Mikroglia ve nöronlar için örnek Boyama: Cryosectioned Rat Beyin Dokusu Üzerine İmmünohistokimya için Astar

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ilgilenilen proteinleri görselleştirmek için immünohistokimya kullanmaktır. Bu örnekte, mikroglial hücreler için IBA1 ve nöronlar için pan-nöronal belirteçler kullanılmıştır. Bu işlem, öncelikle spesifik olmayan bağlanmayı önlemek amacıyla hazırlanan kesitlerin bir bloklama çözeltisine yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir.

İkinci bir adım olarak, ilgilenilen iki farklı proteini tanıyan antikorlar kesitlerin üzerine gece boyunca uygulanır. Ardından kesitler yıkanır ve primer antikorlara floresan etiketler eklemek amacıyla sekonder antikorlar ile inkübe edilir. Çift etiketleme sonuçları, nöron alanları içindeki mikroglial boyamaları ortaya çıkarabilir.

Genellikle, bu tekniğe yeni başlayan kişiler, ayarlanması gereken çok fazla değişken olduğu için başlangıçta zorlanırlar. Bu tekniği bugün, laboratuvarımızda lisans öğrencisi olan Hazel May uygulamalı olarak gösterecektir. Başlamak için, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde kemirgen beyinlerini dikkatlice fikse edin ve kesitler alın, ardından ihtiyaç duyulana kadar negatif 80 °C'de dikkatlice saklayın.

Protokole devam etmeye hazır olduğunuzda, lamları dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün. Çözüldükten sonra, lamları bir rafa yerleştirin ve her biri beş dakika sürecek şekilde üç kez PBS ile yıkayın. Bu noktadan itibaren, kesitlerin kurumasına izin vermeyin.

Sıvının eşit şekilde yayılmasını sağlamak ve kenar etkilerini azaltmak için lamların kenarlarını kurulayın ve pap kalemle lamın çevresine sıvı itici bir sınır oluşturun. Ardından, her lama 300 µL PBS içinde serum ekleyerek kesitleri bloke edin. Serum, sekonder antikorun üretildiği türden olmalıdır.

Bu vakada, eşek serumu kullanılmıştır. Bloklama solüsyonunun lamın kenarına kadar uzandığından ve dokuyu tamamen kapladığından emin olun. Boyamanın düzensiz olmasını önlemek için, lamları oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe etmek üzere bir nem odasına yerleştirin.

İnkübasyon sırasında, IBA1 antikorunu 1:5.000 ve pan-nöronal antikorunu 1:500 oranında %1'lik eşek serumu içeren PBS karışımı içerisinde seyrelterek primer antikorları hazırlayın. Bloklama solüsyonunu uzaklaştırın ve her iki hedef antikoru içeren 300 µL antikor solüsyonunu ekleyin. Ayrıca, üç adet kontrol lamı hazırlayın.

Bir lamın üzerine tek başına IVA seyreltisinden 300 microliters, ikinci bir lamın üzerine tek başına pan nöronal antikor seyreltisinden 300 microliters ve üçüncü bir lamın üzerine PBS içinde %1 eşek serumundan 300 microliters ekleyin. Tüm lamları bir nem odasına yerleştirin ve dört degrees Celsius'ta gece boyunca inkübe edin; ertesi sabah lamları PBS ile beşer dakikalık sürelerle üç kez yıkayın.

Her ikisini de %1'lik Donkey serum içeren PBS içinde 1/250 oranında seyrelterek floresan ikincil antikor karışımını hazırlayın. Her bir slayta Cs 300 µL karışım ekleyin ve slaytları oda sıcaklığında 60 dakika boyunca ışık geçirmeyen bir nem odasına yerleştirin. Ardından slaytları PBS ile beşer dakikalık üç yıkama işlemine tabi tutun ve son olarak çift distile su ile durulayın.

Yıkama işlemi sırasında lamları ışıktan koruyun. PBS içerisinde, floresan sinyal yoğunluğunun korunmasına yardımcı olan sulu bir montaj ortamından birkaç damla her lama ekleyin. Ardından lamı kapatın, lamel yerleştirin ve montaj ortamını lamlara sabitlemek ve kesitlerin kurumasını önlemek için pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak kalan tüm hava kabarcıklarını giderin.

Kenarları oje ile kaplayın. Lamlar, folyoya sarılıp dört derece santigrat sıcaklıkta ışık geçirmeyen bir kapta saklanmadan önce, ışık korumalı bir kutuda bir saat boyunca düz bir şekilde kurumaya bırakılır. Oje kuruduktan sonra, görüntüleme için lamları mikroskop odasına getirin.

Tavan ışıklarını kapatarak ve dışarıdan gelen diğer tüm ışık kaynaklarını engelleyerek odayı hazırlayın. Mikroskobu, floresan ışık kaynağını ve görüntüleme bilgisayarını açın. Ardından, mikroskop tablasına bir lam yerleştirin ve odağı ayarlayın.

Eşlik eden yazılımı kullanarak her dalga boyu için pozlama süresini ayrı ayrı ayarlayın. Numunenin fotobeyazlamasını (photobleaching) önlemek için slaytın uzun süre ışığa aşırı maruz kalmasından kaçının. Ardından, kesiti hareket ettirmeden veya odağı ayarlamadan her kanalda görüntüler elde edin.

Görüntüleme yazılımını kullanarak görüntüleri birleştirin ve daha sonraki görüntü analizi için kaydedin. Az önce açıklanan boyama protokolü kullanılarak, burada gösterilenlere benzer floresan görüntüler kolayca elde edilebilir; kırmızı kanalda IBA one pozitif mikroglialar net bir şekilde görülür ve yeşil kanalda pan nöronal pozitif nöronlar arka planın üzerinde belirginleşir. Her iki antikor boyaması için kontrol görüntüleri yer almaktadır.

Burada gösterilen IBA one ve pan nöronal belirteç ile yapılan karanlık çift etiketleme, kortikal katmanlar boyunca belirgin, uzun ve ince nöronal projeksiyonlara sahip çoğunlukla ramifiye mikrogliaları göstermektedir. Burada gösterilenlere benzer boyama sonuçları, doku kalitesinin düşük olması durumunda da ortaya çıkabilir. Düşük doku kalitesi, net bir şekilde tanımlanmış hücre gövdelerinin eksikliği ile fragmante olmuş mikroglial ve nöronal proseslerle kendini belli eder.

Mikroglial boyamanın net olmaması ve nöronal boyamanın tamamen eksik olması, bu tekniği denerken üst üste bindirilmiş görüntünün anlamlı olmamasına neden olur. Kesitlerin eşit şekilde kaplandığından emin olmak ve adımlar arasında kurumalarına izin vermemek önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, giriş düzeyindeki immünohistokimyasal teknikler hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.