Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Bu prosedürün amacı, elektroporasyona dayalı bir yöntem kullanarak canlı mikroorganizmaların içindeki DNA veya organik Fluor ile etiketlenmiş proteinler gibi biyomolekülleri içselleştirmek ve görselleştirmektir. Bu, elektro-yetkin hücrelerin ilk olarak floresan etiketli biyomoleküllerle inkübe edilmesinden ve ardından bir elektroporasyon kanalına aktarılmasıyla gerçekleştirilir. Vete boyunca yüksek bir voltaj uygulayarak, hem hücre duvarında hem de hücre zarında geçici gözenek oluşumları, hücrelere biyomoleküler difüzyonu sağlayacaktır.

Daha sonra, hücreler, içselleştirilmemiş fazla biyomoleküller uzaklaştırılmadan önce iyileşmelerine izin vermek için zengin bir ortamda inkübe edilir. Son olarak, hücreler düşük floresan minimal besleyici bir arose pedine aktarılır ve daha sonra bir cam agro sandviç oluşturmak için üstüne bir cam örtü astarı yerleştirilir. Sonuç olarak, bu öz mikroskobu, canlı hücrelerin içindeki etiketli biyomoleküllerin konumunu, difüzyon modelini ve dinamik özelliklerini analiz etmek için kullanılır.

Bu yöntem için ilk olarak canlı hücre görüntülemedeki sınırlamaları fark ettiğimizde aklımıza geldi. GFP gibi foto floresan proteinlerinin hızlı bir şekilde bozulması nedeniyle, canlı hücreleri organik floro kuvveti ile etiketlenmiş biyomoleküllerle yükleyerek, canlı mikroorganizmaları nakledeceğimizi düşündük. Bu kuvvetin ana avantajları parlaklık, fotoğraf kararlılığı ve küçük boyuttur.

Daha sonra, DNA veya proteinlerin kendi doğal ortamlarında lokalizasyonunu ve difüzyonunu çok daha uzun zaman ölçeklerinde takip etmeyi umuyoruz, bu da birçok önemli biyolojik süreçle eşleşecektir. Bu tekniklerin mikroenjeksiyon gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, tipik mikroenjeksiyon iğnesinin çapından daha küçük mikroorganizmalara da uygulanabilmesidir. Elektroporasyonun ek bir avantajı, çok sayıda hücrenin aynı anda floresan biyomoleküllerle yüklenebilmesi ve bunları paralel olarak görselleştirebilmesidir, bu da elektroporasyonu özellikle göz verimi tekniği haline getirir.

Bu yöntem, floresan olarak işaretlenmiş biyomoleküllerin in vivo olarak difüzyon ve dinamik davranışı hakkında fikir verebilse de, etiketlenmemiş elektrot biyomolekülleri gibi başka bağlamlarda da uygulanabilir, ancak örneğin, hücre tarafından içselleştirildiğinde fizyolojik bir tepkiyi tetikleyebilir Bakteri veya maya floresan mikroskobu için aros pedleri oluşturmak için iki x düşük floresan ortam hazırlayarak başlayın, Daha sonra damıtılmış suda% 2'lik bir Aros çözeltisini hemen bir laboratuvar mikrodalga fırını ile eritin. Ortama eşleşen bir hacimde sıcak HA gülü ekleyin ve karışımı yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyin. Kabarcık oluşumunu önlemek için, ortaya çıkan karışımın yaklaşık 200 mikrolitresini hemen standart boyutlu bir mikroskop kapak fişi üzerine pipetleyin.

Jel katılaşana kadar kapak fişini oda sıcaklığında bir dakika tezgah üzerinde bırakın veya geçici olarak saklayın, taze pedin üzerine ikinci bir temizlenmiş kapak kılıfı yerleştirin ve düşük iyonik kuvvete sahip bir tamponda hazırlanan bir floresan biyomolekül stoğundan başlayarak yumurta gülünün içinde pul pul dökülmek için üstten hafifçe baskı uygulayın. Beş mikrolitreye kadar biyomolekülü 20 mikrolitrelik bir yetkin bakteri alikotuna veya 50 mikrolitrelik yetkin maya hücresine aktarın. Hücrelerle birlikte inkübe edilen floresan biyomoleküllerin miktarı, hücre başına içselleştirilen biyomolekül miktarı ile doğrudan ilişkilidir.

Elektroporasyondan sonra, karışımı buz üzerinde 10 dakikaya kadar inkübe edin. Aynı zamanda, uygun elektrot aralığına sahip bir elektroporasyon vete seçin ve buz üzerinde soğutun. Hücre karışımını önceden soğutulmuş vete içine aktarın.

Solüsyondaki kabarcıkları çıkarmak için vete'ye birkaç kez hafifçe vurun. Vete'deki nemi bir kağıt havluyla alın ve vete'yi elektroratöre yerleştirin. Bu işlemden hemen sonra hücrelere yüksek voltajlı bir darbe uygulayın.

Elektro cihazda görüntülenen zaman sabitinin dört ila altı milisaniye arasında olduğunu doğrulayın. Daha düşük zaman sabitleri genellikle qve içinde aşırı tuz veya kabarcıkların varlığından kaynaklanır ve biyomoleküllerin hücrelere alımını azaltabilir veya tamamen engelleyebilir. Daha yüksek voltaj darbeleri hücre yüklemesini iyileştirir, ancak elektroporasyondan hemen sonra hücre canlılığını da etkileyebilir.

500 mikrolitre zengin ortam ekleyin ve hücreleri 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Hücre zarının 37 santigrat derece bakteri veya mayayı 29 santigrat derece arasında iki ila 10 dakika inkübe ederek iyileşmesine izin verin. Biyomolekül katılımı ve büyüme geri kazanımından sonra, hücreleri dört santigrat derece önceden soğutulmuş bir santrifüjde bir dakika döndürün ve sırtüstü ajan Reese'i atın.

Peleti 500 mikrolitre tamponda askıya alın ve sıkma doyurma ve çıkarma ve tampon reçine süspansiyon işlemlerini tekrarlayın. Üç kez daha. Bu yıkama adımları, hücre süspansiyonundan içselleştirilmemiş biyomoleküllerin tüm izlerini kaldıracaktır.

Etiketli protein içselleştirme ve ek saflaştırma adımı, hücre süspansiyonunun üstüne 0,22 mikronluk bir membran filtre ile donatılmış 1,5 mililitrelik bir tüpe pipetlenmesiyle gerçekleştirilir. Hücrelerin kurumasını önlemek ve fraksiyondan akışı atmak için filtrenin üzerinde yeterli sıvı kaldığından emin olurken hücreleri santrifüjleme ile tampondan ayırın. Filtrenin altına, hücrelerin üzerine 500 mikrolitre taze PBS ekleyin ve bir döndürme kombinasyonunu ve ardından yeni PBS baskısını tekrarlayın.

İki kez daha. Bir dakika boyunca 3.300 G'de son bir dönüş yapın. Önceki PBS yıkamasını çıkarmak için, hücreleri 150 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın.

Son olarak, daha önce yapılmış aros pedinden üst kapak sürgüsünü çıkarın. Hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini damla damla pipetleyerek hücreleri pedin üzerine yükleyin. Arose pedin üzerine yeni bir temizlenmiş kapak astarı yerleştirdikten sonra, sandviç hücreler artık floresan mikroskobu için hazırdır.

Etiketli biyomoleküllerle inkübe edilmiş nominal olmayan kontroller veya elektro dereceli veya inkübe edilmemiş boş hücreler gibi negatif kontroller de herhangi bir yüklü numuneye paralel olarak hazırlanmalıdır, yüklü hücreler herhangi bir uygun floresan mikroskobunda görüntülenebilir. Geniş alan görüntüleme modu, hücre düzeyinde görüntüleme ve analize izin verirken, çim veya yüksek düşük aydınlatma veya tek molekül gözlemi ve takibi için idealdir. Biyomoleküllerin aşırı foto-ağartılmasını önlemek için, lütfen numune yüklemeden önce tüm sahne üstü lazer aydınlatmalarının kapatıldığından veya opak bir filtreyle engellendiğinden emin olun.

Ayrıca, aşırı pozlamanın fotoğraf makinesine zarar vermesini önlemek için E-M-C-C-G kamera kazancını kapatın. Ters çevrilmiş bir mikroskop kurulumu için, Aris ped sandviçini, hücre kaplı tarafı aşağı bakacak şekilde alt objektife bakacak şekilde mikroskop aşamasına yerleştirin. Ardından üst taraftaki halojen ışığı açın ve lazeri açmadan önce hücreleri iletilen beyaz ışık mikroskobu modunda odaklayın, beyaz ışık iletim modunda hücrelerin fotoğrafını çekin.

Bu fotoğraf, biyomoleküler floresan bölgeleri ile aynı görüş alanı içindeki hücrelerin gerçek konumları arasında ilişki kuracak bir konumsal referans haritası olarak kullanılacaktır. Canlılık ölçümü için, optimum sıcaklığa ayarlanmış bir objektif ısıtıcı kullanın ve sahneyi hareket ettirmeden her 30 dakikada bir beyaz ışık aydınlatması altında aynı görüş alanının sıralı görüntülerini kaydedin, üst üst aydınlatmayı kapatın ve numunenizi laboratuvardaki diğer tüm ortam ışığı kaynaklarından koruyun. Ardından CCD kamerayı açın ve veri toplamaya başlayın.

Lazer aydınlatmayı açmadan hemen önce floresan iyonu kaydetmeye başlayın. Floresan mikroskobu gerçekleştirdikten sonra, ayar düğmesine basarak tüm görüntülerde parlaklık veya kontrast gibi tüm temel görüntü parametrelerini normalleştirmeye başlamak için tüm fotoğrafları Image J gibi bir görüntü işleme yazılımıyla açarak veri analizine başlayın ve diğer tüm görüntülere yayılmayı seçin. Birinci seçenek, hücre yüklemesinin başarılı olup olmadığını kalitatif olarak belirleyebilir, çünkü yüklü hücreler, belirli bir görüntü için negatif kontrol olarak kullanılan elektroporasyonlu olmayan hücrelerden önemli ölçüde daha parlak olmalıdır.

Serbest el seçimi aracını kullanın ve elle çizilmiş çokgenlerle farklı floresan bölgelerini çevreleyin. Analiz menüsünden ölçüm seçeneğini seçerek ilgili tüm çokgenler arasındaki floresan yoğunluğunu karşılaştırın. Her örnekteki tüm hücrelerin ve negatif kontrollerin piksel başına yoğunluğunu çıkarmak için bu işlemi manuel olarak veya otomatik bir komut dosyası kullanarak tekrarlayın.

Elektro dereceli bir hücreye bir veya birkaç floresan biyomolekül yüklendiğinde, ortalama emisyon yoğunluğu, negatif kontrol numunesinin ortalama yoğunluğundan daha büyük olacaktır. Hücre canlılığını değerlendirmek için, bölünmeyen ve hasar görmüş hücreler tarafından bozulmadan bölünme yüzdesini manuel olarak sayın. Verilerin her 30 dakikada bir birkaç bölünme boyunca kaydedildiği aynı görüş alanında, özellikle biyomoleküller hızlı bir şekilde yayıldığında veya hücreler beşten fazla etiketli biyomolekül ile yüklendiğinde, hücre başına içselleştirilen biyomolekül sayısını doğrudan saymak her zaman mümkün değildir.

Hücre bazlı foto ağartma analizi, bu tür durumlarda hücre başına etiketli biyomolekül sayısının değerlendirilmesine izin verir. Serbest seçim düğmesini kullanarak, belirli bir floresan hücrenin ana hatlarını izleyin ve foto ağartma etkilerinden dolayı zamanın bir fonksiyonu olarak ham hücre floresansını çıkarın ve çizin. Yoğunluğa karşı zaman grafiği, ağır yüklü hücreler olan katlanarak azalan bir eğri olacaktır, ancak 10'dan az biyomolekül içeren hücreler için net adımlar ayırt edilebilir olmalıdır.

Deneyin düz kuyruk ucu kısmının yakınındaki ham floresan yoğunluk değerlerinin ortalamasını alarak foto ağartma sonrası ortalama otofloresansı hesaplayın, bu örneğin hızlandırılmış serideki son 50 ila 100 görüntü karesi olabilir. Taban çizgisi yoğunluğunu belirledikten sonra, ham floresan verilerinden temel otofloresanı çıkararak zamana bağlı foto ağartma yoğunluğunu hesaplayın, ardından elde edilen foto ağartma yoğunluğu verilerini bloke edin ve her adımın yüksekliğini manuel olarak veya bir algoritma kullanarak niceleyin. Bu işlem, ortalama adım yüksekliğinin doğru bir tahminini elde etmek için genel olarak 100'den fazla adım sergileyen birkaç hücre için tekrarlanmalıdır, bu değer, tek bir floro dördünün ağartılmasına bağlı üniter floro dört yoğunluğuna karşılık gelir.

Son olarak, hücre başına içselleştirilmiş molekül sayısı, sıfıra eşit olduğunda taban çizgisi çıkarılan hücre yoğunluğunun üniter floro ile bölünmesiyle hesaplanabilir. Bu elektroporasyon protokolü için dört yoğunluk. Bakteri veya mayaya içselleştirilebilen floresan etiketli DNA veya protein miktarı, elektroporasyon tamponu içinde bulunan DNA problarının miktarı ayarlanarak kontrol edilebilir.

Biyomoleküler içselleştirme oranı yüksek olduğunda, önce floresan yoğunluğunun zamanın bir fonksiyonu olarak çizilmesi ve ardından üstel zaman sabitinin çıkarılmasıyla bulunabilen etiketli biyomolekülün foto-ağartma ömrü, boyaların in vivo foto stabilitesi hakkında bilgi verir. Düşük birleştirme oranları durumunda, floresan yoğunluğunun nicelleştirilmesi, belirli bir hücre içindeki toplam biyomolekül sayısını yaklaştırmak için bir araç sağlayacaktır. Elektroporasyon, proteinleri bakteri veya mayaya dahil etmek için de kullanılabilir.

Floresan etiketli protein durumunda. Serbest floroforların kendileri çok verimli bir şekilde içselleştirilebildiğinden, tüm fazla serbest ve kovalent olarak bağlanmamış floroforların protein stoğundan çıkarılması önemlidir. Son olarak, moleküllerimiz tarafından iki kez etiketlenen, canlı hücrelerde birkaç saniye boyunca tek molekül fret gözlemine izin vermek için yöntemimiz kullanılarak içselleştirilebilir.

Bu prosedürü denerken, etiketli bir biyomolekül ile inkübe edilen elektro olmayan hücreler veya ne elektroporasyona tabi tutulmuş ne de etiketli bir molekül ile inkübe edilmemiş boş hücreler gibi kontrol numunelerini de hazırlamayı ve analiz etmeyi unutmamak önemlidir. Bu kontroller, hücre otofloresan seviyesini ve yıkama adımlarının eksikliğini değerlendirmemize izin verir ve bu nedenle, elektroporasyon deneyinin başarılı olup olmadığını değerlendirmek için gereklidir. Bu teknik, biyofizik ve üçüncü biyoloji alanındaki araştırmacılar için canlı mikroorganizmalarda etiket biyomolekülünün difüzyonunu ve dinamik davranışını araştırmak için yeni yollar açtı.

Ve bu, GFP'ler gibi otofloresan proteinlerden bir ila iki kat daha uzun bir zaman ölçeğinde. Organik d etiketlemesinin esnekliğini in vivo olarak aktararak, canlı hücrelerde molekül içi ve moleküller arası dinamiklerin incelenmesi için tek moleküllü tehdit deneylerini çok daha uygun hale getirdi.