Fare İskelet Kası Algılama ve DNA Hasar Analizi In Situ TÜNEL Yöntemiyle

Bu prosedürün genel amacı, C iki'de DNA kırılmalarını ve hücre ölümünü tespit etmektir. Bu, tünel reaktiflerinin hücre çekirdeğine girmesine izin vermek için ilk perme dokusu bölümleri ile gerçekleştirilir. Daha sonra TDT enzimi, DTP'leri bu hücrelerdeki DNA kırılmalarının üç ana ucuna kovalent olarak bağlamak için kullanılır.

Daha sonra DUTP bir floresan probu ile etiketlenir. Sonuç olarak, tünel pozitif sinyali, hücrelerdeki DNA kırılmalarının nispi sıklığını yansıtan doku kesitlerinde ölçülür. Bu tekniğin southern blotting veya immünohistokimya gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, nispeten hızlı spesifik olması ve gürültü ve otofloresanı ortadan kaldırmanın bir yolunu sağlamasıdır.

İzole edilmiş arka bacakları 15 mililitrelik bir tüpte PBS'de% 4 Para formaldehitte sabitleyerek başlayın, fiksasyonun dört santigrat derecede dört ila en fazla 24 saat sürmesine izin verin. Doku embriyonik ise sadece iki saat gereklidir. Bununla birlikte, fiksasyondan sonra, dokuyu kriyo korumak ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe etmek için çözeltiyi% 10 sükroz ile değiştirin.

Ertesi gün, çözeltiyi steril filtrelenmiş% 30 sükroz ile değiştirin ve inkübasyona gece boyunca veya arka bacaklar tüpün dibine batana kadar devam edin. Gömme sırasında, arka bacakların gömme ortamına tamamen daldırılması önemlidir. Gömme kalıpları, ortamı dondurmak için doğrudan kuru buz üzerine veya kuru buz üzerine isop pentan içine yerleştirilebilir.

Kriyoseksiyon yaparken. Bloklar, 10 mikron kalınlığında veya daha ince olan transfer bölümlerini keser, daha kalın bölümler tünel etiketleme reaktifleri tarafından nüfuz etmeyecektir. Bu ince bölümleri oda sıcaklığında jelatin veya vektör bağ kaplı cam slaytlar üzerinde toplayın.

Çok hızlı bir şekilde, slaytları saklamak için kuru buza aktarın. İlk olarak, donmuş doku bölümünün bir slaytını oda sıcaklığına çözün ve 16 ila 64 saat kurumasını bekleyin. Slayt oda sıcaklığına geldiğinde, bölümü PBS ile doldurulmuş bir bağlantı kavanozunda 10 dakika boyunca yeniden sulandırın.

Bu rehidrasyon adımını bir kez tekrarlayın, ardından bölüme nüfuz etmek için doku bölümünü rahatsız etmeden slaytı bir laboratuvar mendiliyle dikkatlice kurulayın, slaytı bir nem odasına yerleştirin ve 50 mikrolitre proteolitik olmayan saponin bazlı ticari reaktifleri bölüme pipetleyin. Ayrılabileceği veya hasar görebileceği için doğrudan bölümlerin üzerine pipetlemeyin. Ardından, reaktifi yaymak için bölümün üzerine küçük bir parça para film yerleştirin.

Kabarcıklar oluşursa, para filmi tekrar uygulayın. Slaytın bir saat sonra bir saat kuluçkaya yatmasına izin verin. PBS'de beş dakikalık iki yıkama kullanarak reaktifleri çıkarın ve dikkatlice kurulayın.

DNA kırmalarını TDT ile etiketlemenin yanında, piyasada bulunan bir kit kullanın. İlk olarak, bir XTDT tamponu yapın ve bölümün üzerine pipetleyin. Daha sonra slaytı nemlendirme odasında beş dakika inkübe edin.

İkinci olarak, kit talimatlarına veya pozitif bir kontrol slaytına göre bir TDT etiketleme karışımı yapın. TDT etiketleme karışımına DNA ekleyin. Negatif bir kontrol slaytı için, TDT enzimini karışımdan çıkarın.

Şimdi bir mendil kullanarak, slayttan mümkün olduğunca fazla tamponu çıkarın ve etiketleme karışımının üzerine pipetleyin. 50 mikrolitre yeterli olacaktır. Yine, çözeltiyi kabarcıklar yapmadan paraform ile yayın.

Slaytın haznede bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmesine izin verin. Üçüncüsü, kitin talimatlarına göre bir x durdurma tamponunu yapın. Etiketleme karışımını laboratuvar mendiliyle çıkardıktan sonra, bölümü tamamen kaplamak için iki ila 300 mikrolitre arasında durdurma karışımı ekleyin.

Daha sonra slaydı haznede beş dakika inkübe edin. Bu adımda para film kullanılmaz. Durdurma tamponunu çıkarmak için PBS'de iki adet iki dakikalık yıkama kullanın.

Şimdi 50 mikrolitre taze hazırlanmış floresein etiketleme solüsyonunu pipetleyin. Slaytın üzerine perfil uygulayın ve haznede 20 dakika inkübe edin, ancak şimdi karanlıkta. Etiketleme solüsyonunu PBS'de iki dakikalık tek bir yıkama ile çıkarın, yıkarken bazı kancaları seyreltin.

3, 3, 2, 5, 8 ila PBS'de mililitre başına bir mikrogram. Yıkamalardan sonra, bölümleri seyreltilmiş kanca çözeltisinin bir ila 200 mikrolitresi ile kaplayın. Daha sonra slaydı beş dakika inkübe edin, kancaları lekelemek için ışıktan koruyun, PBS'de beş dakikalık üç yıkama kullanın.

Ardından slaytı bir laboratuvar mendiliyle dikkatlice kurulayın ve görüntüleme için bir kapak fişi uygulayın. Kanca lekesini, tünel lekesini ve otofloresan sinyallerini tek bir görüntüde üç yanlış renk kanalına ayırmak için dpi, fitzy ve Texas kırmızı filtrelerini kullanarak bölümü görüntüleyin. Kolayca karşılaştırılabilmeleri için tüm slaytlar arasında aynı görüntüleme ayarlarını standartlaştırın ve koruyun.

Anatomik referans için herhangi bir otomatik pozlama veya kazanç ayarı kullanmayın. Görüntü analiz yazılımında h ve e ile boyanmış bitişik bir arka bacak bölümünün parlak, parlak alan görüntüsünü kullanın. Tünel kanalını kapatın.

Ardından, diğer kanalları kullanarak ölçülecek kas alanının ana hatlarını manuel olarak izleyin. İzlenen alanı bir maskeye dönüştürün. Ardından tünel kanalını tekrar açın ve otomatik floresan sinyalini hariç tutmak için minimum yoğunluk eşiğini ayarlayın.

Çalışmada analiz edilen tüm bölümler için aynı eşik sınırını kullanın. Ardından, eşik piksellerini bir maskeye dönüştürün. Her görüntüde kas alanı maskesini ve eşik tüneli maskesini birleştirin.

Bu, izlenen kas alanı içindeki tünel sinyalinin bir temsilini yapar. Şimdi, tünel pozitif nesnelerin sayısını ve kas içindeki tünel sinyalinin toplam piksel alanını belirlemek için birleşik maskeyi ölçün. İstatistiksel analiz için bu değerleri kullanın.

Düşük büyütme oranına sahip tünel pozitif cisimler iskelet kasında parlak düzensiz parçalar olarak görünebilir. Bununla birlikte, daha yüksek büyütmede, hücre ölüm tipi bu apoptozu içeriyorsa, klasik apoptotik morfolojiye sahip bazı tünel pozitif nesneler gözlenmelidir. D DNA'ları eklenmiş pozitif kontrol, tüm dokulara eşit olarak dağılmış bol miktarda tünel pozitif sinyali sergilemelidir.

bölümünde. TDT enzimi olmayan negatif kontrol, düşük yoğunluklu bir arka plana sahip olmalı ve sadece otofloresan göstermelidir. Tarif edilen protokol ile eritrositlerin kemik ve endotel hücrelerinin hazırlanan yüksek ekstremite kesitlerinde otofloresan sinyale katkıda bulunduğu bulundu.

Gerçek tünel pozitif sinyali çok daha yoğundu. Bir piksel yoğunluğu eşiği kullanılarak otofloresan sinyalden izole edilebilir. Tünel sinyalini izole etmek için başka bir seçenek, kırmızı otofloresan kanalını tünel kanalından dijital olarak çıkarmaktı.

Bu tekniği kullanarak, iskelet kası hücresi ölümü. SMA'nın bir fare modelinde değerlendirildi, tünel etiketlemesi beş günlük SMA farelerinde kontrollere göre daha fazla apoptotik hücre ortaya çıkardı. Tünel boyamayı ölçerek, bu gözlemin arka bacak içindeki çoklu kas grupları için istatistiksel olarak anlamlı olduğu gösterildi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, güvenilir nicel sonuçlar elde etmek için tünel tekniği yaklaşık dört saat içinde yapılabilir.