Name: Süspansiyon Retina pigment epiteli Hücreleri sunun Kemirgenler Subretinal Enjeksiyonları Sahne (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Öğrenin, kemirgenlerde subretinal RPE hücre enjeksiyonu için minimal travmalı bir yöntem. Bu teknik, retinal dejenerasyon modellerinde hücre teslimatını ve hayatta kalışını değerlendirmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Subretinal enjeksiyon tekniğinin geliştirilmesine yardımcı olduğu için Alison Dorsey'e teşekkür etmek istiyoruz. Ayrıca Ulusal Göz Enstitüsü'ne (NEI hibeleri EY11254 ve EY021416), California Rejeneratif Tıp Enstitüsü'ne (CIRM hibesi TR1-01219) ve Lowy Tıbbi Araştırma Enstitüsü'ne (LMRI) bu proje için çok cömert fonlar için teşekkür ederiz.

NOT: Tüm hayvanlar Scripps Araştırma Enstitüsü tarafından kurulan etik kurallara uygun olarak tedavi edildi. Enjeksiyon için Materyallerin hazırlanması 1. (~ 20 dk) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Ön sıcak hücre ayrışma çözeltisi (tercihen serumu ile seyreltme yoluyla durdurulmuş olduğu bir), steril PBS ve kültür ortamı (Tablo 1). </li><li> Demontaj ve 15 dakika için su içinde parça kaynatılmasıyla bir kör iğne ile şırınga sterilize edin. </li></ol> Enjeksiyon için RPE Hücreler 2. Hazırlık (30 dakika saat 1) <ol style="margin-left: 40px;"><li> 37 ° C&#39;de 5-8 dakika boyunca ön ısıtılmış hücre ayrışma çözeltisi kullanılarak RPE hücreleri ayırmak. </li><li> Hala bağlı olduğu herhangi bir serbest bırakmak için hafifçe kazıyın hücreleri. </li><li> Kültür ortamı büyük bir hacmi (15 ml tüp doldurmak) ayrışma çözümü inaktive ve onları saymak hücreleri seyreltin. </li><li> Pelet hücreleri 5 dakika boyunca 800 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Steril, önceden ısıtılmış PBS / ml 200,000 hücreleri (0.5 ul hacim içinde 100,000 hücre sağlamak için) hücreleri yeniden süspanse edin ve bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine transfer edin. </li><li> İsteğe bağlı olarak, bir canlı hücre geçici floresan markörü ekleyebilir ve 30-45 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Hücrelerden 0.5 ul, kör bir iğne şırınga yerleştirin. Kısa sürede hücreleri enjekte edilir. </li></ol> 3. Alt-retinal Enjeksiyon (~ Enjeksiyon başına 5 dakika) NOT: Mümkünse Limbustan damarları görselleştirmek için çok daha kolay olduğundan, erişkin albino sıçanlar ile tekniğini öğrenmek. Daha kolay enjeksiyon yerinde görülmesini kolaylaştırmak için (hücreleri enjekte denemeden önce) öğrenme sırasında Hızlı Yeşil çözüm enjekte edilir. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Kemirgen anestezisi. 100 mg / ml ketamin ve 10 mg / ml ksilazin (20 ul / 10 g vücut ağırlık intraperitoneal enjeksiyon kullanınizofluoran inhalasyon üzerinde sekiz) bu kemirgen manevra ve inhaler içinde burnu ile göz içine enjekte etmek zor olduğundan. <ol><li> Hayvan derinden pençeleri birini kısma anestezi emin olun. O geri çekildiğinde ise, birkaç dakika daha bekleyin ve subretinal enjeksiyon başlamadan önce tekrar deneyin. </li></ol></li><li> Enjekte edilecek göz tavan bakacak şekilde onun yüzüne kemirgen yerleştirin. </li><li> Göz soketi (geçici propitozisin) biraz dışarı açılır ve sadece kulak üstünde ve çene ile ve yavaşça göz kapaklarının deri paralel germek iki parmak ile başını tutarak daha erişilebilir hale böylece mikroskop altında cildi nazikçe germek çok göz hafifçe soketten açılır ki (Şekil 1C bakınız). Boğaz çok yakın kemirgen tutmayın. </li><li> 30 G keskin tek ön-sterilize iğne ile, gemiler isabet eğer, kanama olacak b (hemen limbusun altında bir delik yapmakönemli e ve daha sonra delik bulmak zor olabilir) ve bir açıyla iğne (Şekil 1D) ile lensi dokunmamak için. Meydana gelecek keskin (ya da künt) iğne veya acil katarakt oluşumu ile lensi dokunmaktan kaçının. NOT: Enjeksiyon iki kişi ile daha iyi çalışır. Bu şekilde bir kişi onlar delik olduğu odaklanmak korumak için keskin tek iğne ile ilk delik oluşturduktan sonra enjeksiyon yapan kişiye künt iğne ile şırınga iletebilirsiniz. </li><li> Kafasına kavrama korurken göz atılabilir keskin iğne geri çekin. Delik tam olarak nerede unutmayın. </li><li> Ya bir micromanipulator bir künt bir iğne ile ön-yüklü şırınga montaj veya elle tutarak, lensi dokunma ve hafifçe göz aracılığıyla itmek için değil yine dikkat çekici, delikten künt iğne ile şırınga ucu ekledikten sonra çok yavaşça duygu direnci (Şekil 1D) kadar. </li><li> Kminimumda tüm hareketleri eeping, dikkatle yavaş yavaş subretinal boşluğa RPE hücreleri enjekte. NOT: RPE / retinanın ayrılması bağlı olacak; Bu kaçınılmazdır. Bununla birlikte, daha temiz bir enjeksiyon dekolmanı en aza indirir ve büyük ölçüde yeniden takılması (Şekil 1E) şansını arttırır. Herhangi abartılı hareketler retina geri iğneyi hareket edebilir, ve yanlara hareketler retinaya zarar edebilirsiniz. bir enjeksiyon pompasının kullanılması isteğe bağlıdır fakat çok hassas bir teslimat sağlar. </li><li> Yavaş yavaş şırınga geri çekin. Göz nemlendirici uygulayın hidrate göz tutmak düşer. </li><li> Sternal yatma kavuşur kadar hayvan izlemeye devam edin. Gözetimsiz bırakmayın hayvan veya sternum yatma kavuşur kadar diğer uyarı hayvanlarla bir kafes iade etmeyin. </li></ol>

<ol><li>Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targets+in+age-related+macular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targets in age-related macular disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3033-3041 (2010).</li>
<li>Jong, P. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJong%2C+PT+%22Age-related+macular+degeneration%22">Age-related macular degeneration</a>. Med, N. . E. ngl. J. . 355 (14), 1474-1485 (2006).</li>
<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auto+iris+pigment+epithelial+cell+transplantation+in+patients+with+age-related+macular+degeneration%3A+short-term+results%5BTitle%5D)+AND+%22The+Tohoku+Journal+Of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Auto iris pigment epithelial cell transplantation in patients with age-related macular degeneration: short-term results.</a> The Tohoku Journal Of Experimental Medicine. 191 (1), 7-20 (2000).</li>
<li>Algvere, P. V., Berglin, L., Gouras, P., Sheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+fetal+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration+with+subfoveal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularization.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 232, 707-716 (1994).</li>
<li>Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+transplantation+of+autologous+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration%3A+a+prospective+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (11), 4151-4160 (2004).</li>
<li>Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+autologous+retinal+pigment+epithelium+in+eyes+with+foveal+neovascularization+resulting+from+age-related+macular+degeneration%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study.</a> Am. J. Ophthalmol. 133 (2), 215-225 (2002).</li>
<li>Juan, E., Loewenstein, A., Bressler, N. M., Alexander, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+the+retina+for+management+of+subfoveal+choroidal+neovascularization+II%3A+a+preliminary+report+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Translocation of the retina for management of subfoveal choroidal neovascularization II: a preliminary report in humans.</a> Am. J. Ophthalmol. 125 (5), 635-646 (1998).</li>
<li>Falkner-Radler, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+transplantation%3A+outcome+after+autologous+RPE-choroid+sheet+and+RPE+cell-suspension+in+a+randomised+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomised clinical study.</a> British Journal of Ophthalmology. 95 (3), 370-375 (2011).</li>
<li>Joussen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+complete+is+successful+%27Autologous+retinal+pigment+epithelium+and+choriod+translocation+in+patients+with+exsudative+age-related+macular+degeneration%3A+a+short-term+follow-up%27+by+Jan+van+Meurs+and+P.R.+van+Biesen%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes.+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">How complete is successful 'Autologous retinal pigment epithelium and choriod translocation in patients with exsudative age-related macular degeneration: a short-term follow-up' by Jan van Meurs and P.R. van Biesen.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 241 (12), 966-967 (2003).</li>
<li>Lai, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+outcomes+following+macular+translocation+with+360-degree+peripheral+retinectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Visual outcomes following macular translocation with 360-degree peripheral retinectomy.</a> Arch. Ophthalmol. 120 (10), 1317-1324 (2002).</li>
<li>Machemer, R., Steinhorst, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+separation%2C+retinotomy%2C+and+macular+relocation%3A+II.+A+surgical+approach+for+age-related+macular+degeneration%3F+Graefes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Retinal separation, retinotomy, and macular relocation: II. A surgical approach for age-related macular degeneration? Graefes.</a> Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 231 (11), 635-641 (1993).</li>
<li>MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+transplantation+of+the+retinal+pigment+epithelium+and+choroid+in+the+treatment+of+neovascular+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Autologous transplantation of the retinal pigment epithelium and choroid in the treatment of neovascular age-related macular degeneration.</a> Ophthalmology. 114 (3), 561-570 (2007).</li>
<li>Peyman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+retinal+pigment+epithelium+transplantation+for+age-related+macular+degeneration+secondary+to+extensive+subfoveal+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Surgery%22%5BJournal%5D)">A technique for retinal pigment epithelium transplantation for age-related macular degeneration secondary to extensive subfoveal scarring.</a> Ophthalmic Surgery. 22 (2), 102-108 (1991).</li>
<li>Buchholz, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+functional+retinal+pigmented+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).</li>
<li>Carr, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+phagocytosis+by+human+embryonic+stem+cell-derived+RPE+cells+using+a+novel+human+retinal+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay.</a> Mol. Vis. 15 (4), 283-295 (2009).</li>
<li>Carr, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+human+iPS-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+transplantation+in+the+retinal+dystrophic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat.</a> PLoS One. 4 (12), e8152(2009).</li>
<li>Hirami, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+retinal+cells+from+mouse+and+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells.</a> Neurosci Lett. 458 (3), 126-131 (2009).</li>
<li>Idelson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).</li>
<li>Klimanskaya, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+comparative+assessment+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+embryonic+stem+cells+using+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics.</a> Cloning Stem Cells. 6 (3), 217-245 (2004).</li>
<li>Kokkinaki, M., Sahibzada, N., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Induced+Pluripotent+Stem-Derived+Retinal+Pigment+Epithelium+%28RPE%29+Cells+Exhibit+Ion+Transport%2C+Membrane+Potential%2C+Polarized+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Secretion%2C+and+Gene+Expression+Pattern+Similar+to+Native+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human Induced Pluripotent Stem-Derived Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Exhibit Ion Transport, Membrane Potential, Polarized Vascular Endothelial Growth Factor Secretion, and Gene Expression Pattern Similar to Native RPE.</a> Stem Cells. 29 (5), 825-835 (2011).</li>
<li>Krohne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+small+molecules+and+OCT4-reprogrammed+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4-reprogrammed human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (2), 96-109 (2012).</li>
<li>Lund, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (39), 16698-16703 (2009).</li>
<li>Osakada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+by+small-molecule+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molecule induction.</a> J. Cell Sci. 122 (17), 3169-3179 (2009).</li>
<li>Vugler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+phenomenon+of+HESC-derived+RPE%3A+anatomy+of+cell+genesis%2C+expansion+and+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation.</a> Exp. Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).</li>
<li>Westenskow, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+flow+cytometry+to+compare+the+dynamics+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+in+iPS-derived+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (10), 6282-6290 (2012).</li>
<li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Arch. Ophthalmol. 122 (10), 598-614 (2004).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+efficacy+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+%28iPS%29+grafts+in+a+preclinical+model+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and efficacy of human-induced pluripotent stem cell (iPS) grafts in a preclinical model of retinitis pigmentosa.</a> Molecular Medicine. 18, 1312-1319 (2012).</li>
<li>Wang, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa).</a> Transplantation. 89 (8), 911-919 (2010).</li>
<li>Ramsden, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+retinal+regeneration%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stem cells in retinal regeneration: past, present and future.</a> Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).</li>
<li>Schwartz, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> The Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Carr, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+human+embryonic+stem+cell+therapies+for+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Development of human embryonic stem cell therapies for age-related macular degeneration.</a> Trends in Neurosciences. 36 (7), 385-395 (2013).</li>
<li>Westenskow, P., Friedlander, M. Ch. 111. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWestenskow%2C+P+%22The+New+Visual+Neurosciences%22">The New Visual Neurosciences</a>. Werne, J. S., Chalupa, L. M. , The MIT Press. Cambridge, MA. 1611-1626 (2013).</li>
<li>Westenskow, P., Sedillo, Z., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Derivation+of+Retinal+Pigment+Epithelium+Cells+from+iPS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from iPS.</a> J. Vis. Exp. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Furhmann, S., Levine, E. M., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraocular+mesenchyme+patterns+the+optic+vesicle+during+early+eye+development+in+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick.</a> Development. 127 (21), 4599-4609 (2000).</li>
<li>Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Safety+and+Function+of+RPE+from+Human+Embryonic+Stem+Cells+in+Preclinical+Models+of+Macular+Degeneration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Long-Term Safety and Function of RPE from Human Embryonic Stem Cells in Preclinical Models of Macular Degeneration).</a> Stem Cells. 27 (9), 2126-2135 (2009).</li>
<li>Zhao, T., Zhang, Z. -N., Rong, Z., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 474 (7350), 212-215 (2011).</li>
<li>Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+transplantation+of+MACS+purified+photoreceptor+precursor+cells+into+the+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina.</a> Journal Of Visualized Experiments. , e50932(2014).</li>
<li>Huber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+mouse+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5888-5895 (2009).</li>
<li>Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+mouse+retinal+degeneration+with+high-resolution+spectral-domain+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vision%22%5BJournal%5D)">Monitoring mouse retinal degeneration with high-resolution spectral-domain optical coherence tomography.</a> Journal of Vision. 53 (8), 4644-4656 (2008).</li>
<li>Pennesi, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+characterization+of+retinal+degeneration+in+rd1+and+rd10+mice+using+spectral+domain+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-term characterization of retinal degeneration in rd1 and rd10 mice using spectral domain optical coherence tomography.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 4644-4656 (2012).</li>
<li>Fisher, S. K., Lewis, G. P., Linberg, K. A., Verardo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+remodeling+in+mammalian+retina%3A+results+from+studies+of+experimental+retinal+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+And+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular remodeling in mammalian retina: results from studies of experimental retinal detachment.</a> Progress in Retinal And Eye Research. 24 (3), 395-431 (2005).</li>
<li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+for+subretinal+implantation+of+ultrathin+substrates+containing+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer.</a> Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).</li>
<li>Diniz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+implantation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%3A+improved+survival+when+implanted+as+a+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (7), 5087-5096 (2013).</li>
</ol>

Yazarların hiçbirinin beyan edecek herhangi bir ticari açıklaması yoktur.

Bu yazıda sıçanlarda ve farelerde süspansiyon RPE hücrelerinin subretinal enjeksiyonları gerçekleştirmek için nispeten basit bir yöntem tarif. protokol az travmalarda tercüme edecek tekniği ile öğrenmesi kolay ve daha deneyim (Şekil 3, bu iyi enjeksiyon birini temsil) bir mikromanipülatör (Şekil 1A) kullanıldığında, özellikle. Herhangi bir travma, bir cSLO ve Ekim sistemi (Şekil 2) varsa in vivo izlenebilir. Yüksek çözünürlük ve daha az gürültülü görüntüler ist...

Duyusal retina, nöronların, gliaların ve endotel hücrelerinin fonksiyonel katmanlarında düzenlenmiştir. Retinanın arkasındaki fotoreseptörler ışıkla aktive edilir; Fototransdüksiyon yoluyla fotonları, internöronlar tarafından rafine edilen ve beyindeki görsel kortekse iletilen elektrik sinyallerine dönüştürürler. Fototransdüksiyon, Mueller glia ve retina pigment epitel (RPE) hücrelerinin koordineli çabaları olmadan gerçekleşemez. RPE, fotoreseptörlerin hemen arkasında tek bir tabaka halinde düzenlenir ve fotoreseptör fonksiyonu ve homeostazın ayrılmaz bir parçası olan çoklu ve çeşitli işlevleri yerine getirir. Aslında, RPE ve fotoreseptörler o kadar birbirine bağımlıdır ki, tek bir fonksiyonel birim olarak kabul edilirler. RPE'nin ölümü veya işlev bozukluğu, fotoreseptörler üzerinde yıkıcı ikincil etkilere neden olur ve yaşlılarda körlüğün önde gelen nedeni olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ile ilişkilidir1,2.
AMD için herhangi bir tedavi keşfedilmemiş olsa da, birkaç klinik çalışma RPE hücre replasmanının umut verici bir terapötik seçenek olabileceğini göstermiştir3-13. Kök hücre teknolojisinin ortaya çıkmasıyla birlikte, fonksiyonel ve anatomik olarak somatik muadillerine güçlü bir şekilde benzeyen embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (hES ve hiPS) in vitro olarak çok sayıda RPE hücresi üretmek artık mümkündür14-26. Kök hücre kaynaklı RPE'nin, spontan retina dejenerasyonu olan sıçan ve fare hatlarında retina dejenerasyonunu önemli ölçüde yavaşlatmak için bizimki de dahil olmak üzere birçok bağımsız grup tarafından in vivo olarak işlev gördüğü gösterilmiştir16,18,21,22,25,28,29. Klinik ve klinik öncesi destekleyici kanıtların bu kombinasyonu o kadar ikna edicidir ki, kök hücre türevli RPE hücreleri kullanılarak retina dejenerasyonunu önlemek için çeşitli klinik çalışmalar şu anda devam etmektedir30,31. 
RPE, hES ve/veya hiPS'den kolayca türetilebilir ve çeşitli türetme ve enjeksiyon teknikleri kullanılarak kemirgenlerin subretinal boşluğuna implante edilebilir32,33. (Kullandığımız yönlendirilmiş farklılaşma protokolünü gösteren multimedya formatında bir yöntem belgesi için Westenskow ve ark.'ya bakınız)34. İmplantasyon üzerine eksojen olarak verilen RPE hücrelerinin güvenliği, sağkalımı ve fonksiyonel kapasitesi ile ilgili kritik sorular vardır, bu nedenle kemirgenlerde subretinal enjeksiyon yapma yeteneği kritik bir beceridir16,18,21,29,36,37. RPE'nin verilmesi önemsiz değildir ve alan en etkili enjeksiyon tekniğine bölünmüştür. Burada tanımladığımız protokol, RPE hücrelerinin bolusunu subretinal olarak vermenin basit ve etkili bir yoludur ve kök hücre kaynaklı RPE transplantasyonu için ilk klinik çalışmada kullanılmıştır31. (Okuyucu ayrıca Eberle ve ark. kemirgenlerde subretinal enjeksiyonların alternatif bir tasviri için. 38) 
Bu yazıda özetlenen teknik görselleştirilemez ve travma kaçınılmazdır (herhangi bir subretinal enjeksiyon tekniğinde olduğu gibi). Limbus damarlarının hemen altında bir delik açılarak ve taban tabana zıt retinanın altına bir hücre bolusu enjekte etmek için transskleral bir yol boyunca künt bir iğne sokularak gerçekleştirilir. Enjeksiyonu yapan kişi, künt iğne retinaya temas ettiğinde direnç hissedecektir. Bununla birlikte, hücreler enjeksiyondan sonra doğrudan görüntülenebilir ve indüklenen retina dekolmanı derecesi, RPE hücrelerinin geçici bir floresan işaretleyici ile işaretlenmesi ve bunların bir konfokal taramalı oftalmoskop (cSLO) ile tespit edilmesiyle belirlenebilir. Travmayı izlemek ve enjeksiyon bölgesini kolayca tanımlamak için bir optik koherens tomografi (OCT) sistemi de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol (55 mM)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21985-023</td><td>50 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Hücre Görüntüleyiciler</td><td>VWR</td><td>89260-222</td><td>Kasa x 1</td></tr><tr><td>CellTracker Yeşil CMFDA</td><td>Moleküler Problar</td><td>C34552</td><td>50 & mikro; g x 20</td></tr><tr><td>DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Hızlı Yeşil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258</td><td>25 g x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Genteal Jel Damlalar Orta ila Şiddetli Kayganlaştırıcı Göz Damlası&nbsp;</td><td>Walmart</td><td>4060941</td><td>25 ml x 1</td></tr><tr><td>Hamilton Model 62 RN SYR</td><td>Hamilton</td><td>87942</td><td>Şırınga x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Hamilton İğne 33 G, 0.5", nokta 3 (304 paslanmaz çelik)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>İğneler x 6</td></tr><tr><td>Nakavt DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829-018</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Değiştirme</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>Manyetik Stand</td><td>Leica Biosystems</td><td>39430216</td><td>Stand x 1</td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi 100X&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Leica Biosystems</td><td>3943001</td><td>Manipülatör x 1</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>İğnesiz Kayar Uçlu Şırınga BD&nbsp; (3 ml)&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD309656</td><td>Paketi x 1</td></tr><tr><td>Özel Kullanım İğneleri BD&nbsp; (30 g, 1 inç)</td><td>VWR</td><td>BD305128</td><td>Kutusu x 1</td></tr><tr><td>TripLE Ekspres Enzim (1X), fenol içermeyen kırmızı</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>100 ml x 1</td></tr></tbody></table>

süspansiyon retina pigment epiteli hücreleri sunun kemirgenler subretinal enjeksiyonları sahne

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

elektriksel uyarıların içine ışık dönüşümü dış retina oluşur ve çubuk ve koni fotoreseptör ve retina pigment epiteli (RPE) hücreleri tarafından büyük ölçüde gerçekleştirilir. RPE fotoreseptör ve ölüm ya da RPE hücrelerinin disfonksiyonu yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), insanlar yaş 55 ve üzeri kalıcı görme kaybının önde gelen nedeni karakteristik için kritik destek sağlamaktadır. AMD için bir tedavi tespit edilmiş olmakla birlikte, hasta göze sağlıklı RPE implantasyonu etkili bir tedavi olduğu ortaya çıkabilir ve RPE hücreleri, çok sayıda hali hazırda, pluripotent kök hücreleri elde edilebilir. RPE hücre teslim ve güvenliğine ilişkin birçok ilginç sorular hala hayvan modellerinde incelenebilir ve RPE enjekte için kullanılan kabul görmüş protokoller geliştirilmiştir. Burada açıklanan teknik çeşitli çalışmalarda çoklu gruplar tarafından kullanılan ve ilk keskin iğne ile göz delik oluşturarak içerir. Bir blu ile daha sonra bir şırıngaHücre yüklü nt iğne deliğinden sokulur ve hafifçe RPE temas edene kadar vitröz geçirilir. Nispeten basittir ve çok az ekipman gerektirmektedir, bu enjeksiyon yöntemi kullanarak, hayvan modellerinde fotoreseptör dejenerasyonu önemli miktarda önleyen ana RPE arasında kök hücre türetilmiş RPE hücreleri, tutarlı ve etkili bir entegrasyon sağlamak. Gerçek protokolünün bir parçası değildir, biz de enjeksiyon, ve nasıl hücreler in vivo görüntüleme yöntemleri kullanarak subretinal boşluğa enjekte edildi doğrulamak için neden olduğu travmanın boyutlarını belirlemek için nasıl açıklar. Son olarak, bu protokolün kullanılması RPE hücreleri ile sınırlı değildir; Bu retina altına doğru herhangi bir bileşik ya da bir hücre enjekte etmek için kullanılabilmektedir.

Biz bu yazıda anlatılan tekniği kullanarak hızlı ve tutarlı kemirgenler subretinal boşluğa RPE hücrelerinin bir süspansiyon sunabilirsiniz. Gerekli olmamakla beraber, travmalar büyük ölçüde Şekil 1A ve B, bir mikromanipülatör ile gösterilen düzeneği kullanılarak en aza indirilebilir. Geçici propitozlar Şekil 1C&#39;de gösterildiği gibi, kemirgen tutun. mikromanipülatör veya elle yapıldığı takdirde adımlar aynıdır; Bu Şekil 1D karikatür tasvir edilir. Etiketli RPE hücrel...

Burada, sıçanlarda ve farelerde bir RPE hücresi bolusunu subretinal olarak enjekte etmek için multimedya formatında topluluk tarafından kabul edilen bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, retinal dejenerasyonun hayvan modellerinde implantasyon üzerine aşılanmış RPE hücrelerinin kurtarma potansiyellerini, güvenlik profillerini ve hayatta kalma kapasitelerini belirlemek için kullanılabilir.

Süspansiyon Retina pigment epiteli Hücreleri sunun Kemirgenler Subretinal Enjeksiyonları Sahne

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Bu prosedürün genel amacı, travmayı en aza indirirken retina pigmenti, epitel veya RPE hücrelerini kemirgenlerin subretinal boşluğuna enjekte etmektir. Bu, önce sakinleştirici bir hayvanın gözüne bir delik açmak için keskin bir iğne kullanılarak gerçekleştirilir. Daha sonra, hücreler künt bir iğne kullanılarak subretinal boşluğa enjekte edilir.Son adımda, göz nemli kalması için nemlendirici ile kaplanır. Sonuç olarak, enjeksiyonun etkinliğini izlemek için histoloji ve in vivo görüntüleme modaliteleri kullanılabilir. Bugün size gösterdiğimiz yöntem, RPE hücrelerinin subretinal boşluğa verilmesi için özel olarak tasarlanmış olsa da, tekniğin kendisi, çeşitli preklinik çalışmalarda kullanılmak üzere çeşitli diğer hücre tiplerinin ve kimyasalların subretinal alana verilmesi için geniş ölçüde uygulanabilir.Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, enjeksiyonun ne kadar iyi yapıldığını görmek zor olduğu için mücadele edeceklerdir. Bu yöntemin görsel gösterimleri, enjeksiyon adımlarının gerçekleştirildiğini görmeden öğrenilmesi zor olduğu için kritik öneme sahiptir. Şahsen.Enjeksiyondan yaklaşık bir saat önce, tripsin olmayan bir hücre ayrışma solüsyonunu, steril PBS'yi ve kültür ortamı

performing-subretinal-injections-rodents-to-deliver-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu cerrahi teknik fare gözün subretinal boşluk içine gen terapisi vektörleri ve kök hücrelerinin enjeksiyonu göstermektedir.

Fare Göz içine Gen Terapisi Vektörler ve Kök Hücre Subretinal Enjeksiyon

Kaynak: Park, S. W., et al. Farelerde Gen Tedavisi için Viral Vektörlerin Limbal Yaklaşım-Subretinal Enjeksiyonu Retinal Pigment Epiteli. J. Vis. Uzm. (2015)Video, bir fare modelinde viral vektörlerin retina pigment epiteline (RPE) subretinal enjeksiyonu için yöntemi açıklamaktadır. Anestezi ve göz hazırlığından hassas lentiviral vektör dağıtımına kadar prosedürü detaylandırarak RPE'de gen entegrasyonunu ve ekspresyonunu sağlar.

Bir Fare Modelinde Viral Vektörlerin Retina Pigment Epiteline Subretinal Enjeksiyonu

Subretinal enjeksiyon, fare gözündeki retina pigment epiteline etkili gen iletimi için kullanılan cerrahi bir tekniktir.  Burada, deneysel farelerde viral vektörlerin retina pigment epiteline subretinal enjeksiyonu için kolay ve tekrarlanabilir bir yöntem açıklanmaktadır.

Fareler Retina Pigment Epitel Gen Tedavisi için Viral Vektörler Limbal Yaklaşım-Subretinal Enjeksiyon

Subretinal enjeksiyonlar, proteinler ve viral vektörler gibi büyük terapötik ajanları fotoreseptörlere ve retina pigment epiteline iletmek için en yaygın tekniktir. Farelerde, minimum ikincil hasar ve hızlı iyileşme süreleri ile subretinal boşluğu başarılı bir şekilde hedefleyen alternatif bir yöntem burada açıklanmaktadır.

Subretinal Space erişim için bir alternatif ve Onaylı Enjeksiyon Yöntemi<i&gt; yoluyla</i&gt; Bir transkleral Posterior Yaklaşım

Subretinal enjeksiyon kök hücre replasman tedavisi için yaşa bağlı makula dejenerasyonu preklinik çalışmalarda yaygın olarak uygulanmıştır. Görüntülenmeyecektir bu makalede, biz daha az riskli, tekrarlanabilir ve tam olarak değiştirilmiş subretinal enjeksiyon tekniğini hücrelerin sıçan gözlerinin içine sunmak için trans-scleral yaklaşım yoluyla tanımlamak.

Sıçan gözlerinin içine insan retina Pigment epitel hücrelerinin Trans-scleral Subretinal nakli için rafine bir protokol geliştirilmesi

Retina pigment epitel hücreleri hücre-replasman tedavisi için Kuru yaşa bağlı makula dejenerasyonu gelişmiş form olarak hizmet verebilir. Bu iletişim kuralı coğrafi Atrofi büyük gözlü modeli ve hastalık bu modeline insan embriyonik kök hücre kaynaklı retina pigment epitel hücrelerinin nakli subretinal nesil açıklar.

Büyük gözlü manken coğrafi Atrofi, içine insan embriyonik kök hücre elde edilen retina Pigment epitel hücrelerinin subretinal nakli

Retina pigmentli epitelin (RPE) subretinal implantasyonu, dejeneratif retina hastalıklarının tedavisinde en umut verici yaklaşımlardan biridir. Bununla birlikte, büyük gözlü hayvan modelleri üzerinde yapılan klinik öncesi çalışmaların performansı zorlu olmaya devam etmektedir. Bu yazıda RPE'nin bir hücre taşıyıcısı üzerinde minidomuzlara subretinal transplantasyonu için kılavuzlar sunulmaktadır.

Minipiglerde RPE'nin taşıyıcı üzerine subretinal implantasyonu: Preoperatif preparatlar, cerrahi teknikler ve postoperatif bakım için kılavuzlar

Bu protokol, retina dejenerasyonu olan veya olmayan fare alıcılarında düşük cerrahi komplikasyon oranıyla subretinal hücresel greftleri güvenli ve hassas bir şekilde vermek için transpupiller görme kılavuzluğunda trans-skleral bir yaklaşım sunar.

Retinal Dejenerasyon Fare Modelinde Subretinal Greftlerin Transpupiller Kılavuzluğunda Transskleral Transplantasyonu

Kriyoprezervasyon sonrası hESC kaynaklı fotoreseptör progenitör hücrelerin hazırlanması ve bu hücrelerin rd10 farelerde retina altı verilmesi için ayrıntılı bir protokol tanımladık.

Rd10 Farelerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Fotoreseptör Progenitörlerinin Sub-Retinal Verilmesi

Bu makale, hem enjeksiyon bölgesini hem de retina dekolmanı alanını kontrol etmek için intraoperatif görselleştirmeyi kullanan sıçanlarda subretinal enjeksiyon yöntemlerini açıklamaktadır.

Sıçanlarda Subretinal Enjeksiyon ve Retina Dekolmanı İntraoperatif Görselleştirmesi

Subretinal enjeksiyonlar, fotoreseptör ve RPE hastalıkları için terapötiklerin klinik öncesi gelişimi için vazgeçilmez bir tekniktir. Farelerde intraoperatif başarı oranlarını artıran ve retina hasarını en aza indiren optimize edilmiş bir transskleral subretinal enjeksiyon tekniğini tanımladık.

Farede Optimize Edilmiş Minimal İnvaziv Transskleral Subretinal Enjeksiyon Tekniği

Öğrenin, kemirgenlerde subretinal RPE hücre enjeksiyonu için minimal travmalı bir yöntem. Bu teknik, retinal dejenerasyon modellerinde hücre teslimatını ve hayatta kalışını değerlendirmek için kullanılır.

Süspansiyon Retina pigment epiteli Hücreleri sunun Kemirgenler Subretinal Enjeksiyonları Sahne

Daha fazla video keşfet