Toksik</td></tr><tr><td>Piperidin ve ge; Peptit Sentezi için% 99</td><td>Roth</td><td>A122.1</td><td>Yanıcı, Toksik, aşındırıcı</td></tr><tr><td>Oxyma Pure (Etil (hidroksiimino) siyanoasetat)</td> <td>Novabiochem</td><td>8510860100</td><td></td></tr><tr><td> N, N' -Diizopropilkarbodiimid purum &; %98 GC</td><td>Fluka</td><td>38370</td><td>Yanıcı, Toksik, aşındırıcı</td></tr><tr><td>Asetik anhidrit</td><td>Roth</td><td>CP28.1</td><td>Yanıcı, Toksik, aşındırıcı</td></tr><tr><td>Triizopropilsilan %99</td> <td>Aldrich</td><td>233781</td><td>Yanıcı, Toksik</td></tr><tr><td>Diklormetan ve ge; % 99.9</td> <td>Roth</td><td>P089.1</td><td>Kanserojen</td></tr> <tr><td>< > N-Metil-2-Pirolidon</td><td>Roth</td><td>4306.2</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Türevlendirilmiş selüloz Membran</td><td>Intavis AG K&ouml; ln</td><td>32.1</td><td></td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit</td><td>Roth</td><td>P088.2</td><td>Toksik, aşındırıcı</td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Hidrojen</td><td>Karbonat Roth</td><td>T871.2</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat Peletleri</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td>Toksik, Yanıcı</td></tr><tr><td>MultiPep Sentezleyici</td><td>Intavis AG K&ouml; ln</td><td>n.a.HyperfilmTM</td><td></td></tr> <tr><td>yüksek performanslı film</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>Phoretix yazılımı</td><td>TotalLab</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

spot peptit diziler protein lizin methyltransferases Özgünlüğü analizi

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lizin metilasyonu yükselen bir translasyon sonrası modifikasyon olup, hücre gelişimi ve bir çok hastalıkta önemli bir rol oynar burada bu, birkaç histon ve histon olmayan proteinleri üzerinde tespit edilmiştir. Yaklaşık 5.000 lisin metilasyon siteleri, protein lisin methyltransferases birkaç onlarca tarafından belirlenen farklı proteinler, tespit edilmiştir. Bu artık, sadece bir ya da iki alt-tabakalar, bu enzimlerin birkaç için tespit edilmiştir, ancak kadar her PKMT birden proteinleri metile işaret etmektedir. Bu sorunu yaklaşım, biz girmiştik peptit dizisi bazlı substrat özgüllüğü PKMTs analizleri. Peptid dizileri farklı dizi ile çeşitli substratların metilasyon bir dizi test edilebilir, çünkü PKMTs özgüllüğünü tanımlamak için güçlü araçlardır. Biz INTAVIS SPOT sentezleyici kullanılarak selüloz zarı üzerinde peptid dizileri sentezlenmiş ve çeşitli PKMTs özgüllüğünü analiz edilmiştir. Bu enzimlerin birçoğu için, sonuçlara göre, yeni substrates tanımlanabilir. Örneğin peptit dizileri kullanılarak NSD1 için, bunun H4 K44 yerine rapor H4K20 metile ve buna ek olarak H1.5K168 önceden bilinen H3K36 üzerinde yüksek ölçüde tercih edilen alt-tabaka olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, peptid dizileri biyokimyasal PKMTs karakterize güçlü araçlardır.

Bu yaklaşım 5,16-19 ile peptid dizileri başarılı bir şekilde biyokimyasal olarak PKMTs özgüllüğünü tanımlamak için kullanılmıştır ve PKMT birkaç yeni histon ve histon olmayan alt-tabakalar tanımlanmıştır. Bir PKMT (veya herhangi bir enzim) doğru substrat spektrumunu tanımlama moleküler mekanizması ve hücresel fonksiyonların anlaşılması yönünde önemli bir adımdır. Peptid SPOT dizi metilasyon yöntemin bir uygulama örnek olarak, NSD1 PKMT 19 özgüllüğü analiz sonuçlarını ta...

SPOT yöntemiyle sentezlenen peptit dizileri, Protein lizin metiltransferazların (PKMT'ler) substrat özgüllüğünü analiz etmek ve biyolojik rollerini anlamak için PKMT'lerin substrat spektrumunu tanımlamak için kullanılabilir. Bu protokol, peptit dizilerinin nasıl sentezleneceğini, PKMT'lerle nasıl metilleneceğini ve sonuçların nasıl analiz edileceğini açıklar.

SPOT Peptit Diziler Protein Lizin Methyltransferases Özgünlüğü Analizi

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, protein lizin metil transferazların veya PK mts'nin substrat özgüllüğünü araştırmaktır. Bu, bir başlangıç substratının tanımlanması ve bu substratın farklı pozisyonlarda tek amino asit değişimleri içeren birkaç varyantı ile peptit dizilerinin hazırlanması ile elde edilir. İkinci bir adım olarak, peptit dizisi, radyoaktivitenin karşılık gelen peptit noktasına aktarılmasıyla peptit metilasyonunun saptanmasına izin veren bir radyoaktif metil grubu donörü varlığında PKMT ile inkübe edilir.Daha sonra, dizi bir x-ışını filmine maruz bırakılır ve peptitlerin her birindeki metilasyon aktivitesini belirlemek için kantitatif olarak analiz edilir. Ve PKMT'nin özgüllük profilini tanımlamak için, sonuçlar, substrat peptidindeki hangi amino asitlerin PKMT tarafından metilasyonu için kritik olduğunu gösterir. Bu tekniğin veya tek tek peptitlerin metilasyonu gibi mevcut yöntemlerin ana avantajı, bir dizi farklı peptitin tek bir deneyde uygun maliyetli bir şekilde test edilebilmesidir.Bu yöntem, PK mtss'nin daha önce bilinmeyen yeni substratlarının spesifikasyonu gibi protein lym metilasyon alanındaki anahtar soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Dolayısıyla bu yöntem, PK mts'nin özgüllüğü hakkında fikir verebilir. Ayrıca protein kinazlar, diğer protein yöntemi, transferazlar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir veya transferazlara eklenebilir.Bu yöntem için ilk olarak, peptit spot sentezi kullanarak makul maliyetlerle büyük özel peptit dizileri hazırlama olasılığına aşina olduğumda aklıma geldi Bu prosedüre başlamak için, çoklu pep gözcü yazılımını kullanarak sentez için peptit dizileri tasarlayın. Peptit dizilerini, bu ön şişmeyi takiben spesifik amino asidi, uçta amino peg işlevselleştirilmiş nokta zarını, 10 dakika boyunca uç dimetilformamid veya DMF'yi tanımlayan tek bir harf kodu olarak girin. Bitirdiğinizde, ıslak zarı herhangi bir hava kabarcığı veya kırışıklık olmadan nokta sentezleyici çerçevesine yerleştirin.Sentez programına başlamadan önce zarı en az 10 dakika tamamen kurulayın. Membran üzerindeki serbest amino grubu ile amid bağı oluşturmak için membranı %100 etanol ile üç kez yıkayın. Amino asit türevine DIC ve etil hidroksi amino sino asetat ekleyerek gelen amino asidin karboksi grubunu aktive edin.Aktivasyonu takiben, programlanabilir robotu kullanarak amino peg işlevselleştirilmiş membran üzerinde istenen hacimlerde aktif amino asitleri tespit edin. İlk aktive edilmiş amino asidin daha iyi bağlanmasını sağlamak için önceki adımı üç kez tekrarlayın. Membranı 20 dakika inkübe ettikten sonra, kuruduktan ve serbest amino gruplarını bloke ettikten sonra bağlanmamış amino asitleri çıkarmak için DMF ile yıkayın.Membranı DMF ile dört kez yıkayın ve ardından FM koruma grubunu çıkarmak için DMF'de% 20 piperin ile 20 dakika inkübe edin. Membranı yıkadıktan ve kuruttuktan sonra, istenen peptit uzunluğu elde edilene kadar lekelenme ve F MOC giderme adımlarını tekrarlayın. Son F MOC grup D korumasını takiben, membranı DMF ve% 100 etanol ile yıkayın.Daha sonra zarı DMF'de %0.02 brom fenol mavisi ile tamamen maviye dönene kadar en az beş dakika tedavi edin. Membranı yıkadıktan ve kuruttuktan sonra, sentezleyiciden çıkarın ve kimyasallara dayanıklı bir kutuya koyun. Amino asit yan zincirlerini modifikasyondan korumak için yan zincir koruma gruplarını ve süpürücü reaktifleri parçalamak için %95 trikloroasetik asitten oluşan 20 ila 25 mililitre yan zincir D koruma karışımı ile muamele edin.Derin koruma karışımının zarı kapladığından emin olduktan sonra, kutuyu tamamen kapatın ve inkübasyondan sonra hafifçe çalkalayarak bir ila iki saat inkübe edin. Membranı altı kez, her biri iki dakika boyunca 20 ila 25 mililitre di kloro metan ile yıkayın. % 100 etanol ile iki kez yıkadıktan sonra, zarı gece boyunca kurutun.Daha sonra, peptit dizisi zarını, enzim içermeyen ilgili metilasyon tamponunu içeren kapalı bir plastik torba içinde önceden inkübe edin ve radyoaktif olarak etiketlenmiş metil grubu ile amet 10 dakika boyunca, ön inkübasyon tamponunu atın ve zarı, ilgili PKMT'yi içeren sekiz mililitre metilasyon tamponunda bir ila iki saat inkübe edin. Bunu takiben, metilasyon tamponunu bir radyoaktif atık kabına atın ve peptit dizilerini, bağlı proteini çıkarmak için 100 milimolar amonyum bikarbonat ve% 1 STS içeren 20 mililitre tampon ile beş kez yıkayın. Radyoaktif atık kabındaki son yıkama tamponunu attıktan sonra, zarı 10 mililitre amplifiye edici çözelti içinde beş dakika inkübe edin.Ardından, organik çözücüler için radyoaktif atık kabındaki yükseltici çözeltiyi atın. Peptit dizisini plastik bir torbaya koyun ve bir oto radyografi kasetine koyun. Oto radyografi filmini karanlık bir odada peptid üzerine yerleştirin.Ardından kaseti dikkatlice kapatın. Filmi eksi 80 santigrat derecede pozladıktan sonra, sonuçları analiz etmek için geliştirin. Son olarak, güçlü şekilde metillenmiş peptit substratlarının doygunluğunu önlemek için görüntüyü farklı pozlama süreleriyle birkaç kez yakalayın.Bir peptit dizisinin NSD ile metilasyon reaksiyonunun bir örneği burada gösterilmiştir. Yatay eksen, peptit dizisini ve dikey yönde temsil eder. Değiştirilmiş amino asit, nsd ile metilasyonu gösterir, biri spesifik olarak H üç K 36 üzerinde etkili olduğunu ve NSD'nin üç peptit dizisi deneyinin hedef lizin konsolidasyonunun her iki tarafında üç ila dört amino asit kalıntısını tanıdığını gösterir.Peptitlerin yaklaşık% 85'i artı veya eksi %20'den daha küçük standart sapmalar gösterir ve peptitlerin %97'sinden fazlası artı veya eksi %30'dan daha küçük standart sapmalar gösterir Hesaplanan ayrım faktörü verileri, NSD'nin eksi iki pozisyonunda aromatik kalıntıları tercih ettiğini göstermektedir. Eksi bir ve artı iki bölgelerde, hidrofobik atik kalıntıları tercih eder. Ve artı bir sitede, arginin, lisin, glutamin veya asparagin tercihi vardır.Potansiyel yeni peptit substratları, insan proteomunun veri tabanı aramalarıyla bulunabilir. Bu peptitlerin bazılarının bazı peptitlerle güçlü metilasyonu, yeni NSD bir peptit substratları olarak kimliklerini doğrular. Bu prosedürü denerken, bu prosedürü takiben en uygun ilk alt tabakayı kullanmayı unutmamak önemlidir.Proteinlerin substrat olarak kabul edilip edilmediğini öğrenmek için in vitro ve hücrelerde karşılık gelen proteinlerin metilasyonu gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu teknik, protein lizin mesilasyonu alanındaki araştırmacıların, birçok PK mt'nin substrat özgüllüğünü tanımlamasının ve birkaç yeni substratı tanımlamasının yolunu açtı. Bu, PK mts'nin önemli biyolojik işlevinin anlaşılmasına yardımcı oldu.Peptit sentezinde radyoaktivite ve organik çözücülerle çalışmanın iddia edilebileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman uygun önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

specificity-analysis-protein-lysine-methyltransferases-using-spot

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yakalama Bileşikler fotoğraf crosslinking ve saflaştırma takip fonksiyonel geri dönüşümlü küçük molekül-protein etkileşim proteom karmaşıklığını azaltmak için trifunctional küçük moleküllerdir. Burada Yakalama...

Methyltransferases, profilleme ve Diğer S Adenosil- L</subYakalama Bileşik Kütle Spektrometresi (CCMS)> homosistein bağlayıcı Proteinler

Biz lisin metilasyon değişiklikleri ölçmek için MALDI kütle spektrometresi ve indirgeyici metilasyon kimya kullanmak için bir yöntem sunuyoruz.

Lizin demetilaz Faaliyet Kantitatif Ölçümler MassSQUIRM Uygulaması

Bu video, histon peptitleri üzerindeki translasyon sonrası modifikasyonları (PTM'ler) tanıyan antikorların özgüllüğünü profillemek için peptit mikrodizi teknolojisini uygulayan bir tekniği göstermektedir. Bilinen PTM kombinasyonlarına sahip hareketsizleştirilmiş florofor konjuge histon peptitleri içeren bir mikrodizi slaytı, hedef PTM'ye özgü antikorlarla muamele edilir. Bu işlem, antikorun hedef için özgüllüğünü ve hedef olmayan PTM'lerle potansiyel çapraz reaktivitesini tanımlamaya yardımcı...

Antikorların Özgüllük Profili için Bir Peptit Mikroarray Teknolojisi

Yerli birleştirerek ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile kromatin imunopresipitasyon çapraz bağlanmasıyla, ChroP yaklaşım histon modifikasyonları, çeşitleri ve fonksiyonel olarak farklı kromatin etki de synergizing olmayan histonic proteinlerin kompozit proteomik mimarisini incelemek için olanak sağlar.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Peptit dizisi taraması, protein-protein etkileşim bölgelerini tanımlamak için yüksek verimli bir testtir. Bu, bir hedef proteinin çoklu etkileşimlerinin haritalanmasına izin verir ve bir proteini hedef alan inhibitörler için bölgeleri belirlemek için bir yöntem olarak hizmet edebilir. Burada peptit dizilerini taramak ve analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Bu el yazısı, histonları ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını tanıyan antikorların spesifiklik profiline peptid mikroarray teknolojisinin uygulanması için yöntemleri açıklamaktadır.

Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi

Burada, proteaz özgüllük ham fare doku belirlemek için bir protokol MALDI-TOF spektrometresi kullanılarak özleri mevcut.

Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle

Bu iş akışı, nicel küresel proteomik analiz için aynı anda birden fazla protein çeviri sonrası modifikasyonun (PtM) zaman ve maliyet-etkin zenginleşmesinin performansını açıklar. Protokol, ptm çapraz konuşmasına biyolojik kavrayışlar kazandırmak için birden fazla konjuge antikorla peptid düzeyinde PTM zenginleştirme, ardından da veri bağımsız iktisap kütle spektrometresi analizini kullanmaktadır.

Niceleme ve Site Yerelleştirmesi Için İki Çeviri Sonrası Modifikasyonun Eşzamanlı Affinity Zenginleştirmesi

Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, çoklu biyolojik yolları düzenleyen geniş çaplı bir translasyonel sonrası modifikasyondur. Kütle spektrometresi, modifiye peptid zenginleştirme için biyokimyasal yaklaşımlarla birleştirildiğinde, R-metil-proteomun küresel profilini çıkarmak için en iyi teknolojidir. İnsan hücrelerinde küresel R-metilasyonun yüksek güvenilirlikle tanımlanması için tasarlanan iş akışı burada açıklanmaktadır.

Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

Bu makalede, ölüm sonrası bozulmayı önleyen endojen peptitleri korumak için ısı inaktivasyonuna dayanan bir örnek hazırlama yöntemi ve ardından izotopik etiketleme artı LC-MS kullanarak göreli nicelik açıklanmaktadır.

Peptidomik Çalışmalar için Aminlerin Indirgeyici Metilasyonunu Kullanarak Numune Hazırlama ve Göreli Nicellik

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlardaki dinamik lizozomal mikro çevreyi karakterize etmek için proteomik protokolü etiketleyen bir nöronal lizozom yakınlık protokolü burada tanımlanmıştır. Lizozomal membran proteinleri ve lizozomlarla etkileşime giren proteinler (kararlı veya geçici olarak), canlı insan nöronlarında mükemmel hücre içi uzamsal çözünürlük ile bu yöntemde doğru bir şekilde ölçülebilir.

Nöronal lizozom interaktomunun yakınlık etiketleme proteomikleri ile karakterizasyonu

Öğrenin, SPOT peptit dizileri yöntemiyle protein lizin metiltransferazların substrat özgünlüğünü nasıl analiz edebilirsiniz. Bu teknik, PKMT biyolojik rollerini anlamak için kritik amino asitleri belirlemenizi sağlar.

SPOT Peptit Diziler Protein Lizin Methyltransferases Özgünlüğü Analizi

Daha fazla video keşfet