Name: Kimyasal Güvenlik Tarama ve Sistem Biyolojisi Veri Üretimi Gelişim Toksisite Tahliller Tabanlı İnsan Pluripotent Kök Hücre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 28 s
Description: Keşfedin, insan embriyonik kök hücreleri ve transkriptom analizi kullanarak gelişimsel toksisite test sistemleri oluşturmayı. Bu yöntem, kimyasal güvenlik değerlendirmelerinde hayvan çalışmalarına olan bağımlılığı azaltmaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mükemmel teknik destek için M. Kapitza, Margit Henry, Tamara Rotshteyn, Susan Rohani ve Cornelia Böttinger'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Alman Araştırma Vakfı (RTG 1331) ve Alman Araştırma Bakanlığı (BMBF) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

<ol><li>Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Models+for+Drug+Discovery+and+Toxicology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Molecular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).</li>
<li>Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+in+Pharmaceutical+Biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Stem Cells in Pharmaceutical Biotechnology.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 12 (11), 1760-1773 (2011).</li>
<li>Leist, M., Hartung, T., Nicotera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dawning+of+a+new+age+of+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">The dawning of a new age of toxicology.</a> ALTEX. 25 (2), 103-114 (2008).</li>
<li>Kuegler, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+murine+embryonic+and+neural+stem+cells%2C+neurons+and+astrocytes%3A+reference+points+for+developmental+neurotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Markers of murine embryonic and neural stem cells, neurons and astrocytes: reference points for developmental neurotoxicity testing.</a> ALTEX. 27 (1), 17-42 (2010).</li>
<li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+oocytes+reprogram+adult+somatic+nuclei+of+a+type+1+diabetic+to+diploid+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells.</a> Nature. , (2014).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature cell biology. 16 (1), 118-126 (2014).</li>
<li>Zimmer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Developmental+Toxicants+and+Signaling+Pathways+in+a+Functional+Test+Based+on+the+Migration+of+Human+Neural+Crest+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Developmental Toxicants and Signaling Pathways in a Functional Test Based on the Migration of Human Neural Crest Cells.</a> Environmental Health Perspectives. 120 (8), 1116-1122 (2012).</li>
<li>Bosman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+Functional+Evidence+of+HCN4+and+Caveolin-3+Interaction+During+Cardiomyocyte+Differentiation+from+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Molecular and Functional Evidence of HCN4 and Caveolin-3 Interaction During Cardiomyocyte Differentiation from Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (11), 1717-1727 (2013).</li>
<li>Sartiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+cardiomyocytes+differentiated+from+human+embryonic+stem+cells%3A+A+molecular+and+electrophysiological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in cardiomyocytes differentiated from human embryonic stem cells: A molecular and electrophysiological approach.</a> Stem Cells. 25 (5), 1136-1144 (2007).</li>
<li>Xu, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+medium+supporting+cardiomyocyte+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells.</a> Differentiation. 76 (9), 958-970 (2008).</li>
<li>Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+cardiomyocyte+differentiation+from+human+embryonic+stem+cells+under+3-D+and+2-D+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells under 3-D and 2-D culture conditions.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (2), 200-206 (2013).</li>
<li>Subramanian, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+Culture+for+Enhanced+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+to+Hepatocyte-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Spheroid Culture for Enhanced Differentiation of Human Embryonic Stem Cells to Hepatocyte-Like Cells.</a> Stem Cells and Development. 23 (2), 124-131 (2014).</li>
<li>Sivertsson, L., Synnergren, J., Jensen, J., Bjorquist, P., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+Differentiation+and+Maturation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+Cultured+in+a+Perfused+Three-Dimensional+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Hepatic Differentiation and Maturation of Human Embryonic Stem Cells Cultured in a Perfused Three-Dimensional Bioreactor.</a> Stem Cells and Development. 22 (4), 581-594 (2013).</li>
<li>Jagtap, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+arabinoside+induces+ectoderm+and+inhibits+mesoderm+expression+in+human+embryonic+stem+cells+during+multilineage+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cytosine arabinoside induces ectoderm and inhibits mesoderm expression in human embryonic stem cells during multilineage differentiation.</a> British Journal of Pharmacology. 162 (8), 1743-1756 (2011).</li>
<li>Krug, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+test+systems+for+developmental+neurotoxicity%3A+a+transcriptomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived test systems for developmental neurotoxicity: a transcriptomics approach.</a> Archives of Toxicology. 87 (1), 123-143 (2013).</li>
<li>Leist, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Test+systems+of+developmental+toxicity%3A+state-of-the+art+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Test systems of developmental toxicity: state-of-the art and future perspectives.</a> Archives of Toxicology. 87 (12), 2037-2042 (2013).</li>
<li>Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Molecular medicine. 6 (2), 88-95 (2000).</li>
<li>Khoo, M. L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+of+embryoid+bodies+derived+from+human+embryonic+stem+cells%3A+Effect+of+glucose+and+basic+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells: Effect of glucose and basic fibroblast growth factor.</a> Biology of Reproduction. 73 (6), 1147-1156 (2005).</li>
<li>Son, M. Y., Kim, H. J., Kim, M. J., Cho, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+Passaging+of+Embryoid+Bodies+Generated+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Physical Passaging of Embryoid Bodies Generated from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Plos One. 6 (5), (2011).</li>
<li>Winkler, J., Sotiriadou, I., Chen, S., Hescheler, J., Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+embryonic+stem+cells+combined+with+-omics+technologies+as+model+systems+for+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">The potential of embryonic stem cells combined with -omics technologies as model systems for toxicology.</a> Current medicinal chemistry. 16 (36), 4814-4827 (2009).</li>
<li>Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+accelerated+patient-+and+disease-specific+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery.</a> Current medicinal chemistry. 17 (8), 759-766 (2010).</li>
<li>Miller, M. T., Stromland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratogen+update%3A+Thalidomide%3A+A+review%2C+with+a+focus+on+ocular+findings+and+new+potential+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Teratology%22%5BJournal%5D)">Teratogen update: Thalidomide: A review, with a focus on ocular findings and new potential uses.</a> Teratology. 60 (5), 306-321 (1999).</li>
<li>Newman, C. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratogen+Update+-+Clinical+Aspects+of+Thalidomide+Embryopathy+-+A+Continuing+Preoccupation%5BTitle%5D)+AND+%22Teratology%22%5BJournal%5D)">Teratogen Update - Clinical Aspects of Thalidomide Embryopathy - A Continuing Preoccupation.</a> Teratology. 32 (1), 133-144 (1985).</li>
<li>Stern, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+the+teratogenic+potential+of+drugs+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Obstetrics+and+gynecology%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of the teratogenic potential of drugs in humans.</a> Obstetrics and gynecology. 58 (5 Suppl), 3S-8S (1981).</li>
<li>Lynch, H. T., Reich, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diethylstilbestrol%2C+Genetics%2C+Teratogenesis%2C+and+Tumor+Spectrum+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">Diethylstilbestrol, Genetics, Teratogenesis, and Tumor Spectrum in Humans.</a> Medical Hypotheses. 16 (3), 315-332 (1985).</li>
<li>Satoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+teratology+of+mercury+and+its+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Tohoku+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Behavioral teratology of mercury and its compounds.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 1-9 (2003).</li>
<li>Meganathan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Thalidomide-Specific+Transcriptomics+and+Proteomics+Signatures+during+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Identification of Thalidomide-Specific Transcriptomics and Proteomics Signatures during Differentiation of Human Embryonic Stem Cells.</a> Plos One. 7 (8), (2012).</li>
<li>Balmer, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+changes+and+disturbed+neural+development+in+a+human+embryonic+stem+cell-based+model+relating+to+the+fetal+valproate+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic changes and disturbed neural development in a human embryonic stem cell-based model relating to the fetal valproate syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 21 (18), 4104-4114 (2012).</li>
<li>Smirnova, L., Hogberg, H. T., Leist, M., Hartung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+neurotoxicity+-+Challenges+in+the+21st+Century+and+In+Vitro+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Developmental neurotoxicity - Challenges in the 21st Century and In Vitro Opportunities.</a> ALTEX. 31 (2), 129-156 (2014).</li>
<li>Leist, M., Efremova, L., Karreman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+for+thought+...+considerations+and+guidelines+for+basic+test+method+descriptions+in+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Food for thought ... considerations and guidelines for basic test method descriptions in toxicology.</a> ALTEX. 27 (4), 309-317 (2010).</li>
<li>Zimmer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+waves+of+gene+expression+during+neuronal+differentiation+of+embryonic+stem+cells+as+basis+for+novel+approaches+to+developmental+neurotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Coordinated waves of gene expression during neuronal differentiation of embryonic stem cells as basis for novel approaches to developmental neurotoxicity testing.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (3), 383-395 (2011).</li>
<li>Experion RNA StdSens Analysis Kit for RNA analysis by Electrophoresis. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10000976B%20%20RNA%20STDSENS%20MANUAL.PDF">http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10000976B%20%20RNA%20STDSENS%20MANUAL.PDF</a> (2014).</li>
<li>Affymetix GeneChip 3 IVT Express Kit for Target RNA preparation, Fragmentation and hybridization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://microarray.csc.mrc.ac.uk/downloads/3'%20IVT%20Express%20Manual.pdf">http://microarray.csc.mrc.ac.uk/downloads/3'%20IVT%20Express%20Manual.pdf</a> (2014).</li>
<li>Affymetrix GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.affymetrix.com/catalog/131467/AFFY/Hybridization,-Wash,-and-Stain-Kit#1_1">http://www.affymetrix.com/catalog/131467/AFFY/Hybridization,-Wash,-and-Stain-Kit#1_1</a> (2014).</li>
<li>Affymetrix GeneChip Operating Software. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.affymetrix.com/estore/partners_programs/programs/developer/gcos_sdk/gcos_sdk_overview.affx#1_1">http://www.affymetrix.com/estore/partners_programs/programs/developer/gcos_sdk/gcos_sdk_overview.affx#1_1</a> (2014).</li>
<li>Partek Genomics Suite. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.partek.com/pgs">http://www.partek.com/pgs</a> (2014).</li>
<li>ChIP DNA Clean and Concentrator. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/pcr-dna-clean-up-concentration/chip-dna-clean-concentrator">http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/pcr-dna-clean-up-concentration/chip-dna-clean-concentrator</a> (2014).</li>
<li>Kraljevic, S., Stambrook, P. J., Pavelic, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerating+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Accelerating drug discovery.</a> EMBO Reports. 5 (9), 837-842 (2004).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Toksikolojik testler Geleneksel yaklaşımlar dolayısıyla test masraflı ve zaman alıcı hale kapsamlı hayvan çalışmaları içerir. Ayrıca, türler arası farklılıklar nedeniyle klinik öncesi hayvan güvenlik çalışmaları insanlar için uygun potansiyel ilaçların toksisitesi etkilerini tahmin etmek her zaman geçerli değildir. Insan olmayan primatlar, en öngörülebilir, halen etik güçlü ve sosyoekonomik talepleri hızla in vitro testinde hassas ve sağlam gelişen modern toplumlar tarafından yükselterek rağmen insan...

hücrelerin çeşitli içine ayırt etmek, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) yeteneği in vitro toksisite testleri 1, hastalık modelleme ve rejeneratif tıp 2 yeni bir dönem açtı. kök hücreler kendini çoğaltmak için kapasite, onların pluripotent devleti korumak için, ve özelleşmiş hücrelere 3,4 içine ayırt etmek için sahiptirler. HESC özellikleri, aynı zamanda, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSC) ya da nükleer transfer 5 tarafından üretilen hücreler gibi diğer insan pluripotent kök hücreleri, bulunan (kapasitesi tüm ana hücre tiplerine ayırt etmek için). Örneğin, birçok farklı HESC hatları hücreler 13,14 gibi nöronlar 6, böbrek hücreleri 7, nöral krest hücrelerinden 8, kardiyomiyositler 9-12 veya hepatositlere ayırt edilmiştir. Dahası, HESC kendiliğinden embriyoid organları (EBS) 19,20 her üç germ 15-18 hücre içine ayırt edebilirsiniz. Early embriyonik gelişim mikro-dizi teknolojisi kullanılarak 15 transkriptomik mRNA düzeyinde yakalandı farklı germ ile ilgili çeşitli genlerin farklı sunum-düzenlenir. Bu çabalar HESC / hiPSC ve transkriptomik analizi (inceleme için 21,22 bakınız) dayalı organa özgü toksikolojik modellerin kurulması ile sonuçlandı. Bu modeller laboratuar hayvanları hep insan güvenliği tahmin değildir kullanarak preklinik çalışmalarda olarak toksikolojik çalışmalar için laboratuvar hayvanlarının geleneksel kullanımı üzerinde avantajları var. hastalarda karşılaşılan ilaca bağlı toksisiteleri genellikle insanlar ve deney hayvanlarında arasında farklılık metabolik veya sinyal süreçleriyle ilgilidir. türler farkı insanlarda gelişimsel toksisite güvenilir erken teşhis engelledi ve bu talidomid 23,24 ve 25,26 olarak dietilstilbestrol örnek ilaçlar nedeniyle teratojenite piyasadan çekildi. Thalidomide sıçan veya farelerde herhangi gelişimsel toksisite göstermemiştir. Örneğin metil civa 27 Çevresel kimyasal maddeler, çeşitli türlerde sinir sistemi ile ilgili prenatal gelişim toksisite sonuçlandı, ancak insan belirtiler hayvanlarda modellemek zor olmuştur. Türlerin özgüllüğü sorunları sorunu çözmek için, farklı projelerde altında çalışan bilim adamları vb şüphelenilen insan toksik atıkları kullanarak embriyonik toksisite, nörotoksisite, kardiyotoksisite, hepatotoksisite ve nefrotoksisite için farklı modellerin geliştirilmesinde başlattık reprotect, ESNATS, dedektif gibi kök hücreleri dayalı insanları etkiler. Avrupa konsorsiyumu projesinde &#39;Embriyonik Kök hücre tabanlı Roman Alternatif Test Stratejileri (ESNATS)&#39; kapsamında beş test sistemleri kurulmuştur. Bir test sistemi olarak adlandırılan UKK (U niversitäts k linikum K OLN) test sistemi kısmen erken insan embriyonik gelişmeyi yakalar. Bu s olarakistem insan embriyonik H9 hücreleri üç germ (ektoderm, endoderm ve mezoderm) 15 ve germ tabakası belirli imzalar Affymetrix mikroarray platformu kullanarak profil transkriptomik tarafından esir edilmiş olarak ayrılır. Talidomid 28, valproik asit, metil cıva 16,17 veya sitosin arabinosid 15 gibi çeşitli gelişimsel toksik maddeler bu sistemde test edilmiştir ve zehirli spesifik gen imzalar elde edilmiştir. Ikinci bir test sisteminde, bu nedenle test sistemi 1 UKN1 (K onsta n = U niversity) olarak adlandırılan, H9 hücreleri 6 gün süreyle nöroektodermal projenitör hücreleri (NEP) ile ayrılır. Bu tür Pax6 ve OTX2 olarak nöral gen belirteçleri yüksek ifadesi ile belirlenir. Farklılaşma sırasında 6 gün, NEP hücreler gibi VPA, metil cıva gibi gelişimsel nöro-toksik maruz kalmıştır. Zehiri özgü de regüle transkriptomik profilleri obtai olmuşturAffymetrix mikroarray platformu 16,29 ile de tanımlanır. 21. yüzyılın toksikoloji için yeni bir vizyon test sistemleri uzun vadeli toxicant inkubasyon sonunda in vivo histopatolojik veya transcriptome değişiklikleri gibi fenotipik açıklamaları verim yapmak değil sadece öngörmektedir. Daha çok tahliller mekanistik bilgi 3. sağlamak ve bu bilgilerin sözde eşlenebilir düşündürmektedir olumsuz sonuç yolları (AOP) zararlı etkilerinden 30 için bilimsel gerekçe sağlamak. Bu tür bilgi vermek, uygulamalı test sistemleri yüksek kaliteli sağlam standart operasyon prosedürlerine göre belgelenmiş örneğin olarak, 31 kontrol edilmesi gerekiyor. Ayrıca, zaman-bağımlı değişiklikler yüksek çözünürlüklü eşlenmesi gerekir. Bu senkronize değişikliklerle 32 test sistemlerini gerektirir. Burada anlatılan UKN1 ve UKK test sistemleri bu gereksinimleri için optimize edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11320082</td><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartalı Ortam: Besin Karışımı F-12</td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10828028</td><td>Nakavt Serum Değişimi</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>GlutaMAX takviyesi</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190-0144</td><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin, kalsiyumsuz, magnezyumsuz</td></tr><tr><td>mTeSR ortamı</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>V alt plaka</td><td>VWR</td><td>734-0483</td><td>Plaka, Microwell, V BTTM, 96 Kuyu, Steril 1 * 50 ST</td></tr><tr><td>V alt plaka kapağı</td><td>VWR</td><td>634-0011</td><td>Kapak, Mikrotitre plakaları, Kond. Yüzük 1 * 50 ST</td></tr><tr><td>Kalem/Strep</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td>Penisilin-Streptomisin, Sıvı</td></tr><tr><td>Damıtılmış Su</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15230-089.</td><td>Steril Damıtılmış Su</td></tr><tr><td>İnsan FGF-2 (bFGF)</td> <td>Millipore</td><td>GF003AF-100UG</td><td>Fibroblast Büyüme Faktörü baz, insan rekombinant, hayvansız</td></tr><tr><td>Filtre 0.22 & mu; m</td><td>Millipore SCGPU02RE</td><td></td><td>Stericup-GP, 0.22 & mu; m, polietersülfon, 250 ml, radyo-sterilize</td></tr><tr><td>StemPro EZPassageTM Disposablte</td><td>Invitrogen</td><td>23181010</td><td></td></tr><tr><td>BD MatrigelTM, hESC onaylı Matris Kök</td><td>Hücre Teknolojileri</td><td></td><td>354277 5 ml flakon</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater Stabilizasyon Çözümü</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM7020</td><td>Dondurulmamış numunelerde RNA bütünlüğünü stabilize eder ve korur.</td></tr><tr><td>70 &mu; m Hücre Süzgeci</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td>70 & mu ile hücre süzgeci; m Naylon ağ</td></tr><tr><td>35 & mu; m Kapak hücreli süzgeç, 5&nbsp; ml tüp</td><td>Becton Dickinson</td><td>352235</td><td>5 ml polistiren yuvarlak tabanlı test tüpü, hücre süzgeç kapaklı (35&nbsp; &mu; m)</td></tr> <tr><td>50 ml steril Polipropilen tüp</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>50 ml Konik tabanlı polipropilen tüp, Steril</td></tr><tr><td>T75 şişe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td>CELLSTAR Filtre Kapağı Hücre Kültürü 75 cm2 Şişeler</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>10296010</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu optik alt plakalar</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Blue</td><td>Promega</td><td>G8081</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA</td><td>L11-007</td><td></td></tr><tr><td>Apotransferin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-2036</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Worthington Biyokimyasallar</td><td>LS002104</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorfin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAA</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco Canlandırıcı</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco Canlandırıcı</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt DMEM</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R& D Sistemleri</td><td>719-NG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom AG</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7556</td><td></td></tr><tr><td>Putresin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5780</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitörü Y-27632</td><td>Tocris Biosciences</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris Biosciences</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>Selenyum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5261</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Kitlerin Listesi</strong</td></tr><tr><td>>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Hibridizasyon, Yıkama ve Leke Kiti</td><td>Affymetrix</td><td>900721, 22, 23</td><td>Bu kit, mikrodizilerin hibridizasyon, yıkama ve boyama için gerekli tüm reaktifleri sağlar.</td></tr><tr><td>Rnaz İçermeyen DNase Seti</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Ekipman listesi</td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX71</td></tr><tr><td>Genechip Hibridizasyon Fırını - 645</td><td>Affymetrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genechip Akışkan İstasyonu-450</td><td>Affymetrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix Gen Çip Tarayıcı-3000-7 G</td><td>Affymetrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectramax M5</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td> &#160; &#160; &#160;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Yazılım listesi</td></tr><tr><td>Prism 4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix GCOS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Partek Genomic Suite 6.25</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İşlevsel açıklama için çevrimiçi araçlar DAVID Onto-tools Akıllı Sistemler ve Biyoinformatik Laboratuvarı</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kimyasal güvenlik tarama ve sistem biyolojisi veri Üretimi gelişim toksisite tahliller tabanlı İnsan pluripotent kök hücre

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

-omics Teknolojiler potansiyel ilaçların in vitro toksisite testleri için yeni ufuklar açtı verimli protokoller arada çeşitli dokularda insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek. Bu tür tahliller için sağlam bir bilimsel temel sağlamak için, gelişim zamanı seyrine ve sistemler biyolojisi yaklaşımları ile altta yatan düzenleyici mekanizmaları üzerine sayısal bilgiler elde etmek için önemli olacaktır. İki tahlilleri dolayısıyla bu gereksinimler için buraya ayarlandı. UKK test sistemi olarak, insan embriyonik kök hücreleri (HESC) (veya başka bir pluripotent hücreler) kendiliğinden üç germ hücrelerinin üretilmesini sağlamak için, embriyoid organları 14 gün ayırt etmek için bırakılır. Bu sistem, erken insan embriyonik gelişiminin önemli adımlar özetlediği ve hücreler farklılaşma sırasında kimyasallara maruz kalırsanız o, insana özgü erken embriyonik toksisite / teratojenite tahmin edebilirsiniz. UKN1 test sistemi bir populat için ayırt hESC dayanmaktadırnöroektodermal dede iyon (NEP) 6 gün boyunca hücreler. Bu sistem, erken nöral gelişimi özetlediği ve erken gelişim nörotoksisiteyi ve kimyasallar tarafından tetiklenen epigenetik değişiklikler öngörüyor. Her iki sistem de, transcriptome mikrodizi çalışmaları ile kombinasyon halinde, toksisite biyolojik göstergeleri için uygundur. Ayrıca, sistem biyolojisi analiz için veri üretmek için kombinasyon halinde kullanılabilmektedir. Bu test sistemleri, hayvanların büyük miktarlarda gerektiren geleneksel toksikolojik çalışmalar bir çok dezavantajı vardır. test sistemleri, ilaç geliştirme ve kimyasal güvenlik değerlendirmesi için maliyetlerin azalmasına katkıda bulunabilir. Onların kombinasyonu özellikle özel nöro-gelişimsel sürecini etkileyebilir bileşikler ışık tutuyor.

UKK test sistemi Metil civa poz Sitotoksisite tahlili IC 10 bir değer metil cıva sitotoksisite için (% 10 canlılığı azalma) (Şekil 1) elde etmek üzere H9 EBS ile gerçekleştirildi. Biz de bir mikrodizi tabanlı (affymetrix platformu) biyomarker çalışması gerçekleştirdi. H9 EBS 14 gün boyunca metil civa (0.25 1 uM) maruz kalmıştır. 14. günde numuneler Trizol ile toplanmış ve RNA izole edildi. Transkripsiyonal profilleme İnsan Genom U133 artı 2,0 dizi yongaları kullan...

protokoller, insan embriyonik kök hücreleri ve transcriptome çalışmalarına dayalı iki in vitro gelişimsel toksisite test sistemleri (UKK ve UKN1) açıklar. test sistemleri, insan gelişimsel toksisite tehlike tahmin ve hayvan çalışmaları, maliyet ve kimyasal güvenlik testi için gerekli süreyi azaltmak için katkıda bulunabilir.

Kimyasal Güvenlik Tarama ve Sistem Biyolojisi Veri Üretimi Gelişim Toksisite Tahliller Tabanlı İnsan Pluripotent Kök Hücre

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Bu prosedürün genel amacı, insan embriyonik kök hücrelerine ve transkriptom çalışmalarına dayalı iki in vitro gelişimsel toksisite test sistemini tanımlamaktır. Bu, öncelikle insan embriyonik kök hücrelerinin fare embriyonik fibroblastları üzerinde kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, ya insan embriyonik kök hücrelerinin üç germ tabakasının tüm hücrelerini oluşturabilecekleri embriyoid cisimler oluşturmasına izin vermek ya da onları nöroektodermal progenitörlere farklılaştırmaktır.Ardından, farklıyeleşme sırasında embriyo gövdeleri veya nöroektodermal progenitörler, ilgilenilen bileşiklerle farklı konsantrasyonlarda işleme tabi tutulur. Son adımlar, hücrelerin canlılığının değerlendirilmesi ve RNA'nın izole edilmesidir. Nihayetinde, ilgilenilen bir bileşik ile işlem görmüş hücrelerdeki RNA ekspresyonundaki değişimleri, işlem görmemiş kontrol hücreleri ile karşılaştırmak için transkriptom mikroarray analizi kullanılır. İnsan neoni kök hücreleri ve DNA makro alanlarına dayanarak, insana özgü gelişimsel toksisite etkilerinin izlenmesine olanak tanıyan bir in vitro metodoloji oluşturmuş bulunmaktayız.Bu metodoloji, potansiyel ilaçların ve çevresel toksikanların güvenlik taraması için ilaç ve kimya endüstrisi tarafından uygulanabilir. Bu yöntem, kimyasalların çok erken nörogelişim üzerindeki etkisi gibi gelişimsel toksisite alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başlamak için, kök hücre ortam takviyesini oda sıcaklığında çözün ve bundan 100 mililitresini 400 mililitre bazal kök hücre ortamına ekleyin.Ardından, bazal membran matrisini buz üzerinde çözün ve ardından üreticinin önerdiği şekilde, matrisin tamamlayıcı hacmini 24 mililitre soğutulmuş dmm. F 12 bazal medyuma ekleyin, pipetle nazikçe aşağı yukarı çekerek çözeltiyi karıştırın ve ardından karışımın iki mililitresini 12 ayrı altı santimetrelik plağa ekleyin. Matris plakaları kaplarken, plakaları oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.Ardından besiyerini uzaklaştırın ve iki mililitre kök hücre besiyeri ekleyin. Sonra, fare embriyonik fibroblast feeder katmanları üzerinde büyütülen, ekteki metin içi protokolde açıklandığı şekilde hazırlanan insan embriyonik H9 hücrelerini içeren dört konfluen plağı inkübatörden çıkarın. Bir stereoskop altında, bir mililitrelik pipet ucu kullanarak farklılaşmış kolonileri plaktan uzaklaştırın.Farklılaşmamış kolonların sınırları belirgindir ve hücreler kompakttır, buna karşın farklılaşmış hücreler sınırlardan dışarıya doğru yayılmaya başlar ve hücre boyutları daha büyüktür. Besiyerini aspire edin ve hücreleri dört mililitre PBS ile yıkayın. Ardından, bir stereoskop yardımıyla iki mililitre kök hücre besiyeri ekleyin.Kolonileri 26 gauge iğne ile her birini altı ila dokuz parçaya ayıracak şekilde kesin ve kümeleri bir mililitrelik pipet uçlarıyla sıyırın. Kesilen kolonileri nazikçe 50 mililitrelik bir falcon tüpüne toplayın ve 200 G'de beş dakika boyunca pelletleyin. Ardından, süpernatantı aspire edin ve hücreleri 12 mililitre kök hücre ortamında resüspande edin.Hücre süspansiyonundan 20 µL'yi bir lam üzerine yerleştirin ve mikroskop altında kümelerin sayısını belirleyin. Süspansiyon konsantrasyonunu mililitrede 150 küme olacak şekilde ayarlayın ve ardından her bir 6 cm'lik plağa iki mililitre süspansiyon ekleyin. Hücrelerin homojen bir şekilde dağılması için plakları ileri geri ve yanlara doğru hareket ettirin ve ardından plakları bir hücre kültürü inkübatöründe gün aşırı olarak inkübe edin.Besiyerini dikkatlice değiştirin. Diferansiye olmuş koloniler çıkarıldıktan sonra, Vbo 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 40 µL steril %5 blok kopolimer çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Koloniler içeren konfluen plakayı inkübatörden çıkarın ve bir stereo mikroskop altında, bir mililitrelik pipet ucuyla diferansiye olmuş kolonileri seçerek alın. Ardından, plakadaki besiyerini aspire edin ve hücreleri dört mL PBS ile nazikçe yıkayın.Ardından, her plakaya iki mililitre rastgele diferansiyasyon ortamı ekleyin. H9 hücre kolonilerini tek tip boyuttaki kümeler halinde kesmek için pasaj aracını kullanın. Kümeleri bir hücre kazıyıcı ile kazıyın ve nazikçe 50 mililitrelik bir falcon santrifüj tüpüne toplayın.Koloni kümeleri 400 G'de beş dakika boyunca santrifüjlenir, ardından supernatant aspire edilir ve hücreler rastgele farklılaşma besiyerinde mililitre başına 1000 küme olacak şekilde yeniden süspanse edilir. Sonra, V tabanlı 96 kuyucuklu plaktaki blok kopolimer çok kanallı bir pipet yardımıyla aspire edilir; her bir kuyucuğa 100 µL koloni süspansiyonu eklenir. Plaka 4 °C'de dört dakika boyunca 400 G'de santrifüjlenerek kümeler V şeklindeki kuyucukların tabanında toplanır. Ardından plaka inkübatöre yerleştirilerek dört gün bekletilir. Geniş ağızlı 200 µL uçlar kullanılarak embriyo gövdeleri 96 kuyucuklu plaktan çıkarılır ve steril bir 122 mm kare plaka içerisine yerleştirilir.Ardından, embriyo gövdelerini kare plakadan 15 milliliter falcon tüpe aktarmak için 10 milliliter steril serolojik pipet kullanın. Embriyo gövdelerinin iki dakika boyunca çökmesine izin verin ve ardından süpernatantı aspire ederek embriyo gövdelerini beş milliliters PBS ile yıkayın. Embriyo gövdelerinin tekrar iki dakika boyunca çökmesini bekleyin ve ardından süpernatantı aspire edin.Bu kez embriyo gövdelerini beş mililitre rastgele diferansiyasyon besiyerinde yeniden süspande edin. Ardından, embriyo gövdelerini 10 santimetrelik bir bakteriyolojik plakaya aktarın ve 10 mililitre daha rastgele diferansiyasyon besiyeri ekleyin. Plakaları 37 °C ve %5 CO2 koşullarında, yatay bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.50 RPM hızda, beşinci, dokuzuncu ve 14. günlere ait temsilci embriyo gövdeleri gösterilmektedir. Her iki günde bir medyumu dikkatlice değiştirin ve 15 mililitrenin tamamını taze rastgele farklılaşma medyumu ile yenileyin. Bir ilacın farklılaşma üzerindeki etkisini değerlendirmek için, ekteki metin protokolünde açıklandığı üzere beşinci günden itibaren 10 gün boyunca medyuma ilaç eklemeye başlayın.Steril bir pipet kullanarak, embriyo gövdelerini 10 santimetrelik plakalardan 15 mililitrelik bir falcon tüpüne toplayın. İki dakika boyunca çökmelerini bekleyin, ardından süpernatanı aspire edin. Onları beş mililitre PBS ile yıkayın ve nükleaz içermeyen 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.Çökmelerini bekleyin ve üst fazı aspire edin. Embriyo gövdelerini bir mililitre triol reaktifi içinde süspande edin ve hücreleri parçalamak için çözeltiyi bir mililitrelik şırınga ve 24 gauge iğne yardımıyla yaklaşık 15 kez geçirin. Ardından, her örneğe 200 µL kloroform ekleyin.İçindekileri kısa bir süre vortekslendirin ve ardından numuneleri 4 °C'de, 12.000 G'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin; diğer katmanları bozmadan süpernatantı 1,5 ml'lik tüplere toplayın. Daha sonra süpernatanta eşit hacimde soğutulmuş %70 etanol ekleyin ve içeriği çalkalayarak nazikçe karıştırın. Karışımdan 700 µL'yi bir mini spin kolona aktarın ve son elüsyon adımında RNA'yı saflaştırmak için üreticinin talimatlarını izleyin.Spin kolonuna 22 µL nükleaz içermeyen su ekleyin ve tüpleri 12,000 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından toplama tüpünü çıkarın ve RNA'yı buz üzerinde bekletin. Konfluent her bir T 25 flask H9 hücresi için bir mL önceden ısıtılmış disc space ekleyin ve flask'ı 37 °C'de dokuz dakika inkübe edin.Ardından, uzaklaştırılan işlem görmüş hücrelere iki mililitre önceden ısıtılmış yıkama besiyeri ekleyin ve beş mililitrelik bir pipetle beş kez nazikçe yukarı aşağı pipetleyin. Hücre solüsyonunu bir falcon tüpüne aktarın.Ardından, balonu dokuz mililitre yıkama ortamı ile yıkayın ve bunu hücrelerin bulunduğu tüpe ekleyin. Hücreleri 500 G'de üç buçuk dakika boyunca santrifüj ederek toplayın. Daha sonra süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri 10 mililitre yıkama ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri tekrar 500 G'de üç buçuk dakika boyunca santrifüj edin ve ardından süpernatantı uzaklaştırıp hücreleri dört mililitre insan embriyonik kök hücre ortamında yeniden süspanse edin; mitotik olarak inaktive edilmiş fare embriyonik fibroblastları içeren, PBS ile yıkanmış taze bir T 25 balonuna 0,5 mililitre hücre süspansiyonu ve 4,5 mililitre taze ortam ekleyin.Erlenmeydeki besiyerini her gün değiştirin. 10 santimetrelik bir petri kabını, PBS içerisinde %0,1 jelatin ile kaplayın ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Ardından, besiyerini uzaklaştırarak insan embriyonik kök hücrelerini hasat edin ve hücreler ayrılırken T 25 erlenine bir mililitre accutase ekleyin.330 µL dondurulmuş bazal membran matriksine 6,6 mL soğuk besiyeri ekleyin. Çözeltiyi 40 µm'lik bir hücre süzgecinden süzün ve altı kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğu kaplamak için süzülmüş çözeltiden 1 mL kullanın. Hücreler, insan embriyonik hücrelerinin Accutane ile 30 dakikalık inkübasyonunun ardından kaplanmış plaklara ekilecektir; reaksiyonu 1,5 mL Hess besiyeri ekleyerek durdurun.Hücreleri flasktan kazıyın ve ardından sekiz mililitre ek Hess ortamı ekleyin. 10 mililitrelik bir pipetle nazikçe aşağı yukarı pipetleyerek tek hücre süspansiyonu oluşturun; hücreleri 40 µm'lik bir hücre süzgecinden süzün ve ardından hücreleri 500 G'de üç dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri 10 mililitre ortamda yeniden süspande edin; hücreleri 500 G'de üç dakika boyunca tekrar döndürün. Ardından süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri, nihai konsantrasyonu 10 µM olan rock inhibitörü Y 2 7 6 3 2 içeren 10 mililitre Hess S ortamında yeniden süspande edin.Ardından, jelatin kaplı kapçık plakasındaki süpernatanı ve jelatin kaplı kaptaki hücre süspansiyonunu uzaklaştırın ve tam olarak bir saat boyunca 37 °C'de inkübe edin. Bu adımlar sırasında, hipoblastlar jelatin kaplı plakalara çökecek, insan embriyonik kök hücreleri ise serbest kalacaktır. Yüzme süresi kritiktir; çünkü çok uzun inkübasyon kök hücrelerin kümelenmesine, çok kısa inkübasyon ise fibroblastların yapıştığında bunlardan yalnızca birkaçının uzaklaştırılmasına neden olur.Plakadaki ortamı kullanarak, yapışmayan kök hücreleri plaktan nazikçe yıkayın. Plağı 10 mL Hess ortamı ile ikinci kez yıkayın ve hücreleri birleştirin, hücreleri 500 G'de üç dakika boyunca santrifüjleyin, oluşan süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri 10 µM rock inhibitörü Y 2, 7, 6, 3, 2 ve 10 ng/mL fibroblast büyüme faktörü iki içeren yaklaşık 4 mL kondisyonlu ortamda yeniden süspande edin. Ardından, hücreleri tripan mavisi ile karıştırın ve bir hemositometre plağında sayın.Bazal membran kaplama işleminden önce plakaya santimetrekare başına 18, 000 hücre ekleyin. Membran kaplı plakalarda hücrelerin üzerini kuyuk başına 1,5 mililitre besiyeri ile kapatın ve 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında inkübe edin. 24 saat sonra besiyerini tazeleyin. Bir 24 saat daha geçtikten sonra, besiyerini yalnızca 10 nanogram/mililitre fibroblast büyüme faktörü 2 ile desteklenmiş taze kondisyonlu besiyeri ile değiştirin ve 72 saat bekletin.Hücreler ekildikten sonra, besiyerini knockout serum ikame besiyeri ile değiştirin. Bu zaman noktası, diferansiyasyonun sıfırıncı günü olarak adlandırılır. Sonraki üç gün boyunca hücreleri her gün taze besiyeri ile yenileyin.Dördüncü ve beşinci günlerde besiyeri değiştirilirken, %25 N iki takviyeli besiyeri ve %75 knockout serum ikamesinden oluşan bir karışım ekleyin. Altıncı günde, analiz için hücreleri hasat etmek üzere besiyeri kullanın. Embriyo gövdeleri birçok farklı çalışma için kullanılabilir.Burada, farklı metil cıva konsantrasyonlarının hücre canlılığı üzerindeki etkisini gösteren örnek bir sitotoksisite çalışması yer almaktadır. Bu grafikten, 14 günlük maruziyet sonucunda 24 micromolar noktasının %10 hücre ölümüne ve 1.61 micromolar konsantrasyonun %50 hücre ölümüne neden olduğu belirlenmiştir. Üç metil cıva uygulama grubunun embriyo gövdelerinden izole edilen RNA'lar, çok çeşitli biyobelirteçleri incelemek amacıyla bir mikro dizilim (microarray) analizine tabi tutulmuştur.25 µM cıvaya maruz kalanlar kırmızı ile gösterilmiştir. 1 µM metil cıvaya maruz kalanlar mavi ile, kontrol RNA'sı ise yeşil ile gösterilmiştir. Bu temel bileşen analizi haritası, her bir tedavi grubunun genetik özelliklerinin diğerlerinden önemli ölçüde farklılaştığını ve 1 µM metil cıva konsantrasyonuna maruz kalındığında 276'dan fazla genin iki katından fazla modifiye olduğunu göstermektedir.Bu genlerden 30 tanesi, 25 mikromolar noktasındaki düşük konsantrasyon grubu tarafından da modifiye edilmiştir. Bu ısı haritasında, bir mikromolar tedavi grubunda modifiye edilen genlerin 233'ünün aşağı regüle edilen genler olduğu ve tedaviden dolayı yalnızca 43'ünün yukarı regüle edildiği görülebilir. Triazol veya geliştirme karıncaları ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken güvenlik gözlükleri ve kimyasallara dayanıklı eldivenler takmak ve triol ile ilgili tüm çalışmaları çeker ocak altında yapmak gibi önlemlerin her zaman dikkate alınması gerektiğini unutmayın.Bu prosedürün ardından, fenotipik çıpalama gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla boyama veya tüp oluşumunuzu karıştırabilecek feros oluşumu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

human-pluripotent-stem-cell-based-developmental-toxicity-assays-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu makale, insan embriyonik kök hücre popülasyonlarının insan hepatik endoderm üretimi üzerinde durulacaktır.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil

Açıklanan protokoller, laboratuvarların programlanabilir bir sıvı işleme robotu ve 96 oyuklu plakalar kullanarak minimum işçilik, deneyim ve ekipman yatırım maliyeti ile yüksek verimde ölçeklenebilir, yapışık kök hücre kültürü gerçekleştirmesine olanak tanır.  Bu sistemde 20'den fazla kez geçen iPSC'ler pluripotentliği, normal karyotipleri korudu ve kardiyomiyositlere farklılaştı.

Bir Robotik Sıvı İşleme Sisteminin Kullanılması Ölçeklenebilir 96-iyi iPSC Kültür Bazlı Plaka ve Üretim

Çalışmanın amacı, empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analizörü ve in vitro toksikolojik değerlendirme için yüksek içerikli tarama (HCS) tabanlı bir platformun bir kombinasyonunu kullanarak 15 sigara dumanı bileşeninin biyolojik etkisini değerlendirmekti. Bu çalışma, test edilen bileşiklerin etkili dozları, toksisitesi ve etki şekilleri hakkında bilgi sağlar.

Zararlı ve Potansiyel Zararlı Bileşenlerinin Toksikolojik etkilerinin değerlendirilmesi için yüksek İçerik Tarama Analizi (HPHC)

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC), ilaç ve kimyasal tarama için ve nörotoksisiteyi de içeren toksisite testi için yeni in vitro modellerin geliştirilmesi için güçlü bir araç olarak düşünülür. Burada, hiPSC'lerin nöronlara ve glia'ya diferansiyelleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol anlatılmıştır.

Nörotoksisite Testi İçin İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Nöronlar ve Glia Karışık Kültürlerine Ayrıştırılması Protokolü

Burada sunulan Protokolü küçük moleküller karaciğer hastalığının tedavisi için tanımlamak için bir platform açıklar. Adım adım açıklamasını nasıl iPSCs hücrelere 96-şey plakaları hepatosit özellikleri ile ayırt etmek ve küçük moleküller için potansiyel terapötik etkinlik ile ekran için hücreleri kullanmak için ayrıntılı sunulmaktadır.

İnsan kullanarak Pluripotent kök hücre kaynaklı hepatosit benzeri hücreler indüklenen ilaç bulma için

Biz, toplu, verimli ve hızlı kimyasal reversion lineage astarlanmalıdır geleneksel insan pluripotent kök hücre (hPSC) bir epigenomically-kararlı saf Preimplantasyon epiblast benzeri pluripotent devlet için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem düşük lineage astarlanmalıdır gen ekspresyonu ve yönettiği multilineage ayrımında belirgin iyileşme geleneksel hPSC satırları arasında geniş bir repertuar sonuçlanır.

Geleneksel insan Pluripotent kök hücreler kimyasal Reversion için geliştirilmiş Multilineage farklılaşma potansiyeli ile saf gibi devlet

Bu iletişim kuralı insan pluripotent kök hücreler 96 iyi plaka kartvizitlere hepatosit benzeri hücreleri üretmek için yarı otomatik bir yaklaşımı açıklar. Bu hızlı ve uygun maliyetli, hepatosit benzeri hücreler temel ve uygulamalı insan araştırma için toplu halde üretim kalite güvence sağlayan işlemdir.

Hepatosit Pluripotent kök hücreler hücreleri gibi yarı otomatik üretimi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hastalık modellemesi için umut verici bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Burada, hiPSC-CM'lerin kontraktilitesini ve elektrofizyolojisini ölçmek için bir protokol detaylandırıyoruz.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositler Üzerindeki Mikroelektrot Dizisi ve Yama Kelepçesi Kayıtlarının Teknik Uygulamaları

İnsan iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin kasılma fonksiyonlarındaki ve hücresel bütünlüğündeki değişikliklerin analizi, klinik olmayan ilaç gelişimi için büyük önem taşımaktadır. Hibrit bir 96 kuyucuklu hücre analiz sistemi, klinik aşamalara güvenli bir geçiş için gerekli olan güvenilir, insanla ilgili sonuçlar için her iki parametreyi de gerçek zamanlı ve fizyolojik bir şekilde ele alır.

Preklinik Kardiyak Risk Değerlendirmesi için İnsan iPSC Kaynaklı Kardiyomiyositlerin Yapısal ve Kasılma Değişikliklerini Değerlendirmek için Hibrit Hücre Analiz Sistemi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), klinik öncesi kardiyotoksisite taraması için hayvanların kullanılmasına bir alternatif sunar. Preklinik toksisite taramasında hiPSC-CM'lerin yaygın olarak benimsenmesinin bir sınırlaması, hücrelerin olgunlaşmamış, fetal benzeri fenotipidir. Burada hiPSC-CM'lerin sağlam ve hızlı olgunlaşması için protokoller sunulmaktadır.

Olgun İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyosit Monokatmanları Kullanılarak Yüksek Verimli Kardiyotoksisite Taraması

Bu çalışmada, teratojenik kimyasalları tanımlamak için bir in vitro hücre testi sunuyoruz. Fibroblast büyüme faktörü (FGF)/serum yanıt faktörü (SRF) sinyallemesinin dinamikleri, insan kaynaklı pluripotent kök (iPS) raportör hücrelerinde ölçüldü ve teratojenite riski, bu sinyal yolunun kimyasal bozulması ölçülerek değerlendirildi.<br...

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde fibroblast büyüme faktörü sinyal bozulmasının gerçek zamanlı izlenmesine dayalı gelişimsel toksisite testi

Keşfedin, insan embriyonik kök hücreleri ve transkriptom analizi kullanarak gelişimsel toksisite test sistemleri oluşturmayı. Bu yöntem, kimyasal güvenlik değerlendirmelerinde hayvan çalışmalarına olan bağımlılığı azaltmaya yardımcı olur.

Kimyasal Güvenlik Tarama ve Sistem Biyolojisi Veri Üretimi Gelişim Toksisite Tahliller Tabanlı İnsan Pluripotent Kök Hücre

Daha fazla video keşfet