Name: Biyoparlaklık Görüntüleme Ardından Fare Subkutan Modeli Tıbben-ilgili yabancı Organları Candida albicans Biyofilm Geliştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Keşfedin biyoparlaklık görüntüleme yöntemiyle fare subkutan modelinde Candida albicans biyofilm gelişiminin canlı izlenmesi. Bu teknik antifungal tedavi testleri için güvenilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, KU Leuven PF 'IMIR', bakteri ve mantar biyofilmlerinin biyolojisi ve ekolojisi üzerine FWO Araştırma topluluğu (FWO: WO.026.11N) ve FWO projesi G.0804.11 tarafından desteklenmiştir. SK, PDMK 11/089 bursu için KU Leuven'e ve doktora sonrası burs için FWO'ya minnetle teşekkür eder. Figürlerin hazırlanmasındaki yardımları için Nico Vangoethem'e minnettarız. İn vivo deneysel prosedürler sırasında teknik yardım için Celia Lobo Romero'ya teşekkür ederiz.

NOT: Tüm hayvan deneyleri KU Leuven (proje numarası 090/2013) etik komitesi tarafından onaylanmıştır. KÜ Leuven hayvan bakım talimatlarına uygun olarak hayvanları koruyun. 1. C. albicans Büyüme <ol><li> Yirmi dört saat hayvan deneyinde başlatılmasından önce, maya özü, Taneli 10 g, bakteriyolojik pepton 20 g ve granüle agar 15 g ekleyerek YPD plakaları hazırlamak. Milli-Q su ve otoklav ile 900 ml sesini olun. </li><li> Steril% 40 glikoz, 50 ml ilave edilir. İyice karıştırın ve Petri kutularına dökün. Soğumaya ve katılaşmaya agar bırakın. NOT: Bu çalışmada, iki suşları, yani vahşi tip C kullanın albicans SC5314 - glukozit negatif (WT olarak anılacaktır) soyu ve C. Bir vahşi tip C olan albicans SKCA23 suşu SKCA23- bir adında suşu (.in Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmid 22 ile transforme albicans SC5314CTgLuc) glukozit (bu promotör mantar büyümesinin yanısıra hipal aşaması, maya aktif) ACT1 (aktin) promoterinin kontrolü altında endojen PGA59 geni ile kaynaştırılır. Bu suş Prof. Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, Belçika laboratuvar talep edilebilir. Plazmid Clp10 :: Act1p-gLUC59 plazmid 22 nazik Prof. C. d&#39;Enfert, Pasteur Enstitüsü&#39;nde, Paris, Fransa tarafından bağışlanmıştır. </li><li> -80 ° C&#39;de gliserol stoku ve deposunda hem suşları koruyun. </li><li> Bir YPD plaka üzerine herhangi bir deney çizgi suşları önce. Gece boyunca 37 ° C&#39;de plaka inkübe edin. </li></ol> 2. Kateter adet Hazırlık <ol><li> Deneyden önce, gerekli olan kaç kateterler belirler. Bu fare başına 6 adet kateter (solda 3 kateterler ve hayvan (Şekil 2A&#39;da sağ tarafında 3 kateter) kadar implant mümkündür. </li><li> Yirmi dört saat hayvan cerrahisi öncesinde, paketi açmakbiyolojik güvenlik kabini altında üçlü lümen kateter içeren yaşı. Steril bir bisturi ile kateter bağlı kısmını steril bir cımbız ile tüm gereksiz parçalar çıkarın ve kesti. Plastik paketi altında cetvel yerleştirin ve cetvel üzerinde ölçek (Şekil 1) &#39;e göre tam 1 ​​cm poliüretan kateter parçaları kesti. NOT: Bu kateter parçasının bu tip fosforlu ve BL 18,19 nedenle uygun olmadığını belirtmek önemlidir. </li><li> 2 ml mikrosantrifüj tüpler içine 15 kesilmiş kateter parçaları (adım. 2.2) maksimum yerleştirin. Daima yapışma süre sonra cihaz üzerinde takılı Candida hücrelerinin miktarını numaralandırmak için kullanılan ekstra 3 adet, hazırlamak. </li><li> Yaklaşık 1.8 ml% 100 fetal sığır serumu (FBS) eklenmiştir ile kateterler Ek. </li><li> Şiddetle vorteks ve% 100 FBS ek 100-200 ul ekleyin. Tamamen serum Tüm kateter parçaları kapsamaktadır. </li><li> Gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li&gt; </ol> 3. Hayvanlar ve Bağışıklık Sistemi Bastırma <ol><li> Standart gıda ve su ad libitum ücretsiz erişim ile bireysel havalandırılan filtre üst kafeslerde dişi BALB / c fareleri (yaş yaklaşık 8 hafta) tutun. </li><li> Hayvanların içme suyuna deksametazon (0.4 mg / L) ilave edilerek, hayvan cerrahi öncesi bağışıklık sistemi 24 saat bastırılmasını başlatın. Ev sahibi herhangi bir bakteri kirlenmesini önlemek amacıyla, bir antibiyotik ile içme suyu ilave, örneğin, ampisilin, sodyum tozu (0.5 gr / L). </li><li> (6 güne kadar) tüm deney sırasında hayvanların bağışıklık tutun. </li></ol> 4. ex vivo C. albicans Yapışma FBS kaplı Poliüretan Yüzeyler <ol><li> Taze 1,5 ml mikrosantrifüj tüp içine her serum kaplı kateter parçası aktarın. </li><li> Bazı C. kazıyarak albicans hücreleri YPD kapları (Aşama 1) üzerinde büyütüldü ve PBS, 1 ml askıya. </li><li> Seyreltik CanAyrı bir mikrosantrifüj tüpü içinde: ggmmok hücreleri (100 1). Seyreltilmiş örnek 10 ul alın ve bir hücre sayımı odasının üzerine uygulayın. En az 16 küçük kareler sayın. </li><li> 5 x 10 4 hücre / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona RPMI 1640 ortamı Candida hücreleri (her biri ayrı ayrı suş) hazırlayın. </li><li> Her serum kaplı kateter birim hücre süspansiyonu 1 ml ilave edilir. </li><li> Şiddetle girdap ve kateterler, ortam içine ve üstünde yüzen değildir emin olun. </li><li> 90 dakika için 37 ° C (yapışma süresi) en kateterler inkübe edin. </li><li> Steril cımbız ile kateterler çıkarın ve PBS 1 ml ile iki kez yıkayın. Bu adım sırasında yıkama sıvısı çok nazikçe kateter yıkama sırasında dikey konumda kateter tutarak lümen yoluyla gider emin olun. Önemli bir şekilde, birleşmiş hücrelerin çıkarılması yol açabilir güçlü bir akış kullanmayın. </li><li> Tu başına temiz bir mikrosantrfuj tübü (tek parça her yıkandı, kateter aktarma) olmak. </li><li> Buz üzerinde yerleştirin ve ameliyat kadar orada tutun. </li></ol> 5. Anestezi <ol><li> Medetomidin, 100 ul (1 mg / ml) ve steril tuzlu su içinde 825 ul ketamin 75 ul (100 mg / ml) ile karıştırmak suretiyle anestezi hazırlayın. 45-60 mg / kg ketamin ve 0.6-0.8 mg / kg medetomidin dozunda elde edilen 10 g vücut ağırlığı başına anestetik kokteyli intraperitonal (ip), 60-80 ul uygulayın. </li><li> Anestezi ters için, 0.5 mg / kg&#39;lık bir dozda elde edilen, panzehir olarak IP uygulanması, 4.95 mi tuzlu su içinde 10 g vücut ağırlığı başına 100 ul 50 ul atipamezol (5 mg / ml) seyreltin. </li><li> Anestezi enjeksiyonundan sonra, ayrı bir kafes içine hayvan koyun ve tamamen uykuda kadar bekleyin. </li><li> Açık ten tutam ve cilde herhangi bir zarar vermez ayak tutam, hayvansal uygun anesthetization onaylayın. Gözlemlenen hareket hayvan yeterli ameliyat için anestezi olduğunu gösterir. Bu durumda, bir cou bekleyinuzun hayvanın kadar dakika ple deri veya ayak tutam üzerine hareket herhangi bir belirti göstermez. </li></ol> 6. Hayvan Cerrahisi <ol><li> Aktarım ısıtma pedi üzerine yerleştirilmiş temiz bir doku üzerine kafes hayvan anestetize, 37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış (Şekil 2A, (1)). NOT: Daha ucuz bir alternatif elektrikle ısıtılan battaniye kullanmaktır. Hayvan ameliyat öncesinde mikrodalga fırında ısıtılan gereken izotermik yastıkları, kullanmak da mümkündür. </li><li> Gözleri oftalmik merhem sürün. </li><li> Elektrikli ustura ile hayvanın alt arka Tıraş. Tüm hayvan tüyleri ve temiz bir dokusu üzerinde hayvan aktarın. (% 1 iyot izopropanol ya da% 70 alkol içinde% 0.5 klorheksidin ile, örneğin), cilt dezenfekte ve yaklaşık olarak 1 dakika boyunca kurumaya dezenfekte bölgeyi terk (Şekil 2A (2)). </li><li> (Deride yaklaşık 0.5 (hayvanın sağ tarafında solda) diğeri küçük bir kesi yapmak ve# 8211; 1 cm) (Şekil 2A, (3)). </li><li> İki deri altı tünelleri oluşturmak için bir makas ile subcutis ayır. Her bir tünel yaklaşık 1.5 cm uzunluğunda ve 1 cm genişliğinde olacaktır. </li><li> Her tünelde, daha önce Candida ile enfekte üç kateter parçaları, yerleştirin. Kateterler yatay düzende birbirine yalan emin olun ve toplam altı kateter parçalarının implantasyonu sağlamak için birbirlerine kapatmayın ki (Şekil 2A (4)). </li><li> Sütür ile kesiler kapatın. Alternatif olarak, yarayı kapatmak için Dermabond kullanın. </li><li> % 70 alkol veya iyot izopropanol (% 1) ile çok yavaşça% 0.5 klorheksidin ile yarayı dezenfekte edin. </li><li> Doğrudan yaranın üzerine lokal anestezi (xylocaine jel,% 2) uygulayın. </li><li> Anestezi tersine (protokolünü 5, adım 2) yönetme: intraperitoneal 100 ul 10 başına g vücut ağırlığı. </li><li> Temiz bir kafes transfer hayvan, daha önce bir ısıtıcı plaka üzerine yerleştirilmiştir. Hayvan tutunAyrı ve sıcak hayvan tamamen uyanık kadar. Bu arada, bir sonraki hayvanın operasyon ve implant ile devam ediyor. Bir kez tüm çalışan hayvanlar tamamen uyanık. Bir kafese transfer. Düzenli hayvanları izleyin. </li></ol> 7. Biyoparlaklık Görüntüleme: coelenterazine (CTZ) hazırlanması G. için, Yüzey princeps lusiferaz <ol><li> Asidifiye etanol içinde 5 mg / ml CTZ çözülmesi ya da imalatçının talimatlarına göre taze coelenterazine (CTZ) stok çözelti hazırlayın. </li><li> Steril PBS içinde stok çözelti 1:10 seyreltilmesiyle 1.2 mM&#39;lik çalışma çözeltisi hazırlayın. NOT: kateterleri çevredeki 100 ul CTZ çalışma çözümleri deri altına enjekte edilir. CTZ ve deri altına enjeksiyon için, insülin şırınga kullanın. </li><li> Her zaman karanlıkta CTZ tutmak (örneğin, alüminyum folyo ile CTZ içeren mikrosantrifüj tüpler kapak). Deneyler süresince -80 ° C&#39;de stok solüsyonu saklayın. </li></ol&gt; 8. Biyoparlaklık Görüntüleme <ol><li> BLI Fotoğraf makinesini sıfırlayın. </li><li> Bir indüksiyon kutusunu kullanarak hayvanları uyutmak. % 2-3, oksijen N2 O / O 2, veya hava izofluran bir gaz karışımı kullanın. </li><li> Indüksiyon sonrası, indüksiyon kutusunda ve% 1.5-2 olarak görüntüleme odasında anestezi korumak. </li><li> Görüntüleme oturumu başlamadan önce, 10 cm FOV karşılık A konumunda görüntüleme plaka, yerleştirin. Emin olun kutusuna bir uyku hayvan koyarak anestezi çıkışları ve hayvanın doğru pozisyonda olduğunu. </li><li> Hayvan hakkı kamera altında FOV içinde, istenen görüntüleme konuma gelene kadar birkaç fotoğraf çekin. </li><li> İnsülin şırınga CTZ hazır çözelti, her biri 100 ul hazırlayın. </li><li> Bankta bir hayvan koyun ve gaz anestezi sağlayan bir burun konisi vasıtasıyla uykuda tutmak. </li><li> Kateterler deri çevreleyen bir yerde şırınga iğneleri getirin ve enjekteCTZ aynı anda kateter üstüne. </li><li> Enjeksiyondan hemen sonra, kamera kutusu sıcak plaka üzerinde hayvan koyun ve biyoışıldama görüntü alımı başlatabilirsiniz. </li><li> 20 maksimum sinyal yoğunluğu ulaşana kadar 60 saniye (sinyal yoğunluğuna bağlı olarak) arasında değişen satın alma süreleri ile ardışık taramaları Edinme. Bir sonraki karenin alımı sırasında, bu ROI ile foton akı her kateterler üçlü üzerinde bir yatırım getirisi yerleştirerek ve ölçerek, daha önce edinilmiş kare BLI sinyal yoğunluğunu ölçmek. </li><li> Bir sonraki hayvanın (ler) için 7. adımdan tekrarlayın. </li><li> Görüntüleme sonra, kendi kafesine hayvanları dönün. Biyofilm oluşumu uzunlamasına, non-invaziv takip için bir deney sırasında BLI tekrarlayın. </li><li> Yaşam Görüntü yazılımı kullanılarak BLI verileri analiz. Her kateter üçlüsü üzerinde sabit boyutta bir dikdörtgen ROI ve her ROI ile foton akı (parlaklık) ölçün. Her hayvan için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> RaporSaniyede foton akı olarak her kateter üçlüsü BLI sinyal yoğunluğu. Ortalama ve her grup için saniyede foton akı SD çizerek logaritmik ölçekte BLI verileri temsil. Günlük 10 dönüştürülmüş veriler üzerinde istatistiksel analiz. </li></ol> 9. Kateter Eksplantasyon <ol><li> Her kateter cihaz için PBS, biri 1 ml içeren mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın ve buz üzerinde saklayın. </li><li> Servikal dislokasyon ile hayvanlar öldürülür (Şekil 2B, (1)). </li><li> % 70 alkol içinde ya da iyot izopropanol (% 1) ile% 0.5 klorheksidin ile sırtın deri dezenfekte. </li><li> Kateter üzerinde bir kesi (yaklaşık 3 cm) yapın. </li><li> Deri altı doku kesin ve steril cımbız kullanarak deri altı doku altına birer kateter fragmanlarını birini kaldırmak (Şekil 2B, (2)). </li><li> Dikey konumda yavaşça kateter işlemek ve steril 1 ml PBS ile iki kez yıkanır. Her kateter yerleştirinAyrı bir mikrosantrifüj tüpü içine bir parça (Kademe 1 de elde edilmiş). </li></ol> Koloni Oluşturma Birimleri Kont (CFU) ve Sonuçlar İstatistiksel Analizler tarafından 10. Niceliklendirilmesi Biyofilm ilişkili Hücreler <ol><li> Sonikasyon kateterler, daha önce bir su banyo sonikatörü içinde 40,000 Hz 10 dakika için 1 ml PBS içine yerleştirilir ve buz üzerine yerleştirin. </li><li> Sonikasyonun sonra, şiddetle buz üzerinde tekrar 30 sn ve yer girdap. </li><li> PBS 900 ul ihtiva eden iki ek mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. </li><li> Orijinal numunenin (kateter içeren bir) 100 dilüsyonları ve buz üzerinde tüm mikrosantrifüj tüpleri tutmak: 01:10 ve 1 yapın. </li><li> Plaka, orijinal numune, 100 ul, 1:10 ve 1: iki kez YPD agar plakaları üzerinde 100 seyreltme. </li><li> 37 ° C&#39;de 2 gün süreyle inkübe edin ve CFU sayısı. </li><li> YPD agar plakaları üzerinde büyüyen kolonilerin (kolonilerin sayılabilir miktarda, maksimum 300 koloni / plaka) Sayım ve uygun Dilu bunları çarpınyon faktörü (1x-orijinal, 10x veya 100x seyreltme). Ayrıca kateter içeren 1 ml tüp kolonilerin son miktarına tekabül 10x her kateter parça, çarpın. 10 hücre / standart sapma (SD) kateter parçası oturum kolonilerin son miktarda getirin. SD ± olarak veri Express. </li><li> Yukarıda belirtilen hesaplamalar ve istatistiksel analizler gerçekleştirmek için, bir elektronik tablo ve / veya istatistik programına her kateter ve belirli bir grup için tüm değerleri yerleştirin. Karşılaştırmak için özel gruplar belirtiniz, yani WT vs mutant ya da 2 gün vs. 6 gün biyofilm oluşumu ve log10-dönüştürülmüş veriler Tukey post-testi ile bağımsız gruplar t-testi ve ANOVA gerçekleştirin. <ol><li> Bir p değerine göre anlamlılık düzeyini ifade eder. Olarak temsil p değeri &lt;0.05, şu, bu çalışmada önemi gösterir: * p &lt;0.05, ** p &lt;0.005, *** p &lt;0.0005. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yapar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+risk+factors+for+invasive+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Clin+Risk+Manag%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis.</a> Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).</li>
<li>Tournu, H., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+biofims+and+the+host%3A+models+and+new+concepts+for+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication.</a> Int J Microbiol. 2012, 845352(2012).</li>
<li>Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Candida+biofilm+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Candida biofilm drug resistance.</a> Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).</li>
<li>Mathé, L., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+Candida+albicans+biofilm+resistance+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms.</a> Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).</li>
<li>Kucharíková, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activities+of+systematically+administered+echinocandins+against+in+vivo+mature+Candida+albicans.+biofilms+developed+in+a+rat+subcutaneous+model%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).</li>
<li>Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+susceptibility+of+Candida+biofilms%3A+Unique+efficacy+of+amphotericin+B+lipid+formulations+and+echinocandins%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).</li>
<li>Ramage, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+amphotericin+B+displays+rapid+dose-dependent+activity+against+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).</li>
<li>Andes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+in+vivo+central+venous+catheter+Candida+albicans+biofilm+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model.</a> Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).</li>
<li>Schinabeck, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+model+of+Candida+albicans+biofilm+infection%3A+liposomal+amphotericin+B+antifungal+lock+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).</li>
<li>Lazzell, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+prevention+of+Candida+albicans+biofilms+with+caspofungin+in+a+novel+central+venous+catheter+murine+model+of+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis.</a> J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).</li>
<li>Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+in+vivo+Candida+albicans+biofilm+denture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model.</a> Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).</li>
<li>Wang, X., Fries, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+for+catheter+associated+Candiduria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A murine model for catheter associated Candiduria.</a> J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).</li>
<li>Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+forms+biofilms+on+the+vaginal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa.</a> Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).</li>
<li>Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characerterization+of+mucosal+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms.</a> PloS One. 4, e7976(2009).</li>
<li>Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilm+formation+in+a+new+in+vivo+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model.</a> Microbiol. 156, 909-919 (2010).</li>
<li>Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+efficacy+of+anidulafungin+against+Candida+albicans+mature+biofilms+in+a+novel+rat+model+of+catheter-associated+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).</li>
<li>Bink, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonsteroidal+antiinflammatory+drug+diclofenac+potentiates+the+in+vivo+activity+of+caspofungin+against+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms.</a> J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).</li>
<li>Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+non-invasive+monitoring+of+pathogen-host+interactions+during+Candida+albicans+biofilm+formation+using+in+vivo+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence.</a> Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).</li>
<li>Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+fungal+biofilm+development+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals.</a> Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).</li>
<li>Gahan, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+lux+reporter+system%3A+applications+in+bacterial+localisation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies.</a> Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).</li>
<li>Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+fungal+infections+in+living+mice+using+bioluminescent+pathogenic+Candida+albicans+strains+transformed+with+the+firefly+luciferase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene.</a> Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).</li>
<li>Enjalbert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+synthetic+Gaussia+princeps+luciferase+reporter+for+live+imaging+of+Candida+albicans+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections.</a> Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).</li>
<li>Mosci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bioluminescence+mouse+model+for+monitoring+oropharyngeal+candidiasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice.</a> Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).</li>
<li>Van Wijngaerden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign+body+infection%3A+a+new+rat+model+for+prophylaxis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemoth%22%5BJournal%5D)">Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment.</a> J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).</li>
<li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

konak bağışıklık sistemi in vitro modeller için hesap edemez biyofilm oluşumunda önemli bir faktör olarak mikrobiyal biyofilm adanmış çalışmalar için hayvan modellerinde, özellikle kemirgen modellerin kullanılması çok önemlidir. Bu çalışmada, oldukça basit bir deri altı C tarif Kolayca bir araştırma laboratuvarında kabul edilebilir ve güçlü teknik beceri gerektirmez albicans biyofilm fare modeli. Bu model, ilk olarak bir sıçanın 24 epidermidis biyofilm oluşumunu çalışmak iç...

Candida albicans, deri üzerinde ya da gastrointestinal ve vajinal florasının bir parçası olarak, örneğin, sağlıklı bireylerin farklı yerlerde bulunan bir ortakçı bir organizmadır. Bununla birlikte, içinde yatan ve özellikle immünokompromize hastalar, bu enfeksiyonların 1 geniş bir neden olabilir. Bu tür kişilerde, bağışıklık sisteminin zayıflamasına Candida hücreleri kan dolaşımına yaymak ve yaşamı tehdit eden enfeksiyonlara neden olan derin dokuları istila sağlar. Buna ek olarak, örneğin merkezi venöz ve idrar sondaları gibi abiyotik alt-tabakaların mevcudiyeti, suni kalp kapakçıkları ve eklemler, Candida ek 2 için bir niş sağlayabilir. Bu tür substratlara yapışma esas polisakaritlerin 2 oluşan hücre dışı bir polimerik malzeme içinde gömülü maya ve hifal hücre katmanı temsil daha biyofilm gelişimi için bir ön koşuldur. C albicans kateter enzimi yüksek yoğunluklu lipoproteinlerde enfeksiyonlaryüksek mortalite ile ilişkilidir. Biyofilm genel karakteristiği gibi azollerin 3,4 olarak bilinen antifungal, onların azalmış duyarlılık olduğunu. Bu tür ekinokandinler ve amfoterisin B lipozom formülasyonu olarak antifungal ilaçların yalnızca yeni sınıflar, kateter ilişkili enfeksiyonların 5-7 karşı aktif olduğunu kanıtladı. Için anti-fungal maddeler ile biyofilm esneklik terapötik yaklaşımlar çok sık kateter çıkarılması ve tek çözüm olarak daha sonraki değiştirilmesine yol açacak şekilde sınırlıdır. C bizim mevcut anlayış çoğu albicans biyofilm geliştirme, yukarıda belirtilen aygıtlar, örneğin, silikon, poliüretan, 2 imalatında kullanılan abiyotik polistiren gibi substratları ya da plastik üzerinde in vitro çalışmalar kaynaklanır. Bu modeller oldukça gelişmiş ve mümkün olduğunca yakından in vivo durumu taklit deneyin. Bununla birlikte, bu sistemler, sürekli bir kan akışı ve t içermeyenO konağın bağışıklık sistemi. Bu tür santral venöz kateter (SVK) modeli 8-10, oral kandidiyazis 11 protez stomatit modeli ve kateter ilişkili kandidüri 12 için bir fare modelinde olarak in vivo model sistemlerinde, geliştirme sonuçlandı. Buna ek olarak, C albicans biyofilm gelişimi vajina 13 ve ağız 14 gibi mukozal yüzeyler üzerinde in vivo incelenmiştir. Laboratuvarımız deri altı C kurulması ile katkıda Sprague Dawley sıçanların 15 arkasındaki enfekte kateter adet implant dayanmaktadır albicans biyofilm modeli. Bu model başarılı diklofenak ve Kaspofungin 17 kombinasyon tedavisinin etkisini incelemek için, uyuşturucu 5,16 Flukonazole biyofilm duyarlılığı test etmek ve ekinokandin bizim laboratuvarda kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, BALB / c farelerinde 18,19 kullanmak için bu uyum sağlamıştır. Içindein vivo modellerde diğer ile karşılaştırılması, bu deri altı modelin ana avantajı implante kateter adet lümen içinde geliştirilen hayvan başına birden fazla biyofilm çalışma imkanı vardır. Deney hayvanlarının sayısını azaltmak için, biz C gelişimini incelemek için bu modeli adapte olması albicans biyoışıldama görüntüleme (BLI) 18,19 kullanılarak non-invaziv biyofilm. Bu yöntem, hayvan kurban kaçınarak, (bu durumda implant kateterlerin bölge) ilgi bölgesi spesifik BLI bir işaret ölçülerek biyofilm ölçmek için kullanılabilecek etkili bir teknik olduğunu kanıtladı. C de dahil olmak üzere bağlı bir özel lux operon&#39;u 20 giriş geni ve biyoışıldama reaksiyon için gerekli olan alt-tabakanın her iki ifade bakterilerin göre, içinde, en ökaryotik organizmalar, albicans, ile birlikte bir lusiferaz geninin heterolog ekspresyonu bağlıdırD-luciferase veya koelenterazin 21 gibi belirli bir substrat, dış yönetim. Muhtemelen, fungal hücre duvarı ve C varlığına albicans morfonogenezi, lusiferaz enzim için substrat hücre içi teslimat ana zorluk 21 oldu. Bu sorunu çözmek için, Enjalbert ve ark. 22, bir yük tasarlanmış burada sentetik C doğal salgılanan Gaussia princeps lusiferaz için bir gen (glukozit) albicans kodon-optimize edilmiş türden C ile kaynaştırılır albicans PGA59 geni, bir GPI- hücre duvarı protein demirli. Çünkü hücre duvarındaki lusiferaz varlığı, substrat hücre içi temin edilebilirliğine ilişkin sorunlar önlenebilir. Bu özel sistem C&#39;nin neden olduğu yüzeysel enfeksiyonları incelemek için kullanılan albicans 22. Çok yakın, BLI da orofaringeal kandidiyazis ve possibl ilerlemesini izlemek için kullanılmıştıre tedavisi 23. Bu bulgular serbest yaşayan hücreler aynı zamanda cihazın ilişkili enfeksiyonların yol açtığı enfeksiyonları incelemek için umut verici bir yöntem olarak BLI kullanımını desteklemektedir. Bu çalışmada, C tarif BL kullanılan poliüretan kateter, BALB / c farelerinde parçaları ve nicelenmesine albicans biyofilm gelişimi. Biz canlı hayvan farelerde implantasyon ve sonraki biyofilm gelişimi takip yapışma döneminde poliüretan kateter in vitro kolonizasyonu ayrıntılı bir protokol sağlar. Apart C. tarafından yayılan BLI sinyalini ölçerek gelen albicans hücreleri, biz de biyofilm mantar yük ölçümü için standart tekniği ile karşılaştırma için birimleri oluşturan koloni belirler.

<table><tbody><tr><td>Maya özü granül</td><td>Merck</td><td>MERC1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriyolojik pepton</td><td>Oksoit</td><td>LP037B</td><td></td></tr><tr><td>Agar granül</td><td>Difco</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glikoz</td><td>Fluka</td><td>49159-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin&nbsp;</td><td>Laboratuvarda</td><td></td><td>1L 10x PBS için hazırlanmış: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2P<O>sub4</td></tr><tr><td>RPMI1640 L-glutamin ve sodyum karbonat olmadan&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R6504-1L</td><td>Candida albicans ilaç duyarlılık testi protokolüne göre hazırlayın&nbsp;</td></tr><tr><td>3- (N-Morpholino) propansülfonik asit (MOPS)</td> <td>Sigma</td><td>M1254</td><td>MOPS, RPMI ortamının pH (pH 7.0) fetal</td></tr> <tr><td>sığır serumu (FBS)</td> pH değerini ayarlamak için kullanılır<td>. Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Poliüretan işkembe lümenli intravenöz kateter parçası (2.4 mm çap, Certofix Trio S730)&nbsp;</td><td>BBraun</td><td>CV-15703</td><td>Poliüretan parça 1 cm'lik parçalar halinde kesilmiş</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Fagron SAS, Fransa</td><td>611139</td><td>İmmünsüpresan (stok çözeltisi 10 mg / ml)</td></tr> <tr><td>Ampisilin ve nbsp;</td><td>Duchefa Biochemie, Hollanda</td><td>A0104</td><td>Antibakteriyel profilaksi</td></tr><tr><td>Ketamin 1000</td><td>Pfizer</td><td>804 119</td><td>Anestezik</td></tr><tr><td>Domitor</td><td>Pfizer</td><td>134737-1</td><td>Anestezik</td></tr><tr><td>Antisedan</td><td>Pfizer</td><td>134783-2</td><td>Anestezinin tersine çevrilmesi</td></tr><tr><td>Ksilokain jeli (% 2) - bu Linisol</td><td>AstraZeneca</td><td>352 1206</td><td>Cilt için lokal anestezik</td></tr><tr><td>Terramisin / polimiksin-b oftalmik merhem</td><td></td><td></td><td>Gözlerin kurumasını ve enfeksiyonunu önlemek için</td></tr><tr><td>Coelenterazine&nbsp;</td><td>Prolume (Nanolight)</td> <td>NF-CTZ-FB</td><td>Işığa duyarlı ajan (karanlıkta tutulmalıdır)</td></tr> <tr><td>İyot izopropanol (% 1)</td> <td>3M ve ticaret; DuraPrep ve ticaret; &nbsp;</td><td></td><td>Cilt için dezenfektan</td></tr><tr><td>%70 alkol içinde %0,5 klorheksidin. &nbsp;</td><td>Cedium</td><td></td><td>Cilt için dezenfektan</td></tr><tr><td>Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre sayma odası</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsülin şırıngaları (0.3 ml)</td><td>Terumo Myjector 29G</td><td>324826</td><td>Coelenterazine enjeksiyonu için</td></tr><tr><td>Elektrikli tıraş makinesi</td><td></td><td></td><td>Küçük hayvanlar için</td></tr><tr><td>Steril cerrahi aletler</td><td></td><td></td><td>Makas, 2 çift cımbız, neşter</td></tr><tr><td>Isıtma yastığı</td><td>Leica</td><td>14042321474</td><td></td></tr><tr><td>Cilt sütür</td><td>Johnson & Johnson</td><td>K890H</td><td>Cerrahi iplik, iğne</td></tr><tr><td>Su banyosu sonikatörü</td><td>Branson 2210</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BLI kamera (IVIS Spectrum)&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Alameda</td><td>IVISSPE</td><td></td></tr><tr><td>Living Image yazılımı&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Alameda</td><td></td><td>(sürüm 4.2)&nbsp;</td></tr></tbody></table>

biyoparlaklık görüntüleme ardından fare subkutan modeli tıbben-ilgili yabancı organları candida albicans biyofilm geliştirme

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Biyotik ve / veya abiyotik yüzeylerde Candida albicans biyofilm gelişimi yatan hastalar için özel bir tehdit oluşturmaktadır. Şimdiye kadar, C albicans biyofilm in vitro ağırlıklı incelenmiştir, ancak, in vivo koşullar altında bu dinamik işlemin daha iyi anlaşılması için önemli bir ihtiyaç vardır. Biz C çalışma bir in vivo deri altı sıçan modeli geliştirdi albicans biyofilm oluşumu. Bizim modelde, (9&#39;a kadar) birden Candida enfekte olan cihazlar hayvanın arka kısmına implante edilir. Bize bir hayvanda birçok bağımsız biyofilm çalışma sağlar gibi bu santral venöz kateter modeli sistemi üzerinden bize büyük bir avantaj sağlıyor. Son zamanlarda, biz C incelemek için bu modeli adapte BALB / c farelerine albicans biyofilm gelişimi. Bu modelde, C olgun albicans biyofilm 48 saat içinde geliştirmek ve tipik üç-boyutlu biyofilm mimarisi göstermektedir. mantar biyofilm ölçümügeleneksel analiz otopsi ve ev sahibi fedakarlık gerektirir. Bu kinetik çalışmalar yapmak birçok hayvan kullanımını gerektirdiğinden, biz uzunlamasına olgun in vivo takip C&#39;ye non-invaziv biyoluminesans görüntüleme (BLI) uygulanan albicans, bizim deri altı modeli gelişmekte biyofilm. C albicans hücreleri hücre duvarına bağlı Gaussia princeps lusiferaz geni (glukozit) ifade etmek için tasarlanmış edildi. biyoışıldama sinyali ölçülebilir ışık ilave edilmiş substrat koelenterazin dönüştürür lusiferaz tarafından üretilir. BLI sinyal Eksplante kateter elde edilen hücre sayımları benziyordu. In vivo biyofilm oluşumu ölçülmesi için Non-invaziv görüntüleme daha iyi anlamak için, burada katkı yanı sıra konak-patojen etkileşimleri dayalı çalışmalar için in vivo koşullarda tarama ve antifungal ilaçların doğrulama için acil uygulamalar sağlarKateter ilişkili enfeksiyonların patogenezi ing.

Bu çalışmada, bir farede in vivo olarak, C. albicans biyofilm gelişimi sırasında kateterin implant ve eksplant cerrahi bir işlemi göstermektedir. Ayrıca, klasik CFU numaralandırma tarafından değil, aynı zamanda BLI tarafından değil, sadece olgun biyofilm miktarının görüntüler. Şekil 1A&#39;da gösterildiği gibi, olmayan fosforlu poliüretan kateter adet 1 sm cihazları halinde kesilir ve daha sonra serum ile kaplandı. Candida hücreleri olmayan serum kaplı impl...

Bir fare deri altı modelinde Candida albicans biyofilm gelişiminin deneysel bir prosedürünü sunuyoruz. Mantar biyofilmleri, koloni oluşturan birimlerin sayısının belirlenmesi ve üretilen ışık miktarının canlı hücre sayısına karşılık geldiği invaziv olmayan bir biyolüminesans görüntüleme ile ölçüldü.

Biyoparlaklık Görüntüleme Ardından Fare Subkutan Modeli Tıbben-ilgili yabancı Organları Candida albicans Biyofilm Geliştirme

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, candida albican hücreleri tarafından in vivo biyofilm oluşumunun noninvaziv izlenmesi için lusiferaz eksprese eden bir suşun kullanımını doğrulamaktır. Bu, candida albicans suşunu ifade eden bir lusiferaz ile kolonize edilmiş kateter parçalarının bir farenin arkasına implante edilmesiyle elde edilir. İkinci aşamada, mayanın hücre dışı bir matris içine gömülü kalın bir hücre tabakasına büyümesine izin verilir ve kateterlerin içinde olgun bir biyofilm oluşturur.Daha sonra, lusiferaz enzimi tarafından dönüştürülecek bir substrat eklenir. Bu reaksiyon ölçülebilir ışık üretir: Biyolüminesan görüntüleme veya BLI daha sonra canlı konakçı içindeki biyofilm oluşumunu kaydetmek ve ölçmek için kullanılır. Bu tekniğin, merkezi Venmo sistemi gibi diğer mevcut tekniklere göre en büyük avantajı, bir hayvanın içinde altı adede kadar biyofilmi test edebilmemiz ve böylece istatistiksel analiz için ihtiyaç duyduğumuz hayvan sayısını büyük ölçüde azaltabilmemizdir.Bu tekniğin etkileri, kandida albicans biyofilm oluşumunun tedavisine kadar uzanır, çünkü yöntemimiz mevcut ve yeni antifungal bileşenlerin kolayca test edilmesine izin verir. Ayrıca, bu yöntem candida albicans, mantar biyofilmleri hakkında bilgi sağlayabilir. Bakteriler veya diğer eğlenceli türler gibi diğer mikroplara da uygulanabilir.Önerilen prosedürlerin, cerrahi prosedür açılmadan 24 saat önce bir biyolojik güvenlik kabini içinde üç lümenli kateterleri içeren paketin bir hayvan tesisine erişimi olan herhangi bir laboratuvarda uygulanması kolaydır. Gereksiz tüm parçaları çıkarmak için steril cımbız ve katetere bağlı kısmı kesmek için steril bir neşter kullanın. Daha sonra plastik ambalajın altına bir cetvel yerleştirin ve poliüretan kateteri bir santimetre uzunluğunda parçalar halinde kesin.Daha sonra, her bir kateteri yaklaşık 1.8 mililitre% 100 fetal sığır serumu ile doldurun ve parçaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, her bir serum kaplı kateter parçasını ayrı ayrı 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın ve C albicans'ı A YPD plakasından ayrı bir mikro santrifüj tüpünde bir ila 100 seyreltmede bir mililitre PBS'ye kazıyın. Saydıktan sonra, hücre süspansiyonunu mililitre başına beş kez 10 ila dördüncü hücreye kadar seyreltin.Ve serum kaplı kateter parçalarının her birine bir mililitre hücre ekleyin. Hücrelerin 37 santigrat derecede 90 dakika boyunca kateterlere yapışmasına izin verin. Daha sonra tüpleri steril cımbızla dikey pozisyonda tutun.Kateterleri yerleştirmek için her parçayı bir mililitre PBS ile lümenden iki kez nazikçe yıkayın. Bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirilmiş sekiz haftalık anestezi uygulanmış bir farenin alt sırtını tıraş ederek başlayın. Daha sonra cildi dezenfekte edin ve hayvanın her iki tarafında 0,5 ila bir santimetrelik küçük bir kesi yapın.Daha sonra, yaklaşık 1,5 santimetre uzunluğunda ve bir santimetre genişliğinde iki deri altı tüneli oluşturmak için alt kısmı makasla inceleyin. Her tünele üç kateter parçası yerleştirin ve parçaların üst üste binmeden yatay bir düzende yan yana durmasını sağlayın. Kesileri dikişlerle kapatın ve ardından yaraları bir dezenfektan ile çok nazikçe temizleyin.Daha sonra doğrudan insizyonlara lokal anestezik uygulayın ve hayvanları tamamen iyileşene kadar izleyen bir anestezi tersine çevirici ajan uygulayın. Biyofilm oluşumunu uygun deneysel zaman noktasında görüntülemek için, anestezi uygulanmış bir hayvanda kateterleri içeren her alana 100 mikrolitre taze hazırlanmış bobin ve terezini deri altına enjekte edin. Ardından, maksimum sinyal yoğunluğuna ulaşılana kadar 20 ila 60 saniye arasında değişen çekim sürelerine sahip ardışık taramalar elde edin.Bir sonraki çerçevenin alınması sırasında, daha önce elde edilen çerçevelerin biyolüminesan görüntülemesini veya BLI sinyal yoğunluğunu ölçmek için her bir kateter üçlüsünün üzerine bir ilgi bölgesi yerleştirin. Canlı görüntü yazılımında arka plan sinyalini ölçmek için bir kontrol bölgesine sabit boyutta dikdörtgen bir ilgi alanı da yerleştirin. Her bir kateter üçlüsü için ve arka plan için ilgilenilen bölgelerden geçen foton akışını ölçün.Biyofilm oluşum raporu sırasında bu ölçümleri her hayvan için ve farklı zaman noktalarında tekrarladıktan sonra, her bir kateter üçlüsünün BLI sinyal yoğunluğu saniyede foton akısı olarak değişir. Veriler doğrudan bir elektronik tablo programına kopyalanabilir ve yapıştırılabilir. Boyuna deneyin sonunda, deri altı dokusundan kesilen her bir hayvanı kurban edin ve kateter parçalarını tek tek çıkarmak için steril cımbız kullanın.Kateterleri, az önce gösterildiği gibi bir mililitre PBS'de iki kez yıkayın. Daha sonra parçaları bir su banyosunda 40.000 hertz'de bir mililitre taze PBS'de yeni bir mikro santrifüj tüpünde sonikleştirin. 10 dakika sonra sonikate, kateterleri içeren tüpleri buz üzerine yerleştirin ve orijinal örneklerin 100 mikrolitresini YPD agar plakaları üzerinde bir ila 10 ve bir ila 100 seyreltme ile plakalayın.İki kopya halinde. Son olarak, koloni oluşturan birimlerin ortalama ve standart sapmasını çizin. Ve logaritmik ölçekte her hayvan için BLI sinyali.Bu görüntüde, biyofilm gelişiminden altı gün sonra belirtilen ilgi alanlarıyla birlikte biyolüminesans sinyalini gösteren temsili bir hayvan gösterilmektedir. Kontrol arka plan alanında, biyofilmin kandida kaplı kateterlerin hemen yanındaki alanlarla sınırlı olduğunu doğrulayan sinyalizasyon eksikliğine dikkat edin. Bu temsili deneyde, biyofilmleri eksprese eden lusiferaz tarafından üretilen net bir BLI sinyali gözlemlenebilirken, vahşi tip suş tarafından yalnızca arka plan sinyali üretiliyor gibi görünmektedir.Sinyaldeki bu artış, biyofilm başına koloni oluşturan birimlerdeki artış ve birlikte alınan her bir hayvan grubu için foton akısı ölçümleri ile aynı eğilimi takip eder. Bu veriler, BLI'nın deri altı fare modelinde in vivo olgun C albicans biyofilm oluşumunu izlemek ve ölçmek için güçlü bir teknik olduğunu göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra kandida hücreleri ile cihazların enfeksiyonu iki saat sürebilirken, kateter implantı fare başına 10 dakika içinde yapılabilir.BLI görüntüleme, fare başına beş dakika içinde gerçekleştirilebilir. BLI kullanmanın en büyük avantajı, aynı hayvanda biyokütle ve biyofilm gelişimini tekrar tekrar izleyebilmenizdir. Zamanla Bu prosedürü takiben, MRI veya CT gibi diğer yöntemler tam katedral pozisyonu hakkında bilgi sağlayabilir.Bu bilgi daha sonra derin damar Katedrali modeli gibi daha karmaşık modellerde niceleme için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, farelerde in vivo, deri altı biyofilm, ss'nin nasıl gerçekleştirileceği konusunda çok iyi bir anlayışa sahip olmalısınız ve bu, konakçı patojen etkileşimlerinin daha derinlemesine analizi için temel oluşturabilir.

candida-albicans-biofilm-development-on-medically-relevant-foreign

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video, Candida albicans'ın deri altı dokuda biyofilm oluşumunu incelemek için bir in vivo fare modelinin geliştirilmesini göstermektedir. Deney, Candida ile enfekte olmuş cihazların biyofilm gelişimi için hayvanın sırt bölgesine implante edilmesini içeriyor.

Candida albicans Bir İn Vivo Fare Modelinde Biyofilm Oluşumu

Burada gerçek zamanlı, non-invaziv, kollarındaki Pseudomonas aeruginosabiyofilm yara enfeksiyonları izleme için tüysüz fareler kullanan bir roman diyabetik fare modeli açıklar. Bu yöntem diğer bakteri ve genetiği değiştirilmiş mikroorganizmalar, çoklu türler biyofilmler, dahil olmak üzere enfeksiyon değerlendirmek ve antibiofilm stratejileri etkinliğini test etmek için adapte edilebilir.

Işık tarafa: In Vivo izleme bir diyabetik tüysüz fare modelinde kronik yaralarda Pseudomonas aeruginosa biyofilm enfeksiyonların

Bu protokol ana bilgisayar fizyolojik koşullar altında Candida albicans biyofilm oluşumu görselleştirmek için özelleştirilebilir otomatik mikrosıvısal aygıt kullanımını açıklar.

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Bu protokolün amacı Memeli gastrointestinal sistemde Candida albicans hücre şekli ve lokalizasyonu görselleştirmektir.

Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi

Candida albicans biyofilmlerinin iç özelliklerini görüntülemek ve ölçmek için, kırılma indisi eşleştirmesi ile açıklığa kavuşturulan sabit bozulmamış numuneler hazırlıyoruz. Daha sonra, optik kesit mikroskopisi biyofilmin tam kalınlığı na rağmen üç boyutlu görüntü verilerini elde etmek için kullanılabilir.

Aydınlatma ve Görüntüleme Candida albicans Biyofilmler

Bu makalede, farelerde idrar yolu enfeksiyonuna neden olacak lüks bir operon ile üropatojenik bakterilerin intravesik yönetimi ve daha sonra biyolüminesans görüntüleme kullanılarak bakteri yükünün uzunlamasına in vivo analizi açıklanmaktadır.

Biyolüminesans Görüntüleme Kullanan Farelerde İdrar Yolu Enfeksiyonlarının Boyuna Takibi ve Tedavileri

Bu makalede, non-invaziv konfokal mikroskopi kullanılarak bir memeli konakçısında aktif enfeksiyon sırasında morfogenez fenotipleri için orta büyüklükte Candida albicans mutant kütüphanelerinin taranması için bir yöntem anlatılmaktadır.

Bir Memeli Konağında Aktif Enfeksiyon Sırasında Candida albicans Mutant Suşlarında Morfogenez Fenotiplerini Taramak için In Vivo Görüntülemenin Kullanımı

Tehlikeli patojenlerin neden olduğu periprostetik eklem enfeksiyonu (PEE) klinik ortopedide yaygındır. Mevcut hayvan modelleri, PJI'nin gerçek durumunu doğru bir şekilde simüle edemez. Burada, PJI için yeni terapötikler araştırmak ve geliştirmek için Candida albicans biyofilm ile ilişkili bir PJI fare modeli kurduk.

Farede Periprostetik Eklem Candida albicans Enfeksiyon Modeli

Kateter üzerinde biyofilmin oluştuğu ve C.albicans ile konakçı arasındaki etkileşimin klinik CRI ile iyi korelasyon gösterdiği C.albicans ile ilişkili kateterle ilişkili enfeksiyonun (CRI) bir fare modelini oluşturduk. Bu model, C.albicans biyofilmle ilişkili CRI için tarama tedavilerine yardımcı olarak klinik dönüşüm için bir temel oluşturur.

Farede Kateterle İlişkili Candida albicans Enfeksiyon Modeli

Bu protokol, oral kandidiyazisin bir fare modelinde antimikrobiyal Fotodinamik Terapinin (aPDT) uygulanmasını açıklar. aPDT, suda çözünür bir kurkuminoid ve mavi LED ışık karışımı kullanılarak gerçekleştirildi.

Oral Kandidiyazisin Murin Modelinde Kurkuminoid Aracılı Antimikrobiyal Fotodinamik Tedavi

Bu protokol, tek bir fare içinde aynı koşullar altında iki implantın bakterilerle aynı anda inkübasyonunu sağlayan implantla ilgili enfeksiyonların benzersiz bir deneysel modelini tanımlar. Ayrıca, optimize edilmiş karşılaştırmalı analitik yöntemler kullanarak implant yüzeylerinde biyofilm oluşumunun hassas bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır ve biyomalzemelerin antimikrobiyal özelliklerini değerlendirmek için gelişmiş teknikleri gösterir.

Subkutan apsede cerrahi implantlarda biyofilm oluşumunun kantitatif değerlendirmesi için benzersiz bir fare modeli

Keşfedin biyoparlaklık görüntüleme yöntemiyle fare subkutan modelinde Candida albicans biyofilm gelişiminin canlı izlenmesi. Bu teknik antifungal tedavi testleri için güvenilir bir araç sunar.

Biyoparlaklık Görüntüleme Ardından Fare Subkutan Modeli Tıbben-ilgili yabancı Organları Candida albicans Biyofilm Geliştirme

Daha fazla video keşfet