Kimyasal Güvenlik Tarama ve Sistem Biyolojisi Veri Üretimi Gelişim Toksisite Tahliller Tabanlı İnsan Pluripotent Kök Hücre

Bu prosedürün genel amacı, insan embriyonik kök hücrelerine ve transkriptom çalışmalarına dayanan iki in vitro gelişimsel toksisite test sistemini tanımlamaktır. Bu, ilk olarak insan embriyonik kök hücrelerinin fare embriyonik fibroblastları üzerinde kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, insan embriyonik kök hücrelerinin, üç germ tabakasının tümünden hücreler üretebilecekleri Embry cisimciklerini oluşturmasına izin vermek veya bunları nöroektodermal progenitörlere farklılaştırmaktır.

Daha sonra, embriyo cisimcikleri veya nöroektodermal progenitörler, farklılaşma sırasında farklı konsantrasyonlarda ilgilenilen bileşiklerle tedavi edilir. Son adımlar, hücrelerin canlılığını değerlendirmek ve RNA'yı izole etmektir. Sonuç olarak, transkriptom mikrodizi analizi, tedavi edilmemiş kontrol hücrelerine kıyasla ilgilenilen bir bileşikle tedavi edilen hücrelerin RNA ekspresyonundaki değişiklikleri göstermek için kullanılır İnsan neonik kök hücrelerine ve DNA makro alanlarına dayanarak, insanla ilgili gelişimsel toksisite etkilerinin izlenmesine izin veren bir in vitro metodoloji oluşturduk.

Metodoloji, potansiyel ilaçların ve çevresel toksik maddelerin güvenlik taraması için ilaç ve kimya endüstrisi tarafından uygulanabilir. Bu yöntem, kimyasalların çok erken nörogelişim üzerindeki etkisi gibi gelişimsel toksisite alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Başlamak için, kök hücre ortamı takviyesini oda sıcaklığında çözdürün ve 100 mililitresini bazal kök hücre ortamının 400 mililitresine ekleyin.

Daha sonra, bazal membran matrisini buz üzerinde çözün ve ardından takviye edilen matris hacmini 24 mililitre soğutulmuş dmm'ye ekleyin. F 12 bazal ortam, üretici tarafından önerildiği gibi, hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek bir çözelti karıştırın ve ardından karışımın iki mililitresini 12 ayrı altı santimetrelik plakaya ekleyin. Matris plakaları kaplarken plakaları oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Sonra ortamı çıkarın ve iki mililitre kök hücre ortamı ekleyin. Daha sonra, insan embriyonik içeren inkübatörden dört birleşik plakayı çıkarın. Bir stereoskop altında eşlik eden metin protokolünde anlatıldığı gibi hazırlanan fare embriyonik fiberblast besleyici katmanları üzerinde büyütülen H dokuz hücre, bir mililitrelik pipet ucu kullanır ve farklılaşmış kolonileri plakadan çıkarır.

Farklılaşmamış koloniler iyi tanımlanmış sınırlara sahiptir ve hücreler kompakttır, oysa farklılaşmış hücreler sınırlardan yayılmaya başlar ve hücrelerinin boyutu daha büyüktür. Ortamı aspire edin ve hücreleri dört mililitre PBS ile yıkayın. Daha sonra bir stereoskopun sekizi ile iki mililitre kök hücre ortamı ekleyin.

Kolonileri her biri 26 gauge iğne ile altı ila dokuz parçaya kesin ve kümeleri bir mililitrelik pipet ucuyla kazıyın. Kesilen kolonileri 50 mililitrelik bir şahin tüpünde nazikçe toplayın ve beş dakika boyunca 200 G'de pelet haline getirin. Daha sonra, snat'ı aspire edin ve hücreleri 12 mililitre kök hücre ortamında yeniden süspanse edin.

20 mikrolitre hücre süspansiyonunu bir cam slayt üzerine yerleştirin ve mikroskop altında kümelerin sayısını sayın. Süspansiyon konsantrasyonunu mililitre başına 150 topak olarak ayarlayın ve ardından her altı santimetrelik plakaya iki mililitre süspansiyon ekleyin. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakaları ileri geri ve yan yana hareket ettirin ve ardından plakaları her gün bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.

Ortamı dikkatlice değiştirin Farklılaşmış kolonileri çıkardıktan sonra, bir Vbo 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 40 mikrolitre steril% 5 blok kopolimer çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe etmesine izin verin. Kuluçka makinesinden koloniler içeren birleşik bir plakayı çıkarın ve bir mililitrelik pipet ucu ile stereo mikroskop altında farklılaşmış kolonileri çıkarın. Daha sonra ortamı plakadan aspire edin ve hücreleri dört mililitre PBS ile nazikçe yıkayın.

Daha sonra, her plakaya iki mililitre rastgele farklılaşma ortamı ekleyin. H dokuz hücre kolonisini tek tip boyutta kümeler halinde kesmek için geçiş aracını kullanın. Topakları bir hücre kazıyıcı ile kazıyın ve nazikçe 50 mililitrelik bir şahin tüpü santrifüjüne toplayın.

Koloni beş dakika boyunca 200 G'de kümelenir ve daha sonra snat'ı aspire eder ve hücreyi ve rastgele farklılaşma ortamını mililitre başına 1000 kümede yeniden süspanse eder. Daha sonra, blok kopolimeri V alt 96 oyuklu plakadan aspire edin: Çok kanallı bir pipet yardımıyla, her bir oyuğa 100 mikrolitre koloni süspansiyonu ekleyin, plakayı 400 G'de dört dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyerek kümeleri V şeklindeki kuyucukların dibine toplayın. Embriyo cisimlerini 96 oyuklu plakadan çıkarın ve steril 122 milimetre kare plakaya yerleştirin.

Daha sonra, embriyo cisimlerini kare plakadan 15 mililitrelik bir şahin tüpüne aktarmak için 10 mililitrelik steril bir serolojik pipet kullanın. Embriyo cisimlerinin iki dakika oturmasına izin verin ve ardından snat'ı aspire edin ve embriyo cisimlerini beş mililitre PBS ile yıkayın. Yine, embriyo cisimlerinin iki dakika oturmasını bekleyin ve ardından süpernatanı aspire edin.

Bu sefer embriyo cisimlerini beş mililitre rastgele farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, embriyo cisimlerini 10 santimetrelik bir bakteriyolojik plakaya aktarın ve 10 mililitre daha rastgele farklılaşma ekleyin. Orta. Plakaları yatay bir çalkalayıcı üzerinde 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin.

50 RPM'de, temsili embriyo cisimleri beşinci gün, dokuzuncu gün ve 14. gün için gösterilir. Ortamı her gün dikkatlice değiştirin ve 15 mililitrenin tamamını yeni rastgele farklılaşma ile değiştirin. Orta. Bir ilacın farklılaşma üzerindeki etkisini değerlendirmek için, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi 10 gün boyunca beşinci günde ortama ilaç eklemeye başlayın.

Steril bir pipet kullanarak, embriyo cisimlerini 10 santimetrelik plakalardan 15 mililitrelik bir şahin tüpüne toplayın. İki dakika oturmalarına izin verin, ardından süpernatanı aspire edin. Bunları beş mililitre PBS ile yıkayın ve nükleaz içermeyen 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Snat yükseltmesini yerleşmelerine ve aspire etmelerine izin verin. Embriyo cisimlerini bir mililitre triol reaktifi içinde askıya alın ve hücreleri parçalamak için bir mililitrelik şırınga ile yaklaşık 15 kez 24 gauge iğneden bir çözelti geçirin. Ardından, her numuneye 200 mikrolitre kloroform ekleyin.

İçeriği kısaca vorteksleyin ve ardından numuneleri 15 dakika boyunca 12.000 G'de santrifüjleyin Dört santigrat derecede, süpernatanı diğer katmanların hiçbirini rahatsız etmeden 1.5 mililitrelik tüplerde toplayın. Daha sonra süpernatanıma eşit hacimde soğutulmuş% 70 etanol ekleyin ve içeriği çalkalayarak hafifçe karıştırın. Karışımın 700 mikrolitresini bir mini döndürme kolonuna aktarın ve son elüsyon adımında RNA'yı saflaştırmak için üreticinin talimatlarını izleyin.

Döndürme kolonuna 22 mikrolitre nükleaz içermeyen su uygulayın ve tüpleri bir dakika boyunca 12.000 G'de santrifüjleyin. Ardından toplama tüpünü çıkarın ve RNA'yı buzun üzerine koyun. H dokuz hücreli birleşik T 25 şişesi başına bir mililitre ön ısıtma disk alanı ekleyin ve şişeyi 37 santigrat derecede dokuz dakika inkübe edin.

Sonra iki mililitre ön ısıtma ekleyin. Ortamı yer değiştirmiş işlem görmüş hücrelere kadar yıkayın ve beş mililitrelik bir pipetle beş kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre çözeltisini bir şahin tüpüne aktarın.

Daha sonra, şişeyi dokuz mililitre yıkama ortamı ile yıkayın ve hücrelerle birlikte tüpe ekleyin. PT, hücrelerini 500 G'de üç buçuk dakika boyunca hasat edin, daha sonra snat'ı çıkarın ve hücreleri 10 mililitre yıkama ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri 500 G'de üç buçuk dakika boyunca tekrar PT edin ve daha sonra suptantı çıkarın ve hücreleri dört mililitre insan embriyonik kök hücre ortamında yeniden süspanse edin, 0.5 mililitre hücre süspansiyonu ve 4.5 mililitre taze ortam ekleyin mitotik olarak inaktive edilmiş fare embriyonik fibroblastları içeren taze bir PBS yıkanmış T 25 şişesine yerleştirin.

Şişedeki ortamı her gün değiştirin. PBS'de 10 santimetrelik bir tabağı% 0.1 jelatin ile kaplayın ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, ortamı çıkararak bir insan embriyonik kök hücrelerini toplayın ve hücreler ayrılırken T 25 şişesine bir mililitre acuta ekleyin.

330 mikrolitre donmuş bazal membran matrisine 6,6 mililitre soğuk ortam ekleyin. Çözeltiyi 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün ve altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğunu kaplamak için filtrelenmiş çözeltinin bir mililitresini kullanın. Hücreler daha sonra insan embriyonik hücrelerinin Accutane ile 30 dakikalık inkübasyonundan sonra kaplanmış plakalar üzerine kaplanacak, 1.5 mililitre Hess ortamı ekleyerek reaksiyonu durduracaktır.

Hücreleri şişeden kazıyın ve ardından sekiz mililitre daha Hess ortamı ekleyin. 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 10 mililitrelik bir pipet filtre hücresi ile hücreleri hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek tek hücreli bir çözelti üretin ve ardından hücreleri üç dakika boyunca santrifüjleyin 500 G'de, S süpernatantını çıkarın ve hücreleri 10 mililitre orta spin hücresinde 500 G'de üç dakika boyunca tekrar yeniden süspanse edin. Hücreleri, kaya inhibitörü Y 2 7 6 3 2 içeren 10 mililitre Hess S ortamında 10 mikromolar nihai konsantrasyonda askıya alın.

Daha sonra, süpernatanı jelatin kaplı tabak plakasından, jelatin kaplı tabak üzerindeki hücre süspansiyonundan çıkarın ve 37 santigrat derecede tam olarak bir saat inkübe edin. Bu adımlar sırasında hipoplast, insan embriyonik kök hücrelerinin serbest kalacağı jelatin kaplı plakalara yerleşecektir. Uzun inkübasyon kök hücrelerin topaklanmasına neden olacağından ve kısa inkübasyon fibroblastlar bağlandığında bu fibroblastların sadece birkaçını çıkaracağından, yüzer süre çok önemlidir.

Yapışmayan kök hücreleri plakadan nazikçe yıkamak için plakadaki ortamı kullanın. Plakayı 10 mililitre Hess ortamı ile ikinci kez yıkayın ve hücreleri bir araya getirin, hücreleri 500 G'de üç dakika santrifüjleyin, elde edilen S süpernatantını çıkarın ve hücreleri 10 mikromolar kaya inhibitörü Y 2, 7, 6, 3, 2 ve mililitre fiberblast büyüme faktörü iki başına 10 nanogram içeren yaklaşık dört mililitre şartlandırılmış ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri trian mavisi ile karıştırın ve bir hemo sitometre plakasında sayın.

Bodrum katından önce plakada santimetre kare başına 18.000 hücre. Membran kaplı plakalar, hücreleri oyuk başına 1.5 mililitre ortam ile kaplar ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edilir. 24 saat sonra, ortamı yenileyin 24 saat sonra, ortamı, mililitre fibroblast büyüme faktörü 2 72 saat başına sadece 10 nanogram ile desteklenmiş taze şartlandırılmış ortama değiştirin.

Hücreleri tohumladıktan sonra, serum replasman ortamını nakavt etmek için ortamı değiştirin. Bu zaman noktası, farklılaşmanın sıfır günü olarak adlandırılır. Önümüzdeki üç gün boyunca hücreleri her gün taze ortamla yenileyin.

Dördüncü ve beşinci günlerde ortamı değiştirirken,% 25 N iki takviye edilmiş orta ve% 75 nakavt serum replasmanından oluşan bir tane ekleyin. Altıncı günde orta, analiz için hücreleri hasat edin. Embriyo cisimleri birçok farklı çalışma için kullanılabilir.

İşte değişen konsantrasyonlarda metil cıvanın hücrelerin canlılığı üzerindeki etkisini gösteren örnek bir sitotoksisite çalışması. Bu grafikten, 14 gün boyunca maruz kaldıktan sonra 24 mikromolar noktasının %10 hücre ölümüne ve 1.61 mikromolar konsantrasyonun %50 hücre ölümüne neden olduğu belirlendi. Üç metil cıva tedavi grubunun embriyo cisimlerinden izole edilen RNA'lar, çok çeşitli biyobelirteçlere bakmak için bir mikrodizi üzerinde çalıştırıldı.

25 noktası mikromolar cıvaya maruz kalanlar kırmızı ile gösterilmiştir. Bir mikromolar metil cıvaya maruz kalanlar mavi renkle gösterilir ve kontrol RNA'sı yeşil renkle gösterilir. Bu temel bileşen analizi haritası, her bir tedavi grubunun genetik özelliklerinin, bir mikromolar metil cıva konsantrasyonuna maruz kaldığında iki kattan fazla modifiye edilen 276'dan fazla genin tümünde diğerinden önemli ölçüde farklı olduğunu göstermektedir.

Bu genlerin 30'u, 25 mikromolar noktasındaki düşük konsantrasyon grubu tarafından da modifiye edildi. Bu ısı haritasında, bir mikromolar tedavi grubunda modifiye edilen genlerin 233'ünün aşağı regüle edilen genler olduğu ve sadece 43'ünün tedavi tarafından yukarı regüle edildiği görülebilir. Triazol veya gelişme çağındaki karıncalarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken septi gözlük takmak, kimyasallara dayanıklı el eldivenleri takmak ve triol ile ilgili tüm işleri çeker ocakta yapmak gibi önlemler her zaman göz önünde bulundurulmalıdır.

Bu prosedürü takiben. Fenotipik ankraj gibi ek soruları yanıtlamak için tüp oluşumunuzu karıştırabilecek boyama, feros oluşumu gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.