Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

Bu prosedürün genel amacı, kök hücrelerden yüksek kaliteli retina pigment epiteli veya RPE'yi tekrarlanabilir bir şekilde elde etmektir. Bu, ilk önce indüklenebilir pluripotent kök hücrelerin birlikte akıcılık elde etmek için büyütülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, hücreleri RPE kaderlerine yönlendirmek için ortam değiştirilir.

Daha sonra, RPE hücreleri çanaktaki diğer farklılaşmış hücrelerden izole edilir ve daha sonra kültürler yeterli sayıda hücre elde edilene kadar genişletilir. Sonuç olarak, kültürlerin koyu pigmentasyonu ve parke taşı morfolojileri, RPE hücrelerinin terminal farklılaşmaya ulaştığını doğrulamak için kullanılabilir. Bu tekniğin spontan diferansiyasyon gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, tanımlanmış faktörlerin eklenmesinin farklılaşmayı, zamanı hızlandırması ve RPE verimini artırmasıdır.

Bugüne kadar binlerce kemirgen, IPSA çeşitli retinal dejeneratif hastalıklardan türetilen RPE hücreleri kullanılarak tedavi edilmiştir. Bununla birlikte, bunu verimli ve etkili bir şekilde bu hastalıklara sahip kliniklerde insanları tedavi etmeye dönüştürürsek, bize yüksek kalite, yüksek sayıda RPE satışı ve IPS sağlayacak iyi kurulmuş tekrarlanabilir protokoller geliştirmemiz kesinlikle zorunludur. Bu yöntemin görsel sunumu esastır, çünkü herhangi bir zamanda sadece bir kişi mikroskopta kaputun altında çalışabilir, izolasyon adımının görselleştirilmesini zorlaştırır. Laboratuvarımdan bir araştırma teknisyeni olan Mitchell Prince, şimdi prosedürün dijital kültür yönleriyle ilişkili protokolü gösterecek Kök hücreden türetilmiş RPE kültürünün, fare embriyonik besleyici hücrelerinin bir tabakası üzerindeki kök hücre çizgisinin farklılaşmasını yönlendirmek için, altı oyuklu bir plakanın oyuğu başına iki kez 10 ila altı hücre, Kolonilerin COF akıcılığına ulaşmasına izin verin ve ardından farklılaşma ile günlük beslemelere geçin.

Nikotinamid ile desteklenmiş ortam. Üç hafta sonra, RPE farklılaşmasını artırmak için beslemelere bir veya IDE'de aktif eklemeye başlayın. İki hafta sonra, günlük beslenmeyi bırakarak farklılaşma ortamına ve tek başına nikotinamide geri dönün.

Ortamdaki pH göstergeleri beslenmeden sonraki gün sararmayı bıraktığında, pigmentli hücrelerin kesilip çıkarılabilecek kadar büyük halkaları görünene kadar kültürü inkübatöre geri koyun. Pigmentli halkaları izole etmek için bir sonraki katta, doğal hücre ortamını taklit eden kseno içermeyen bir matrise sahip 24 oyuklu bir plakanın kuyuları. Daha sonra, 24 kuyulu plakanın çok sayıda kuyusunu gerektiği kadar farklılaştırma ortamı ile doldurun.

Ve bir hücre kültürü davlumbazında, orijinal plakanın altındaki her bir pigmentli deliği iki ila altı parçaya bölmek için bir diseksiyon kapsamı ve bir neşter kullanın ve pigmentli parçaları keskin forsepslerle alın ve ardından her birine bir ila iki pigmentli parça aktarın.24. Plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte, hücreler yapışana kadar üç ila beş gün boyunca inkübe edin. Ardından medyayı haftada üç kez değiştirmeye başlayın.

Farklılaşma ortamında hücreleri üç ila dört hafta boyunca genişletin. Hücreleri geçmek için haftada üç kez beslemeye devam edin. RPE, hücreleri ayırmak için 37 santigrat derecede 200 mikrolitre ön ısıtma tripsin olmayan hücre ayrışma çözeltisi ekler.

Beş ila sekiz dakika sonra, reaksiyonu taze farklılaşma ortamı ile durdurun ve ardından kültürleri 200 mikrolitrelik bir pipetle tek hücreli süspansiyonlara yeniden süspanse edin ve kolonileri birkaç hücre ile bir araya getirin. Daha sonra, ayrışmış kolonileri 15 mililitrelik tüplere aktarın ve hücreleri aşağı doğru döndürün. Peletleri üç mililitre farklılaşma Ortamında askıya alan Resus, her biri kolonileri, kuyu başına üç ek mililitre farklılaşma ortamı içeren matris kodlu altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna aktarır.

Daha sonra, hücreler yaklaşık% 90 birleşene kadar hücreleri bir ila iki hafta boyunca genişletin ve hücreleri, az önce gösterildiği gibi bir mililitre ayrışma çözeltisi içinde tekrar ayırın. Bu sefer. Hücreleri yeniden süspanse etmek için 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, tek hücreli çözeltiyi 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Ve sonra hücreleri tekrar döndürdükten sonra, peleti askıya alın. 18 mililitre farklılaşmada, ortam nihayet minimum geçiş sayısında istenen maksimum hücre sayısını elde etmek için hücreleri matris kodlu bir kültür kabında yeniden doldurur daha fazla aşağı akış analizi için, pigmentli koloniler beş ila yedi haftalık indüklenebilir pluripotent kök hücre hattı kültüründen sonra ortaya çıkmaya başlar. Kültürler korundukça bu koloniler haftalarca büyümeye devam edebilir.

Yeterli bir boyuta ulaştıklarında manuel olarak eksize edilebilirler. RPE olmayan hücrelerle kontaminasyonu önlemek için dikkatli eksizyon, yeterince saf RPE kültürlerinin oluşturulmasını büyük ölçüde kolaylaştırır. Bir kez ustalaştıktan sonra, teknik uygun şekilde uygulanırsa sekiz ila 12 hafta içinde çok sayıda RPE hücresi türetilebilir.

Bu işlemi denerken, besiyeri yaparken ve hücreleri beslerken kültürleri kontamine etmemeye dikkat etmeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, birçoğunuzun IPS'den çok sayıda yüksek kaliteli RPE hücresi üretebileceğini umuyoruz. Umarım bu, tezgahtan yatak başına daha hızlı geçişi kolaylaştıracak ve şu anda tedavi edilemeyen retinal dejeneratif neovasküler hastalıklardan muzdarip hastalara hücre bazlı tedaviler sunacaktır.