Yüksek çözünürlüklü Fourier Patoloji iyileştirilmesi yönünde İnsan Doku Bölümler Kızılötesi (FT-IR) Spektroskopik Görüntüleme Dönüşümü

Fourier Dönüşümü Kızılötesi (FT-IR) spektroskopik görüntüleme, hücre ve dokuların biyokimyasal veri setlerini elde etmek için hızlı ve etiketsiz bir yaklaşımdır. Burada, hastalık teşhisini iyileştirmek için doku kesitlerinin yüksek çözünürlüklü FT-IR görüntülerinin nasıl elde edileceğini gösteriyoruz.

Bu prosedürün genel amacı, doku örneklerinin yüksek çözünürlüklü kızılötesi görüntülerini elde etmektir. Bu, ilk olarak doku örneklerinin kızılötesi uyumlu slaytlar üzerine bölünmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, uygun objektifleri kurarak yüksek çözünürlüklü bir görüntüleme cihazı kurmaktır.

Daha sonra, substratın arka planı toplanır ve doku örneği taranır. Son adım, veri işleme ve görselleştirme için uygun yazılımı kullanmaktır. Sonuç olarak, yüksek çözünürlüklü kızılötesi görüntüleme, biyolojik dokulardan rahatsız edici olmayan bir şekilde biyokimyasal bilgileri görselleştirmek ve elde etmek için kullanılır.

Bu tekniğin ışık mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, dokunun doğal biyokimyasının boya veya prob kullanılmadan incelenebilmesidir. Bu yöntem, diyabetik nefropatinin nüksünü tahmin etmek ve HEPA araba osteogenezisi yoluyla karaciğer hastalığının ilerlemesini sınıflandırmak gibi alan patolojisine yönelik temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, geleneksel histopatolojide bulunmayan çok miktarda biyokimyasal bilgi sağladığı göz önüne alındığında, hastalık teşhisi ve prognozuna kadar uzanır.

Bu yöntem tanı için kullanılabilir olsa da. Ayrıca, yara iyileşme sürecindeki değişiklikleri izlemek ve gastrointestinal sistemdeki kök hücreler ve beyindeki kök hücreler gibi temel doku özelliklerini tanımlamak için de kullanılabilir. Dört mikrometre kalınlığında resmi ve sabit parafin gömülü doku bloğunun bir mikrotom kullanılarak IR uyumlu bir slayt üzerine ilk bölümü.

Bunu takiben. Atmosferik suyu sistemden uzaklaştırmak için FTIR mikroskobunu ve spektrometreyi kuru hava kullanarak temizleyin. Daha sonra hem odak düzlemi dizi dedektörünü hem de dahili cıva kadmiyum Telluride dedektörünü sıvı nitrojen kullanarak mikroskopta soğutun, görünür ışığın açık olduğundan emin olduktan sonra FTIR görüntüleme için numune slaydını mikroskop aşamasına monte edin, numune yakalama programını kullanarak numuneye odaklanın.

Ardından, paket yazılım paketini açın ve topla'ya tıklayın. Tanılama'ya tıklayın ve bir çizgi spektrometresi seçin. Ardından sistemi kalibre etmek için görüntüleme kurulumuna tıklayın.

Optik sekmesinde, sol olarak yer mikroskobu dedektörü olarak dedektörü seçin ve ardından optik modu altında geçirgenliği seçin. Lancer kontrolünde iletim modu için lancer kontrol penceresini açacak olan kuruluma tıklayın. Sahne kontrol joystick'ini kullanarak raw'a tıklayın ve FTIR İnterferogram görüntüsünün canlı görüntüsünün slaytın temiz bir alanına taşınmasını izleyin.

Bu noktada, entegrasyon süresini yaklaşık 8.000 sayıma ve alt kondansatör hedefine ayarlayın. Sayım sayısını maksimuma çıkarmak için, görünüşte Gauss ve nispeten tekdüze olduğundan emin olmak için lancer kontrolünde sağ alttaki görüntünün şeklini izleyin. Entegrasyon süresini ayarladıktan sonra, tercihen bir dokunun kenarı olan yapıya sahip bir doku parçası bulmak için sahneyi tekrar hareket ettirin.

Ardından görüntünün odağını mükemmelleştirin. Sahne kontrolü kumanda kolunu kullanarak slaytın temiz bir alanına gidin. Seçtikten sonra kalibre et düğmesine basın.

Tamam, iki kez Optik sekmesinde, dedektör MCT'ye eşittir ve mikroskop dedektörü sağa eşittir'i seçin. Ardından kurulum'a tıklayın. FTIR interferogramı ekranda görselleştirildikten sonra, merkez patlamayı bul'a tıklayın ve tamam.

Optik sekmesinde, dedektörü yeniden seçin eşittir yer mikroskobu dedektörü sola eşittir. Ardından kurulumu seçin. Lancer kontrolünde görüntünün hala temiz bir alanda olduğundan emin olduktan sonra, tekrar kalibre et'e tıklayın ve tamam.

Bir arka plan FTIR görüntüsü toplamak için elektronik sekmesine gidin ve tipik olarak dört veya sekiz ters santimetre olan uygun bir spektral çözünürlük seçin. Doku için arka plan sekmesine gidin ve kaplamak için taramalara 128 yazın. Yeni dosya düğmesini seçin ve arka plan dosyasını uygun klasöre yerleştirin.

Arka plana tıkladıktan ve taramanın bitmesini bekledikten sonra, dosyayı nereye kaydedeceğinizi onaylayın. Arka plandaki bir bölgeye, FTIR görüntüsüne tıklayın ve spektrumu kontrol edin. Bu noktada, kurulum'a tıklayın ve lancer kontrolünde canlı IR görünümünü kullanın.

İlgilendiğiniz alanı bulmak için elektronik sekmesine gidin ve birleştirilecek tarama sayısını yazın. Ardından tara'ya tıklayın FTIR mikroskobunu yüksek çözünürlüklü analize hazırlamak için, 15 x objektif yerine yüksek büyütme objektifini vidalayın. Bu noktada, görüntü işleme ve analiz yazılımını açın ve IR veri dosyasını yükleyin.

Spektral araçları seçerek IR verilerine bir temel düzeltme algoritması uygulayın ve aşağı kaydırın ve emici spektrumları tıklayın. Açılır menü göründüğünde, taban çizgisi düzeltmesini seçin. Emici spektrumlar menü seçenekleri altında normalleştirilmiş spektrumları seçerek spektral normalleştirme gerçekleştirin.

Bunu takiben, görüntüde toplanan tüm IR frekanslarının bir listesini gözlemleyin. Farklı biyomoleküler bileşenlerin görselleştirilmesine izin verecek görüntüler oluşturmak için seçilen frekansta dokunun bir görüntüsünü gözlemlemek için belirli biyomoleküllere karşılık gelen frekanslara tıklayın. Spektral araçlara tıklayın ve ardından tepe yükseklik oranlarını seçin.

IR görüntüsünün yanı sıra parlak alan görüntüleri yakalayan ayrı bir tam slayt görüntüleyici sistemi kullanarak ilgili bitişik lekeli doku bölümünü tarayın. Görünür görüntü programı ile lekeli dokunun dijital görüntüsünü gündeme getirin. Ardından, ilgilendiğiniz bir bölgedeki görüntüye sağ tıklayın ve seçilen pikselde spektral bilgi vermek için Z profilini seçin.

Görüntüdeki belirli pikselleri işaretlemek için görüntüye sağ tıklayın ve ROI aracını seçin. Etiketlenecek sınıfları oluşturun, örneğin, Meum ve Bowman'ın kapsül sınıfları. Ardından ROI türü noktasını seçin, bunu takip edin, piksellerin seçileceği sınıfı seçin ve IR görüntüsündeki uygun piksellerin üzerine çizim yapın.

Ortalama ROI aracını kullanarak sınıfların her biri için ortalama spektrumları türetin. Son olarak, türetilmiş spektrumları çizerek karşılaştırın. Grafik yazılımında, FT IR görüntüleme, IR frekansına bağlı olarak farklı kontrastlar verebilen dokunun IR görüntülerinin türetilmesine izin verir.

Her piksel, hücre tiplerinin veya hastalık durumlarının biyokimyasal özellikleri hakkında bilgi verebilen farklı biyomoleküllere karşılık gelen farklı zirvelere sahip tüm spektrumdan oluşur. FTIR enstrümantasyonu, opak açıklıklar kullanılarak tek nokta haritalama modunda ölçümden, iletim modunda bir toplama hedefi ile birleştirilmiş bir aydınlatma hedefi veya yansıma modunda hem aydınlatan hem de toplayan tek bir hedef kullanan CASA tane hedefleri kullanarak görüntüleme moduna dönüşmüştür. Doku görüntüleme için uzamsal çözünürlükteki ilerlemeler, hücre tipleri ve doku yapıları artık tanımlanabildiği için kritik öneme sahiptir.

Bu durumda, bir karaciğer dokusu çekirdeğinde böbrek glomerülleri fonksiyonel birimleri gözlenmiştir. Displazi ve displastik olmayan sirozun iki farklı alanını ayıran hepatositleri ve infiltre fibroz bölgelerini görselleştirmek mümkündür. Artan uzamsal çözünürlük, histolojik değişiklikler ortaya çıkmadan önce hastalık tarafından kimyasal olarak değiştirilebilen spesifik yapısal özelliklerin izolasyonuna izin verir.

Bowman kapsülü, meum, glomerüler bazal membran ve tübüler bazal membran gibi böbrek glomerüler yapılarındaki biyokimyasal değişiklikler FTIR görüntüleme ile tanımlanabilir. Bu prosedürü denerken, taramadan önce slaytları tamamen ayırmayı unutmamak önemlidir Bu prosedürü izleyerek. Biyokimyasal imzaları ve doku morfolojisini ilişkilendirmek için aynı doku kesitinde geleneksel immünokimyasal analiz gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

İlk gelişmemiz olan bu teknik, doku görüntüleme alanındaki araştırmacıların, dokulardaki küçük hücre tiplerinin ve yapılarının biyomoleküler durumunu keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, doku örneklerinin yüksek çözünürlüklü FTR görüntülerini nasıl elde edeceğinizi ve temel spektral analizi nasıl yapacağınızı temel bir anlayışa sahip olmalısınız. Sıvı nitrojen ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken kriyo güvenli eldivenler ve koruyucu gözlükler gibi güvenlik önlemlerinin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.