Name: Mikroglia ve nöronlar için örnek Boyama: Cryosectioned Rat Beyin Dokusu Üzerine İmmünohistokimya için Astar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Öğrenin, sıçan beyin dokusunda mikroglia ve nöronları immünohistokimya ile çift etiketleme yöntemini. Bu protokol, hücresel etkileşimleri görselleştirmek için tekrarlanabilir bir teknik sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu iletişim hakkındaki paha biçilmez geri bildirimleri için Bay Ryan Hart ve Bay Arriz Lucas'a teşekkür eder. Bu çalışma NIH NINDS R01 NS065052 ve Phoenix Çocuk Hastanesi Görev Destek Fonları tarafından desteklenmiştir.

NOT: Tüm işlemler Arizona Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) uygun olarak yürütülmüştür. Tavsiye malzeme ve ekipman listesi Tablo 1&#39;de bulunabilir. 1. Doku Hazırlanması <ol><li> Serpilme <ol><li> Sodyum pentobarbital (25 mg / kg, ip) bir fazla dozu ile kemirgen Euthanize ve 8 ml / dk&#39;lık bir akış hızında tam kandan arındırıldı (3-5 dakika kadar) fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile transkardiyal serpmek. Derinlemesine perfüzyon talimatlar için Gage ve ark 2012 9 bkz. </li><li> Hemen / dak, 8 ml bir akış hızında 15-20 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit ile perfüze doku çözmek PBS gömme et. </li><li> 4 ° C &#39;de, (tris tamponlu salin içinde hazırlanan sırayla% 15,% 30,% 30) kademeli sakaroz çözeltileri, ardından 24 saat için% 4 paraformaldehid beyin ve yer çıkarın. Sonraki sakaroz çözüm o beyin aktarınnly beynin sonra her çözeltide batırdı. Not: Genellikle, her çözümün 5 gün doku batmaya için yeterli bir süredir. </li></ol></li><li> Doku Dondurma ve Cryosectioning <ol><li> Örneğin Ekim bileşiği olarak, gömme orta beyin yerleştirin ve -35 ° C arasında bir sıcaklıkta, izopentan içinde daldırın. Beyin, 10 dakika içinde en az dondurma, ve daha sonra -80 ° C&#39;de saklayın izin verin. Sıcaklık titizlik alınmadığı takdirde sorunlar ortaya çıkabilir; sorun giderme bilgileri için tartışma bakınız. </li><li> 20 um kadar bir kalınlıkta ve -20 ° C arasında bir sıcaklıkta bir seri koronal kesitler halinde kesilmiştir. Pozitif yüklü slaytlar üzerine doku toplayın. Beyin kesitleri, -80 ° C&#39;de, bir fermuar-top çantası ve depolanmış uzun vadede folyo ile sarılmış bir slayt kutuya yerleştirilmiş olabilir. Depolama Bu yöntem hava ve dona maruz kalmasını önlemek için bir çift sınır oluşturur. </li></ol></li></ol> 2. Doku İşleme NOT: Örnek ekipman ve materyaller rboyama için equired Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Alternatifleri mevcut, ancak bu görüntülerin immünohistokimyasal yeni başlayanlar ön alım için uygun öğeleri görselleştirmek için yardımcı olacaktır. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52293/52293fig3highres.jpg" /> Şekil 3: Örnek öğeler immünohistokimyasal için gerekli (A) gösterilen siyah kutu immünofloresan için ideal bir nem odası olan, slaytlar folyo kutuyu sarmak için gerek kalmadan ışıktan korunmalıdır gibidir.. Kesit sonrasında slaytlar, örneğin (B) &#39;de gösterildiği san bir kutu gibi bir kutu içinde depolanabilir. Folyo sıkıca kutuyu tamamlayan ve önceki dondurucu bir zip-top çantası yerleştirerek dondurucu yanık doku örnekleri korunmasına yardımcı olur. Slaytlar bir örneği D (çeşitli boyama (D) &#39;de gösterilen yemekler ile (C)&#39; de verilmektedir </strong&gt;). Lameller ancak 1.2 kalınlığında lamelleri en dik ve konfokal mikroskoplar güzel görüntüleme sonuçlarını sağlamak, büyüklük ve kalınlıkta (F) değişebilir. Örneğin (G) &#39;de gösterildiği gibi bir kalem slaytlar etiketlemek için kullanılabilir. Mürekkep çalıştırabilirsiniz gibi kalıcı belirteçler boyama ve örnek ne olduğunu belirlemek için yeteneği hem etkileyen, kaçınılmalıdır. (H) &#39;de gösterildiği gibi bir Mini PAP kalemi bir itici sınır slaytlar üzerine çekilmesini mümkün kılar. <ol><li> Slayt hazırlama <ol><li> Oda sıcaklığında dondurucu ve çözülme slaytları çıkarın. <ol><li> İsteğe bağlı: bölümler, daha önce slaytlar süzülüyor varsa, slaytlar rahatsız yüzen doku kesitleri önlemeye yardımcı olmak için en fazla 4 saat süre ile 60 ° C&#39;de bir fırın içinde çözülmüş slaytlar yerleştirin. </li></ol></li><li> Bir slayt raf ve ilgili tabak yerleştirin kayar. </li><li> Yıkama yıkamalar arasında çözelti, değişen her biri 5 dakika süreyle PBS içinde üç kez kayar. Ileriye Bu adımdan itibaren, secti önlemekons uzun bir süre için sıvı olmadan. Not: bölümler kurumasına, arka plan boyama artar ve anlamlı veriler güvenilir elde edilemez. </li></ol></li><li> Doku Boyama <ol><li> Bir ışık geçirmez boyama kutusunda, iyonu giderilmiş su ile ıslatılmış tüysüz bir doku ile bir &quot;nem odası&quot; oluşturur. </li><li> Uzak doku kesitlerinden, slayt çok kenarında bir sıvı itici sınır yapmak için mini bir pap kalem kullanın, tüysüz bir doku ile slayt kenarlarını kurutun. Bu sınır sıvı menisküs ve yüzey gerilimi boyama etkilemez, böylece doku kenarı arasında geniş bir alan temin etmelidir. Not: ilgi antikorlar mikrodalga antijen alımı gerektirmeyen, PAP kalem kovucu sınır önce 2.1.3 uygulanabilir. PAP kalem PBS içinde yıkama öncesi uygulanmış ise, sıvı itici sınır bütünlüğü bu aşamada kontrol edilmelidir. Sınırda herhangi boşlukları doldurmak için bir mini-pap kalem kullanın. </li><liSlaytlar yatay olarak yerleştirilmiş ile&gt;, blok nonspesifik antijen PBS (blok çözeltisi) içinde% 4 h / h serumu içinde inkübe edilerek bağlama. Pipet oda sıcaklığında 1 saat için slayt başına blok çözeltisi 300 ul. Emin blok çözüm slayt kenarında pap kalem uzanır ve tamamen dokuya yakın yüzey gerilimi nedeniyle düzensiz boyama önlemek için doku kapsar emin olun. <ol><li> İkincil antikor yapıldığı aynı türden serum kullanın. Not: Bu prosedürde, ikincil antikorlar eşek yapılır, ve bu nedenle eşek serumu kullanılmıştır. İki veya daha fazla farklı türlerden ikincil antikorlar kullanıldığında, her türden serum içerir. </li></ol></li><li> Slaytlarınıza Pipet primer antikor. Not: Bu boyama için antikor konsantrasyonları 1&#39;den optimize edilmiştir: 5,000 ve 1: sırasıyla Iba1 ve Pan-nöronal 500. Bu konsantrasyonlar, bir arka plan boyama yokluğu ile anlamlı bir lekeleme göstermek için tespit edilmiştir. <ol><li> Blok çözümü sulandırmak% 1 PBS içinde serum ve primer antikor ilave edin. Slayt başına% 1 serum içinde primer antikor çözeltisi 300 ul Pipet. Yine, sıvı pap kalem kenarına olduğundan emin olun. 4 ° C &#39;de bir gece boyunca inkübe edin. </li><li> Iba1 ne Pan-nöronal ne antikorları içeren bir Pan-nöronal antikor olmadan Iba1 ile bir ve Iba1 olmadan Pan-nöronal antikor: biri üç kontrol slaytlar ekleyin. Bununla birlikte, ikincil antikor, spesifik olmayan bağlanmanın test etmek için, birincil antikor ihmal aynı çözeltiler için de aynı vadede bu slaytlar Leke. </li></ol></li><li> Ertesi sabah, yıkama yıkamalar arasında solüsyonu değişen her biri 5 dakika süreyle PBS içinde üç kez kayar. </li><li> Floresan antikorlar ileri bu adımı, siyah veya karanlıkta inkübe ya olan yıkama kapları folyo ve melezleme kutularında sarılır sağlayarak ışık maruziyeti en aza indirmek, bu nedenle, ışığa duyarlı bulunmaktadır. Tüm slaytlarda uygun ikincil antikorlar pipet ve inkübe1 bir konsantrasyonda, oda sıcaklığında 60 dakika: blok çözeltisi içinde 250, bir ışık geçirmez &quot;nem odası&quot; (aşama 2.2.3) (adım 2.2.1). <ol><li> Farklı dalga boyları ikincil antikorlar kullanın. Burada, birincil antikor tavşan anti-Iba1 için uygun ikincil antikor olarak eşek anti tavşan 594 kullanın. Birincil antikor fare anti-pan-nöronal için, ilgili ikinci antikor olarak eşek anti-fare 488 kullanır. Alternatif olarak, anti-tavşan 488 ve anti-fare 594 kullanır. </li></ol></li><li> Yıkama her biri 5 dakika süreyle PBS içinde üç kez kayar. </li><li> İsteğe bağlı: Nükleer boyama gerçekleştirin. <ol><li> Tam olarak 60 saniye boyunca iki kez damıtılmış H 2 0 içinde 0.03 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyonda, Hoechst (ya da diğer nükleer leke)&#39; de yer. </li><li> Yıkama her biri 5 dakika süreyle PBS içinde üç kez kayar. </li></ol></li><li> GKD 2 0 yıkayın. </li></ol></li><li> Coverslipping <ol><li> Böyle Fluor gibi sulu montaj orta ile lamel slaytlar,omount-G ya da ProlongGold. Bir pamuk uçlu aplikatör kullanarak tüm kabarcıklarını çıkarmak için özen gösterin. Not: Diğer montaj ajanlar kullanılabilir, ancak yüksek sızdırma-yoluyla boyalar arasındaki coverslipping gün içinde bazıları tarafından not edilmiştir. </li><li> , Kenarları mühür açık oje kullanın buharlaşma nedeniyle kurumasını engelleyen bölümleri. Slaytlar düz ve oda sıcaklığında devam ederken tırnak cilası bir ışık geçirmez bir kap içinde kurumasını bekleyin ve daha sonra 4 ° C&#39;de folyo ile sarılmış bir ışık geçirmez bir kapta saklayın. </li></ol></li></ol> 3. Lekeli Doku Görüntüleme <ol><li> Mikroskopla inceleme <ol><li> Oje karanlık bir odada yer alması gereken, mikroskopi başlamadan önce en az bir saat kurumasını bekleyin. </li><li> Floresan ışık kaynağı ve bir dijital kamera eki olan bir konfokal veya araştırma mikroskobu kullanılarak fotomikrografları edinin. Ekteki yazılımı kullanarak, her dalga boyu için pozu ayarlamak - 405, 488, ve 594 - ayrı. Not: derinlemesine görüntüleme talimatları mikroskop üreticisinden online olmalıdır. </li><li> Bölümleri hareketli ya da odak ayarlama yapmadan her kanalda fotomikrografları edinin. Renkli fotoğraf çekmek, ya da dönüşümlü olarak gri tonlu ve daha sonra renk dönüştürmek. Not: Renk veya her kanaldan gri tonlu görüntüleri sonrası işleme harmanlanmış edilebilir. </li><li> Kesitlerin fotoğraf beyazlatma oluşacak şekilde, doku kesitleri uzun süre için ortam ışığı veya mikroskopik ışığa maruz kalmayacağı emin olun. Bunu önlemek için, artan ışık / lazer yoğunluğu yerine pozlama süresini artırın. </li><li> Açıldıktan 30 dakika içinde floresan ışık kaynağı kapatmayın. Not: hızlı bir şekilde açık ve kapalı kaynak geçiş floresan ampul ömrünü azaltabilir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Marrack, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+antigens+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemistry of antigens and antibodies.</a> Nature. 134, 468-469 (1934).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> J Immunol. 45, 159-170 (1942).</li>
<li>Marshall, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+adrenocorticotropic+hormone+by+histochemical+and+immunochemical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods.</a> The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).</li>
<li>Mellors, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+demonstration+of+the+in+vivo+localization+of+antibodies%3A+antigenic+components+of+the+kidney+and+the+pathogenesis+of+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).</li>
<li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-labeled+antibodies%3A+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).</li>
<li>Avrameas, S., Uriel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+antigen+and+antibody+labelling+with+enzymes+and+its+immunodiffusion+application%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+rendus+hebdomadaires+des+seances+de+l%27Academie+des+sciences.+Serie+D%3A+Sciences+naturelles%22%5BJournal%5D)">Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application.</a> Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).</li>
<li>Cuello, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCuello%2C+AC+%22Immunohistochemistry%22">Immunohistochemistry</a>. , Wiley. (1983).</li>
<li>Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJunqueira%2C+LCU+%22Junqueira%27s+basic+histology+%3A+text+and+atlas%22">Junqueira's basic histology : text and atlas</a>. , Thirteenth edition / edn, (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li>
<li>Christensen, N. K., Winther, L. Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. Kumar, G. L., Rudbeck, L. , DAKO North America. Carpinteria, California. 103-108 (2009).</li>
<li>Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyramide+signal+amplification+method+in+multiple-label+immunofluorescence+confocal+microscopy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy).</a> Methods. 18, 459-464 (1999).</li>
<li>Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+sections+of+70-100+mum%3A+a+novel+technique+and+its+benefits+for+studying+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system.</a> Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu iletişimin genel amacı okuyucuya immünhistokimya prosedürleri tanıtmak oldu. Bunun için, Iba1 ve Pan-nöronal antijenler ile çift etiketleme örneği mikroglia ve perfüze paraformaldehid nöronlar gözlemlemek, sükroz cryoprotected cryosectioned sıçan beyin kullanıldı. Bu teknik, sonsuz amaçlara hizmet etmek için adapte edilebilir. Beyin, akciğer, karaciğer, böbrek ve bağırsak sınırlayıcı gibi, ancak doku tiplerinin, çeşitli farklı antijenlerin dizisi protokolü küçük ayarlamalar ile immünohist...

<html> İmmünohistokimya ilgi antijenlere spesifik olarak bağlanan primer antikorlar kullanılarak, doku kesitlerinde antijenleri (örneğin, proteinler) tespit edilmesi için bir işlemdir. O antikorlar Büyük özgüllük 1 antijenleri lokalize olabilir tespit zaman İmmünohistokimya 1934 yılında JR Marrack öncülük ettiler. 1942 yılında başlayarak, immunohistokimyasal görselleştirmek için floresan antikorlar kullanılarak çalışmalar in vitro ilk bazı in vivo histokimyasal çalışmada ilk 4 basıldı sonra 2,3, yayınlandı. 1960 &#39;li yıllarda, üç yıl immünohistokimyasal yöntemleri süre sonra, bir enzim-konjüge edilmiş antikor, ikincil reaktifler olarak kullanılmaya başlanmıştır. Bu yöntemler aynı anda ve birbirinden bağımsız Fransa ve ABD&#39;de 5,6 geliştirilmiştir. Bugün, antikorların geniş bir dizi immunohistokimya çalışmaları 7 için sonsuz olanaklar sağlar. &quot;&gt; Bu yazışmaların genel amacı immünohistokimyasal içine kısa bir tanıtım sağlamak, bu tekniğin kapsamlı ve ayrıntılı bir yorum olması anlamına gelmez özetlenen yöntemde, iki antijen için immünohistokimyasal teknikler mikroglia için (işaretçileri sunulmuş ve. perfüze paraformaldehit boyama nöronlar), sukroz cryoprotected cryosectioned sıçan beyni. immünohistokimyasal boyama, arka plan boyama azaltmak için spesifik olmayan antijen bloke ile başlar. Daha sonra, birincil antikor ile inkübasyon dokusunda özel bir antijene bağlanma sağlar. birincil antikor izlenerek, başka bir antikor, ikincil antikor olarak adlandırılan, bir konjüge görselleştirme sinyali 8 birincil antikor bağlantı uygulanır. ikincil antikor birincil antikora yükseltilmiş olan türlere özgü immünoglobulin G (IgG) alanı hedef alır. sekonder antikor sinyali güçlendirir Primer antikor t Fab bölgelerinde beriPrimer antikor IgG etki alanında birden fazla site için elinden ikincil antikor bağlama. Her iki durumda da, ikincil antikorun Fc bölgelerine konjüge enzimler ya da floresan moleküller görselleştirme sağlar. Örneğin, bir tavşan anti-Iba1 birincil antikor Iba1 için spesifik bir tavşan IgG molekülüdür. Eşek anti-tavşan IgG ikincil antikor olarak tatbik edildiği zaman, bu tanıma ve tavşan anti-Iba1 IgG birden fazla bölgeye (bakınız Şekil 1) bağlanacaktır. eşek antikor çeşitli yöntemlerle görülebilir. Bu yazışmalar floresan mikroskobu ile görselleştirme, primer antikor tanıyan sekonder antikor, konjuge bir floroforun tespiti üzerinde duruluyor. Floresan immünohistokimya, bu tür ajanlar Hoechst veya DAPI gibi bir nükleer boya bütün çekirdeklerinde görselleştirmek için kullanılabilmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig1highres.jpg" /> Şekil 1: SchDoğrudan ve dolaylı antikor etiketleme tekniklerinin ematic temsili. Antikorlar, ilgi alanındaki antijene bağlanan ve birincil antikor türleri karşı artan sekonder antikor ile amplifiye edilebilir. Bu teknik, görselleştirme (A) için amplifikasyon ve DAB için avidin-biyotin kompleksi (ABC) kullanılarak gerçekleştirilmiştir, ya da doğrudan konjüge edilmiş floresan ikincil antikor (B). Alternatif olarak, birincil antikorlar doğrudan biyotin veya bir fluorofor (C) dahil olmak üzere birçok farklı etiketler, konjuge edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> (DAB; Şekiller 1 ve 2), immünohistokimyasal görselleştirilmesi için alternatif bir yöntem, 3,3&#39;-diaminobenzidin tetrahidroklorür kullanır. Bu, bir biyotinile kullanılarak fluoresans farklıdır veyaparlak alan mikroskopisi altında algılanabilen bir çökelti DAB dönüştürmek için bir enzim içerir bayırturpu peroksidaz (HRP) konjüge edilmiş ikincil bir antikor. Tek bir antijen ilgi ya da boyama uzun ömürlü olması için gerekli olan durumlarda, DAB floresan boyama daha uygun olabilir. Bununla birlikte, DAB boyama iki nükleer antijen ilgi, özellikle, birden fazla belirteçleri arasında farklılaşması için çok uygundur değildir. DAB malzemeleri ve protokol değişiklikler hakkında bilgi için, Tablo 1 bakınız. Alternatif olarak, nitro mavi tetrazolyum klorür / 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (NBT / BCIP) orta konjüge bir alkalin fosfataz (AP) görselleştirmek için kullanılabilmektedir antikordur. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52293/52293fig2highres.jpg" /> Şekil 2:. Nikel geliştirilmiş DAB tek etiketli sıçan beyin dokusu kesitlerinin Temsilcisi görüntüleri Sıçan beyin seTek başına mikroglia veya nöronların uzun süren analiz için Iba1 (A) ve Pan-nöronal (B) için nikel geliştirilmiş DAB ile etiketlenmiş olan seksiyonlar. Ölçek çubuğu 20 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Bir doku içinde ilgi antijenin tahmini bolluğu analiz ediliyor düşünmek gerekir. Dolaylı yöntemler (yukarıda anlatıldığı gibi) düşük yoğunlukta olan hedefler için yararlıdır. Ilgi, antijen yüksek bolluk olduğunda, direkt yöntemler uygulanabilir. Doğrudan yöntemler doğrudan görselleştirme sinyaline konjuge edilmiş bir birincil antikor içerir ve dolayısıyla ikincil antikor gereklidir. Bu yöntem boyama işlemini kolaylaştırır, ancak dolaylı yöntemlerle elde amplifikasyon ortadan kaldırır. Bir doğrudan konjüge edilmiş birincil antikor kullanarak da sekonder antikorların çapraz reaktivite ortadan kaldırırne zaman çift etiketleme. Bu iletişim Iba1 ve Pan-nöronal (Tablo 1 ayrıntıları) ile çift etiketleme için protokol göstermektedir. Iba1 dallanmış, hiper-dallanmış, aktif, amoeboid ve çubuk dahil olmak üzere birçok aktivasyon devletler içinde mikroglia lekeler. Pan-nöronal lekeler nöronal akson, dendrit ve soma. Iba1 çoğu mikroglia ve Pan-nöronal olası hedefler nöron leke yana, lekeleri bu kombinasyon mikroglia-nöron etkileşimleri geniş bir anlayış kazanıyor yararlıdır. Özetle, immünohistokimyasal antikorların dikkatli seçimi dayanmaktadır. Araştırma sorusu daha spesifik hale geldikçe, diğer antijenlere karşı üretilen antikorlar arzu edilebilir. Belirli bir mikrogliyal aktivasyon durumunu hedeflemek için, bir yerine Iba1 daha CD45 veya CD68 antikorları kullanmayı tercih edebilir. Dahası, fareler ile çalışma, F4 / 80 gerekli sonuçlar verebilir. Benzer şekilde, nöronal elemanlar özellikle antikorlar ra ile hedeflenebilirçekirdeğin karşı kili, sinaps (öncesi veya sonrası), akson ve büyüme konisinin. Ayrıca, nöron (Çift cortin, Neun) yaşını ayırt diğer belirteçler ve nöronal rejenerasyon (GAP-43) vardır.

<table><tbody><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Cam Kaydıraklar&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-979</td><td>Doku montajı için kullanılır (1.2.2)</td></tr><tr><td>Fırın</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028112</td><td>Doku kurutma için kullanılır (2.1.1)</td></tr><tr><td>Mini Pap kalem</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>00-8877</td><td>Adım 2.2.2'de kullanılır</td></tr><tr><td>Andwin Scientific Tissue-tek Slayt Boyama Kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-149-429</td><td>Boyama sırasındaki tüm yıkamalar (2.2) ve Hoechst adımı (2.2.8) için kullanılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td>Slaytları kurutmak için kullanılır (2.2)</td></tr><tr><td>Siyah Boyama Kutusu</td><td>Ted Pella</td><td>21050</td><td>Engelleme ve boyama adımları için kullanılır (2.2)</td></tr><tr><td>Normal Eşek Serumu</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-413-253</td><td>Blok ve antikor inkübasyonu için kullanılır (2.2)</td></tr><tr><td>Fare &alfa;-Pan-nöronal</td><td>Millipore</td><td>MAB2300</td><td>Primer antikor için kullanılır (2.2.4)</td></tr><tr><td>Tavşan &alpha;-Iba1</td><td>Wako Chemical</td><td>019-19741</td><td>Primer antikor (2.2.4)</td></tr><tr><td>Eşek &alpha;-rabbit için kullanılır 594</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-585-152</td><td>İkincil antikor (2.2.6)</td></tr><tr><td>Donkey &alpha;-mouse için kullanılır 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-150</td><td>İkincil antikor için kullanılır (2.2.6)</td></tr><tr><td>Caterer folyosu</td><td>Herhangi bir</td><td>N/A</td><td>Adım 1.2.2 ve 2.3.2'de kullanılır</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Lamel için kullanılır (2.2.8)</td></tr><tr><td>Lameller</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>Lamel için kullanılır (2.2.8)</td></tr><tr><td>Şeffaf Oje&nbsp;</td><td>Lamele için kullanılan herhangi bir</td><td>N/A</td><td>(2.2.8)</td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 ve LSM 710 (lazer tarama, konfokal)</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Görüntüleme için kullanılır (3)</td></tr><tr><td>Axioskop A2</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Görüntüleme için kullanılır (3)</td></tr><tr><td>CitriSolv&nbsp;</td><td>DAB protokolü için</td> <td>FisherScientific</td><td></td></tr><tr><td>ABC</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>PK-6100</td><td>DAB protokolü için</td></tr><tr><td>DAB Peroksidaz kiti</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>SK-4100</td><td>DAB protokolü için</td></tr><tr><td>Biyotinile at ve alfa;-tavşan IgG Vektör Laboratuvarları</td><td></td><td>BA-1100</td><td>DAB protokolü için</td></tr><tr><td>Biyotinile at ve alfa;-fare IgG</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>BA-2001</td><td>DAB protokolü için</td></tr><tr><td>%30 Hidrojen Peroksit</td><td>FisherScientific</td><td>H325-500</td><td>DAB protokolü için</td></tr><tr><td>Wheaton sürgülü raflar ve boyama kapları</td><td>için TedPella</td><td>21043</td><td>DAB protokolü için</td></tr><tr><td>Masterflex perfüzyon pompası ve hortumu</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>Perfüzyon için kullanılır (1.1.1 ve 1.1.2)</td></tr><tr><td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT bileşiği (12'li durum)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td>Doku dondurma için kullanılır (1.2.1)</td></tr><tr><td>Termometre (-50 ila 50 C)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-059-228</td><td>Doku dondurma için kullanılır (1.2.1)</td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica&nbsp;</td><td>CM3500S</td><td>Doku kesiti için kullanılır (1.2.2)</td></tr><tr><td>Boyama Kabı, 2 Kapaklı Plastik</td><td>Grale Scientific</td><td>353</td><td>Antijen retrival</td></tr><tr><td>için 20 Yer Boyama Rafı, Slaytlar Yatay Grale</td><td>Scientific</td><td>354</td><td>Antijen retrival için</td></tr><tr><td>Mikrodalga</td><td>Antijen retrival için</td> <td>Herhangi bir</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

mikroglia ve nöronlar için örnek boyama: cryosectioned rat beyin dokusu Üzerine İmmünohistokimya için astar

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

İmmünohistokimya yerinde antijenlerin varlığı, konumu ve göreceli bolluk tespiti için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu giriş seviyesi protokol mikroglia ve bir örnek olarak nöronal elemanlar için işaretlerini kullanarak, reaktifler, ekipman, ve kemirgen beyin dokusunun immünohistokimyasal boyama tamamlamak için gerekli teknikler anlatılmaktadır. Özellikle, bu kağıt sırasıyla Iba1 ve Pan-nöronal için immünohistokimya yoluyla mikroglia ve nöronların floresan görselleştirme için bir adım-adım protokoldür. Floresans çift etiketleme doğru hücre tipleri, reseptörler, ligand arasındaki etkileşimi gözlemlemek için bir fırsat sağlamaktadır, aynı numune içinde birden fazla protein lokalizasyonu için özellikle yararlı olduğu ve / veya bir başka yanı sıra protein ko- göre hücre dışı matris Tek bir hücrenin içinde yerelleştirme. Diğer görselleştirme teknikleri aksine, floresan immünohistokimyası boyama yoğunluğu azalabilirUygun önlemler alınmazsa, lekelenmeye önümüzdeki aylarda hafta. Floresan kez daha etkilidir ve iki ya da daha fazlası arasında daha kesin bir ayrım yapmaya imkan tanımaktadır Bu sınırlama rağmen, pek çok uygulamada floresans çift etiketleme, örneğin 3,3&#39;-diaminobenzidin tetrahidroklorid (DAB) veya alkalin fosfataz (AP) gibi alternatifler tercih edilir belirteçler. Tartışma sorun giderme ipuçları ve başarıyı teşvik etmek için tavsiyeler içerir.

Bu boyama protokolü mikrogliya floresan 594 kanal (kırmızı) etiketli olan sıçan beyin dokusu kesitlerinde sonuçları ve 488 kanal etiketli nöronlar (yeşil, Şekil 4). Nükleer leke yapılmış ise, 405 kanalın (mavi) gösterilecektir. Çıkan farklı kanallar içine alınır ve üç kanalın doğrudan bir karşılaştırma için kaplanmış, ya da herhangi bir, iki kanal arasında olabilir. Birçok dijital kazanım yazılım suit, bu işlevselliği içerir. Burada gösterilen Iba1 ve Pan-nöronal işaretleyici ile çift etiketleme kortika...

Bu giriş seviyesi protokolü, örnek olarak mikroglia ve nöronal elementler için belirteçler kullanarak, kemirgen beyinlerinin immünohistokimyasal boyamasını tamamlamak için gereken reaktifleri, ekipmanı ve teknikleri açıklar.

Mikroglia ve nöronlar için örnek Boyama: Cryosectioned Rat Beyin Dokusu Üzerine İmmünohistokimya için Astar

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ilgilenilen proteinleri görselleştirmek için immünohistokimya kullanmaktır. Bu örnekte, mikroglial hücreler için IBA1 ve nöronlar için pan-nöronal belirteçler kullanılmıştır. Bu işlem, öncelikle spesifik olmayan bağlanmayı önlemek amacıyla hazırlanan kesitlerin bir bloklama çözeltisine yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir.İkinci bir adım olarak, ilgilenilen iki farklı proteini tanıyan antikorlar kesitlerin üzerine gece boyunca uygulanır. Ardından kesitler yıkanır ve primer antikorlara floresan etiketler eklemek amacıyla sekonder antikorlar ile inkübe edilir. Çift etiketleme sonuçları, nöron alanları içindeki mikroglial boyamaları ortaya çıkarabilir.Genellikle, bu tekniğe yeni başlayan kişiler, ayarlanması gereken çok fazla değişken olduğu için başlangıçta zorlanırlar. Bu tekniği bugün, laboratuvarımızda lisans öğrencisi olan Hazel May uygulamalı olarak gösterecektir. Başlamak için, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde kemirgen beyinlerini dikkatlice fikse edin ve kesitler alın, ardından ihtiyaç duyulana kadar negatif 80 °C'de dikkatlice saklayın.Protokole devam etmeye hazır olduğunuzda, lamları dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün. Çözüldükten sonra, lamları bir rafa yerleştirin ve her biri beş dakika sürecek şekilde üç kez PBS ile yıkayın. Bu noktadan itibaren, kesitlerin kurumasına izin vermeyin.Sıvının eşit şekilde yayılmasını sağlamak ve kenar etkilerini azaltmak için lamların kenarlarını kurulayın ve pap kalemle lamın çevresine sıvı itici bir sınır oluşturun. Ardından, her lama 300 µL PBS içinde serum ekleyerek kesitleri bloke edin. Serum, sekonder antikorun üretildiği türden olmalıdır.Bu vakada, eşek serumu kullanılmıştır. Bloklama solüsyonunun lamın kenarına kadar uzandığından ve dokuyu tamamen kapladığından emin olun. Boyamanın düzensiz olmasını önlemek için, lamları oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe etmek üzere bir nem odasına yerleştirin.İnkübasyon sırasında, IBA1 antikorunu 1:5.000 ve pan-nöronal antikorunu 1:500 oranında %1'lik eşek serumu içeren PBS karışımı içerisinde seyrelterek primer antikorları hazırlayın. Bloklama solüsyonunu uzaklaştırın ve her iki hedef antikoru içeren 300 µL antikor solüsyonunu ekleyin. Ayrıca, üç adet kontrol lamı hazırlayın.Bir lamın üzerine tek başına IVA seyreltisinden 300 microliters, ikinci bir lamın üzerine tek başına pan nöronal antikor seyreltisinden 300 microliters ve üçüncü bir lamın üzerine PBS içinde %1 eşek serumundan 300 microliters ekleyin. Tüm lamları bir nem odasına yerleştirin ve dört degrees Celsius'ta gece boyunca inkübe edin; ertesi sabah lamları PBS ile beşer dakikalık sürelerle üç kez yıkayın.Her ikisini de %1'lik Donkey serum içeren PBS içinde 1/250 oranında seyrelterek floresan ikincil antikor karışımını hazırlayın. Her bir slayta Cs 300 µL karışım ekleyin ve slaytları oda sıcaklığında 60 dakika boyunca ışık geçirmeyen bir nem odasına yerleştirin. Ardından slaytları PBS ile beşer dakikalık üç yıkama işlemine tabi tutun ve son olarak çift distile su ile durulayın.Yıkama işlemi sırasında lamları ışıktan koruyun. PBS içerisinde, floresan sinyal yoğunluğunun korunmasına yardımcı olan sulu bir montaj ortamından birkaç damla her lama ekleyin. Ardından lamı kapatın, lamel yerleştirin ve montaj ortamını lamlara sabitlemek ve kesitlerin kurumasını önlemek için pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak kalan tüm hava kabarcıklarını giderin.Kenarları oje ile kaplayın. Lamlar, folyoya sarılıp dört derece santigrat sıcaklıkta ışık geçirmeyen bir kapta saklanmadan önce, ışık korumalı bir kutuda bir saat boyunca düz bir şekilde kurumaya bırakılır. Oje kuruduktan sonra, görüntüleme için lamları mikroskop odasına getirin.Tavan ışıklarını kapatarak ve dışarıdan gelen diğer tüm ışık kaynaklarını engelleyerek odayı hazırlayın. Mikroskobu, floresan ışık kaynağını ve görüntüleme bilgisayarını açın. Ardından, mikroskop tablasına bir lam yerleştirin ve odağı ayarlayın.Eşlik eden yazılımı kullanarak her dalga boyu için pozlama süresini ayrı ayrı ayarlayın. Numunenin fotobeyazlamasını (photobleaching) önlemek için slaytın uzun süre ışığa aşırı maruz kalmasından kaçının. Ardından, kesiti hareket ettirmeden veya odağı ayarlamadan her kanalda görüntüler elde edin.Görüntüleme yazılımını kullanarak görüntüleri birleştirin ve daha sonraki görüntü analizi için kaydedin. Az önce açıklanan boyama protokolü kullanılarak, burada gösterilenlere benzer floresan görüntüler kolayca elde edilebilir; kırmızı kanalda IBA one pozitif mikroglialar net bir şekilde görülür ve yeşil kanalda pan nöronal pozitif nöronlar arka planın üzerinde belirginleşir. Her iki antikor boyaması için kontrol görüntüleri yer almaktadır.Burada gösterilen IBA one ve pan nöronal belirteç ile yapılan karanlık çift etiketleme, kortikal katmanlar boyunca belirgin, uzun ve ince nöronal projeksiyonlara sahip çoğunlukla ramifiye mikrogliaları göstermektedir. Burada gösterilenlere benzer boyama sonuçları, doku kalitesinin düşük olması durumunda da ortaya çıkabilir. Düşük doku kalitesi, net bir şekilde tanımlanmış hücre gövdelerinin eksikliği ile fragmante olmuş mikroglial ve nöronal proseslerle kendini belli eder.Mikroglial boyamanın net olmaması ve nöronal boyamanın tamamen eksik olması, bu tekniği denerken üst üste bindirilmiş görüntünün anlamlı olmamasına neden olur. Kesitlerin eşit şekilde kaplandığından emin olmak ve adımlar arasında kurumalarına izin vermemek önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, giriş düzeyindeki immünohistokimyasal teknikler hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

primer-for-immunohistochemistry-on-cryosectioned-rat-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, bir sıçan hipokampal bölümünde biyositin dolu bir internöronun görselleştirilmesi sürecini göstermekte ve spesifik antikorlar ve floresan mikroskobu kullanılarak nörokimyasal kimliğini vurgulamaktadır.

Sıçan hipokampal bölümünde internöronların immün boyanması

Bu video, birincil ve ikincil antikorlar kullanılarak floresan olarak işaretlenmiş astrositlerle sabit bir fare beyin dokusu bölümünün immün boyama prosedürünü gösterir ve konfokal mikroskopi yoluyla lekeli astrositlerin görüntülerini yakalar.

Bir Fare Beyin Dokusu Bölümünde Floresan Etiketli Astrositlerin İmmün Boyanması

Kaynak: Evilsizor, M. N., et. al., Kriyoseksiyonlu Sıçan Beyin Dokusunda İmmünohistokimya için Primer: Mikroglia ve Nöronlar için Örnek Boyama. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, mikroglia ve nöronların mekansal düzenlemesini görselleştirmek için kriyoseksiyonel sıçan beyin dokusu üzerinde adım adım bir immünohistokimya boyama prosedürünü göstermektedir.

Sıçan Koronal Doku Kriyoseksiyonlarının Mikroglia ve Nöronlar için İmmünohistokimyasal Boyanması

Biz burada, formalinle fiksasyonlu, parafine gömülü sıçan merkezi sinir sistemi (CNS) ve periferik lenf nodu (LN) doku kesitlerinde çift immün boyama için optimize edilmiş, ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler

Burada, donma ve beyin dokusu birden çok hayvanlardan tek beyin işleme için zaman kazandıran bir alternatif olarak bölüm için bir protokol mevcut. Bu immünhistokimya sırasında boyama değişkenliği azaltır ve zaman cryosectioning ve görüntüleme azaltır.

Birden çok kemirgen beyin aynı anda Cryosectioning

Burada, İmmünohistokimya ve yüksek çözünürlüklü beyin bölgelerinin proteinleri için tarama ile birlikte yakın kızılötesi boyalar kullanan bir protokol sunuyoruz.

Kemirgen beyninde protein Ifadesini ölçmek için yakın kızılötesi floresan ve yüksek çözünürlüklü tarama kullanma

Bu protokol, mikroglial yoğunluk, dağılım ve morfolojinin yanı sıra fare beyin dokusunda periferik miyeloid hücre infiltrasyonunun analizine ek olarak, IBA1 ve TMEM119'un immünororesan costaining'i için adım adım iş akışını tanımlar.

Fare Beyninde Mikroglial Yoğunluk, Morfoloji ve Periferik Miyeloid Hücre Infiltrasyonu Analizi için IBA1 ve TMEM119 Kullanılarak İmmünofloresanS Boyama

Burada, hedef moleküllerin sağlam beyin yapılarının bir parçası olarak görüntülenmesini sağlayan hidrofobik bir doku temizleme yöntemi sunuyoruz. Bu teknik artık F344/N kontrolü ve her iki cinsiyetten HIV-1 transgenik sıçanlar için onaylanmıştır.

Sıçan Beyin Dokusu için Hidrofobik Doku Temizleme Yöntemi

Bu protokol, perfüzyon, beyin kesiti, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere fare beyni histolojik çalışmaları için verimli ve tekrarlanabilir bir yaklaşımı açıklar.

Fare Beyinlerinin Serbest Yüzen İmmünasyon

Sıçan in vivo modelleri, iskemik inme için patolojik mekanizmaları ve terapötik hedefleri araştırmak için vazgeçilmez araçlardır. Bu çalışma, sıçanlarda orta serebral arter tıkanıklığını (MCAO) takiben enfarktüslü beyin dilimlerinde immünofloresan boyama gerçekleştirmeyi açıklayacaktır.

İskemik İnmenin Sıçan Modelinde İmmünofloresan ile Hücre Ölümü Sinyalinin Değerlendirilmesi

Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), kodlama uzmanlığı gerektirmeyen ve immünoflüoresans görüntülerden tek hücreli mikrogliyal morfoloji analizini yarı otomatikleştiren kullanıcı dostu bir analiz hattıdır. Kemirgenlerin lipopolisakkaridi indükleyen nöroinflamasyon modelinde doğrulanan MMPS, aktivasyonla ilişkili morfolojik değişiklikleri tekrarlanabilir şekilde tespit eder ve standart, ölçeklenebilir mikroglial fenotiplemeyi mümkün kılar.

Mikroglial Parametreleri Haritalama Yazılımı (MMPS): Nicel Mikroglia Morfoloji Analizi için Açık Kaynaklı, Kullanıcı Dostu Bir Araç

Öğrenin, sıçan beyin dokusunda mikroglia ve nöronları immünohistokimya ile çift etiketleme yöntemini. Bu protokol, hücresel etkileşimleri görselleştirmek için tekrarlanabilir bir teknik sunar.

Mikroglia ve nöronlar için örnek Boyama: Cryosectioned Rat Beyin Dokusu Üzerine İmmünohistokimya için Astar

Daha fazla video keşfet