Name: Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Öğrenin, elektroporasyon yöntemiyle canlı mikroorganizmalara floresan biyomoleküllerin içselleştirilmesini ve floresan mikroskopiyle dinamiklerinin gözlemlenmesini. Bu teknik, hücre içi biyomoleküler davranışların uzun süreli izlenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tartışmalar için Stephan Uphoff'a teşekkür ederiz. 
R.C., Oxford Üniversitesi, Linacre College tarafından desteklenmiştir. AP, Alman Akademik Değişim Servisi (DAAD), Alman Ulusal Akademik Vakfı ve EPSRC tarafından desteklenmiştir. MS, Wellcome Trust tarafından desteklenmiştir. A.N.K., Birleşik Krallık BBSRC hibesi (BB/H01795X/1) ve Avrupa Araştırma Konseyi Başlangıç hibesi (261227) ile desteklenmiştir.

<ol><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Leake, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+turnover+in+single%2C+functioning+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li>
<li>Taniguchi, Y., Kawakami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+HaloTag+protein+to+covalent+immobilization+of+recombinant+proteins+for+single+molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Application of HaloTag protein to covalent immobilization of recombinant proteins for single molecule force spectroscopy.</a> Langmuir. 26, 10433-10436 (2010).</li>
<li>Xie, X. S., Choi, P. J., Li, G. W., Lee, N. K., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+approach+to+molecular+biology+in+living+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biophysics%22%5BJournal%5D)">Single-molecule approach to molecular biology in living bacterial cells.</a> Annual review of biophysics. 37, 417-444 (2008).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+subcellular+RNA+sequencing+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ.</a> Science. 343, 1360-1363 (2014).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+microscopy+coming+of+age%3A+from+concepts+to+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Localization microscopy coming of age: from concepts to biological impact.</a> J Cell Sci. 126, 3505-3513 (2013).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Hao Chen, K., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localizationbased+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localizationbased super-resolution imaging.</a> Nat Meth. 8, 1027-1041 (2011).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Meth. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+molecules+at+cell+division+reveals+native+protein+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization.</a> Nat. Methods. 9, 480-482 (2012).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Single-Cell+RNA-Seq+for+Marker-Free+Decomposition+of+Tissues+into+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Single-Cell RNA-Seq for Marker-Free Decomposition of Tissues into Cell Types.</a> Science. 343, 776-779 (2014).</li>
<li>Aldridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHT-ChIP-seq%3A+a+completely+automated+robotic+protocol+for+high-throughput+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation.</a> Genome Biol. 14, R124(2013).</li>
<li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).</li>
<li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nat. Methods. 7, 717-719 (2010).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+the+site-specific+modification+of+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo.</a> Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+incorporating+macromolecules+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A method for incorporating macromolecules into adherent cells.</a> J Cell Biol. 98, 1556-1564 (1984).</li>
<li>Clarke, M. S., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syringe+loading+introduces+macromolecules+into+living+mammalian+cell+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Syringe loading introduces macromolecules into living mammalian cell cytosol.</a> J Cell Sci. 102, 533-541 (1992).</li>
<li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nat. Methods. 7, 203-205 (2010).</li>
<li>Taylor, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromagnetic+syringe%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Electromagnetic syringe.</a> IEEE Trans. Biomed. Eng. 25, 303-304 (1978).</li>
<li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16, 6127-6145 (1988).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Sustarsic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+delivery+of+fluorescently+labeled+proteins+in+live+bacteria+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimized delivery of fluorescently labeled proteins in live bacteria using electroporation.</a> Histochem Cell Biol. , (2014).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat. Methods. 5, 159-161 (2008).</li>
<li>Sinha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+DNA-binding+proteins+for+sexual+commitment+and+development+in+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium.</a> Nature. 000, 1-5 (2014).</li>
<li>English, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+investigations+of+the+stringent+response+machinery+in+living+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E365-E373 (2011).</li>
<li>Crawford, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+intracellular+single-molecule+fluorescence+using+electroporated+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Long-lived intracellular single-molecule fluorescence using electroporated molecules.</a> Biophys J. 105, 2439-2450 (2013).</li>
<li>Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+DNA+repair+in+live+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule DNA repair in live bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8063-8068 (2013).</li>
<li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Protein-DNA+Interactions+in+Live+Bacterial+Cells+Using+Photoactivated+Single-molecule+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Hohlbein, J., Gryte, K., Heilemann, M., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+on+a+new+wave+of+single-molecule+fluorescence+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Surfing on a new wave of single-molecule fluorescence methods.</a> Phys Biol. 7, 031001(2010).</li>
<li>Xie, X. S., Yu, J., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective+-+Living+cells+as+test+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Perspective - Living cells as test tubes.</a> Science. 312, 228-230 (2006).</li>
<li>Santoso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+transitions+in+DNA+polymerase+I+revealed+by+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 715-720 (2010).</li>
<li>Hohlbein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+landscapes+of+DNA+polymerase+I+and+mutator+derivatives+establish+fidelity+checkpoints+for+nucleotide+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion.</a> Nature communications. 4, 2131(2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Çoğu parametre hücre elektroporasyon ve veri toplama ilgi biyolojik sisteme ve deney (hücre düzeyinde ya da tek-molekül analizi) kesin doğasına bağlı olarak sırasında değiştiirlebilir. Bakteri içine DNA elektroporasyon Örneğin, işaretlenmiş dsDNA parçalarının 0,25-5 pmol (daha önce ışıkla ağartma gerek kalmadan örneğin.) Doğrudan tek moleküllü tespitine olanak sağlayan, düşük bir içselleştirme verimliliği sağlanır. 5 pmol dsDNA üzerinde, hücreler ağırlıklı olarak tek bir hücre analizi için bir rejim daha uygun yüklenecek eğilimindedir. Bütün etiketlenmiş DNA&#39;lar aynı zamanda, daha önce jel-saflaştırılmış serbest boyanın izlerini tamamen yok etmek için olması gereken bir DNA stok çözeltisinden (floroforu reaksiyona girmemiş). Ayrıca, özellikle smFRET deneyler için DNA bozulması, potansiyel sorunlar, doğal olmayan nükleik asitler, ya da firkete döngüler gibi eksonükleaz erişilebilir terminallerini koruyan motifli DNA&#39;lar kullanılarak ele alınabilir. Başka Ayarlanamazelektroporasyon e parametresi elektroporasyon sırasında uygulanan alan gücüdür. Düşük alan gücü (yaklaşık 1 kV / cm), tek bir molekül çalışmalar için uygun olan düşük bir yükleme veriminin düşmesine sebep olacaktır. (1.8 kV / cm kadar) yüksek alan kuvvetleri yükleme verimliliğini artıracak; Bununla birlikte, elektroporasyon sonra kapsama alanı ve hücre canlılığı arasında ters bir ilişki vardır (bakınız Şekil 4). Referans için, bakteri ve mantar için elektroporasyonu için kullanılan normal bir alan kuvveti ~ 1.5 kV / cm&#39;dir. zaman sabiti damla kısa sürede herhangi bir ark fenomen küvet içinde meydana gibi beri bu çürüme uzunluğunu temsil eden zaman sabiti, takip için uygun bir parametredir. Normal ayarlar altında, zaman sabiti 4 ms daha büyük olmalıdır; düşük değerler düşük yükleme verimliliği ve hatta olmayan yüklü hasarlı hücrelerin yol açacaktır. En electroporators iki ayarlamak için değiştirilebilir (örneğin, &quot;darbe kesme&quot; veya &quot;şekli darbe&quot; gibi) serbestlik diğer derecelerde teklifHücre yükleme ve canlılık. Ancak biz benzer prosedürler de, bunların zar (tek lipid iki-tabakalı) gerçekten de daha kolay ve elektroporasyon artık bu tür hücreleri ile kullanıldığından uygun Electroporator ayarlarını kullanarak memeli hücrelerine etiketli biyomoleküllerin içselleşmesini izin vermelidir, hem bakteriler ve maya için, bu yöntemi tatbik 21. Etiketli proteinlerin içe, tüm serbest boya işaretli protein, stok çözelti, önce elektroporasyon arasından çıkarılması gerekiyor. Ücretsiz boya molekülleri nedeniyle kendi küçük boyutu, ilgi proteinlerin üzerinde tercihen içselleştirilmiş ve (beklenen hızlı difüzyon rağmen) veri analizi sırasında ayırt etmek zordur edilebilir. Organik etiketlenmiş proteinin bir numune için bir rehber, elektroporasyon için uygun olduğu gibi, serbest boya kalan miktarı% 2&#39;nin altında olması gerekir 22 (SDS-PAGE floresan taraması kullanılarak tespit edilir). Bu işlem, özellikle önemlidirBazı moleküller Electroporated bakteri veya maya dış zarlarında sopa olabilir gibi. Bu bağlamda, negatif kontrol örneği (herhangi bir floresan etiketli biyomoleküller ile inkübe de elektroporasyona edilmemiş hücreler, Şekil 2) boş hücre otofloresan seviyesi ideal olarak, düşük elektroporate edilmiş hücrelerde açıkça daha düşük hücre başına floresan yoğunluğu, göstermesi gerekir. DsDNA gibi, etiketlenmiş proteinlerin içselleştirme verimliliği elektroporasyon önce hücrelere ilave biyomoleküllerin miktarı ile bağlantılıdır. Bununla birlikte, bu boyut ve şarj gibi diğer parametreler, içselleştirme bir rol oynar. Küçük proteinler büyük proteinlerin etmiştir (Şekil 5) 26 (98 kDa kadar) başarılı bir şekilde içselleştirilebilir, ancak daha düşük bir randımanla, yüksek içselleştirme etkinliği düşüktür. protein izoelektrik nokta, hücre zarı ile potansiyel etkileşimler ve diğer fizikokimyasal parametrelerelektroporasyon sırasında etkisi hücre yükleme. Sonuç olarak, kullanıcılar etiketli protein (&gt; 50 mcM) yüksek başlangıç ​​konsantrasyonu başarılı yükleme için en iyi şans vereceğini bilerek, kendi sistemi için deneyler optimize etmek gerekir. Elektroporasyon da perturb ve hücrelerin (ya etiketli veya etiketsiz) içine proteinleri ve diğer biyomoleküllerin getirerek hücresel fonksiyonu analiz için yeni bir araç sunar. Bu, T7 RNA polimeraz deneyleri (Şekil 5C) Bu elektroporasyon kullanılarak in vivo gen ekspresyonunu değiştirmek için bir biyomolekülün neden olabilir bir deney gibi bir örnek. Tek-molekül floresan deneyler yaparken bu lamel yüzeyi (~ 100 nm) üzerinde ince bir bölüm içinde heyecan verici tek floroforlar en iyi sinyal-gürültü oranı sunuyor gibi, TIR aydınlatma genellikle diğer aydınlatma modları üzerinde tercih edilir. Ancak yaşayan mikroorganizmaların içinde difüzyon görüntüleme etiketlenmiş biomoleküller yeniden olabilirquire derin aydınlatma (yukarı, E. coli için 0.8 um). Yüksek sinyal-gürültü oranı muhafaza ederken daha derin aydınlatma, HILO modunda elde edilir. Diğer taraftan, geniş alan görüntüleme kullanıcının yüksek lazer gücü ile bütün bir yüklü hücre ışıkla ağartma ve üretilen yekpare yoğunluğu ile ilk hücre floresan yoğunluğu bölünerek içsel moleküllerinin sayısını tahmin etmek olan aşamalı bir ışıkla ağartma analizi için özellikle önemlidir tek bir molekül (bir ışıkla ağartma aşamasında, Şekil 3) ile incelenmiştir. Kendi yörüngeleri tüm hücre hacmi kapsayacak bile Widefield görüntüleme da ilgi difüzyon molekülleri lokalize etmek amacıyla uzun vadeli molekülü takibi için gereklidir. Bu protokol, elektroporasyon, hücrelerdeki nükleik asitlerin sağlanması için biyologlar ve biyokimya için standart bir teknik, farklı hücre tiplerinde floresan biyomoleküllerin verilmesi için basit bir yöntem teşkil ne sunulmuştur. Throman, yüksek verimli tekniği kendi doğal ortamında etiketli molekülleri gözlemlemek için eşsiz bir araç sunuyor. Flüoroforlar dalga boyu geniş bir kaplama ile etiketlenmiş ilaveli biyomoleküllerin olarak, doğal olmayan nükleotid ve amino asitler, metal kenetleme maddeleri, çapraz bağlayıcılar, ve tespit grupları gibi birçok kimyasal gruplar ile tadil edilmiş moleküller sağlamak elektroporasyon. İlgi biyolojik sistem hücre gelişimi için gerekli değilse içselleştirme sonra gözlenen proteinler, hücre içi protein havuzunun tüm (veya en) temsil sağlanması, hedef protein için gen kodlaması da silinebilir (veya sersemleyen) . Özünde, elektroporasyon &quot;nakli&quot; canlı hücrelere in vitro biyokonjugatlarda esneklik ve dolayısıyla sentetik biyoloji, sistem biyolojisi çabaları, ve in vivo tek-molekül tespiti yararlanabilir.

Canlı hücrelerin içinde çoğu floresan çalışmaları gibi GFP 1 gibi floresan proteinleri (FP), protein füzyonları bağlıdır. Bu floresan etiketler, gen ekspresyonu ya da zar taşıma 2-7 gibi süreçlerde rol oynamaktadır proteinlerin kopya sayısı, difüzyon desen veya lokalizasyon çalışmaları sağlar. FP yüksek etiketleme özgüllük, kolay uygulanmasını teklif, ve çeşitli fotofiziksel ve kimyasal özellikleri 1 çeşitlerinin büyük bir envanter vardır. Bununla birlikte, organik flüoroforlar da daha fazla foto-nedeniyle, in vitro deneyler için birincil seçim kalır (kadar FP daha stabil 100 kat) 8,9, küçük boyutlu (en küçük FP daha hacmi 100 kat kadar) ve molekül içi etiketleme kolaylığı (esas olarak sistein artıklarının kullanımı yoluyla). Tüm bu faktörler tek-molekül floresan için özellikle önemlidir ve FRET 10 inceler. Çeşitli içselleştirme yöntemleri combinOrganik etiketleme ve in vivo tespiti avantaj ing son on yıl içinde kullanılmaya başlanmıştır; Bununla birlikte, bu yöntem, doğal olmayan amino asitler 15 kullanılmasını gerektirmektedir, ya da örneğin, (büyük, tek-zar ökaryotik hücreler ile sınırlıdır, göreceli olarak büyük polipeptitlere etiketler (örneğin, TMP, halo, ya da 20 kDa'lık SNAP etiketleri) 11-14 kullanmak ya da. , yükleme, şırınga yükleme, mikroenjeksiyon) 16-19 kazımak. Bu protokol, in vivo gözlem ile çiftler organik florofor avantajları yeni, basit ve yüksek verimli içselleştirme yöntemi tarif etmektedir. Bu tekniğin geliştirilmesi için, genel olarak, örneğin E.Coli gibi mikroorganizmalar yüklemek için plazmid DNA 20,21 ile hücrelerini dönüştürmek için kullanılan elektroporasyon prosedürü adapte E. coli veya S. organik etiketli biyomoleküllerle cerevisiae. protokol 4 basit adımlardan oluşur: hücrelerinin inkübasyon etiketli biyomoleküllerle,elektroporasyon, hücre kurtarma ve hücre yıkama olmayan içselleştirilmiş biyomoleküllerin kaldırmak için. Burada, bu elektroporasyon protokolü, hem de hücre bazlı ve tek molekül floresan çalışma ve sinyalleri FRET hücre görüntüleme ve veri analizi işlemleri sunmaktadır. Elektroporasyon biyomoleküllerin (Şekil 1) 20,21 hücreleri girebileceği geçici zar gözenekleri oluşturmak için düşük iyonik güçlü bir hücre süspansiyonu üzerinde bir yüksek gerilim elektrik alanı boşaltma dayanır. Sadece plazmid DNA ile bakteri transformasyonu veya maya gibi, hücreler electrocompetency sağlamak için elektroporasyon önce hazırlanmalıdır gerekir. Bu işlem, su ile birkaç yıkama aşamasından oluşan zar geçirgenliğini artırır ve elektroporasyon küveti içinde bir kavisi önlemek için hücre çözeltisinin iyonik mukavemeti azaltır. Bu protokol, hücrelerin (protokol bakınız: 1.1), aşağıda tarif edildiği gibi hazırlanabilir ya da ticari sağlayıcıdan satıns. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52208/52208fig1.jpg"> Şekil 1: içselleştirme protokolünün şematik temsili Soldan sağa:. Elektro-güçlü hücreler (çift-etiketli DNA fragmanları ve bu örnekte bakteri) kana etiketli biyomoleküllerin birkaç mikrolitre ekleyin; buz üzerinde 1 ila 10 dakika inkübe edilir ve önceden soğutulmuş elektroporasyon küvetine transfer; electroporate ve daha sonra hemen sonra hücrelere 0.5-1 ml zengin orta ekleyin; Hücreler dinlendirin 37 ° C (veya organizma için gerekli sıcaklık, örneğin, maya için 29 ° C) inkübe; herhangi bir aşırı olmayan içselleştirilmiş etiketli molekülleri kaldırmak için 5 yıkama adımları gerçekleştirin; PBS tamponu ve pipet bir agaroz ped 10 ul 100-200 ul nihai pelet tekrar süspansiyon; (geniş alan modu veya HILO modunda) bir floresan mikroskop üzerinde bir temizlenmiş lamel ve görüntü ile pedi kapağı. (Şekil 1) sağlayan bir zengin ortam içinde inkübe edilir. olmayan içsel etiketli biyomoleküllerin fazlalığı ilk olarak bir tuz, oldukça yüksek konsantrasyonda ve bir deterjan ihtiva eden bir tampon içinde yıkanarak uzaklaştırılır (3.3 protokolü). tuz varlığı, aksi takdirde dış zar üzerinde yapışabilir olmayan içselleştirilmiş etiketli biyomoleküllerin tarafından oluşturulan non-spesifik elektrostatik etkileşimleri bozar. Benzer bir şekilde, yıkama tampon maddesi içinde deterjan varlığı spesifik olmayan hidrofobik etkileşimler bozar. DNA içselleştirilmesi (Şekil 2) basit iken, önlemler elektroporasyon kullanılarak etiketli proteinleri içselleştirilmesi zaman alınması gereken. İlk olarak, organik işaretlenmiş proteinin hazır numune hala serbest boyanın küçük bir yüzdesini içerebilir. Serbest kalan boya molekülleri protein göre çok daha küçük ve bu nedenle tercihli olarak içselleştirilebilir olabilir. Gözlenen içsel floresan moleküllerin büyük çoğunluğu ilgilenilen proteinin uygun olduğundan emin olmak için, ilk protein örneği az 2 ila en fazla% serbest boya (Şekil 5) 22 içermesi gerekir. olmayan içselleştirilmiş etiketli proteinlerin aşırı ayrıca elektroporasyon sonra dış hücre zarı sopa; Bu olgu, protein-spesifik ve her yeni protein için kontrol edilmesi gerekmektedir. Biz (: 3.3.3 PROTOKOL bakınız) Yüklenen hücre örneği olmayan içselleştirilmiş proteinlerin kaldırılmasını sağlayacak çeşitli seçenekler önermek. Son olarak, hücreler, fosfat tamponu, küçük bir hacim içinde tekrar süspanse edilir ve flüoresanlı bir mikroskop üzerine görüntüleme sağlayan bir agaroz ped üzerine damlatıldı. Agaroz pedleri İmmobilizasyonu bir simplE ve bütünlüğünü zarar vermeden bir lamel hücreleri görüntülenmesi etkili yolu. ped düşük floresan kültür ortamı ihtiva etmelidir. Hücre görüntüleme ya Widefield içinde, toplam iç yansıma floresan (TIRF) veya Hilo kullanarak (Yüksek Eğimli ve Lamine Optik Levha) mikroskopi yapılabilir. HILO yapılandırmada, lazer ışını, daha büyük bir sinyal-gürültü oranı 23 sağlayan, geniş açılı gibi, örneğin tamamına yanmaz henüz TIRF daha numunenin içine derin nüfuz eder. Kullanılan lazer gücü ve zaman çözünürlüğüne bağlı olarak, içselleştirilmiş biomoleküller, (Şekil 3 kademeli-photobleaching analizi kullanılarak) sayılır lokalize veya 24-28 izlenebilir. Flüoroforların bir FRET çifti ile iki kez işaretlenmiş yapıların içselleştirme tek bir hücre ya da tek-molekül seviyesinde (Şekil 6), FRET iki ölçümü sağlar. Farklı parametreler değiştirilebiliristenen çıktı ve çalışılan bir biyolojik sisteme bağlı olarak değişebilir. İlk olarak, hücre başına içsel malzeme miktarı Hücreler, steril elektroporasyon (Şekil 2) eklenmiştir etiketli biyomoleküllerin konsantrasyonunun değiştirilmesiyle ayarlanabilir. Elektroporasyon alan şiddeti de yükleme verimliliği ve hücre canlılığı hem etkileyecektir; Beklendiği gibi, artan kuvvet alanı ile birlikte yükleme verimliliği artar ise, elektroporate edilmiş hücrelerde yaşayabilirliği (Şekil 4A) azalır. Her iki parametre de yüklenen yüzdesini kayıt ve elektroporasyon sonra hücrelerin bölünmesiyle hesaplanabilir. Floresan görüntüleme ile birleştiğinde bu canlılığı tahlil de canlı hücrelerde içselleştirilmiş biyomoleküllerin gözlem doğrular ve birkaç kuşak (Şekil 4B) üzerinde sürekli gözlem sağlar. Özet olarak, bu protokol fosforla etiketlenmiş DNA ve protein moleküllerinin içselleşmesini içine sağlarE. coli veya S. cerevisiae'de 26. Organik fluorophores etiketli Bireysel moleküller büyüklükte bir sipariş daha uzun hekimleri daha zaman çizelgesi için yüksek uzaysal çözünürlüğü ile izlenebilir. Son olarak, bu yöntem, geniş açılı, TIRF ve konfokal tespiti, hem de bu tür ALEX (lazer uyarma 28,29 sırayla değişen) ve darbeli uyarma yapısı ile uyumlu değildir.

<table><tbody><tr><td>ElectroMax DH5-alfa Bileşen hücreler</td><td>Invitrogen</td><td>11319-019</td><td>veya diğer herhangi bir ticari veya laboratuvar büyücüsü elektro-yetkin bakteri veya maya.</td></tr><tr><td>EZ Zengin Tanımlı Madia</td><td>Teknova</td><td>M2105</td><td>düşük floresan zengin ortam</td></tr><tr><td>MicroPulser Elektroporasyon Aparatı&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>veya mikroorganizma dönüşümü için herhangi bir klasik elektroporatör</td></tr><tr><td>Sertifikalı Moleküler Biyoloji agaroz</td><td>Biorad</td><td>161-3100</td><td>agaroz ped için düşük floresan agaroz</td></tr><tr><td>Mikroskop lamel No 1.5 kalınlık</td><td>Menzel</td><td>BB024060SC</td><td>slaytları fırında 500 ° C'de ısıtarak arka plan parçacıklarını çıkarın; 1 saat için C</td></tr><tr><td>Tek moleküllü floresan mikroskobu</td><td>REF'lerde açıklanan</td><td>ev yapımı</td><td></td></tr><tr><td>Yerelleştirme yazılımı</td><td>Özel yazılmış, yerelleştirme</td><td>analizi için uyarlanabilen çevrimiçi</td><td></td> MATLAB ve C++ yazılım paketi.</tr><tr><td>İzleme yazılımı</td><td>Blair</td><td>ve Dufresne tarafından</td> çevrimiçi <td></td> MATLAB uygulaması mevcuttur.</tr></tbody></table>

elektroporasyon yoluyla yaşam mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve floresan biyomoleküllerin gözlem

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

Biyomolekülleri in vivo olarak inceleme yeteneği, biyolojik bağlamda işlevlerini anlamak için çok önemlidir. Güçlü bir yaklaşım, ekspresyonlarını, lokalizasyonlarını ve işlevlerini incelemek için GFP gibi floresan proteinlerle ilgilenen moleküllerin kaynaştırılmasını içerir. Bununla birlikte, GFP ve türevleri, genellikle in vitro deneyler için kullanılan organik floroforlardan önemli ölçüde daha büyük ve daha az fotostabildir ve bu, araştırmanın kapsamını sınırlayabilir. 
Kısa bir süre önce, organik floroforlarla etiketlenmiş biyomoleküllerin canlı mikroorganizmalara içselleştirilmesine olanak tanıyan, elektroporasyona dayalı basit, çok yönlü ve yüksek verimli bir yöntem tanıttık. Burada, etiketli DNA fragmanlarının veya proteinlerinin Escherichia coli ve Saccharomyces cerevisiæ'ye içselleştirilmesi için elektroporasyonun nasıl kullanılacağını, floresan mikroskobu kullanılarak içselleştirilmiş moleküllerin sayısının nasıl ölçüleceğini ve elektroporasyonlu hücrelerin canlılığının nasıl ölçüleceğini açıklıyoruz. Veriler, floresan veya FRET kullanılarak tek hücreli veya tek molekül düzeyinde elde edilebilir. İn vivo fizyolojik gözlemlenebilir bir yanıtı tetikleyen etiketlenmemiş moleküllerin içselleştirilmesi olasılığı da sunulmaktadır. Son olarak, belirli biyolojik sistemler için protokolün optimizasyon stratejileri tartışılmaktadır.

Örnek hazırlanması protokol farklı adımlar, Şekil 1 'de şema olarak sunulmaktadır. Bir örnek olarak, çift etiketli (donör ve alıcı boyalar), DNA fragmanları ile bakteri yükleme temsil etmektedir. DNA internalizasyonundan Örnek sonuçlar Şekil 2'de gösterilmektedir. Her bir elektroporasyona numune için, boş hücreler olmayan elektroporate edilmiş hücrelerde için veriler (bakınız Şekil 2) kaydedildi. "Boş hücreler" ne floresan biyomoleküllerin ne elektropore ile kuluçkaya hücreleri elektrouyumlu karşılık; floresan kanalda kendi yoğunluğu aynı deneysel koşullar (lazer gücü, zaman çözünürlüğü, sıcaklık, vb) kapsamında otofloresans seviyesini yansıtır. "Non-Elektroporasyona tabi tutulan hücreler" (diğer bir deyişle -EP, yani, eksi AP) hücreler, floresan biomolec ile inkübe edilmiştir elektrouyumlu olan bir negatif kontrol tekabültim ama elektropore değil. Bu non-Elektroporasyona hücreler boş hücrelerin otofloresansı benzer ve yüklü, Electroporated hücreler tarafından görüntülenen floresan yoğunluğu önemli ölçüde daha düşük bir floresan seviyesi göstermelidir. Bu dış hücre zarına yapışmış olabilecek herhangi olmayan içselleştirilmiş etiketli biyomoleküllerin kaldırılmasını onaylar. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52208/52208fig2.jpg"> Şekil 2: bakteri farklı konsantrasyonlarda farklı floroforlar ile etiketlenmiş dsDNA'nın içselleştirme (AE) ve maya (F) için Temsilcisi sonuçları sağa Sola:. Beyaz ışık, floresan ve bindirme görüntüler. - / + EP elektroporasyon ile / olmadan inkübasyon gösterir. Ölçek çubukları: 3 mikron. C. Cy3B dsDNA, 10 pmol E. coli. B. ATTO647N dsDNA, 10 pmol E. coli. C Alexa647 dsDNA, 5 pmol E.coli. D. Cy3B dsDNA, 100 pmol, E.coli. E. ATTO647N dsDNA, 100 pmol E. coli. F. ATTO647N dsDNA, 30 pmol Maya. Bu rakam referans 26 modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52208/52208fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Hücre başına içselleştirilmiş biyomoleküllerin sayısını sayma işlem, birbirine Etiketli DNA farklı konsantrasyonları ile elde edilen temsili sonuçlar, Şekil 3 ve Yardımcı film 2 içinde sunulmaktadır ışıkla ağartma analizi kullanılarak hücre başına içsel etiketli biyomoleküllerin sayısını tahmin etmek. Hücre yükleme verimliliği kuluçkaya etiketli DNA başlangıç ​​miktarı artar, bir "tek-molekül" seviyede (&lt;10, Ek Film 2B) bir "topluluk" seviyesine (&gt; 10 den ayarlamak için kullanıcıya hücre başına etiketli moleküllerin sayısını izin , Ek Film 2A). Yüklenen hücrelerin yüzdesini tahmin bir sağlam yol to, olmayan Electroporated hücrelerin ortalama hücre yoğunluğu artı 3 kat standart sapma (yani, Av (I-EP) + 3 * StdDev (I-EP) Av = ortalamanın üzerinde bir hücre yoğunluğu görüntüleme Electroporated hücrelerin sayısını I = piksel şiddeti, std. Dev. = standart sapma ve -EP = olmayan elektroporasyona), Şekil 3'te gösterildiği gibi. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52208/52208fig3.jpg"> Şekil 3:. Photobleaching analizi kullanılarak içselleştirilmiş moleküllerin sayısını sayma (A) Tek hücreli analizi photobleaching. Floresan yoğunluğu timetraces örnekleri (mavi: ham veri; kırmızı: fit; ekler: WL öncesi ve beyazlatma sonrası ATTO647N-etiketli dsDNA'ya yüklü E. coli floresan görüntüleri). En: Tek adım beyazlatma olay. Orta: ağartma gösteren ± 3 molekülleri ihtiva eden hücreve yanıp sönen. Alt: En az 10 moleküllere tekabül&gt; 10 adım içeren hücre az 6 ayırt adımlar içeren 57 hücrelerinden otomatik adım uydurma algoritması tek adım yüksekliği yoğunluklarının (B) Histogram.. Tek-Gauss uyum saniyede 8100 fotonların bir üniter fluorofor yoğunluğu karşılık, 11 ± 3 au merkezli edilir. yıldız üstünde veya üniter fluorofor yoğunluğu ile ilk floresan yoğunluğu bölünmesi sonra hesaplanan ATTO647N dsDNA'nın farklı miktarlarda ile electroporated hücre başına içselleştirilmiş moleküllerin eşit 50 au (C) Histogram tüm basamak yükseklikleri toplama bin işaretler. Alt en: boş hücreler (örneğin, floresan moleküller ile inkübe değildir ve elektroporasyona olan) non-elektroporasyona (ancak floresan moleküller, adı -EP ile inkübe) ve elektroporasyonlu hücreler, 10 ve 100 pmol (EP + adlandırılır) dsDNA inkübe edildi. Boş ve olmayan electroporated hücreleri karşılıkotofloresansı için, elektroporasyona ise hücreler (≥ 4 molekülleri yıldız işaretli bin bakınız), 100 pmol de yüksek yüklü hücrelerin daha yüksek bir oranda içsel bir molekül, geniş bir dağılım göstermektedir. Içselleştirme verimi 10 ve 100 pmol numuneler için (Int hücrelerin oranı. + 3x std. Dev. Sigara -EP numunenin ortalama&gt;) sırasıyla% 94 ve% 90 idi. 10 pmol dsDNA için 121 ± 106 molekülleri ve 100 pmol dsDNA için 176 ± 187 moleküller: Hücre başına içselleştirilmiş moleküllerin sayısını ortalama. Ayarlar: 100 ms pozlama, geniş açılı aydınlatma. Ölçek çubukları: 1 mikron. Bu rakam referans 26 modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52208/52208fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Hücre yükleme ve canlılığı Etiketli biyomoleküllerin miktarının değiştirilmesi ek olarak önce elektroporasyon hücrelere ilave,Kullanıcı elektroporasyon sırasında (Şekil 4, Ek Film 1) farklı alan güçlerini seçerek ayar içselleştirilmiş moleküllerin miktarını yapabilirsiniz. Yüksek alan kuvvetleri daha içselleştirilmesi verimlilikleri yol, ancak hücre canlılığı hafif azalmaya yol. Protein içselleştirilmesi için, bir filtrasyon adım kullanımı olmayan içselleştirilmiş etiketli proteinleri (3.3.3.1.1 bakınız) giderilmesine yardımcı olabilir. Bu gibi durumlarda, hücre filtrasyon gözlenen floresan proteinleri gerçekten bakteriyel sitoplazma içinde içsel sağlar; Biz (Daha fazla bilgi için, REF 22) Ancak, bu filtrasyon de hücre canlılığı üzerine olumsuz etkisi vardır, unutmayın. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52208/52208fig4.jpg"> Şekil 4: Hücre yükleme ve canlılığı üzerine elektroporasyon gerilim Etkisi (A) yükleme effic üzerinde elektroporasyon alan gücü etkisini temsil eden Çubuk grafik.iency (kırmızı çubuklar) ve hücrelerin (yeşil çubuklar) canlılığı. 37 ° C'de bir agaroz yastığı 1 saat sonra olmayan elektroporasyona hücre (0 kV / cm) bölme 84 ±% 8. Aynı koşullar altında, 78 ±% 3 ve 0.9 kV / sm ve 1.8 kV / cm elektroporate edilmiş hücrelerde 49 ±% 3, sırasıyla 1 saat sonra bölün. Hücrelerin 92 ± 6% 1.8 kV / cm yüklenir yüklenirken verimi için, hücreler 73 ±% 8, 0.9 kV / cm yüklenir. Hata çubukları üç bağımsız ölçümlerinden hesaplanan standart sapmayı temsil eder; 200'ün hücreler her bir numune ve her tekrar için analiz edilmiştir. Birkaç nesil boyunca hücre canlılığı hafif zararına elektroporasyon gerilimi ile genel yükleme verimi artar. (B) Hücre bazlı floresan ölçümleri genel floresan yoğunluğu hem kızı hücreleri arasında eşit olarak paylaşılır olduğunu göstermektedir. Hücre 1 ve 2 t = 0 Ölçeğinde (solda) beyaz ışık görüntüdeki hücre sayısı ve floresan görüntü anlamına gelirBar: 1 mikron). Bu şekil, başvuru 26 modifiye edilmiştir. Protein içselleştirme Protein içselleştirilmesi için Temsilcisi sonuçları Şekil 5A &amp; B vardır. Mümkün önce elektroporasyon gibi protein örnek geri kalan serbest (tepkimeye girmemiş) boya kadar çıkarmak için özellikle önemlidir. Şekiller 5A ve B, Cy3b etiketli Klenow Fragment örnek (KF, E. coli DNA polimeraz I Klenow fragmanı olduğu Cy3b-KF, 66 kDa), sadece% 1 serbest boyasını içeren örnekler ise; genel hücre yükleme gibi boya katkısı ihmal edilebilir. Serbest boya eşdeğer bir miktarı ile elektropore (etiketli protein aynı miktarı ile kuluçkalanmıştır) olmayan elektroporate edilmiş hücrelerde hem de ilgi elektroporasyona numune karşılaştırma olarak hücreler gözlenen floresan moleküller sağlamak için gerekli olan iki kontrolleri teşkilgerçekten etiketli proteinleri içselleştirilir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52208/52208fig5.jpg"> Şekil 5: canlı bakteri protein içselleştirilmesi (A) görüş Temsilcisi floresan bindirme alanı.. Hücreler sadece% 1 bedava Cy3b boyası içeren bir protein stok çözeltisinden 50 pmol rnap ω alt birimi ile 1.4 kV geriliminde elektropore. Sigara Elektroporasyona (non -EP) ve boş hücreler, daha önce olduğu gibi tanımlanır. Serbest kalan boya rnap ω Electroporated örnekteki gibi aynı konsantrasyonda internalize edildi. 1 mW, (A) numuneleri için düzeltilmemiş hücre ortalama yoğunlukları 50 ms maruz kalma. (B), dağıtım de geniş alan modu, 532 nm uyarım Imaging, toplam hücre sayımı oranı verilmiştir. Numune başına 400'den fazla hücre dilimli edildi. Bu rakam referans 22 modifiye edilmiştir. Unla (C) içselleştirilmesibir T7 promoterinin kontrolü altında, pRSET-EmGFP plazmid kodlayan zümrüt GFP (EmGFP) taşıyan elektro DH5a içine Beled T7 RNA polimeraz (T7 rnap, 98 kDa) sahiptir. Sol: tahlil şematik. Orta: floresan bindirme. Sağ: kuluçkalanmıştır ve T7 rnap (alt) ile elektroporasyona olmayan elektroporasyona örnek (üst) ve hücreleri için hücre bazlı floresan yoğunluklarının histogram; Electroporated hücrelerin yaklaşık% 11 yüksek floresan yoğunluğu göstermektedir (Int hücrelerin fraksiyonu.&gt; + ortalama 3x Std. Dev. dışı -EP numunesinin) EmGFP ifadesini göstermektedir. 3 um: yıldız üzerinde veya eşit 1,100 au Ölçek çubuğu tüm yoğunlukları toplama kutuları gösterir. Bu şekil, başvuru 26 modifiye edilmiştir. Şekil 5C proteini elektroporasyon başka bir uygulama sunuyor. Burada, Electroporated protein etiketsiz, ama onun içselleştirilmesi gözlemlenebilir floresan yanıtı tetikler. Bu deney öncesi doğrularSense ve hücre sitoplazması içinde elektro proteinlerin işlevleri. Etiketsiz T7 RNA polimeraz (98 kDa) E. içine içselleştirilmiş edildi bir T7 promotörü 26 kontrolü altında floresan protein EmGFP için bir plazmid kodlayan ihtiva eden E. coli suşu DH5a. T7 RNA polimeraz için gen DH5a içinde mevcut olduğu gibi, deneylerde EmGFP sentezleme fonksiyonel T7 RNA polimerazı, elektroporasyon (Şekil 5C) ile hücrelere dahil olmasını gerektirir. 1 umol T7 rnap hücrelerin&gt;% 11 ile elektroporasyon tarafta (mavi bar, Şekil 5C), negatif kontrol daha yüksek flüoresans sergilemiştir (T7 rnap aynı miktarı ile inkübe ancak elektroporasyona yok). Bu sonuç, elektroporasyon tarafından içselleştirilmiş T7 rnap moleküllerinin bir kısmının in vivo kendi bütünlüğünü korumak ve hücre sitoplazmasında amaçlanan işlevlerini gerçekleştirebilirsiniz kurar. In vivo tek molekülün de FRETve tek hücre seviyeleri Son olarak, canlı bakteri çift etiketli türlerin içselleştirme ve analiz 3. Adı floresan protein füzyonları, in vivo smFRET çalışmalar için ideal değildir, Şekil 6 ve ek film sunulmuştur, elektroporasyon kullanılarak canlı hücreler içine iki kez işaretlenmiş biyomoleküllerin iletme kabiliyeti biridir Bu yöntemin büyük varlıkların. Şekil 6A tek hücreli (donör-alıcı FRET çifti olarak Cy3B ve Atto647N fluorophores kullanarak) farklı FRET DNA standartları ile yüklenen bakterilerin analizi FRET sunuyor. Hücreler 0.17, 0.48 görünen FRET verimliliği ile üç kısa çift etiketli dsDNA FRET standartlarının 20 pmol (E *) ile electroporated edilir ve 0.86 in vitro (daha önce 26 belirlenir). Tüm DNA'lar (Şekil 6A, sol) ve her tek hücreli E * dağılımının ana zirve verimli hücrelerine girmek (in vitro sonuçları ile de Şekil 6A kabul, Sağ). Orta ve yüksek FRET örneklerde, düşük bunun nedeni, muhtemelen alıcı ağartma ve Fotofiziksel hareketsizlik, değişken hücre yükleme kombinasyonuna gözlenir beklenenden daha E * (bu nedenle, değişken bir sinyal-gürültü oranı) ve DNA bozulmasıyla hücre popülasyonları . <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52208/52208fig6.jpg"> Şekil 6,.:., Tek hücre ve tek molekül için Örnek sonuçlar Topluluğu ve smFRET çalışmalar tek bakteri yaşayan bakteri içinde gözlem FRET düşük sergileyen her biri üç DNA FRET standartlarının 20 pmol yüklü hücrelerin (A) Analizi (~ 0.17) ara madde (~ 0,48) ve yüksek (~ 0.86), FRET (in vitro tek molekül ölçümleri kullanılarak ölçüldüğünde REF 26). Sol: beyaz ışık ve yeşil / kırmızı (FRET) floresan bindirme görüntüleri (Ölçek çubuğu: 3 mikron). Farklı hücrelerden FRET değerlerin örnekleri (beyaz) gösterilir. Teçhizat (yukarıdan aşağıya) ht:. düzeltilmemiş hücre tabanlı FRET (E *) DNA standartlarını FRET donör sadece (koyu yeşil), düşük (açık yeşil), ara (sarı), ve yüksek (kırmızı) için histogramlar (B-D) in vivo smFRET içinde. Hücreler 0.25 pmol orta FRET DNA (panel B), 0.25 pmol yüksek FRET DNA (panel C) ile yüklenir, ve 5 pmol KF (panel D), çift etiketli. Sol sütun: öncesi ve alıcı photobleaching sonra tek bir kare yeşil / kırmızı floresan bindirme. Orta sütun: sarı daire içinde molekülün karşılık gelen zaman izleri. FRET verimliliği, donör emisyon yoğunlukları ve alıcı emisyon yoğunlukları sırasıyla, mavi, yeşil, kırmızı ve görüntülenir. Sağ kolon: donör sadece moleküller (yeşil) ve her bir numune için 20 kez izlerinden (sarı, kırmızı ve gri) donör-alıcı molekülleri FRET histogramlar. Ölçek çubukları: A 3 um, B-D-1 um. Bu şekil, başvuru 26 modifiye edilmiştir.208fig6large.jpg "target =" _ blank "&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. DNA ya da protein, orta ve yüksek-FRET DNA standartları örnekleri, düşük miktarlarda (0.25 umol) (Şekil 6B, C) ​​ya da, FRET çifti çift etiketli KF (Alexa647 / Cy3B fluorophores 5 pmol Şekil için in vivo olarak smFRET gözlemlemek 6D) E. elektroporasyona tabi olan coli. Bu konsantrasyonlar izleme ve tek moleküllerin izlenmesi FRET, doğrudan yerelleştirme izin birkaç (n = 1-10) etiketli molekülleri ile yüklenen birçok hücrelere yol açtı. Diğerleri hareketsiz görünür veya yavaş (Ek Film 3) yaygın ise bazı moleküller, serbestçe yayılır. 1-30 saniye sürer ve smFRET ayırt edici göstermektedir hareketsizleştirilmiş çift etiketli biyomoleküllerin (Şekil 6, ortada) Timetraces: Örneğin alıcı ağartma üzerine donör ve akseptör floresansta anticorrelated değişimleri (t ~ 16 saniye; Şekil 6B, orta ), tek ardından(örneğin, t +; 19 saniye; Şekil 6B), aşama verici ağartma. Bu tür timetraces (Şekil 6, sağ) in vitro çalışmalar, 26,31,32 yayınlanan ile mükemmel bir uyum içinde olan, bir ortalama değer sonuç elde FRET dağılımlar. Bu sonuçlar içselleştirilmiş DNA'lar ve proteinler üzerinde kantitatif smFRET çalışmaları için yeteneği kurmak, ve (T7 rnap içselleştirilmesi deneyleri tarafından desteklenen) proteinleri elektroporasyon ve içselleştirilmesi üzerine kendi bütünlüğünü ve yapısını korumak öneririz. Ek Film 1:. Hücre canlılığı Sol: Beyaz ışık görüntüleri. Sağ: floresan görüntüler. Hareketli GIF 10 pmol Atto647 işaretlenmiş DNA ile yüklü bakteri elektroporasyon (1.8 kV / cm) sonra ayrımı gösteren animasyonlu. floresan genel belirgin düşüş kısmen her sırasında meydana photobleaching da hücre bölünmesi üzerine etiketli DNA seyreltme nedeniyle ve birölçümü. Ek Film 2: Hücre bazlı photobleaching çalışmaları A.. (&gt; 100 Atto647N etiketli DNA moleküllerini ihtiva eden) bir ağır yüklü hücre Örnek örneği. En sol, faiz (kırmızı dikdörtgen) bir hücrenin beyaz ışık görüntüsü. En doğru, birkaç dakika içinde kendi floresan çürümesine gösteren yüklenen hücrelerin film. Ilgi hücrenin genel floresan yoğunluğu çürüme Bottom, zaman iz. Organik flüoroforlar yaşam süreleri FP daha yüksek büyüklükte 2 sipariş (burada ~ Atto647N 41 sn), ışıkla ağartma sergileyebilir. En az 10 işaretli moleküllerin (bu durumda 3) ile yüklü bir hücre B. Örnek örneği. Paneli A. Bottom, tek aşamalı ağartma gösteren ve / veya tek organik floroforlar karşılık gelen yanıp sönen ilgi hücrenin genel floresan yoğunluğu zaman izi ile aynı Üst,. Bu adımların ortalama yüksekliği ~ burada (tek-molekül üniter yoğunluğuna karşılık12 au) hücre başına içselleştirilmiş moleküllerin ilk sayısını tahmin etmek için kullanılmıştır. 300 uW güçte sürekli kırmızı lazer uyarma altında Filmler ve kare başına 100 ms. Ek Film 3:. Ben n tek-molekül FRET En vivo: Hücreler sürekli nTIRF aydınlatma altında kare başına 50 ms izlenir 0.25 pmol (Şekil 6C gibi) yüksek FRET DNA 1 mW yeşil (532 nm) lazer kullanarak yüklü. Her kare, her kanalda bir yeşil / kırmızı (FRET) floresan bindirme olduğunu. Difüzyon ve hareketsiz kırmızı (bozulmamış) ve yeşil (tek aktif etiket) DNA molekülleri görülebilir. Alt: sarı daire içinde molekül gelen Zaman iz. FRET verimliliği, donör emisyon yoğunlukları ve alıcı emisyon yoğunlukları sırasıyla, mavi, yeşil, kırmızı ve görüntülenir. Anti-ilişkili alıcı ağartma olayı (kırmızı-yeşil-geçişler için) tek-molekül FRET imzalanmasından karşılık gelir.

Biyomoleküllerin in vivo çalışmaları, biyolojik bağlamda moleküler işlevi anlamak için çok önemlidir. Burada, DNA veya proteinler gibi floresan biyomoleküllerin canlı mikroorganizmalara içselleştirilmesine izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Floresan mikroskobu ile kaydedilen in vivo verilerin analizi de sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

Bu prosedürün amacı, elektroporasyona dayalı bir yöntem kullanarak canlı mikroorganizmaların içindeki DNA veya organik Fluor ile etiketlenmiş proteinler gibi biyomolekülleri içselleştirmek ve görselleştirmektir. Bu, elektro-yetkin hücrelerin ilk olarak floresan etiketli biyomoleküllerle inkübe edilmesinden ve ardından bir elektroporasyon kanalına aktarılmasıyla gerçekleştirilir. Vete boyunca yüksek bir voltaj uygulayarak, hem hücre duvarında hem de hücre zarında geçici gözenek oluşumları, hücrelere biyomoleküler difüzyonu sağlayacaktır.Daha sonra, hücreler, içselleştirilmemiş fazla biyomoleküller uzaklaştırılmadan önce iyileşmelerine izin vermek için zengin bir ortamda inkübe edilir. Son olarak, hücreler düşük floresan minimal besleyici bir arose pedine aktarılır ve daha sonra bir cam agro sandviç oluşturmak için üstüne bir cam örtü astarı yerleştirilir. Sonuç olarak, bu öz mikroskobu, canlı hücrelerin içindeki etiketli biyomoleküllerin konumunu, difüzyon modelini ve dinamik özelliklerini analiz etmek için kullanılır.Bu yöntem için ilk olarak canlı hücre görüntülemedeki sınırlamaları fark ettiğimizde aklımıza geldi. GFP gibi foto floresan proteinlerinin hızlı bir şekilde bozulması nedeniyle, canlı hücreleri organik floro kuvveti ile etiketlenmiş biyomoleküllerle yükleyerek, canlı mikroorganizmaları nakledeceğimizi düşündük. Bu kuvvetin ana avantajları parlaklık, fotoğraf kararlılığı ve küçük boyuttur.Daha sonra, DNA veya proteinlerin kendi doğal ortamlarında lokalizasyonunu ve difüzyonunu çok daha uzun zaman ölçeklerinde takip etmeyi umuyoruz, bu da birçok önemli biyolojik süreçle eşleşecektir. Bu tekniklerin mikroenjeksiyon gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, tipik mikroenjeksiyon iğnesinin çapından daha küçük mikroorganizmalara da uygulanabilmesidir. Elektroporasyonun ek bir avantajı, çok sayıda hücrenin aynı anda floresan biyomoleküllerle yüklenebilmesi ve bunları paralel olarak görselleştirebilmesidir, bu da elektroporasyonu özellikle göz verimi tekniği haline getirir.Bu yöntem, floresan olarak işaretlenmiş biyomoleküllerin in vivo olarak difüzyon ve dinamik davranışı hakkında fikir verebilse de, etiketlenmemiş elektrot biyomolekülleri gibi başka bağlamlarda da uygulanabilir, ancak örneğin, hücre tarafından içselleştirildiğinde fizyolojik bir tepkiyi tetikleyebilir Bakteri veya maya floresan mikroskobu için aros pedleri oluşturmak için iki x düşük floresan ortam hazırlayarak başlayın, Daha sonra damıtılmış suda% 2'lik bir Aros çözeltisini hemen bir laboratuvar mikrodalga fırını ile eritin. Ortama eşleşen bir hacimde sıcak HA gülü ekleyin ve karışımı yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyin. Kabarcık oluşumunu önlemek için, ortaya çıkan karışımın yaklaşık 200 mikrolitresini hemen standart boyutlu bir mikroskop kapak fişi üzerine pipetleyin.Jel katılaşana kadar kapak fişini oda sıcaklığında bir dakika tezgah üzerinde bırakın veya geçici olarak saklayın, taze pedin üzerine ikinci bir temizlenmiş kapak kılıfı yerleştirin ve düşük iyonik kuvvete sahip bir tamponda hazırlanan bir floresan biyomolekül stoğundan başlayarak yumurta gülünün içinde pul pul dökülmek için üstten hafifçe baskı uygulayın. Beş mikrolitreye kadar biyomolekülü 20 mikrolitrelik bir yetkin bakteri alikotuna veya 50 mikrolitrelik yetkin maya hücresine aktarın. Hücrelerle birlikte inkübe edilen floresan biyomoleküllerin miktarı, hücre başına içselleştirilen biyomolekül miktarı ile doğrudan ilişkilidir.Elektroporasyondan sonra, karışımı buz üzerinde 10 dakikaya kadar inkübe edin. Aynı zamanda, uygun elektrot aralığına sahip bir elektroporasyon vete seçin ve buz üzerinde soğutun. Hücre karışımını önceden soğutulmuş vete içine aktarın.Solüsyondaki kabarcıkları çıkarmak için vete'ye birkaç kez hafifçe vurun. Vete'deki nemi bir kağıt havluyla alın ve vete'yi elektroratöre yerleştirin. Bu işlemden hemen sonra hücrelere yüksek voltajlı bir darbe uygulayın.Elektro cihazda görüntülenen zaman sabitinin dört ila altı milisaniye arasında olduğunu doğrulayın. Daha düşük zaman sabitleri genellikle qve içinde aşırı tuz veya kabarcıkların varlığından kaynaklanır ve biyomoleküllerin hücrelere alımını azaltabilir veya tamamen engelleyebilir. Daha yüksek voltaj darbeleri hücre yüklemesini iyileştirir, ancak elektroporasyondan hemen sonra hücre canlılığını da etkileyebilir.500 mikrolitre zengin ortam ekleyin ve hücreleri 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Hücre zarının 37 santigrat derece bakteri veya mayayı 29 santigrat derece arasında iki ila 10 dakika inkübe ederek iyileşmesine izin verin. Biyomolekül katılımı ve büyüme geri kazanımından sonra, hücreleri dört santigrat derece önceden soğutulmuş bir santrifüjde bir dakika döndürün ve sırtüstü ajan Reese'i atın.Peleti 500 mikrolitre tamponda askıya alın ve sıkma doyurma ve çıkarma ve tampon reçine süspansiyon işlemlerini tekrarlayın. Üç kez daha. Bu yıkama adımları, hücre süspansiyonundan içselleştirilmemiş biyomoleküllerin tüm izlerini kaldıracaktır.Etiketli protein içselleştirme ve ek saflaştırma adımı, hücre süspansiyonunun üstüne 0,22 mikronluk bir membran filtre ile donatılmış 1,5 mililitrelik bir tüpe pipetlenmesiyle gerçekleştirilir. Hücrelerin kurumasını önlemek ve fraksiyondan akışı atmak için filtrenin üzerinde yeterli sıvı kaldığından emin olurken hücreleri santrifüjleme ile tampondan ayırın. Filtrenin altına, hücrelerin üzerine 500 mikrolitre taze PBS ekleyin ve bir döndürme kombinasyonunu ve ardından yeni PBS baskısını tekrarlayın.İki kez daha. Bir dakika boyunca 3.300 G'de son bir dönüş yapın. Önceki PBS yıkamasını çıkarmak için, hücreleri 150 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın.Son olarak, daha önce yapılmış aros pedinden üst kapak sürgüsünü çıkarın. Hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini damla damla pipetleyerek hücreleri pedin üzerine yükleyin. Arose pedin üzerine yeni bir temizlenmiş kapak astarı yerleştirdikten sonra, sandviç hücreler artık floresan mikroskobu için hazırdır.Etiketli biyomoleküllerle inkübe edilmiş nominal olmayan kontroller veya elektro dereceli veya inkübe edilmemiş boş hücreler gibi negatif kontroller de herhangi bir yüklü numuneye paralel olarak hazırlanmalıdır, yüklü hücreler herhangi bir uygun floresan mikroskobunda görüntülenebilir. Geniş alan görüntüleme modu, hücre düzeyinde görüntüleme ve analize izin verirken, çim veya yüksek düşük aydınlatma veya tek molekül gözlemi ve takibi için idealdir. Biyomoleküllerin aşırı foto-ağartılmasını önlemek için, lütfen numune yüklemeden önce tüm sahne üstü lazer aydınlatmalarının kapatıldığından veya opak bir filtreyle engellendiğinden emin olun.Ayrıca, aşırı pozlamanın fotoğraf makinesine zarar vermesini önlemek için E-M-C-C-G kamera kazancını kapatın. Ters çevrilmiş bir mikroskop kurulumu için, Aris ped sandviçini, hücre kaplı tarafı aşağı bakacak şekilde alt objektife bakacak şekilde mikroskop aşamasına yerleştirin. Ardından üst taraftaki halojen ışığı açın ve lazeri açmadan önce hücreleri iletilen beyaz ışık mikroskobu modunda odaklayın, beyaz ışık iletim modunda hücrelerin fotoğrafını çekin.Bu fotoğraf, biyomoleküler floresan bölgeleri ile aynı görüş alanı içindeki hücrelerin gerçek konumları arasında ilişki kuracak bir konumsal referans haritası olarak kullanılacaktır. Canlılık ölçümü için, optimum sıcaklığa ayarlanmış bir objektif ısıtıcı kullanın ve sahneyi hareket ettirmeden her 30 dakikada bir beyaz ışık aydınlatması altında aynı görüş alanının sıralı görüntülerini kaydedin, üst üst aydınlatmayı kapatın ve numunenizi laboratuvardaki diğer tüm ortam ışığı kaynaklarından koruyun. Ardından CCD kamerayı açın ve veri toplamaya başlayın.Lazer aydınlatmayı açmadan hemen önce floresan iyonu kaydetmeye başlayın. Floresan mikroskobu gerçekleştirdikten sonra, ayar düğmesine basarak tüm görüntülerde parlaklık veya kontrast gibi tüm temel görüntü parametrelerini normalleştirmeye başlamak için tüm fotoğrafları Image J gibi bir görüntü işleme yazılımıyla açarak veri analizine başlayın ve diğer tüm görüntülere yayılmayı seçin. Birinci seçenek, hücre yüklemesinin başarılı olup olmadığını kalitatif olarak belirleyebilir, çünkü yüklü hücreler, belirli bir görüntü için negatif kontrol olarak kullanılan elektroporasyonlu olmayan hücrelerden önemli ölçüde daha parlak olmalıdır.Serbest el seçimi aracını kullanın ve elle çizilmiş çokgenlerle farklı floresan bölgelerini çevreleyin. Analiz menüsünden ölçüm seçeneğini seçerek ilgili tüm çokgenler arasındaki floresan yoğunluğunu karşılaştırın. Her örnekteki tüm hücrelerin ve negatif kontrollerin piksel başına yoğunluğunu çıkarmak için bu işlemi manuel olarak veya otomatik bir komut dosyası kullanarak tekrarlayın.Elektro dereceli bir hücreye bir veya birkaç floresan biyomolekül yüklendiğinde, ortalama emisyon yoğunluğu, negatif kontrol numunesinin ortalama yoğunluğundan daha büyük olacaktır. Hücre canlılığını değerlendirmek için, bölünmeyen ve hasar görmüş hücreler tarafından bozulmadan bölünme yüzdesini manuel olarak sayın. Verilerin her 30 dakikada bir birkaç bölünme boyunca kaydedildiği aynı görüş alanında, özellikle biyomoleküller hızlı bir şekilde yayıldığında veya hücreler beşten fazla etiketli biyomolekül ile yüklendiğinde, hücre başına içselleştirilen biyomolekül sayısını doğrudan saymak her zaman mümkün değildir.Hücre bazlı foto ağartma analizi, bu tür durumlarda hücre başına etiketli biyomolekül sayısının değerlendirilmesine izin verir. Serbest seçim düğmesini kullanarak, belirli bir floresan hücrenin ana hatlarını izleyin ve foto ağartma etkilerinden dolayı zamanın bir fonksiyonu olarak ham hücre floresansını çıkarın ve çizin. Yoğunluğa karşı zaman grafiği, ağır yüklü hücreler olan katlanarak azalan bir eğri olacaktır, ancak 10'dan az biyomolekül içeren hücreler için net adımlar ayırt edilebilir olmalıdır.Deneyin düz kuyruk ucu kısmının yakınındaki ham floresan yoğunluk değerlerinin ortalamasını alarak foto ağartma sonrası ortalama otofloresansı hesaplayın, bu örneğin hızlandırılmış serideki son 50 ila 100 görüntü karesi olabilir. Taban çizgisi yoğunluğunu belirledikten sonra, ham floresan verilerinden temel otofloresanı çıkararak zamana bağlı foto ağartma yoğunluğunu hesaplayın, ardından elde edilen foto ağartma yoğunluğu verilerini bloke edin ve her adımın yüksekliğini manuel olarak veya bir algoritma kullanarak niceleyin. Bu işlem, ortalama adım yüksekliğinin doğru bir tahminini elde etmek için genel olarak 100'den fazla adım sergileyen birkaç hücre için tekrarlanmalıdır, bu değer, tek bir floro dördünün ağartılmasına bağlı üniter floro dört yoğunluğuna karşılık gelir.Son olarak, hücre başına içselleştirilmiş molekül sayısı, sıfıra eşit olduğunda taban çizgisi çıkarılan hücre yoğunluğunun üniter floro ile bölünmesiyle hesaplanabilir. Bu elektroporasyon protokolü için dört yoğunluk. Bakteri veya mayaya içselleştirilebilen floresan etiketli DNA veya protein miktarı, elektroporasyon tamponu içinde bulunan DNA problarının miktarı ayarlanarak kontrol edilebilir.Biyomoleküler içselleştirme oranı yüksek olduğunda, önce floresan yoğunluğunun zamanın bir fonksiyonu olarak çizilmesi ve ardından üstel zaman sabitinin çıkarılmasıyla bulunabilen etiketli biyomolekülün foto-ağartma ömrü, boyaların in vivo foto stabilitesi hakkında bilgi verir. Düşük birleştirme oranları durumunda, floresan yoğunluğunun nicelleştirilmesi, belirli bir hücre içindeki toplam biyomolekül sayısını yaklaştırmak için bir araç sağlayacaktır. Elektroporasyon, proteinleri bakteri veya mayaya dahil etmek için de kullanılabilir.Floresan etiketli protein durumunda. Serbest floroforların kendileri çok verimli bir şekilde içselleştirilebildiğinden, tüm fazla serbest ve kovalent olarak bağlanmamış floroforların protein stoğundan çıkarılması önemlidir. Son olarak, moleküllerimiz tarafından iki kez etiketlenen, canlı hücrelerde birkaç saniye boyunca tek molekül fret gözlemine izin vermek için yöntemimiz kullanılarak içselleştirilebilir.Bu prosedürü denerken, etiketli bir biyomolekül ile inkübe edilen elektro olmayan hücreler veya ne elektroporasyona tabi tutulmuş ne de etiketli bir molekül ile inkübe edilmemiş boş hücreler gibi kontrol numunelerini de hazırlamayı ve analiz etmeyi unutmamak önemlidir. Bu kontroller, hücre otofloresan seviyesini ve yıkama adımlarının eksikliğini değerlendirmemize izin verir ve bu nedenle, elektroporasyon deneyinin başarılı olup olmadığını değerlendirmek için gereklidir. Bu teknik, biyofizik ve üçüncü biyoloji alanındaki araştırmacılar için canlı mikroorganizmalarda etiket biyomolekülünün difüzyonunu ve dinamik davranışını araştırmak için yeni yollar açtı.Ve bu, GFP'ler gibi otofloresan proteinlerden bir ila iki kat daha uzun bir zaman ölçeğinde. Organik d etiketlemesinin esnekliğini in vivo olarak aktararak, canlı hücrelerde molekül içi ve moleküller arası dinamiklerin incelenmesi için tek moleküllü tehdit deneylerini çok daha uygun hale getirdi.

internalization-observation-fluorescent-biomolecules-living

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada izlenir ve sayısal, fonksiyonel moleküler kompleksler tespit sağlamak için canlı bakteri hücreleri tek-molekül floresan mikroskopi gerçekleştirmek için protokolleri göstermektedir.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Bu video hücrelerin verimli elektrofüzyon...

Hücre Elektrofüzyon Floresan Mikroskop ile görüntülendi

Kaynak: Aigrain, L. ve diğerleri. Elektroporasyon yoluyla canlı mikroorganizmalarda floresan biyomoleküllerin içselleştirilmesi ve gözlemlenmesi.  J. Vis. Exp. (2015)Video, elektroporasyon kullanılarak floresan biyomoleküllerin elektro yetkili mikrobiyal hücrelere nasıl teslim edildiğini gösteriyor. Süreç, florofor etiketli DNA veya proteinlerin soğutulmuş hücre süspansiyonuna eklenmesiyle başlar. Daha sonra yüksek voltajlı bir darbe uygulanarak geçici membran gözenekleri oluşturulur ve...

Floresan Biyomoleküllerin Bakteriyel Hücrelere Elektroporasyon Tabanlı Teslimatı

Bu video, floresan protein kodlayan plazmit DNA'sını fare birincil serebellar granül hücre öncülerine sokan elektroporasyon tekniğini göstermektedir.

Elektroporasyon Aracılı İn Vitro Gen İletimi: Floresan Raportör Protein Kodlayan Plazmitleri Kültürlenmiş Hücrelere Sokmak İçin Bir Elektrik Darbe Tekniği

Biz canlı hücre konfokal görüntüleme vasıtasıyla, endoplazmik retikulum (ER) içerisinde yerleşik transfekte floresan protein dağılımı ve hareketliliği incelemek için kullanılan görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Biz de ultrastruktural bu subselüler bölmesinin mimarisi üzerine kendi ifade etkisini analiz.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

Ilgili ilkeleri ölçme ve floroforlar ve antikor hedefli koşulları çok sayıda uyumluluğunu göstererek Lüminesans (YAKIT) dan Sınırsız Uyarma tarafından Floresans temel ve uygulanabilirliğini genişletilmesi.

BRET Ötesinde Bir Adım: Sınırsız Uyarma tarafından Flüoresan Lüminesans dan (YAKIT)

Biyolistik dönüşüm homolog yeniden bağlama aracılığıyla fırsatçı patojen Cryptococcus neoformans genomuna DNA'nın kararlı bütünleşmesinin oluşturmak için kullanılan bir yöntemdir. Biz C.neoformans içine floresan etiket mCherry kaynaşmış kodlayan gen asetat kinaz olan bir yapı, biolistik dönüşümü gösterecektir.

Fırsatçı mantar patojenlere bir Floresan etiketli geninin biyolistik transformasyonu<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

pH'ya duyarlı bir florofor ile bir membran proteinin hücre dışı alanını Etiketleme, superecliptic pHluorin (SEP), hücre içi lokalizasyonu, sentezleme ve trafik saptanmasına olanak sağlamaktadır. Görüntüleme toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) proteinleri Eylül-etiketli periferal ER ve plazma membranı protein seviyelerinin ölçümü sağlar.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Bakterilerde temel süreçleri işlevini anlamak zordur. Floresans mikroskobu hedef özel boyalar ile mikrobiyal hücre büyüme ve hücre döngüsü ilerleme içine anahtar anlayışlar sağlayabilir. Burada, Agrobacterium tumefaciens yöntemleri canlı hücre görüntüleme için gerekli işlemleri karakterizasyonu için vurgulamak için bir model bakteri kullanılmaktadır.

Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Bakteri hücrelerinin görüntülenmesi, büyük makromoleküler makinelerin işlevini belirleyen statik ve dinamik süreçleri tanımlamaya odaklanmış yeni ortaya çıkan bir sistem biyolojisi yaklaşımıdır. Burada Lejyonella pnömophila tip IV salgı sistemi mimarisi ve fonksiyonlarını incelemek için kantitatif canlı hücre görüntüleme ve kriyo-elektron tomografisi entegrasyonu kullanılmaktadır.

Legionella pnömophila Dot/Icm Salgı Sisteminin Spatiotemporal Özelliklerini Çözmek İçin Canlı Hücre Görüntüleme ve Kriyo-Elektron Tomografisi Uygulama

Elektroporasyon, moleküler kargoyu tanıtmak için hücre kültürlerinde geçici gözenekler oluşturmak için darbeli elektrik alanlarının (PEF'ler) kullanılmasıdır. Bu teknik son zamanlarda araştırma ve klinik ortamlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, canlı hücreli, floresan mikroskobu gerçekleştirmek için yakın zamanda geliştirilen "Elektroporasyon Sitometri Sistemi" ni kullanarak elektroporasyon tekniklerini açıklıyoruz.

U2 OS Hücre Kültürü Kullanılarak Canlı Hücre, Floresan Mikroskobu için Bir Elektroporasyon Sitometrisi Protokolü

Öğrenin, elektroporasyon yöntemiyle canlı mikroorganizmalara floresan biyomoleküllerin içselleştirilmesini ve floresan mikroskopiyle dinamiklerinin gözlemlenmesini. Bu teknik, hücre içi biyomoleküler davranışların uzun süreli izlenmesini sağlar.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Daha fazla video keşfet