Name: Bir Ex vivo Akut Beyin Dilimleri bir Oligodendrosit yönelik T-Hücre Saldırı Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Öğrenin, akut beyin dilimleri kullanarak oligodendrosit yönelik CD8+ T-hücre saldırılarını incelemeyi. Bu yöntem, nöroimmünolojide demiyelinizasyon ve nöronal apoptoz mekanizmalarını detaylı çalışmanıza olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Disiplinlerarası Klinik Araştırma Merkezi (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 - S.G.M. ME3283/2-1 - S.G.M.) ve Yenilikçi Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB ve SGM) tarafından desteklenmiştir.

Fareler kullanan tüm deneyler ilgili kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi kurallarına uygun olarak yapılmalıdır. Fare Deneyler için 1. Genel Yorumlar <ol><li> Patojen içermeyen koşullar altında fareler tutun ve onlara yiyecek ve su ad libitum erişim sağlar. NOT: immünolojik desenler yaş ve cinsiyet ile değişebilir çünkü deney gruplarında yaş ve cinsiyet uyumlu fareler kullanmak önemlidir. </li></ol> 2. hazırlanması ve Aktivasyon OVA-spesıfik CD8 + T hücreleri (OT-I) <ol><li> Beyin dilimleri hazırlama 5 gün, aşağıda tarif edildiği gibi OT-I T hücrelerinin uyarılmasını yapın. Not: 5 x 10 5 aktive efektör CD8 + OT-I T hücreleri, (CD8 + T hücreleri, MHC-I-molekülleri bağlamında sadece OVA257-264 peptidi tanıyan transgenik farelerin) dilim başına gerekli olan konsantrasyonu 5 x 10 5, deney seçildihücreler aynı zamanda, dilim içine göç ve başlar bir kez iyi bir hücre-hücre etkileşimi lehine optimum olarak müttefik, hücrelerin miktarı tek hücre 8,18 sayma sağlayan bir aşırı reaksiyonunu uyarmak için çok yüksek değil. </li><li> OT-I T hücrelerinin kültürlenmesi için ortam hazırlar. % 5 fetal dana serumu (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 50 uM 2-merkaptoetanol,% 1 esansiyel olmayan amino asitler ve 25 ug / ml gentamisin 500 mi DMEM Supplement. Kullanılana kadar 4 ° C &#39;de orta saklayın. </li><li> Referans 16&#39;daki gibi OT-I transgenik farelerin dalak çıkarın. Hazırlanan ortama aktarabilirsiniz. </li><li> 5 dakika, 4 ° C 300 xg&#39;de 70 mikron süzgeç ve santrifüj süspansiyon yoluyla dalak ezme yoluyla tek bir hücre süspansiyonu oluşturun. </li><li> Kırmızı kan hücreleri lize etmek için 5 dakika boyunca 5 mi amonyum klorür-potasyum (ACK), tampon (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO 3, 0.1 mM EDTA, pH 7.3) ile bir hücre süspansiyonu inkübe edin. </li><li> Kuluçkalamadan DurTekrar 10 ml ortam santrifüj o ile ilgili yukarıda tarif edildiği gibi. </li><li> Orta hücre süspansiyonu seyreltin ve sayıları hesaplamak. Plaka 3 x 10 7 hücre yoğunluğunda hücre / kuyuda 12-kuyu plaka ve birinci bunları inkübasyon tarafından OVA 257 - 264 (SIINFEKL; 1 nM) ve IL-2 (IL-2), (500 lU / ml) 5 gün. </li><li> 4 gün sonra, 500 IU / ml yoğunlukta yeniden IL-2 ilave edin. </li><li> Uyarımı takiben, imalatçının talimatları izlenerek bir negatif seçim göre fare CD8 + T hücresi izolasyon kiti kullanılarak hücre süspansiyonundan OT-I T hücrelerinin saflaştırılması. Arıtma CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC Sınıf II Ter-119 ve TCRγ karşı bir antikor kokteyli olmayan tüm CD8 + hücrelerinin azalmasına dayanmaktadır / δ daha sonra saflaştırılmış CD8 + T hücrelerinin, yıkama için manyetik sütun kullanarak atılır olan. NOT: Bu procedu Kritik adımlaryeniden üretici tarafından gösterilir: bu topakların bulunması yıkama aşaması esnasında sütun bloke çünkü reaksiyon sadece tek hücreler içeren çok önemlidir; Byotin kokteyl ilave edilmeden önce hücre sayımı örnek saflık derecesi için önemlidir ve işlem spesifik antikor bağlantıları en aza indirmek için, buz üzerinde yapılmalıdır. </li></ol> OT-I T-hücreleri ile Akut Beyin Dilimleri ve Co-kültür 3. Hazırlık <ol><li> Akut beyin hazırlanmasından önce 19, 200 mM sakaroz, 20 mM PIPES, 2.5 mM KCI, 1.25 mM NaH 2 PO 4, 10 mM MgSO 4, 0.5 CaCl2 ve 10 mM dekstroz ile placedine buz soğukluğunda fizyolojik yemek tuzu çözeltisi hazırlamak dilimler ve yapay serebrospinal akışkan (ACSF) 125 mM NaCI, 2.5 KCl, ile 1.25 NaH 2 PO 4, 24 mM NaHCO 3, 2 mM MgSO 4, 10 mM dekstroz, 2 mM CaCl2,. Usin ile 7,35 her çözeltinin pH ayarlamag NaOH. ACSF pH değerinin ayarlanması önce çözelti,% 95 O2 ve% 5 CO2 karışımı ile kabarcıklar halinde olmalıdır. </li><li> Çözüm Öncesi serin. </li><li> 8 uyutmak - (10 haftalık fareler gibi, C57Bl% 5.0 izofluran,% 5.0 halotan veya bekleyin ip üzerinden 100 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg vücut ağırlığı ksilazini enjekte kullanarak kontrol veya inhalasyon ile transgenik ODC-OVA fareler 17 gibi / 6 anestezi. anestezi düzeyini değerlendirmek ve bir kerede onları başını kesmek için bir ayak tutam kullanmak ve kurumsal hayvan bakımı göre fareler Euthanize ve ötenazi için komite kriterlerini kullanabilirsiniz. </li><li> Ventral pozisyonda fare koyun. Dezenfekte ve sagittal saç derisini kesti. , Sagitally kranial kemik açın, bir kepçe yardımı ile hızlı bir şekilde beyin kaldırmak ve tutkal kullanarak bir vibratome plaka üzerine sabitleyin. </li><li> Hazırlanan placedine buz soğukluğunda fizyolojik yemek tuzu çözeltisi ile plaka doldurun. </li><li> Vibratome ile 300 mikron koronal dilim kesin. NOT: Bu prosedür biliyorumn, en az 8 saat, 19-21 arasında bir zaman aralığı içinde işlevsel hücresel çalışmalar için uygun olan canlı sağlam doku örneklerinin elde edilir. Nitekim, zaten 6 saat sonra başlayan bu süre, sonra, hazırlık azaltılmış kalite, aksiyon potansiyeli üretimi ve yayılması gibi temel ve fonksiyonel özelliklerinde yani değişiklikleri gösterir. </li><li> Kesit sonra ACSF ile dolu bir 12 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, hemen bir dilim aktarın. </li><li> Dilim başına dikkatli bir şekilde 5 x 10 5 OT-I T hücrelerinin ekleyin. </li><li> Bir kuluçka makinesi içinde en fazla 8 saat (37 ° C,% 5 CO2) için dilim inkübe edin. </li><li> Kuluçka dönemi, hasat dilimleri ve sonra Ekim bileşik Doku Tek kullanarak onları gömmek ve sıvı azot onları dondurmak. Değerlendirilmesi, örneğin, daha fazla histolojik çalışmalar için -20 ° C &#39;de nöronal yapı (örneğin, kullanılarak anti-MAPII ya da anti-sinaptofisin antikorlar) ya da apoptozu (saklayın örneğin, bir anti-Kaspaz-3 antikorları, anti-neun anti kullanarakorganları), standart prosedürlere göre yöntem. </li></ol>

<ol><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+demyelination+in+PML+and+MS%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences.</a> Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).</li>
<li>Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transected+neurites%2C+apoptotic+neurons%2C+and+reduced+inflammation+in+cortical+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions.</a> Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).</li>
<li>Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpial+demyelination+in+the+cerebral+cortex+of+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).</li>
<li>Babbe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+expansions+of+CD8%28%2B%29+T+cells+dominate+the+T+cell+infiltrate+in+active+multiple+sclerosis+lesions+as+shown+by+micromanipulation+and+single+cell+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction.</a> J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).</li>
<li>Junker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+T-cell+receptor+expression+in+distinct+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions.</a> Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).</li>
<li>Skulina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+brain-infiltrating+CD8%2B+T+cells+persist+as+clonal+expansions+in+the+cerebrospinal+fluid+and+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).</li>
<li>Friese, M. A., Fugger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoreactive+CD8%2B+T+cells+in+multiple+sclerosis%3A+a+new+target+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy.</a> Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).</li>
<li>Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+and+neuronal+damage%3A+direct+and+collateral+mechanisms+of+cytotoxicity+and+impaired+electrical+excitability%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability).</a> FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).</li>
<li>Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+analysis+of+T+lymphocyte+subsets+in+the+central+nervous+system+in+chronic+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis.</a> J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).</li>
<li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+analysis+of+the+cellular+infiltrate+in+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions.</a> Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).</li>
<li>Hoftberger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules+on+the+different+cell+types+in+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions.</a> Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).</li>
<li>Göbel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+neuronal+apoptosis+in+CNS+gray+matter+during+an+oligodendrocyte-directed+CD8%28%2B%29+T+cell+attack%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack.</a> Glia. 58, 469-480 (2010).</li>
<li>Melzer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+neuronal+cell+death+during+an+oligodendrocyte-directed+CD8%2B+T+cell+attack+in+the+CNS+gray+matter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter.</a> J Neuroinflammation. 10, 121(2013).</li>
<li>Huseby, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathogenic+role+for+myelin-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+in+a+model+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis.</a> J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).</li>
<li>McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bystander+killing+of+neurons+by+cytotoxic+T+cells+specific+for+a+glial+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen.</a> Glia. 53 (5), 457-466 (2006).</li>
<li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76 (1), 17-27 (1994).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+transgenic+mice+expressing+ovalbumin+in+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes.</a> Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).</li>
<li>Göbel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29+CD25%28%2B%29+FoxP3%28%2B%29+regulatory+T+cells+suppress+cytotoxicity+of+CD8%28%2B%29+effector+T+cells%3A+implications+for+their+capacity+to+limit+inflammatory+central+nervous+system+damage+at+the+parenchymal+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level.</a> J Neuroinflammation. 9, 41(2012).</li>
<li>Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin+slice+preparation+for+patch+clamp+recordings+from+neurones+of+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system.</a> Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).</li>
<li>Meuth, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+TWIK-related+acid-sensitive+K%2B+channel+1+%28TASK1%29+and+TASK3+channels+to+the+control+of+activity+modes+in+thalamocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons.</a> J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).</li>
<li>Misgeld, U., Frotscher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+the+viability+of+neurons+in+hippocampal+slices+on+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply.</a> Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).</li>
<li>Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+activation+of+antigen-specific+CD8%2B+T+cells+in+the+presence+of+antigen+in+organotypic+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices.</a> J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Farklı hayvan modelleri MS gibi inflamatuar demiyelinizan hastalıklarının patolojik özellikleri ele son on yıl içinde tarif edilmiştir. In vivo fare hem de sıçan modelleri yaygın bir hastalık patofizyolojik özelliklerini taklit etmek için kullanılır, yani, demiyelinasyon ve remiyelinizasyon işlemlerinin sonuçlarının analizi ve inflamasyon ve nörodejenerasyonda içiçe bölüm. Bununla birlikte, sadece bir ex vivo yaklaşım tam altında yatan mekanizmaları incelemek için izin verir. <p class="jove_content...

Multipl skleroz (MS) geçiren bireylerde gri cevher lezyonlarında oligodendrositlerin ölümü ve miyelin kılıfının tahrip olması, nöron ve akson kaybına eşlik eden tipik patolojik bulgulardır1,2. Kortikal lezyonlar şimdiye kadar subpiyal, intrakortikal ve lökokortikal lezyonlar olmak üzere üç farklı alt tipe ayrılabilir2. Beyaz cevher plaklarıyla karşılaştırıldığında, infiltratlar CD8 + T hücrelerinin baskınlığı ile karakterize edilir, bu da gri madde iltihabında olası belirleyici rollerini düşündürür3. Ayrıca, kan, beyin omurilik sıvısı (BOS) ve enflamatuar lezyonlar içinde oligoklonal genişlemeler, CD8 + T hücrelerinin kendileri içinbulunabilir 4-6. 
Buna paralel olarak, CD8+ T hücrelerinin farklı miyelin proteinleri için spesifik olabileceği varsayılmaktadır7,8. Gerçekten de, CD8 + T hücreleri, MHC I ekspresyonunu11 gösteren oligodendrositlerin ve miyelin kılıflarının9,10 yakınında bulunur ve bu nedenle miyelin kılıfının kaybından sorumlu olabilir. Bu süreç genellikle merkezi sinir sistemi (CNS) gri cevheri1,2 içinde geniş "kollateral" nöronal ve aksonal hasar ile birlikte görülür. Aslında, oligodendrositlerin ve nöronların doğrudan ve dolaylı ölümü, CD8 + T hücreleri tarafından iki farklı mekanizma ile indüklenir: (i) perforinlerin ve granzimlerin salınmasını takiben sitotoksik granüllerin oluşumuna bağlı hücre zarı şişmesi ve yırtılması ve (ii) Fas reseptörlerine bağlanma veya yüzeylerinde FasL açığa çıkması8,12,13.
Bahsedilen süreçlerin altında yatan mekanizmayı incelemek için farklı türde hayvan modelleri oluşturulmuştur. Bu bağlamda, oligodendrositler veya astrositler gibi CNS glial hücrelerinde indüklenmiş ekspresyona sahip otoantijenlere özgü astarlanmış CD8+ T-hücreleri, daha sonra gri cevherde "kollateral" nöronal ve aksonal ölümü analiz etmek için evlat edinilebilir14,15. Bu tür in vivo deneyleri gerçekleştirmek, MS'in bazı patofizyolojik yönlerini taklit etmek için büyük bir yardımcıdır, ancak bu yaklaşım, aksonal hasar ve nöronal apoptozun altında yatan mekanizmayı ve kinetiği çözmek için uygun değildir.
Bu kısıtlamaların üstesinden gelmek için, oligondendrositlere yönelik bir CD8+ T hücresi saldırısını takiben nöronal hücre ölümünün mekanizmalarını ve zaman seyrini incelemek için ex vivo bir yaklaşım oluşturulmuştur. İmmün hücreler tarafından sadece oligodendrositler ve dolayısıyla miyelin kılıf üretiminin hedeflenmesi gerektiğinden, MHC sınıf-I sınırlı, ovalbümin (OVA)-reaktif OT-I Thücreleri kullanılır16. Bu hücreler daha sonra oligodendrositlerde (ODC-OVA fareleri) seçici olarak OVA eksprese eden farelerden elde edilen beyin dilimlerine aktarılır17.

<table><tbody><tr><td>12 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>2-Metilbutan</td><td>Roth</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>70 & mikro; m süzgeç</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td>kalsiyum klorür</td></tr><tr><td>CD8+-izolasyon kiti</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-859</td><td></td></tr><tr><td>D (+) - glikoz</td><td>Merck</td><td>1.08337.1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>37 & derece sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td></td><td>EDTA Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA Laboratuvarları</td><td>A15-151</td><td>fetal buzağı serumu</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-050</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Peprotech</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Abbott</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04933.0500</td><td>potasyum klorür</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P9144</td><td>potasyum hidrojen karbonat</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck</td><td>1.05886.0500</td><td>magnezyum sülfat</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td>sodyum klorür</td></tr><tr><td>NaH2PO4 * H2O</td><td>Merck</td><td>1.06346.0500</td><td>sodyum hidrojen fosfat</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td>sodyum hidrojen karbonat</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.09137.1000</td><td>sodyum hidroksit</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>213330</td><td>amonyum klorür</td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asit</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>OVA (257-264)</td><td>Genscript</td><td>RP10611</td><td>ovalbümin</td></tr><tr><td>BORULAR</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Merck</td><td>1.07687.1000</td><td></td></tr><tr><td>Doku-Tek OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

bir ex vivo akut beyin dilimleri bir oligodendrosit yönelik t-hücre saldırı modeli

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Multipl skleroz (MS) gibi inflamatuar demiyelinizan hastalıklarda kortikal ve subkortikal gri cevher lezyonlarında oligodendrositlerin ölümü ile nöron ve akson yıkımı tipik histopatolojik bulgulardır. Bu bozukluklarda, miyelin ve oligodendrosit ile ilişkili antijenler için varsayılan özgüllüğe sahip CD8 + T hücreleri bulunur, bu nedenle gri cevher lezyonlarındaki nöronal apoptoz bu hücrelerin bir yan etkisi olabilir. Bahsedilen patofizyolojik süreçlerin altında yatan mekanizmaları incelemek için farklı türde hayvan modelleri oluşturulmuştur. Bununla birlikte, MS'in bazı yönlerini taklit etseler de, "kollateral" nöronal hücre ölümünün kesin mekanizmasını ve zaman seyrini incelemek imkansızdır. Bu kursu ele almak için, burada oligodendrosit yönelimli bir CD8 + T hücresi saldırısını takiben nöronal hasarın mekanizmalarını ve zaman tepkisini incelemek için bir protokol gösteriyoruz. Sadece miyelin kılıfını ve oligodendrositleri hedeflemek için, in vitro aktive oligodendrosit-spesifik CD8 + T-hücreleri akut olarak izole edilmiş beyin dilimlerine aktarılır. Tanımlanmış bir inkübasyon döneminden sonra, miyelin ve nöronal hasar farklı ilgi bölgelerinde analiz edilebilir. Bu modelin potansiyel uygulamaları ve sınırlılıkları tartışılacaktır.

Oligodendrosit yönelik CD8 + T hücreleri ile beyin dilimlerindeki inkübasyondan sonra, oligodendrositler olarak nöronlar apoptoz (Şekil 2A ve 1C, sırasıyla) tabi tutulur. Apoptoz histolojik bulgular (örneğin, Kaspaz-3, Tünel) ilk inkübasyon 3 saat sonra tespit edilebilir. Kuluçka dönemi hazırlanması ve tekrarlanabilir sonuçlar iyi kalitesini garanti etmek için uzun 8 saat daha olmamalıdır. Apoptotik hücreler tüm miyelinli alanlarda üstünlüğü ile dilim üzerinde bulunabilir. Yapısal bü...

İnflamatuar demiyelinizan bozuklukların kortikal lezyonlarında demiyelinizasyon ve nöronal apoptoz mekanizmalarını ele almak için farklı hayvan modelleri kullanılır. Biz burada, beyin dilimlerinde oligodendrosit spesifik CD8 + T hücreleri kullanarak, oligodendroglial ve nöronal ölümle sonuçlanan ex vivo bir yaklaşımı tanımladık. Modelin potansiyel uygulamaları ve sınırlılıkları tartışılmıştır.

Bir Ex vivo Akut Beyin Dilimleri bir Oligodendrosit yönelik T-Hücre Saldırı Modeli

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Bu prosedürün genel amacı, ex vivo olarak CD sekiz T hücresinin oligodendrosit yönelimli saldırısını incelemektir. Bu, ilk olarak farelerin dalaklarından CD sekiz T hücresinin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, akut beyin dilimleri hazırlamaktır.Daha sonra beyin dilimleri, aktive edilmiş CD sekiz T hücresi ile altı saate kadar inkübe edilir, ardından kriyo koruma ve histolojik çalışmalar yapılır. Sonuç olarak, immünofloresan mikroskobu, T hücrelerinin yerini ve oligodendrositlerin apoptozunu incelemek için kullanılabilir. Bu yöntemin, hafif sklerozun bir hayvan modeli olan deneysel otoimmün ensefalomiyelit gibi mevcut tekniklere göre en büyük avantajı, nöron hasarıdır.CD sekizini takiben oligodendrosit saldırısı ayrıntılı olarak incelenebilir. Bu yöntem, dokuda bağışıklık hücresi kaçakçılığı veya nöronların ve oligodendrositlerin dejenerasyonu gibi nöroimmünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Alexander Hamman olacak: Beyin dilimlerini hazırlamadan beş gün önce, hücreleri aktive etmek için OT bir T hücresini uyarın.İlk olarak, birkaç O OT bir transgenik farenin dalaklarını çıkarmak için görülen protokolü izleyin. Dalakları taze hazırlanmış, takviye edilmiş ortamda toplayın. Daha sonra, dalakları 70 mikronluk bir süzgeçten geçirerek tek hücreli bir süspansiyon oluşturun ve ardından süspansiyonu dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 Gs'de santrifüjleyin.Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı dökün ve hücreleri beş mililitre amonyum klorür potasyum tamponu içinde yeniden süspanse edin. Kırmızı kan hücrelerini parçalamak için hücrelerin bu tamponda dört santigrat derecede beş dakika inkübe etmesine izin verin. Ardından, dört santigrat derecede 10 mililitre takviye edilmiş ortam ekleyerek reaksiyonu sonlandırın.Ardından, hücreleri daha önce olduğu gibi döndürerek tekrar toplayın. Daha sonra peletlenmiş hücreleri toplayın, yeniden canlandırın, ortamda askıya alın ve yoğunlukları bilindiğinde sayın. Hücreleri, kuyucuk başına 30 milyon hücrede 12 Kuyulu bir plakaya aktarın.Daha sonra OVA ve interlökin iki içeren ortam ekleyin ve hücreleri dört gün boyunca inkübe edin. Dört gün sonra, mililitre başına 500 birim konsantrasyonda daha fazla interlökin iki ekleyin. Sonra hücreleri bir gün daha inkübe edin.Şimdi bir CD sekiz pozitif T hücresi izolasyon kiti kullanarak, O OT bir T hücresini kültürlenmiş hücrelerden saflaştırın. Kısaca. CD olmayan sekiz pozitif hücre, bir antikor kokteyli kullanılarak tüketilir ve manyetik bir kolon kullanılarak ayrılır. Bunu yaparken, numuneyi buz üzerinde hazırlayın ve reaksiyonun yalnızca tek hücreleri içerdiğinden emin olun, böylece kolon tıkanmaz.Sonra hücreleri sayın. Bu deney için. Sekiz ila 10 haftalık transgenik, O-D-C-O-V-A, fareler ve yaş ve cinsiyet uyumlu C 57 siyah altı kontrole sahip olun.Her zamanki gibi, fareleri yiyecek ve suya ücretsiz erişimi olan patojen içermeyen bir ortamda barındırın. Bir fareyi uyuşturduktan sonra, anestezi seviyesini değerlendirmek için bir arka pençe tutamını kullanın ve ardından hemen ötenazi yapın. Şimdi bir fareyi ventral olarak konumlandırın ve kafa derisini dezenfekte edin ve kafasını çıkarın.Sonra hızlıca kafa derisini kesin, kafatasını açın ve beyni çıkarın. Beyni yapıştırıcı kullanarak yerine sabitleyin ve bir vibram plakasına aktarın. Sonra tabağı buz gibi ve fizyolojik tuzlu su ile doldurun.Hazırlandıktan sonra 300 mikronluk dilimler kesin. Dilimleri, A BOS ile doldurulmuş 12 veya 24 oyuklu bir plakanın ayrı ayrı kuyucuklarına aktarın. Daha sonra her dilime dikkatlice yarım milyon OT bir T hücresi ekleyin.Yarım milyon aktive edilmiş hücre Kişiselleştirilmiş, iyi hücre hücre etkileşimi sağlar. Hücreler bir kez oluştuktan sonra, hücreler dilime geçmeye başlar. Aynı zamanda, hücre miktarı aşırı reaksiyona neden olmak için çok yüksek değildir, bu nedenle tek hücre sayımı mümkündür.Tüm kuyucukları yükledikten sonra, ko-kültürü inkübasyondan sonra sekiz saate kadar inkübe edin, dilimleri hasat edin ve bunları OCT bileşiğine gömün. Daha sonra gömülü dilimleri sıvı nitrojen içinde dondurun ve daha ileri histolojik çalışmalar için eksi 20 santigrat derecede saklayın. Beyin dilimlerinin oligodendrosit yönlendirilmiş CD sekiz pozitif T hücresi ile inkübasyonundan sonra, oligodendrositlere apoptoz uygulandı.Nöronlar ayrıca apoptoz geçirdi. Apoptozun en erken belirtileri üç saatlik inkübasyondan sonra görüldü ve sekiz saat boyunca sağlamdı. Apoptoz, OT bir T hücresine maruz kalan O-D-C-O-V-A hücrelerinde diğer herhangi bir duruma göre daha fazla kaydedildi.Bu prosedürü takiben, T hücresi göç davranışı veya kendi laboratuvar pitozunuzda iyon kanallarının katılımı ile ilgili soruları yanıtlamak için ek yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, akut beyin dilimlerinin nasıl hazırlanacağını ve bunların T hücreleri ile nasıl birlikte kültürleneceğini iyi anlamış olmalısınız.

an-ex-vivo-model-an-oligodendrocyte-directed-t-cell-attack-acute

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, sitotoksik CD8+ T hücrelerinin aracılık ettiği beyin hücresi ölümünü indüklemek için ex vivo bir tekniği göstermektedir. Beyin dilimleri elde edildikten sonra, aktive edilmiş oligodendrosit yönelimli CD8 + T hücreleri, miyelin kılıfını ve oligodendrositleri hedeflemek için dilimlere aktarılır. İnkübasyon sonrası, miyelin hasarı ve nöronal ölüm, ilgilenilen bölgelerde histolojik olarak değerlendirilebilir.

Oligodendrosit Spesifik CD8 + T Hücreleri Yoluyla Nöronal Ölümü İndüklemek için Ex Vivo Bir Teknik

Kaynak: Kennedy, L. H., et. al. Organotipik Beyin Dilimlerinde Oligodendrosit Organellerinin Adeno İlişkili Virüs ve Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Görselleştirilmesi ve Canlı Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, organotipik fare beyin dilimlerinde oligodendrosit mitokondrinin görüntülenmesini göstermektedir. Dilim, sürekli sıvı sirkülasyonu ve kontrollü sıcaklığa sahip bir banyo odasının içine yerleştirilir. Konfokal mikroskobun çeşitli parametrelerini ayarladıktan sonra, kırmızı...

Organotipik Beyin Dilimi Kültürlerinde Oligodendrositler İçindeki Mitokondriyal Hareketin Konfokal Görüntülenmesi

Ön beyin ve beyincik dilim kültür sistemini kullanarak NG2 hücrelerini ve oligodendrositleri incelemek için bir teknik açıklanmıştır.  Bu yöntem, doku sitomimarisini korurken hücre dışı ortamın kolayca manipüle edilebildiği oligodendrosit soyu içindeki hücrelerin çoğalma ve farklılaşma dinamiklerinin incelenmesine izin verir.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

Globoid hücreler, şu anda etkili bir uzun süreli tedavisi olmayan bir lökodistrofi olan Krabbe hastalığının tanımlayıcı bir patolojik özelliğidir. Aktive edilmiş mikrogliaların doğuştan gelen biyolojisini ve patojenik potansiyelini ve bunların globoid hücrelere dönüşümünü incelemek için bir hücre kültürü modeli geliştirdik.

Bir İn Vitro Globoid Hücre lökodistrofi Hücresel Patofizyoloji Çalışması Modeli

Organotypic Hipokampal dilim kültürler (OHSC) vivo durumu çok iyi taklit bir vitro modeli temsil. Burada biz vibratome tabanlı açıklar yüksek kaliteli dilimleri tümör hücreleri biyolojik davranışını veya yeni maddeler nöroprotektif potansiyelini değerlendirmek amacıyla elde etmek için iletişim kuralı Dilimleme geliştirilmiş.

Organotypic Hipokampal dilim kültürler çalışma Neuroprotection ve tümör hücrelerinin Invasiveness Model olarak

Myelinating oligodendrocytes hızlı aksiyon potansiyeli yayılması ve nöronal hayatta kalma teşvik. Burada açıklanan bir oligodendrocyte özel mesaj organotypic floresan proteinlerin beyin dilimleri ile sonraki zaman hata görüntüleme iletişim kuralıdır. Ayrıca, günahı miyelin görüntülenmesi için basit bir prosedür sunulur.

Görselleştirme ve Oligodendrocyte organelleri Adeno ilişkili virüs ve Confocal mikroskobu kullanılarak Organotypic beyin dilimleri içinde canlı görüntüleme

Biz daha fazla ateş altında yatan erken etkinlik kazandırabileceğini kurulan eski-vivo beyin tekniğine dayalı bir yöntemini in vivo ve in vitro deneyler avantajlarını birleştiren mevcut. Ayrıca, tedavi ve tedavi edilmezse grubun aynı anatomik düzlemde doğrudan karşılaştırma için eşsiz bir fırsat temsil eder.

Ateş Ex Vivo sıçan beyin dilimleri kullanarak birincil olayları incelemek için alternatif bir yaklaşım

Microglia, yerleşik bağışıklık hücreleri beynin, çabuk morfolojik değişiklikler ile çevrenin değişiklikler cevap. Bu protokol iki fotonlu mikroskobu serotonin veya ATP doğru mikroglial süreçlerinde fareler dilim akut beyin cazibe çalışmak için nasıl kullanılacağını açıklar.

Mikroglial süreçleri cazibe ATP veya Serotonin akut beyin dilimleri içinde doğru iki fotonlu görüntüleme

Burada fare serebellum ve miyelin kılıf immünhistokimya tarafından myelination ve remyelination merkezi sinir sisteminde mekanizmaları araştıran için uygun boyama dilim kültürler organotypic hazırlamak için bir yöntem mevcut.

Hazırlık ve Immunostaining Myelinating Organotypic serebellar dilim kültürlerin

Bu protokol, in situ akson büyümesi ve büyüme konisi dinamiklerini incelemek için basit ve sağlam bir yöntem göstermektedir. Fizyolojik olarak ilgili akut beyin dilimlerinin ex vivo olarak nasıl hazırlanacağını açıklar ve kullanıcı dostu bir analiz boru hattı sağlar.

Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Öğrenin, akut beyin dilimleri kullanarak oligodendrosit yönelik CD8+ T-hücre saldırılarını incelemeyi. Bu yöntem, nöroimmünolojide demiyelinizasyon ve nöronal apoptoz mekanizmalarını detaylı çalışmanıza olanak tanır.

Bir Ex vivo Akut Beyin Dilimleri bir Oligodendrosit yönelik T-Hücre Saldırı Modeli

Daha fazla video keşfet