Fare Sırt Sütun Crush Yaralanmalarında mikroglia ve Makrofagların ile aksonal İlişkilerin Intravital Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, yaralı omurilikteki mikroglia, monositler ve diğer hücre tipleri arasındaki hareketi ve etkileşimi gözlemlemektir. Bu, ilk olarak, bir floresan işaretleyici ile etiketlenmiş yerleşik mikroglia veya kemik iliği türevi makrofajlara sahip olacak kemik iliği kimerik fareleri oluşturarak gerçekleştirilir. İkinci adım, omurilikte bir dorsal kolon ezilme yaralanması oluşturmaktır.

Daha sonra hayvanlar yeniden açılır ve omurilik stabilize edilir Çoklu foton görüntüleme için son adım, lezyon içinde tek görüntüler veya hızlandırılmış filmler çekmektir. Sonuç olarak, görüntü analizi, hücresel hareketi ve çevredeki substratlarla hücresel etkileşimi gösterir. Bu tekniğin hücre kültürü ve sabit doku gibi geleneksel tekniğe göre temel avantajları, hücrelerin canlı hayvandaki doğal karmaşık ortamlarında görüntülenebilmesidir.

Bu ameliyat için kimerik veya çift transgenik hayvanlar kullanın. Anesteziyi indükledikten sonra yerleşik veya kemik iliği türevli hücrelerin nasıl etiketleneceğine ilişkin metin protokolüne bakın, dakikada yaklaşık 60 ila 100 nefes alma hızı için %2 ila %2 ISO flor ile koruyun. Şimdi, göz merhemlerini uygulayın ve bir ayak parmağı tutamıyla cerrahi bir anestezi düzlemini onaylayın.

Önce hedeflenen omurilik bölgesini tıraş ederek ve ardından cildi povidon iyot ve% 70 alkol fırçalarıyla silerek ameliyata hazırlanın, hayvanı örtün ve ameliyat bölgesine erişmek için bir delik açın. Ardından otoklav aletlerini steril bir örtü üzerine yerleştirin. Bu, dişler arasında bir milimetre olacak şekilde sabitlenmiş ve uçlardan bir milimetre işaretleri olan dört numaralı bir forseps içerir.

Şimdi iris makası kullanarak orta hattaki cildi açabilir ve kas sistemini açığa çıkarabilir. Diseksiyon mikroskobu altında ameliyata devam edin. Orta hat boyunca, omurgayı açığa çıkarmak amacıyla dorsal omurga süreçlerine bağlandıkları sırt kaslarını kesin.

Bu, latisimus dorsi'nin trapez ve bağlarının kesilmesini içerir. Daha sonra, çıkarılması hedeflenen spesifik omurun laminasını ortaya çıkarmak için enine süreçler ve dorsal süreç arasındaki rotator kasları çıkarın. Burada T 10 açığa çıkar.

RO jüri üyesi ipuçlarını işlemin üstündeki ve altındaki boşluğa sokarak devam edin. Ardından, uçların güvenli bir şekilde yerinde olduğundan ve çok derin olmadığından emin olmak için hafifçe kaldırın. Ardından laminayı çıkarmak için RO jüri üyelerini kapatın.

Şimdi, kalan omurun tüm küçük kısımlarını çıkarın, böylece açıklığı genişletin. 30 gauge bir iğne kullanarak, sabit forsepsler için bir erişim noktası oluşturmak için durada bir milimetre aralıklı iki delik açın. Daha sonra sabit forsepsleri dura boyunca 90 derecelik bir açıyla yerleştirin ve dişler üzerindeki işaretleri dura'nın üzerinde tutun.

Şimdi, forsepsleri 10 saniye boyunca sıkıştırın. On saniye sıkmayı iki kez daha yapın ve forsepsleri çıkarın. Daha sonra, bir parça emilebilir jelatin, sıkıştırılmış süngeri tuzlu suya batırın ve yaralanma bölgesini bununla örtün.

Dört numaralı, sentetik, naylon olmayan koşu dikişleri kullanarak jelatin sünger üzerindeki kası kapatın. Ardından cildi sabitlemek için beş milimetre yara klipsi kullanın. Prosedürü, kilogram başına bir miligram için 490 mikrolitre salin içinde 10 mikrolitre bupivakain deri altı enjeksiyonu ile tamamlayın.

Daha sonra kilogram başına 100 mikrogram için gluteus kasına beş mikrolitre buprenorfin enjekte edin. Ameliyat sonrası. Hayvanı ısıtın ve bilincini geri kazanana kadar izleyin. Hayvanı görüntüleme için yeniden açmak için, daha önce olduğu gibi anestezi uygulayın ve ardından yara klipslerini üreticinin ve talimatlara göre çıkarın.

Gerekirse, kesi etrafındaki alana bir epilasyon ürünü uygulayın. Bu sefer povidon iyot ve %70 alkol ile ekstra kese uygulayın. Şimdi, önceki kesi boyunca cildi yeniden açın.

Kalan dikişleri çıkarın ve gerektiğinde makas kullanarak kasları forseps ile açın. Diseksiyon mikroskobu altında, omur üzerindeki enine süreçler boyunca, laminektominin bir seviye üstünde ve laminektominin bir seviye altında omurilik klempleri için cepler yapmak için makası kullanın. Omurilik stabilizatörünün kelepçelerini her bir omurun etrafına yerleştirin ve kelepçeleri sıkın.

Kelepçeleri, omurilik görüntüleme platformuna paralel olacak ve doku stabil olacak şekilde ayarlayın. Solunum artefaktı görülürse, hareketi en aza indirmek için kelepçeleri ayarlayın. Ardından kelepçeleri kapatın ve paraform yapın.

Daha sonra, jel köpüğü forseps kullanarak nazikçe çıkarın. Mümkün olduğunca çıkarın. Ayrıca, mevcut olabilecek meninksler üzerindeki kalın yara dokusunu çıkarın.

Tüm jel köpük çıkarıldıktan sonra, omuriliği tuzlu su ile örtün. Kanama fark edilirse, kanamayı durdurmak için jelatin sünger kullanın. Gerekirse koter sırasında koter kullanın.

Omuriliğe dokunmamaya ve tuzlu su ve jel köpük ile kaplı tutmaya dikkat edin. Şimdi daldırma sıvısını tutmak için bir kuyu oluşturun, cildi ve dokuları siyanoakrilat yapıştırıcı ile kapatın. Daha sonra iki kelepçe arasında bir diş akrilik kuyusu oluşturun.

İyileşmek için zaman tanıyın. Sertleştikten sonra, kuyuyu yapay BOS ile doldurun. Bu adımlar sırasında kanamayı izlemeye devam edin.

Bu noktada isteğe bağlı olarak floresan damar kalıpları kuyruk damarına enjekte edilir. Görüntüleme sırasında kan damarlarını vurgulamak için, 70 kilodalton kuantum noktasının üzerinde bir floresan DExT ipliği veya floresan etiketli lektinler kullanın. Görüntüleme sırasında, fareyi kontrollü bir ortamda 37 santigrat derecede tutun Mikroskop aşamasında, Başarılı bir hazırlığın en kritik adımları, omuriliğin temiz olduğundan, kanama olmadığından ve görünür bir solunum artefaktı olmadığından emin olmaktır.

Görüntüleme sırasında periyodik olarak, dakikada 60 ila 100 nefes arasında olması gereken hayvanın solunumunu izleyerek anestezi seviyesini kontrol edin. ISO flor seviyelerini ayarlayarak anesteziyi düzeltin. Görüntülemeden sonra, hayvanı oradaki cerrahi bölgeye geri koyun, omurga kelepçelerini çıkarın ve akriliği deriden çekin.

Fare daha sonra ilk ameliyatın sonunda olduğu gibi daha sonraki görüntüleme için kapatılabilir veya yaralanmadan beş gün sonra ötenazi yapılabilir. Forsep yerleştirme bölgeleri hala görülebilir, ancak inflamasyonun neden olduğu ikincil yaralanma nedeniyle lezyonun boyutu artmaya başlamıştır. Lezyonun ko-ucundaki aksonlar, yaralanmanın ilk bölgesinden geri çekilmiştir.

Aynı zamanda, mikroglia veya makrofajlar olmak üzere büyük bir CX üç C bir pozitif hücre akışı, bu hücrelerin lezyon mikroçevresi içindeki davranışını ayırt etmek için ezilme lezyonunun içine ve çevresine sızdığı görülebilir, önce bir radyasyon kimera modeli kullanıldı. Bir CX üç CR bir pozitif GFP faresinin kemik iliği progenitör hücreleri, floresan olmayan donör hücrelerle değiştirildi, bu nedenle sadece GFP pozitif CNS'de yerleşik mikroglia görünür olacaktır. İkinci olarak, floresan olmayan bir faredeki kemik iliği progenitör hücreleri, kemik iliğinden türetilmiş hücreleri görüntülemek için bir CX üç CR bir pozitif GFP faresinden alınan kemik iliği hücreleri ile değiştirildi.

Yaralanmadan önce, tespit edilen tek kemik iliği kaynaklı GFP pozitif hücreler büyük ölçüde paravaskülerdi ve ezilme yaralanmasından sonra kemik iliğinden sürekli olarak değiştirildiği bildirilmiştir. CX üç C bir pozitif GFP hücresi, lezyonu çevreleyen kan damarlarının içi boyunca artar. Ek olarak, lezyon merkezi infiltre CX üç CR bir pozitif GFP makrofajı ile doluydu.

Bu tekniği kullanarak, hem omurilik içindeki hem de diğer hastalık modellerindeki etkileşimlerini tanımlamak için diğer floresan hücre popülasyonlarını etiketlemek için farklı transgenik hayvanlar kullanılabilir.