Biyoparlaklık Görüntüleme Ardından Fare Subkutan Modeli Tıbben-ilgili yabancı Organları Candida albicans Biyofilm Geliştirme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, candida albican hücreleri tarafından in vivo biyofilm oluşumunun noninvaziv izlenmesi için lusiferaz eksprese eden bir suşun kullanımını doğrulamaktır. Bu, candida albicans suşunu ifade eden bir lusiferaz ile kolonize edilmiş kateter parçalarının bir farenin arkasına implante edilmesiyle elde edilir. İkinci aşamada, mayanın hücre dışı bir matris içine gömülü kalın bir hücre tabakasına büyümesine izin verilir ve kateterlerin içinde olgun bir biyofilm oluşturur.

Daha sonra, lusiferaz enzimi tarafından dönüştürülecek bir substrat eklenir. Bu reaksiyon ölçülebilir ışık üretir: Biyolüminesan görüntüleme veya BLI daha sonra canlı konakçı içindeki biyofilm oluşumunu kaydetmek ve ölçmek için kullanılır. Bu tekniğin, merkezi Venmo sistemi gibi diğer mevcut tekniklere göre en büyük avantajı, bir hayvanın içinde altı adede kadar biyofilmi test edebilmemiz ve böylece istatistiksel analiz için ihtiyaç duyduğumuz hayvan sayısını büyük ölçüde azaltabilmemizdir.

Bu tekniğin etkileri, kandida albicans biyofilm oluşumunun tedavisine kadar uzanır, çünkü yöntemimiz mevcut ve yeni antifungal bileşenlerin kolayca test edilmesine izin verir. Ayrıca, bu yöntem candida albicans, mantar biyofilmleri hakkında bilgi sağlayabilir. Bakteriler veya diğer eğlenceli türler gibi diğer mikroplara da uygulanabilir.

Önerilen prosedürlerin, cerrahi prosedür açılmadan 24 saat önce bir biyolojik güvenlik kabini içinde üç lümenli kateterleri içeren paketin bir hayvan tesisine erişimi olan herhangi bir laboratuvarda uygulanması kolaydır. Gereksiz tüm parçaları çıkarmak için steril cımbız ve katetere bağlı kısmı kesmek için steril bir neşter kullanın. Daha sonra plastik ambalajın altına bir cetvel yerleştirin ve poliüretan kateteri bir santimetre uzunluğunda parçalar halinde kesin.

Daha sonra, her bir kateteri yaklaşık 1.8 mililitre% 100 fetal sığır serumu ile doldurun ve parçaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, her bir serum kaplı kateter parçasını ayrı ayrı 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın ve C albicans'ı A YPD plakasından ayrı bir mikro santrifüj tüpünde bir ila 100 seyreltmede bir mililitre PBS'ye kazıyın. Saydıktan sonra, hücre süspansiyonunu mililitre başına beş kez 10 ila dördüncü hücreye kadar seyreltin.

Ve serum kaplı kateter parçalarının her birine bir mililitre hücre ekleyin. Hücrelerin 37 santigrat derecede 90 dakika boyunca kateterlere yapışmasına izin verin. Daha sonra tüpleri steril cımbızla dikey pozisyonda tutun.

Kateterleri yerleştirmek için her parçayı bir mililitre PBS ile lümenden iki kez nazikçe yıkayın. Bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirilmiş sekiz haftalık anestezi uygulanmış bir farenin alt sırtını tıraş ederek başlayın. Daha sonra cildi dezenfekte edin ve hayvanın her iki tarafında 0,5 ila bir santimetrelik küçük bir kesi yapın.

Daha sonra, yaklaşık 1,5 santimetre uzunluğunda ve bir santimetre genişliğinde iki deri altı tüneli oluşturmak için alt kısmı makasla inceleyin. Her tünele üç kateter parçası yerleştirin ve parçaların üst üste binmeden yatay bir düzende yan yana durmasını sağlayın. Kesileri dikişlerle kapatın ve ardından yaraları bir dezenfektan ile çok nazikçe temizleyin.

Daha sonra doğrudan insizyonlara lokal anestezik uygulayın ve hayvanları tamamen iyileşene kadar izleyen bir anestezi tersine çevirici ajan uygulayın. Biyofilm oluşumunu uygun deneysel zaman noktasında görüntülemek için, anestezi uygulanmış bir hayvanda kateterleri içeren her alana 100 mikrolitre taze hazırlanmış bobin ve terezini deri altına enjekte edin. Ardından, maksimum sinyal yoğunluğuna ulaşılana kadar 20 ila 60 saniye arasında değişen çekim sürelerine sahip ardışık taramalar elde edin.

Bir sonraki çerçevenin alınması sırasında, daha önce elde edilen çerçevelerin biyolüminesan görüntülemesini veya BLI sinyal yoğunluğunu ölçmek için her bir kateter üçlüsünün üzerine bir ilgi bölgesi yerleştirin. Canlı görüntü yazılımında arka plan sinyalini ölçmek için bir kontrol bölgesine sabit boyutta dikdörtgen bir ilgi alanı da yerleştirin. Her bir kateter üçlüsü için ve arka plan için ilgilenilen bölgelerden geçen foton akışını ölçün.

Biyofilm oluşum raporu sırasında bu ölçümleri her hayvan için ve farklı zaman noktalarında tekrarladıktan sonra, her bir kateter üçlüsünün BLI sinyal yoğunluğu saniyede foton akısı olarak değişir. Veriler doğrudan bir elektronik tablo programına kopyalanabilir ve yapıştırılabilir. Boyuna deneyin sonunda, deri altı dokusundan kesilen her bir hayvanı kurban edin ve kateter parçalarını tek tek çıkarmak için steril cımbız kullanın.

Kateterleri, az önce gösterildiği gibi bir mililitre PBS'de iki kez yıkayın. Daha sonra parçaları bir su banyosunda 40.000 hertz'de bir mililitre taze PBS'de yeni bir mikro santrifüj tüpünde sonikleştirin. 10 dakika sonra sonikate, kateterleri içeren tüpleri buz üzerine yerleştirin ve orijinal örneklerin 100 mikrolitresini YPD agar plakaları üzerinde bir ila 10 ve bir ila 100 seyreltme ile plakalayın.

İki kopya halinde. Son olarak, koloni oluşturan birimlerin ortalama ve standart sapmasını çizin. Ve logaritmik ölçekte her hayvan için BLI sinyali.

Bu görüntüde, biyofilm gelişiminden altı gün sonra belirtilen ilgi alanlarıyla birlikte biyolüminesans sinyalini gösteren temsili bir hayvan gösterilmektedir. Kontrol arka plan alanında, biyofilmin kandida kaplı kateterlerin hemen yanındaki alanlarla sınırlı olduğunu doğrulayan sinyalizasyon eksikliğine dikkat edin. Bu temsili deneyde, biyofilmleri eksprese eden lusiferaz tarafından üretilen net bir BLI sinyali gözlemlenebilirken, vahşi tip suş tarafından yalnızca arka plan sinyali üretiliyor gibi görünmektedir.

Sinyaldeki bu artış, biyofilm başına koloni oluşturan birimlerdeki artış ve birlikte alınan her bir hayvan grubu için foton akısı ölçümleri ile aynı eğilimi takip eder. Bu veriler, BLI'nın deri altı fare modelinde in vivo olgun C albicans biyofilm oluşumunu izlemek ve ölçmek için güçlü bir teknik olduğunu göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra kandida hücreleri ile cihazların enfeksiyonu iki saat sürebilirken, kateter implantı fare başına 10 dakika içinde yapılabilir.

BLI görüntüleme, fare başına beş dakika içinde gerçekleştirilebilir. BLI kullanmanın en büyük avantajı, aynı hayvanda biyokütle ve biyofilm gelişimini tekrar tekrar izleyebilmenizdir. Zamanla Bu prosedürü takiben, MRI veya CT gibi diğer yöntemler tam katedral pozisyonu hakkında bilgi sağlayabilir.

Bu bilgi daha sonra derin damar Katedrali modeli gibi daha karmaşık modellerde niceleme için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, farelerde in vivo, deri altı biyofilm, ss'nin nasıl gerçekleştirileceği konusunda çok iyi bir anlayışa sahip olmalısınız ve bu, konakçı patojen etkileşimlerinin daha derinlemesine analizi için temel oluşturabilir.