3D Hücre Kültürü Modelleri Kütle Spektrometre Görüntüleme Hazırlık Stratejileri Numune

Bu prosedürün genel amacı, üç boyutlu hücre kültürleri hazırlamak ve bunları kütle spektrometrisi görüntülemesi ile analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle üç boyutlu hücre kültürlerinin oluşturulması ve istenen boyuta ulaşana kadar büyümelerinin sağlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, üç boyutlu hücre kültürlerinin hasat edilerek jelatine gömülmesidir.

Ardından, üç boyutlu hücre kültürleri bir kriyostat kullanılarak -30 °C'de dilimlenir ve iletken lamlar üzerine yerleştirilir. Son adım, dilimlerin bir MALDI MSI cihazı ile analiz edilmesi ve tespit edilen moleküllerin analizinin gerçekleştirilmesidir. Nihayetinde, birçok farklı biyomolekül sınıfına ait analitlerin üç boyutlu hücre kültürü boyunca dağılımındaki değişiklikleri göstermek için kütle spektrometrisi görüntüleme kullanılır.

Bu tekniğin kütle spektrometrisi benzeri mikroskopi veya otoraidografi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kütle spektrum görüntülemenin; proteinler, lipid ilaçları ve metabolitler gibi birden fazla analitin tek bir deneyde, antikor etiketlemesi gerektirmeden tespit edilmesine ve lokalize edilmesine olanak tanımasıdır. Prosedürü; Dorothy Alf Wheatcraft, şahsım (doktora sonrası araştırmacı) ve Hamman laboratuvarından lisansüstü öğrenci Shin Li gerçekleştirecektir. Bu prosedüre başlamadan önce, HCT 116 kolon karsinomu hücre hattı gibi uygun bir hücre hattını iki boyutlu monokatman kültüründe çoğaltın. Ardından, 50 mL'lik konik bir tüp içinde 10 mL standart medyuma 0,19 gram aros ekleyin.

Hafifçe karıştırarak inklüzyonu sağlayın, ardından agrosları bir su banyosunda çok kanallı pipet aspirasyonu kullanarak 20 dakika boyunca otoklavlayın. Agros besiyeri karışımının 50 µL'sini, düz dipli 96 kuyucuklu bir kültür plakasının merkezindeki 60 kuyucuğa aktarın. Plakanın çevre kenarlarındaki kuyucukların buharlaşma oranları biraz daha yüksek olduğu için, bu kenarlara agros yerine 200 µL 1x fosfat tamponlu salin ekleyin.

Aros karışımı iç kuyucuklara eklendikten sonra, hücre ekimi öncesinde plağı yaklaşık 37 °C'ye soğuması için kenara alın. Bu aşamada, aros kaplı 96 kuyucuklu plağa 200 µL uygun hücre çözeltisi ekleyin, plağın üzerini kapatın ve hücre büyümesi için %5 karbondioksit içeren 37 °C'lik nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. İnkübasyonun ardından, arosun altındaki küçük üç boyutlu hücre kültürünün etrafındaki eski medyumu dikkatlice aspire ederek medyumu değiştirin.

Ardından, üç boyutlu hücre kültürünün üzerine nazikçe 200 µL taze besiyeri ekleyin. Yüksek saflıkta su içerisinde yaklaşık 175 mg/mL jelatin çözeltisi hazırlayın. Çözelti viskoz hale gelip manipülasyonu zorlaştıktan sonra jelatini kuvvetlice karıştırın.

Tüpü, çözelti berraklaşana ve kolayca aspire edilebilecek hale gelene kadar yaklaşık 60 °C sıcaklıktaki bir su banyosuna yerleştirin. İki mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, 24 kuyucuklu düz tabanlı bir plakanın kuyucuklarına 0,6 ml sıcak jelatin çözeltisi ekleyin. Üç boyutlu yapının bozulmasını önlemek için farklı bir iki mililitrelik pipet kullanarak, yıkanmış üç boyutlu hücre kültürlerini derhal jelatin tabakasının üzerine yerleştirin.

Hücre kültürleri jelatin tabakasının yüzeyine yerleştirildikten sonra, konumlarını bozmamaya dikkat ederek üzerlerine 0.6 mL daha ılık jelatin karışımı pipetleyin. Ardından, jelatin içine gömülmüş üç boyutlu hücre kültürlerini -80 °C'de dondurun.

Hücre kültürlerini içeren 24 kuyucuklu plaka dondurucudan çıkarıldıktan sonra, pensler kuyucuğun kenarından nazikçe aşağı kayana kadar plakanın alt kısmını elinizle ısıtın. Ardından, merkezdeki kısmı çözmeden jelatini serbest bırakmak için pensleri diskin etrafında pürüzsüzce kaydırın.

Kriyostat desteğine bir damla su ekleyin ve jelatin diski desteğe yapıştırın. Ardından, dondurmak için kriyostata yerleştirin. Üç boyutlu hücre kültürlerini açığa çıkarmak için fazla jelatini tıraşladıktan sonra, pürüzsüz bir hareketle 12 ila 16 µm kalınlığında kesitler halinde yavaşça dilimleyin.

Kesitler çözündükten sonra, bunları indiyum kalay oksit kaplı cam lamlara monte edin. Lamları etiketledikten sonra, bozulmamış protein tespiti için bir desikatörde saklayın. Sinyali maskeleyebilecek lipidler gibi küçük molekülleri uzaklaştırmak için kesitleri soğuk aseton ile yıkayın.

Matrisi, organik çözücü ve %0.1 trikloroasetik asit içeren su çözeltisi içinde hazırlayın. Matris çözeltisinden 0.5 µL'yi üç boyutlu hücre kültürü kesiti üzerine uygulamak için ince uçlu bir şırınga kullanın. Matrisin kristalleşmesini bekledikten sonra, Maldi MSI öncesinde lamları bir desikatörde en az 30 dakika boyunca kurutun.

Bu aşamadaki analiz için, üç boyutlu hücre kültürü kesitlerini görüntülemek amacıyla lamları, 75 mm x 25 mm boyutundaki lamları güvenli bir şekilde tutmak için tasarlanmış bir adaptöre yerleştirin. Ardından, lam adaptörünü cihaza yükleyin. Uygun veri toplama yöntemlerini geliştirdikten sonra, kütle aralığını küçük molekül veri toplama için 101.000 m/z ve proteinler için 8.020 ile 5.000 m/z arasında ayarlayın.

Bunu takiben, kalibrasyon solüsyonu ve yakındaki feda edilebilir üç boyutlu hücre kültürü dilimini kullanarak lazer gücünü, frekansını, lazer atış sayısını ve spot boyutunu ayarlayın. Bu yöntemi, cihaz üreticisi tarafından sağlanan görüntüleme yazılımında kullanılmak üzere kaydedin. Daha önce açıklandığı gibi, seçilen kütle aralığı için protein veri toplama yöntemleri geliştirin.

Ardından, görüntüleme yazılımını kullanarak spesifik MS cihaz parametrelerini ayarlayın. Cihaz parametrelerini seçtikten sonra, 3D hücre kültürü üzerinde nerenin taranacağını belirleyerek cihaz kontrol yöntemi pozisyonunu ayarlayın. Sonra, lazeri her birine taşıyarak örnek üzerinde üç uygun öğretme noktası seçin.

Ardından, print screen kullanarak maldi TOF lazer kontrol yazılımından optik fotoğrafı alın. Daha sonra, görüntüleme yazılımından görüntüleme işlemini başlatın ve hedeflenen analiz için her bir dilimden kütle spektrumlarını edinin. Ortalama spektrumdaki bir kütleye tıklayarak spektrumların manuel analizini gerçekleştirin.

Son olarak, matematiksel yazılımlarda çıkarılan veri setleri ile istatistiksel analiz gerçekleştirin. Kütle spektrometrisi görüntüleme, üç boyutlu hücre kültürlerinde birçok farklı moleküler dağılımı ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir. Daha önce açıklanan yöntemi kullanarak, küçük moleküllerden büyük proteinlere kadar olan türler kültür boyunca takip edilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, üç boyutlu hücre kültürlerinin kütle spektrometrisi görüntüleme ile nasıl hazırlandığı, dilimlendiği ve analiz edildiği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.