Makromoleküler 3D İmar için bir örnek Hazırlanması Astar ve Yüksek Kalite Veri Toplama: Cryo-elektron mikroskobu Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

Aşağıdaki deneyin amacı, transmisyon elektron mikroskobu ile makromolekülleri donmuş hidratlı hallerinde görüntüleyebilmektir. Bu, ince bir vitrifiye numune elde etmek için numunenin bulunduğu ızgaranın kriyojen üzerine hızlı daldırılmasıyla elde edilir. İkinci adım olarak, numune, makro moleküllerin bir projeksiyon görüntüsünü oluşturacak olan elektron ışınına maruz bırakılır.

Daha sonra, makro molekülün 3D rekonstrüksiyonunu elde etmek için görüntüler bilgisayarda işlenir. Sonuçlar, makro molekülün oldukça ayrıntılı bir 3D yapısını, onayını ve moleküler ortaklarının 3D konumunu göstermektedir. Bu tekniğin, elektromikroskopi için diğer numune hazırlama yöntemlerinin temel bir avantajı vardır.

Kriyoda görüntü doğrudan makromolekül içindeki elektronlar tarafından oluşturulur. Bu, Yerli yapısına daha sadık bir şekilde yansıtıyor. Bu yöntemin görsel bir gösterimi kritik öneme sahiptir.

Kriyo ızgara hazırlığı ve elektron mikroskobuna aktarılması, kriyojenik sıcaklıklarda çalışırken ek komplikasyon nedeniyle öğrenilmesi zordur, Isınma döngüsü, pompalama dizisinin başlangıcında ve bir kriyo EM seansından sonra kullanılır. Bu prosedüre başlamak için, kriyo tutucuyu pompa istasyonunun pompalama portlarından birine yerleştirin. Isınma döngüsü seçeneğini başlatın.

Soğuk kademe kontrol cihazında, kelebek vana V ik'i açın ve turbo pompa istasyonundaki vakum stabilize olduğunda ve eksi üç tura 10 okuduğunda veya daha iyisi kelebek vana V bir'i açın. Tutucudaki sıcaklık oda sıcaklığının üzerinde sabit hale geldiğinde ve ısınma döngüsü tamamlandığında. V bir düşürür ve döngüyü durdurur.

Ardından, ze ışık döngüsü seçeneğini başlatın ve bir ila iki çarpı 10 ila eksi dört tor aralığında iyi bir vakum elde etmek için gerekli süreyi seçin. Vakum 10 ila eksi üç aralığına ulaştığında, DU tahliye vanası B üçünü ve kriyo tutucusundaki vanayı açın. Döngü tamamlandığında, vanaları açıldıkları sıranın tersine çevirin.

Bir cımbız kullanarak, iki yeni yüzeyi ortaya çıkarmak için bir parça MICA'ya bırakın. Açıkta kalan yeni mika yüzeylerini yüzü yukarı bakacak şekilde bir Petri kabındaki beyaz bir kağıda yerleştirin. Petri kabını bir karbon evaporatörünün kavanozuna yerleştirdikten sonra, vakum 10 ila eksi altı derecenin altına düşene kadar pompalama sırasını gerçekleştirin ve mika'yı ince bir karbon tabakasıyla kaplayın.

Ardından ince karbonu ızgaraya aktarın. 0,5 x bir santimetre kaplanmış mika parçası ve karbonu filtrelenmiş deiyonize suyun düz yüzeyine yüzdürün. Cımbız kullanarak, ızgaranın kutsal karbon tarafını yüzen karbon tabakasının üst yüzeyi ile temas ettirin ve kaldırın.

Izgarayı, karbon tarafı yukarı bakacak şekilde, güç filmi ile kaplı 7,5 x 2,5 santimetrelik bir cam slayt üzerine yerleştirin. Ardından cam sürgüyü kızdırma deşarj ekipmanının haznesine yerleştirin ve hazneyi kapatın. Çan kavanozunu pompalayın ve parlayın.

25 miliamperde 20 saniye ve yedi kez 10 eksi iki milibara boşaltın. Bu noktada, daldırmalı dondurma aparatını açın. Rezervuarı sıvı nitrojenle doldurarak Ethan kabını aşağı çekin.

Sıvı nitrojenin kaynaması durduğunda, Ethan tankından gelen tüpün ucunu iç hazneye yerleştirin ve valfi çok yavaş bir şekilde açın. Etanı iç haznede sıvılaştırın ve üstten bir milimetreye kadar doldurun. Nemi açın.

Daha sonra, cımbıza bir ızgara yükleyin ve kutsal ızgaranın karbon yüzeyine üç ila beş mikrolitre numune yükleyin. Numunenin ızgaraya emilmesini bekledikten sonra, lekeleme yapın İnce bir sıvı tabaka allık elde etmek için, ızgarayı sıvı etan içine daldırarak dondurun. Cımbız ızgara tertibatını sıvı etandan dikkatlice çıkarın ve sıvı nitrojen içeren dış hazneye aktarın.

Ardından ızgarayı sıvı nitrojene batırılmış küçük bir ızgara kutusuna aktarın. Bu noktada, kriyo tutucuyu kriyo transfer iş istasyonuna yerleştirin. Kriyo tutucunun ve iş istasyonu kabının doerini sıvı nitrojen ile doldurun.

Donmuş hidratlı ızgarayı içeren kriyo ızgara kutusunu iş istasyonundaki sıvı nitrojene hızlı bir şekilde aktarın. Kriyo ızgara kutusunu açtıktan sonra, donmuş hidratlı ızgarayı alın ve numune tutucu yuvasına yerleştirin. Ardından, klips halkasını ızgaranın üzerine yerleştirin ve klips halkası aletinin kör ucuyla ve yerine sıkıca oturana kadar hafifçe bastırın.

Ardından kriyo deklanşörünü kapatın. TEM anti-kontaminasyonu sıvı nitrojen ile doldurun. Mikroskop tablasını eksi 60 dereceye kadar tekrar eğin.

Bunu takiben, mikroskopta PrepU hava kilidi döngüsüne başlayın. Pompa hava kilidi sırası bittiğinde, koro tutucuyu hava kilidine takın ve soğuk s'yi bağlayın.tage sıcaklığı izlemek için kontrol kablosu tutucuya bağlayın. Kırmızı ışık söndükten sonra, T EM'nin yüksek vakum kolonuna yerleştirilmesi için tutucuyu sıfır derece konumuna çevirin.

Kriyo kapağını geri çekin ve kolon valflerini açın. Düşük doz programını arama modunda etkinleştirin. Sahneyi ortalayın ve sahneyi artı veya eksi 15 derece sallamak için alfa yalpalayıcıyı kullanarak merkez yüksekliğini ayarlayın, uygun bir delik seçin ve XY sahne kontrolörü ile alanın ortasına yerleştirin.

Odak moduna geçin ve görüntüyü odaklayın. Ardından, görüntü 0,5 ile 4,5 mikron arasında netlenir. Pozlama moduna geçin ve görüntüyü kaydedin.

Son olarak, bir sonraki deliği seçmek için arama moduna dönün ve sırayı tekrarlayın. Farklı yapısal özelliklere sahip dört temsili örnek için negatif boyama ve kriyo EM yöntemleriyle elde edilen mikroskobik görüntüler karşılaştırılmıştır: burada negatif boyanmış adeno-ilişkili virüs kapsidleri virüs benzeri partikülleri ortaya çıkarır ve kriyo EM bunların boş olduğunu gösterir. Tütün mozaik virüsünün görüntüleri, negatif boyamada leke ile dolu ve kriyo EM görüntülerinde boş olan merkezi kanala sahip sarmal çubukları göstermektedir.

KLH, hem negatif boyama hem de kriyo EM görüntülerinde altı çizgi gösteren karakteristik varillerde toplanır. Dikdörtgen yan görünümler ve dairesel ve açık görünümler, odin reseptöründeki kriyo EM tarafından bir yapıda boş olduğunu ortaya çıkarır. Merkezi bir haç ve merkezi bir çöküntü gibi karmaşık yüzey özellikleri, negatif boyama ile leke birikimi ve kriyo em ile daha düşük yoğunluklu bölgeler olarak kendini gösterir.

Kriyo EM artefaktlarının tipik örnekleri kristal buz, buz kirliliği, astigmatizma ve ağ benzeri yapılardır. Tek partikül analizi ve donmuş hidratlanmış in reseptörünün 3D rekonstrüksiyonu, dört katlı simetrik yapısını ortaya çıkarır. Sitoplazmik alan, kare bir prizma oluşturur ve iskele benzeri bir yapı oluşturan birkaç tekrarlanabilir gular alan içerir.

10 angstrom çözünürlükte, alfa HELOC'ları 3D olarak görselleştirmek mümkündür. Fark haritalama, önemli ligandların konumunu ortaya çıkarabilir. Onaylayıcı değişiklikler, makro molekülün dinamik bir görünümünü sağlar.

Bu videoyu izledikten sonra, yüksek kaliteli kriyo EM numunelerinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Görüntü işleme ile birleştirilen Cryo EM, araştırmacıların makromoleküler makinelerin yapısını, alt birim organizasyonunu ve konformasyonel dinamiklerini keşfetmelerini sağlamıştır.