Name: Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Öğrenin, perkütan iğne biyopsisiyle elde edilen iskelet kası dokusundan mitokondri izolasyonu ve respirometrik analiz yöntemini. Bu teknik minimal doku gereksinimiyle klinik araştırmalar için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Boston Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden Dr. Marc Liesa'ya, yararlı tartışmalara, Wake Forest Tıp Fakültesi'nden Bayan Karin Murphy'ye, Bayan Heather Gregory'ye ve Bay John Stone'a, bu protokolün geliştirilmesindeki yardımcı teknik yardımları için teşekkür ederiz.

NOT: Tıp Wake Forest Okulu Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmıştır açıklanan protokol. Aydınlatılmış onam yazılı elde edilmiştir. Tüm katılımcılar 23-35 arasında değişen BYES ile, her iki cinsiyette sağlıklı yaşlı yetişkinler (65-79 yaş) idi. 1. İskelet Kası Biyopsi <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi, 9 bir O / N hızlı sonra sabahın erken saatlerinde tüm biyopsi. Biyopsi öncesi hafta kanama, trombosit, ya da morarma etkileyebilir aspirin, reçete ve over-the-counter non-steroid anti-inflamatuar ilaçlar, ya da diğer bileşikleri almaktan kaçınmaları konular isteyin. Ayrıca biyopsi öncesinde en az 36 saat süreyle herhangi bir yorucu hareketlerden kaçınmalısınız isteyin. NOT: Kas% 1 lidokain ile lokal anestezi altında perkütan iğne ile perkütan iğne biyopsisi tekniği kullanılarak lateralis vastus elde edilir. Hiçbir tıbbi komplikasyon ya da other prosedürden advers olaylar klinik araştırma biriminde meydana gelmiş bildirildi. </li><li> NOT: tarif biyopsi işlemi Bergstrom 10 o uyarlanmıştır. <ol><li> Kısaca, yerel kas sızmak için% 1 lidokain alma bakım yönetmek. Yeterli uyuşturma izin için 10 dakika bekleyin dönemi ile bu izleyin. </li><li> Subfasiyal ve myotendonous alanları kaçınarak kas (ekleme ve menşe arasındaki kasın orta bölge) karnından biyopsi al. <ol><li> Perkütan iğne (pencere ve iç kesim silindiri kesme bir tarafı ile bir emme destekli yeniden cihaz) kullanın ve bir rehber olarak fasya bir fasiyal &quot;pop&quot; veya direnç izleyin. </li><li> , Anestezi iğnesi ile derinliğini tahmin sonra tekrar dar neşter bıçağı ile hissediyorum ve fasya ile 4-5 mm kesi yapmak. O kas içine sokulur kadar kesikten iğne Advance. </li><li> Toplamakpencere birden çok numune farklı yönlerde dönmektedir. Ilerleyen ve farklı yönlere perkütan iğne içine 2-4 kez kas örnekleri geri çekilirken bir 60 cc şırınga kullanarak sürekli emme uygulayın. Emiş durdurun ve iğneyi çıkartın. NOT: Her geçiş (ekleme ve iğne çıkarılması) bir dakikadan az sürer. </li><li> 5 dk hemostaz kurmak için bir asistan sitesine delinmeye firma baskı uygulayın var. Emme boru iğne ayırın ve dikkatle pencere ve varil kas örnekleri çıkarın. </li></ol></li><li> Daha fazla kas Yukarıdaki prosedürü tekrarlayarak gerekirse ikinci bir geçiş yapın. </li><li> , Forseps kullanarak kas örneğinden herhangi bir görünür kan pıhtıları çıkarın örneği tartmak ve hemen buz gibi soğuk DPBS içeren bir tüp yerleştirmek. NOT: Bu yöntemi kullanarak ortalama verim 150 ± 20 mg. </li></ol></li></ol> 2. Mitokondriyal İzolasyon &lt;ol&gt; <li> Taze deneyde, ya alikotunun gününde Chappel-Perry (CP) ve Mitokondriyal Testi Çözümü (MAS) tamponları (Tablo 1) hazırlamak ve -20 ° C&#39;de saklayın. -20 ° C de, 2.5 mM konsantrasyonda ve tablet ve mağazada dimetil sülfoksit bileşikleri hazırlayınız. Hazırlama gününe 2 ay içinde -20 ° C sıcaklıkta depolanmış ara bellek ve bileşik alikotları kullanın. </li><li> Keskin bir makas ve cımbız kullanarak numune görülebilir bağ dokusu çıkarın; kullanabilme Bu aşama için bir mikroskop gerekirse. İyice kan ayrılması için buz-soğuğu DPBS tamponu ile numuneler- 3-4 kez yıkayın. Biyopsisinden fazla 45 dakika fazla dikkat ederek, en kısa sürede, buz gibi soğuk DPBS ile süreci örnekleri tutun. Dikkatle kas örnekten herhangi tendonları veya yağ doku kaldırmak için önlem alın. </li><li> Hemen makas steril bir çifti kullanılarak ince parçalar halinde doğrayın kas dokusu ve 1 ml TÜFE içeren pr 500 ul askıya0.2 mg / g doku konsantrasyonunda oteinase (Nagarse). Oda sıcaklığında 5 dakika inkübasyon ile takip ve sonra buz transfer. </li><li> Otomatik bir homojenleştirici kullanılarak Nagarse ile muamele kıyılmış dokular homojenize edilir. Bu süreç boyunca buz üzerinde örnek tutun. 10.000 rpm&#39;lik bir hız ayarında otomatik homojenleştirici kullanılarak, 2 saniyelik bir darbe için, her doku numunesinde dört kez, her zaman homojen hale getirilir. Dokular arasında damıtılmış su, ardından% 70 etanol ile sonda yıkanır. </li><li> CP I (1 ml 500 ul) ve CP II 2x hacmi (2 ml 1 mi) bir eşit hacmi ile homojenleştirilir doku yıkayın ve 600 x g&#39;de, 4 ° C sıcaklıkta bulunan bir santrifüj tüpüne ve santrifüj içeriği toplamak 10 dk. Bir ıslatılmış bez ile peynir süpernatant geçmek süzüntü toplamak ve böylece olmayan mitokondriyal fraksiyonların çoğunluğunu kaldırarak, pelet atın. </li></ol> 3. Yıkama Mitokondri <ol><li> 10 ° C Yukarıdaki adımda elde edilen süpernatant santrifüj,000 xg, 10 dakika, 4 ° C. 10000 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de CP II tamponu ve daha fazla santrifüj 4 ml pelet süspanse edin. NOT: Nadir durumlarda, kan ince bir pelet mitokondriyal pelet altında oluşur. Bu durumda, CPII tamponu ile yavaşça çekilerek mitokondriyal pelet çıkarın. Bu adım adım iyice 2 kanı yıkayarak önlenebilir. </li><li> CP Ben tampon 2 ml elde pelet Askıya. Bu aşamada, protein kestirimi için bu süspansiyondan küçük bir kısım kullanın. Ben yukarıdaki gibi tampon ve santrifüj CP kalan örnek süspanse. Mitokondriyal Deney Çözeltisi (MAS) ve çok az miktarda (200 ul) son pelet süspanse edin. NOT: CP I tampon BSA yok çünkü protein örnekleri daha sonra o BSA var askıya alınacak olan MAS ise, bu aşamada tahlil edilir. </li></ol> 4. tahmin bir BCA Protein Deney kiti kullanarak protein konsantrasyonunu ölçme ile mitokondriyal İçerik <pSınıf = &quot;jove_content&quot;&gt; Not: respirometrik ölçümlerde, veya Western blot deneyleri için 24 çukurlu mikro-üzerine yüklenmesi için kullanılacak mitokondri miktarını hesaplamak için bu konsantrasyon kullanın. Protein konsantrasyonu hesaplanmasında dikkate seyreltme faktörü (10) atın. Rogers, GW ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi 5. XF tahlilleri yapın. 12 NOT: pmole O 2 / dk O 2 tüketimi oranını (OCR) gözünüzde canlandırın, ya da veri çıkışı O 2 ve pH mutlak seviyeleri. <ol><li> Bileşikleri hazırlamak için 1x MAS kullanarak enjekte edilecek. Aşağıdaki gibi, bir son konsantrasyon elde etmek üzere bağlantı noktaları MS bileşiklerin 10x konsantrasyon ekleyin: Noktası A ADP [Adenozin 5 &#39;-diphosphate, 2 mM, 50 ul]; B portu, oligomycin (2 uM, 55 ul); Port C, FCCP [karbonil siyanit 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon, 6 uM, 60 ul]; ve liman D, 2 mcM antimycin-A (65 ul). Hazırlamakkuyu sayısı için bileşiklerin yeterli bir miktar. </li><li> Titrasyonuyla mitokondri optimum miktarda belirleyin. Örneğin, yük 1.0 ug, 2.5 ug, ve alt tabaka ihtiva eden buzla soğutulmuş 1x MAS bir 50 ul hacim içinde oyuk başına mitokondri 5.0 ug. İlk soğuk 1x MAS + substrat 10x mitokondri sulandırmak, kuyular arasındaki değişkenliği en aza indirmek için. Sonraki, (arka plan düzeltme kuyuları hariç) her bir kuyunun bu süspansiyon 50 ul teslim. </li><li> 2000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca plaka santrifüjleyin. Her bir oyuğa (bakınız aşağıda başlangıç ​​koşullarına) Santrifüj işleminden sonra, yavaşça 1 x MAS + süksinat (10 mM) ve rotenone (2 uM) 450 ul ilave edin. XF analizörü plaka transfer iyi önce homojen yapışmasını sağlamak için mikroskop altında mitokondri görüntüle. Not: solunum ya da VB kompleksi I ya da kompleks II kaynaklı olup olmadığının bağlıdır kullanılan başlangıç ​​koşullarını oluşturmuştur. Karmaşık II-odaklı solunum için, SU kullanınccinate (10 mM) ve başlangıç ​​koşulları olarak rotenon (2 uM). Rotenone blokları kompleks I ve II süksinat kompleksi (süksinat dehidrogenaz) için yakıt sağlar. Kompleks I tarafından tahrik edilen solunum çalışma yapmak için, ilk koşullar olarak 10 mM&#39;lik bir son konsantrasyonda 5 mM veya glutamat ve malat, her bir son konsantrasyonda piruvat ve malat, her birini kullanabilirsiniz. İkincisi trikarboksilik asit döngüsü ve yüzey ulaşım arasındaki disfonksiyon ayırt yardımcı olabilir. Hem kompleks I ve II kompleksi tarafından tahrik solunum çalışma başlangıç ​​koşulları olarak rotenone veya malat olmadan piruvat ve süksinat dahil etmek. Β-oksidasyonu için bir alt-tabaka olarak palmitoil karnitin kullanın. </li><li> Sırayla önce 12 açıklandığı gibi programlayarak solunumu kullanarak gerçek zamanlı olarak mitokondriyal solunum ölçmek. Tablo 2&#39;de verilmiştir respirometredeki ayarlarını kullanın. NOT: aşağıdaki gibi çeşitli mitokondriyal solunum devletlerin kısa bir açıklama vardır: </li><li&gt; Devlet 2 = substrat mevcut ile birleştiğinde devlet; Devlet ADP doyurarak varlığında solunum fosforile 3 =; Oligomycin tarafından uyarılan Devlet 4 o = olmayan fosforile solunum; Devlet 3u = uncoupler FCCP tarafından uyarılan maksimal uncoupled solunum; Antimycin-A karmaşık III inhibisyonu sonrası rezidüel olmayan mitokondriyal solunum = solunum. Aynı zamanda mitokondriyal konsantrasyon ile birlikte OCR ölçüm uzunluğu ölçümü dönemlerinde oksijen tüketen verileri etkileyebilecek, işaret edilmelidir. </li></ol> 6. Western Blot NOT: Son örnek mitokondri zenginleştirme sağlamak için Western blot ile mitokondriyal işaretleyici COX IV ve tüm doku GAPDH belirleyin <ol><li> % 12 sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jelleri izole edilmiş mitokondri ve bütün doku özü ayırın. </li><li> Poliviniliden florit (PVDF) membran üzerine proteinleri aktarın.</li><li> COX IV antikoru (1: 20,000) ile inkübe yaban turpu peroksidaz (HRP), ve ardından ikincil antikorlar ile konjüge edilmiş. GAPDH tespiti için, bir GAPDH monoklonal antikor (: 2,000 1) ile leke ve prob şerit. NOT: ER kontaminasyon farklılıklar endişe ise, böyle bir analiz ERp72, calnexin, ya kalretikulin olarak ER işaretçileri bulunur. </li></ol>

<ol><li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods. 26, 292-297 (2002).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Iglesias-Gonzalez, J., Sanchez-Iglesias, S., Beiras-Iglesias, A., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolating+rat+brain+mitochondria+with+high+metabolic+activity%3A+effects+of+EDTA+and+EGTA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolating rat brain mitochondria with high metabolic activity: effects of EDTA and EGTA.</a> Journal of Neuroscience Methods. 213, 39-42 (2013).</li>
<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).</li>
<li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PloS One. 8, e82392(2013).</li>
<li>Chappell, J. B., Perry, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+and+adenosinetriphosphatase+activities+of+skeletal-muscle+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria.</a> The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).</li>
<li>Tyrrell, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respirometric+Profiling+of+Muscle+Mitochondria+and+Blood+Cells+Are+Associated+With+Differences+in+Gait+Speed+Among+Community-Dwelling+Older+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. , (2014).</li>
<li>Nicklas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+physical+function+to+vastus+lateralis+capillary+density+and+metabolic+enzyme+activity+in+elderly+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">Relationship of physical function to vastus lateralis capillary density and metabolic enzyme activity in elderly men and women.</a> Aging Clinical and Experimental Research. 20, 302-309 (2008).</li>
<li>Bergstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Percutaneous+needle+biopsy+of+skeletal+muscle+in+physiological+and+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Clinical+and+Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35, 609-616 (1975).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746(2011).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6, e18317(2011).</li>
</ol>

Yazar George Rogers, bu makalede kullanılan enstrümanı üreten Seahorse Bioscience'ın bir çalışanıdır. Açık Erişim ücretleri Seahorse Biosciences tarafından desteklendi.

İzole edilmiş alt-tabaka, genellikle mitokondri taşıma ve TCA döngüsü fonksiyonu dahil olmak üzere VB fonksiyonunun rolü, hem de diğer mitokondri aktivitelerini incelemek çalışmalarda kullanılmıştır. Izole organelleri kullanarak Respirometrik testler oksidatif fosforilasyon temel süreçleri ve ETC içsel özelliklerinin doğrudan incelenmesine olanak Bütün hücrelerin veya permeabilize kas liflerine kıyasla izole edilmiş bir mitokondri respirometrik profili nispeten kolay veri yorumlama avantajları ve mitokondriyal kütle / biogenesizdeki olmayan mitokondriyal işlemler veya değişiklikleri &quot;girişim&quot; yokluğunu sahiptir. Verilerin Normalleştirme böylece numuneler arasında mitokondri basit çapraz karşılaştırma sağlayan, mitokondriyal protein içeriği dayanmaktadır. İzole mitokondri Respirometrik profil çalışmanın amacı altta yatan mekanizmalar ve ETC bileşeni olarak belirli hedefler belirlenmesi belirlemek için bir tercih yaklaşıms / kompleksler, ya da mitokondriyal taşıma mekanizmaları. Küçük doku örneklerinden kas biyopsisi ve fonksiyonel mitokondri izolasyonu için protokol açıklanmıştır. El dounce homojenizatörlerinin işletilen karşı bu yöntem nedeniyle otomatik homojenleştirici kullanımına kullanıcıları arasında tekrarlanabilir sonuçlar verir. Mitokondri izolasyonu kas dokusu olarak yaklaşık 20 mg ile yapılabilir. Bu örnek büyüklüğü elde edilebilir izole mitokondri miktarı daha da moleküler analiz için başka deneyler ve depolama için fazla mitokondri bırakarak Hippocampus plaka bazlı Solunum çalıştırmak için yeterli değildir. Bu yöntem, mitokondri daha küçük miktarlarda (her 1-2 ug) kullanılabilir XF 96, tercüme edilebilir belirtmek gerekir. Izole mitokondri için çeşitli protokoller ilk doku bozulması için dounce homojenizatör güveniyor. Bu yöntemin bir dezavantajı, eller, ilk doku doğası olanHomojenizasyon. homojenleştiricide tokmak ve kuvvet ve hız operatörleri 6 arasında önemli ölçüde değişebilir. Bu deney,-için-deney varyasyonu, hem de laboratuvar kadar laboratuarda değişmesine yol ve deneyler arasında veri karşılaştırması yapılmasını zorlaştırır olabilir. Katılımcılardan gelen veriler genellikle tedavi öncesi ve sonrası, ve potansiyel birden fazla site için ayrı zaman noktalarında toplanan bu insan müdahalesi çalışmalarında özellikle endişe vericidir. Biz sınırlı kişiden kişiye değişkenlik daha tekrarlanabilir sonuçlar verir daha tutarlı bir yaklaşım için bir otomatik homojenleştirici kullanın. hazırlama hızı, aynı zamanda, aynı anda birden fazla numune işleme için uygun olan, bu yaklaşım sağlar. Tipik olarak, en fazla üç deney, bir günde gerçekleştirilir. Burada tarif edilen tekniğin potansiyel sınırlamaları izole organel kullanımı ve bir plaka temelli bir biçimde kullanımı ortaya çıkar. Örneğin, Picard et al. iblis varİzole mitokondri permeabilize myofibers bozulmamış mitokondri bu temelde farklı fonksiyonel özelliklere sahip olduğu strated. Onlar mitokondriyal izolasyon teknikleri gibi daha reaktif oksijen türlerinin üretimi 13 eşliğinde permeabilize myofibers göre önemli ölçüde artmıştır RCR olarak değişmiş bioenergetic fonksiyonu, neden önerdi. Permeabilize kas lifleri ile karşılaştırıldığında, mitokondri izolasyonu uzun hazırlık süresi gerektirir. Ayrıca, hücresel içeriği kaybı fizyolojik alaka, bütün hücreler ve hatta permeabilize lifleri tutulur bir şey azalır. açıklanan teknik izni ile plaka bazlı Respirometrik kullanımı örnek başına çalışır çoğaltmak. Ancak, mitokondri de her alt uymalıdır. Bu konfigürasyon, normal ortamından farklıdır ve fonksiyonel özelliklerini etkileyebilir. Buna ek olarak, belirtilmelidir ki, mitokondriyal izolasyonu için protokol kullanılarak, TherE hala mitokondriyal hazırlık endoplazmik retikulum (ER) kirlenme olabilir. ER kirlenme farklılıklar mitokondriyal verim ve etkisi sonuçlarının belirlenmesini etkileyebilir. Sonuç olarak, bu çalışma, bu prosedür kullanılarak dokulardan izole mitokondri işlevsel olarak aktif olan ve çalışmalar / iskelet kası numunelerin minimum miktarda yüksek kaliteli izole mitokondri gerektiren uygulamalar için kullanılabileceğini teyit etmektedir verileri sunulur. Bu yöntemin avantajı şudur: i) bir iskelet kası az miktarlardaki mitokondri izole edilmesi mümkündür, ii) işlem iii) plaka bazlı teknoloji, aynı zamanda birçok örnek arasında çalıştırmak mümkündür, hızlı ve iv) örnek depolama ve diğer moleküler biyolojik araştırmalar için bioenergetic tahlil sonra yeterli artı dokusu ve izole mitokondri vardır.

Mitokondri hücrenin birincil enerji üretim alanları ve yaşlanma önemli roller yanı sıra, kalp damar hastalıkları, Alzheimer hastalığı, diyabet, kanser ve aşırı şişmanlık gibi çeşitli yaş ile ilişkili bozukluklar vardır. İzole mitokondri Respirometrik profil elektron taşıma zinciri (OGS) fonksiyonu doğrudan analiz sağlar ve mitokondriyal biyoloji anlayışımız ve sağlık ve hastalık rolüne önemli katkılarda bulunmuştur. İzole mitokondri Bu yazıda anlatılan metodoloji insan denekler elde edilen iskelet kas dokusu biyopsi izole mitokondri Respirometrik analiz izin için optimize edilmiştir vb substrat ulaşım, ATP sentaz aktivitesi, proton sızıntısı, gibi biyoenerjitiklerin çeşitli yönlerini incelemek için kullanılır. Bu yazıda anlatılan biyopsi protokol son 12 yıldır bizim personel tarafından kullanılmıştır. Grubumuz, çeşitli yaş yetişkin 700&#39;den fazla prosedürleri yürüttü90 yaşına kadar, ve herhangi bir olumsuz güvenlik sorunları olmaksızın çeşitli kronik hastalık koşulları ile. Bu protokolün önemli bir yönü, özellikle böylece klinik araştırmalarda kullanımını kolaylaştıran, doku az miktarda kullanmak için tasarlanmış olmasıdır. Çeşitli protokoller mitokondri izole edilmesi için geliştirilmiştir. Fernandez-Vizarra ve ark., 1,2 çeşitli fare dokuları gibi kültürlenmiş hücrelerden mitokondri izole etmek için bir yöntem açıklamıştır. Garcia-Cazarin ve ark. 3, sıçan ve fare iskelet kaslarının mitokondri izole etmek için bir yöntem bildirmiştir. Fare beyninden alınan mitokondri izole edilmesine yönelik bir yöntem olup, aynı zamanda Iglesias-Gonzales ve ark. 4 Gross tarafından rapor edilmiştir, ve ark. 5 barocycler ve / veya PCT parçalayıcı kullanarak mitokondri izole edilmesi için bir yöntem rapor etmiştir. Son zamanlarda, Franco ve ark. 6 anti kullanarak zenginleştirilmiş mitokondri izole edilmesi için bir yöntem rapor-TOM22 Manyetik boncukları. Bu protokoller mükemmel sonuçlar elde ederken, doku boyut gereksinimleri Bu yazıda anlatılan yönteme kıyasla yüksek. Örneğin, Gross vd. 5 gastrokinemius kası 1.5-1.8 g ve böbrek dokusu yaklaşık 2 g kullanılır. Benzer şekilde, Franco ve ark. 6 500 mg fare karaciğer dokusu kullanılır. Bizim deneyim, tipik verimleri iskelet kası (vastus lateralis) perkütan iğne biyopsisi beklenen 100-200 mg arasında değişir. Burada anlatılan protokol kullanılarak kas dokusunun 20-50 mg mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek için yeteneği, diğer moleküler biyoloji deneylerinde gelecekteki kullanım için biyopsi başına ve mağaza örnekleri birden değerlendirmeler yapmalarına izin verir. Bu klinik araştırma ve örneklerin çalışkan kullanımını gerektiren diğer çalışmalarda kritik bir özelliktir. Daha önce dondurulmuş mitokondri oute bağlanmış solunum nedeniyle çalışmak için iyi olmadığını belirtmek gerekirmitokondriyal membran hasarına ve Sitokrom C aktivitesi kaybının r. Bizim yöntemi adapte Chappell ve Perry 7 tarafından yayınlanan yöntemle modifiye edilmiştir. Bu yazıda anlatılan yöntemleri kullanarak, son zamanlarda insan vastus izole mitokondri Respirometrik profil doğrudan yürüyüş hızı 8 olarak ölçülen fiziksel yeteneği ile ilişkilidir lateralis olduğunu bildirmiştir.

<table><tbody><tr><td>Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homojenizatör Bio-Gen PRO200</td><td>BioExpress</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Santrifüj 5804 R</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deepwell geç Rotor&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 mm Üniversite Koleji Hastanesi İğne</td><td>Kadansı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 cc şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka okuyucu</td><td>Tecan (Genios-basic)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Denizatı XF 24-3 analizörü</td><td>Denizatı Biosciences, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein jel sistemi</td><td>Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodak Jel Mantık 112</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodak kamera düzeneği</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sarf malzemeleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XF24 V7 Hücre Kültürü Mikroplaka ve XF24 sensör kartuşu</td><td>Denizatı Biyobilim</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>100867-100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit (KOH)</td> <td>Sigma-Aldrich Co</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit (HCl)</td> <td>Acros</td><td>12421-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat tamponlu tuzlu suyu&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Yağ asidi içermeyen BSA</td><td>Calbiochem</td><td>126575</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriyel proteinaz</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P-8038</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO 4</td> <td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein test kiti</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>PI23227</td><td></td></tr><tr><td>Süksinik Asit*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Pirüvik asit*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Malik asit*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>2288</td><td></td></tr><tr><td>ADP(K+ tuzu)*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>XF Hücre mito stres testi kiti</td><td>Denizatı Biyolojik Bilimler</td><td>101706</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji, Inc.&nbsp;</td><td>SC-29113</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE %12 Bis-Tris Jel</td><td>Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)</td><td>NP0343BOX</td><td></td></tr><tr><td>İmmobilin Transfer Membranları (0.45 um)</td><td>Milipore</td><td>IPVH20200</td><td></td></tr><tr><td>MOPS SDS Koşu Tamponu (20X)-500 ml</td><td>Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Tamponu (20X)-1 litre</td><td>Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Primer antikorlar (mAB ila VDAC1/Porin)</td><td>Abcam</td><td>ab14734</td><td></td></tr><tr><td>Primer antikorlar (mAB ila GAPDH)</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare IgG (Keçi), HRP etiketli</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF822E001EA</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tavşan IgG (Keçi), HRP etiketli</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF812E001EA</td><td></td></tr><tr><td>* ADP, süksinik asit, pirüvik asit ve malik asit sadece KOH ile pH 7.4'e ayarlanmalıdır&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

perkütan İğne biyopsisi ile elde edilen İskelet kası doku İzole mitokondri hazırlanması ve respirometrik değerlendirmesi

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

İzole mitokondri Respirometrik profilleme yaygın elektron taşıma zinciri fonksiyonunu araştırmak için kullanılır. Bu, hücre dışı bir akım (XF) analiz cihazı kullanılarak, insan vastus lateralis örnekleri elde iskelet kas dokusunda en az miktarlardan mitokondri izole edilmesi için bir yöntem ve plaka bazlı respirometrik profil açıklanmaktadır. 1.0, 2.5 ve mitokondri 5.0 ug kullanılarak elde edilen Respirometrik profillerin karşılaştırılması 1.0 ug solunum ölçmek için yeterli olduğunu göstermektedir ve 5.0 mikrogram standart hataların karşılaştırılması dayalı en tutarlı sonuçlar sağlar. Mitokondriyal işaretleyici COX IV olmayan mitokondriyal doku belirteci GAPDH için izole mitokondri, Western blot analizi, bu protokol kullanılarak sınırlı olmayan mitokondriyal kirlenme olduğunu gösterir. kas dokusunun az 20 mg gibi mitokondriyal Solunum çalışma yeteneği, kullanıcıların, klinik birden çalışmanın tamamlanması için bireysel biyopsi kullanmasına olanak sağlararaştırma projeleri.

Şekil 1, tüm protokol ayrıntılı akış şemasını göstermektedir. COX IV / GAPDH (Şekil 2), Western blot profilleri mitokondriyal protein COX IV olmayan mitokondriyal marker, GAPDH ekspresyonu tasvir etmektedir. COX IV ve GAPDH hem ifadesi, tüm kas hücresi içerisinde belirgindir. Mitokondri, bu protokol açıklanan tekniği kullanılarak izole sonra GAPDH aynı pozlama de yokken, COX IV bantları hala belirgindir. Uzun poz bir soluk GAPDH bandı ortaya çıkarabilir. Bu lekeler izole mitokondri az olmayan mitokondriyal kontaminasyonu sahip olduğunu göstermektedir. Ayrıca, izole edilmiş bir mitokondri COX IV ekspresyonu örnekler arasında tutarlıdır. Şekil 3 1.0 ug, 2.5 ug, ve mitokondri 5.0 ug kullanılarak kompleks II (süksinat ve rotenone) tarafından tahrik tipik Respirometrik profillerini göstermektedir. Beklendiği gibi, genel olarak, OCR ağırlık arttırılıri mitokondri yüksek miktarlarda. Bu deney için hesaplanan solunum kontrol oranı (RCR) mitokondriyal hazırlık kaliteli olduğunu belirten, 7.95. Ayrıca, devlet 3u OCR mitokondriyal kalitesini onaylayan, devletin 3 biraz daha yüksektir. Mitokondri farklı miktarlarda profil oluşturma sırasında sonuç tutarlılığı karşılaştırma amacıyla, ANOVA (Varyans Analizi) oluşturulmuş ve kullanılarak varyans gerçek değerleri olarak kareler (SS) toplamı hesaplanır 1.0 ug, 2.5 ug, ve mitokondri 5.0 ug başına yüklenmiştir iyi (Şekil 4). SS devlet 2, devlet 3, devlet 3U, Antimisin ve RCR sunulmuştur. Devlet 2 ve devlet 3 ölçümler için, tek yönlü ANOVA (sırasıyla, p &lt;0.01 ve p &lt;0.05) istatistiksel olarak anlamlı idi. Benzer şekilde, tek yönlü ANOVA antimycin ve RCR (p &lt;0.01 ve p &lt;0.0001 istatistiksel olarak anlamlı idi, sırasıyla. Anlamlı fark gruplar arasında devlet 3U görüldü. These sonuçlar kuyu başına mitokondri 5,0 mikrogram diğer konsantrasyonlara göre düşük SS verdi ve katılımcıların bizim nüfusa sahip XF 24 sistemde kullanılacak optimum miktarda olduğunu göstermektedir. Şekil 5 çok mitokondriyal protein ilk kas örneklem büyüklüğü dayalı beklenebilir nasıl göstermek için bir rehber olarak hizmet vermektedir. Beklendiği gibi işlenmiş kas (mg) miktarı ve son numune toplam mitokondriyal protein içeriği (mg) arasında güçlü bir ilişki vardır. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Chappel-Perry tampon I (TÜFE) </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 1 mM </td></tr&gt; <tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Chappel-Perry tampon II (CPII) </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 0.2 mM </td></tr><tr><td> Yağ-asidi serbest BSA </td><td> 0.50% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitokondriyal Deneyi Çözüm (MAS) (2X) </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> 35 mM </td></tr><tr><td> Mannitol </td><td> 110 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 2.5 mM </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> 2.5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1.0 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.5mM </td></tr><tr><td> Yağ-asidi serbest BSA </td><td> % 0.10 </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Karmaşık II başlangıç ​​koşulları ile Mitokondriyal Testi Çözümü (MAS) </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Suksinat </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Karmaşık Ben başlangıç ​​koşulları ile Mitokondriyal Testi Çözümü (MAS) </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Piruvat</td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Malat </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td colspan="2"> * Tüm tamponlar deiyonize su içinde yapılacak </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Çözüm ve tampon tarifleri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Protokol Adımları </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> StartProtocol </td></tr><tr><td> Komuta </td><td> Zaman (dk) </td><td> Liman </td></tr><tr><td> Ayarlamak </td><td> 0.00 </td><td></td></tr><tr><td> Bekleyin </td><td> 10.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Bekleyin </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Bekleyin </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Enjekte etmek </td><td></td><td> Bir </td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 6.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Enjekte etmek </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Enjekte etmek </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr<html> &gt; <tr><td> Tedbir </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Enjekte etmek </td><td></td><td> D </td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> EndProtocol </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Mix, ölçmek ve respirometredeki için çevrim ayarını karıştırın. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52350/52350fig1highres.jpg" /> Şekil tüm protokol 1. Akış Şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> /ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. bütün iskelet kası dokusu hem de izole mitokondri için temsili bir Western blot. Tüm doku ekstraktı olarak izole mitokondri olmayan mitokondriyal kontrol mitokondriyal işareti ve GAPDH antikor gibi COX IV antikoru ile bağışık edilmiştir. Hiçbir GAPDH bandı olmayan mitokondriyal kaynaklardan az veya hiç bulaşmayı gösteren izole mitokondri gözlendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52350/52350fig3highres.jpg" /> İnsan Vastus izole mitokondri Şekil 3. Temsilcisi Respirometrik profil lateralis. Izole mitokondri üç konsantrasyonları, 5.0 ug, 2.5 ug ve 1.0 ug biz<html> Bu tahlilde kullanılan re. Liman enjeksiyondan sonra bileşiklerin Final konsantrasyonları 2 mM ADP (port A) idi; 2 mcM oligomycin (B portu); 6 mcM FCCP (port C); ve 2 mcM A (port D) antimycin. Bu çalışma için hesaplanan RCR 7.95 oldu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52350/52350fig4highres.jpg" /> 5.0 ug, 2.5 ug ve 1.0 ug mitokondri kullanarak farklı mitokondriyal solunum devletler ve RCR için kareler Şekil 4. karelerinin toplamı. Toplamı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> ig5highres.jpg &quot;/&gt; . Şekil 5. Bu ilk kas numune ağırlığı Regresyon analizine dayalı beklenebilir mitokondriyal protein miktarını tahmin etmek için bir rehber olarak kullanılabilir: kas (mg) ve toplam mitokondriyal protein verimi (mg) miktarı. Beklendiği gibi, kas miktarı ve elde edilen toplam mitokondriyal protein arasında doğrudan bir korelasyon vardır.

Vastus lateralis biyopsi saflaştırılmış mitokondrinin preparasyonu ve respirometrik profil için yöntemler tarif edilmiştir. Küçük kas hacminin kullanımı klinik araştırma uygulamaları için bu teknik uygundur.

Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Bu prosedürün genel amacı, biyopsiyle alınan iskelet kası dokusundan izole edilen mitokondrilerdeki solunum kontrolünü incelemektir. Bu işlem, öncelikle perkütan iğne biyopsisi ile az miktarda kas dokusu elde edilerek gerçekleştirilir. İkinci adım ise, biyopsiyle alınan kastan homojenizasyon yoluyla mitokondrilerin izole edilmesidir.Ardından, izole edilen mitokondriler yıkanır ve santrifüjleme ile örneğin katlanmış bir tülbentten geçirilmesi yoluyla mitokondriyal olmayan fraksiyonlardan ayrıştırılır. Son adım, oksijen tüketim hızını görselleştirmek amacıyla hücre dışı akış analizleri (extracellular flux assays) aracılığıyla respirometrik analiz gerçekleştirmek için izole mitokondrilerin plakaya ekilmesidir. Nihayetinde, izole mitokondrilerdeki solunum kontrolünü incelemek için seahorse hücre dışı akış analizörü kullanılır.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, 20 miligram kadar düşük bir minimum kas dokusu miktarının yeterli olması ve deneyler arası değişkenliği sınırlamasıdır. Bu özellikler, tekniği klinik araştırma uygulamaları için uygun hale getirmektedir. Bu tekniğin uygulama alanı, hastalarda mitokondriyal disfonksiyonun teşhis edilmesidir.Kas biyopsisi ve mitokondri izolasyonu, yalnızca metinle anlatılmak yerine görsel olarak gösterilmesinin daha etkili olduğu hassas manipülasyonlar gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Biyopsiyi lokal olarak gerçekleştirmek için, kas dokusuna sızdırmamaya dikkat ederek %1 lidokain uygulayın. Bunu 10 dakikalık bir bekleme süresiyle takip edin.Yeterli uyuşmayı sağlamak için, subfasial ve miyotendinöz bölgelerden kaçınarak, kasın insersiyo ve origo arasındaki orta bölgesinden biyopsiler alın. Bunu başarmak için öncelikle perkütan bir iğne kullanın ve kılavuz olarak fasyanın yırtılma sesini (pop) veya fasyanın direncini takip edin. Derinliği anestezi iğnesi ile tahmin edin, ardından dar neşter ucuyla hissederek fasya boyunca dört ila beş milimetrelik bir insizyon yapın.İğneyi, kas dokusuna girene kadar insizyondan ileri sürün. Pencere farklı yönlere çevrilerek birden fazla örnek toplayın. Kas örneklerini perkütan iğneye farklı yönlerde iki ila dört kez sokup çıkarırken, 60 cubic centimeter'lik bir şırınga kullanarak sürekli vakum uygulayın.Vakumlamayı durdurun ve iğneyi çıkarın. Bir asistana, ponksiyon bölgesine beş dakika boyunca sıkıca baskı uygulamasını söyleyin. Hemostazı sağlamak için iğneyi vakum hortumundan ayırın ve kas örneklerini pencereden ve gövdeden dikkatlice çıkarın.Daha fazla kasa ihtiyaç duyulursa, bu işlemi tekrarlayarak ikinci bir geçiş yapın. Kas örneğindeki görünür kan pıhtılarını pens yardımıyla temizleyin. Ardından örneği tartın ve derhal buz içeren bir tüpe yerleştirin.Fosfat tamponlu salin veya DPBS ile soğutun. Keskin makas ve cımbız kullanarak örnekteki görünür bağ dokusunu temizleyin. Örnekleri buz gibi soğuk DPBS tamponu ile üç ila dört kez iyice yıkayın.Kanı uzaklaştırmak için örnekleri buz gibi soğuk DPBS içinde tutun ve mümkün olan en kısa sürede işleyin. Biyopsiden sonraki 45 dakika içinde, kas örneğindeki tendonları veya adipoz dokuları dikkatlice uzaklaştırmak için önlem alın. Saklamak amacıyla, herhangi bir ekstra dokunun küçük bir kısmını eksi 80 °C'de depolamak üzere ayırın.Bu yöntem, Western blot gibi diğer deneyler için de kullanılabilir. Kas dokusunu derhal küçük parçalara ayırın. Steril bir makas kullanarak, ardından dokuyu; CP 1 tamponunda doku başına 0,2 mg konsantrasyonda çözünmüş nagars gibi bir Sistine protein ACE inhibitörünün 500 µL ile 1 mL'lik hacmi içerisinde süspande edin.Numune, iyice süspande olmuş görünene kadar kıyılır. Homojenizatörün önceden tamamen yıkanmış olduğundan emin olarak, bu işlemi oda sıcaklığında beş dakikalık bir inkübasyonla izleyin ve ardından örneği buza aktarın. Nagarlar ile işlem görmüş kıyılmış dokuyu homojenize edin.Otomatik bir homojenizatör kullanın. Bu işlem boyunca numuneyi buz üzerinde tutun. Her doku numunesini, her seferinde iki saniyelik darbelerle dört kez homojenize edin.Otomatik homojenizatörü 10,000 RPM hız ayarında kullanarak örneği tekrar buz üzerine yerleştirin. Dokular arasında probu önce %70 etanol ile, ardından distile su ile yıkayın. Şimdi, homojenize edilmiş dokuyu eşit hacimde chapel Perry one veya CP one tamponu ile yıkayın.Ardından dokuyu, CP two tamponu ile hacminin iki katı kadar yıkayın. Başka bir konik tüpte suyu aynı hacme getirerek denge tüpünü ekleyin. İçeriği bir santrifüj tüpüne toplayın ve 4 °C'de 600 g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin; tüm partiküllerin geçmesini sağlamak ve bezde takılmasını önlemek için tülbenti önceden ıslatın.Süpernatantı ıslatılmış bir tülbentten geçirerek filtratı toplayın ve pelletini atın; böylece mitokondriyal olmayan fraksiyonların çoğunluğunu uzaklaştırın. Ardından süpernatantı 4 °C'de 10 dakika boyunca 10,000 g'de ultrasantrifüjden geçirin. Santrifüjleme işleminin ardından, pelletini 4 mL CP 2 tamponunda süspanse edin ve aynı şekilde ikinci kez santrifüjleyin.Süpernatanı atın ve pellet'i iki mililitre CP one tamponunda yeniden süspande edin. Bu aşamada, protein tayini için kullanılmak üzere bu süspansiyondan küçük bir alikotu ayrı bir test tüpüne aktarın. Kalan örneği CP one tamponunda yeniden süspande edin ve santrifüjleyin.Daha önce belirtildiği gibi, protein plakasının önceki santrifüj aşamaları sırasında standartlarla birlikte hazırlanması gerektiğini unutmayın. Son olarak, elde edilen son peleti minimal miktarda mitokondriyal analiz çözeltisi veya kütlesi içinde yeniden süspande edin. Dakika başına pikomol oksijen cinsinden oksijen tüketim hızını veya OCR'yi ya da oksijen ve pH'ın mutlak seviyelerini görselleştirmek için XF analizlerini gerçekleştirin.Veri çıkışında. Metin protokolünde listelenen nihai konsantrasyonu sağlamak için, bir X kütlesindeki bileşiklerin 10 x konsantrasyonunu plaka bazlı respirometrenin A'dan D'ye kadar olan portlarına ekleyin. Gerekli kuyu sayısı için yeterli miktarda bileşik hazırlayın.Eklenecek mitokondri konsantrasyonlarını belirlemek için daha önce yapılan protein hesaplamalarını kullanın. Kuyuklar arası değişkenliği en aza indirmek için 24 kuyulu plakadaki her kuyuğa bir mikrogram, 2.5 mikrogram ve beş mikrogram mitokondri titre ederek optimum mitokondri miktarını belirleyin.Öncelikle 10 x mitokondriyi, soğuk, bir x kütle artı substrat içinde seyreltin. Ardından, bu süspansiyonun 50 µL'sini her bir kuyucuğa aktarın. Arka plan okumaları olarak kullanılmak üzere, yalnızca 50 µL kütle içeren dört kuyucuğu boş bırakın.Cihaz kalibrasyonunu gerçekleştirmek için önceden ıslatılmış kalibrasyon plakasını ve daha önce hazırlanan üst kartuşu respirometreye yerleştirin. Test plakası çalışmasına hazırlık için plakayı 4 °C'de 20 dakika boyunca 2000 GS hızında santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra.Her bir kuyuya 450 µL bir x kütle, artı süksinat ve rotten ekleyin. Plakayı XF analizörüne aktarmadan önce, kuyulara homojen yapışmayı sağlamak için mitokondrileri mikroskop altında inceleyin. Respirometre, burada gösterilen metin protokolünde sağlanan respirometre ayarları kullanılarak programlanıp gerçek zamanlı mitokondriyal solunum ölçümleri sırayla gerçekleştirilir. Beklendiği üzere, 1 µg, 2,5 µg ve 5 µg mitokondri kullanılarak kompleks iki ile tetiklenen tipik respirometrik profiller elde edilmiştir.Genel olarak, OCR daha yüksek mitokondri miktarlarıyla artış gösterir. Bu analiz için hesaplanan solunum kontrol oranı veya RCR 7,95'tir; bu değer, farklı mitokondri miktarlarının profillenmesi sırasında sonuçların tutarlılığını karşılaştırabilmek için mitokondri preparasyonunun yüksek kalitede olduğunu göstermektedir. Varyansların analizi veya Inova gerçekleştirilmiş ve kareler toplamı hesaplanmıştır. Kareler toplamı veya SS; durum iki, durum üç, durum üç, ayrıştırılmış antimisin A ve durum iki ile durum üç ölçümleri için tek yönlü RCR şeklinde sunulmuştur.Innova'nın yanı sıra ANTIMYCIN ve RCR için de istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde edilmiştir. Gruplar arasında durum üç ayrıklaşmış (uncoupled) için anlamlı bir fark görülmemiştir. Bu sonuçlar, kuyucuk başına beş mikrogram mitokondrinin diğer konsantrasyonlara kıyasla en düşük SS değerini verdiğini göstermektedir.Bu grafik, başlangıç kas örneği boyutuna bağlı olarak ne kadar mitokondriyal protein beklenebileceğini göstermek için bir kılavuz görevi görür. Beklendiği üzere, işlenen kas miktarı ile final örneğinin toplam mitokondriyal protein içeriği arasında güçlü bir korelasyon vardır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde üç saatten kısa sürede tamamlanabilir.Kas biyopsisinin ardından, biyopsi yapılan dokuların iyi iyileşmesini sağlamak amacıyla, hastanın sonraki üç gün boyunca aspirin, ibuprofen veya diğer reçetesiz satılan steroid dışı antiinflamatuar ilaçları kullanmadığından emin olmak önemlidir. Bir sonraki nokta ise, hastanın sonraki bir buçuk gün boyunca sarsıntılı aktiviteler gibi ağır fiziksel aktivitelerde bulunmadığından emin olmaktır; basketbol veya trambolin gibi aktiviteler buna örnektir, ancak normal günlük aktivitelerini gerçekleştirebilirler.Ayrıca, bölgenin 24 saat boyunca kuru tutulmasını, ancak ilk kez ıslandığında bunun bir duş sırasında olmasını istiyoruz; böylece temizlemediğimiz ve ciltte bulunabilecek herhangi bir bakteri türü kesiye girmez. Bu videoyu izledikten sonra, S lateral iskelet kası dokusundan nasıl biyopsi yapılacağı, mitokondrilerin nasıl izole edileceği ve solunum kontrolünün nasıl ölçüleceği konusunda daha iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

preparation-respirometric-assessment-mitochondria-isolated-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu protokol, iskelet kaslarının izole edilen mitokondri solunum çalışması için bir prosedür açıklanmıştır. Bu yöntem Scorrano...

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Memeli Doku biyopsilerinden mitokondri hızlı izole edilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Sıçan karaciğer, iskelet kası ya da preparat, ticari ayrıştırıcı doku homojenize edildi ve mitokondri naylon gözenekli filtrelerden geçerek, süzme ile izole edilmiştir. Seçenek yöntemler kullanılarak da 100 dakika - Mitokondriyal izolasyon süresi 60 kıyasla &lt;30 dk.

Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Sunulan yöntemler, minimum miktarlarda fare iskelet kasından izole mitokondri kullanılarak yapılan bir mikroplaka bazlı respirometrik tahliller koleksiyonunun performansı için adım adım talimatlar sağlar. Bu tahliller, yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelinde mitokondriyal oksijen tüketimindeki mekanik değişiklikleri/adaptasyonları ölçebilir.

Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Burada, daha küçük miktarlarda fare iskelet kasından yüksek kaliteli ve saflaştırılmış mitokondrinin izolasyonuna izin veren daha önce bildirilen bir yöntemin bir modifikasyonunu sunuyoruz. Bu prosedür, mikroplaka bazlı respirometirk testleri sırasında yüksek işlevle solunum yapan yüksek oranda bağlanmış mitokondri ile sonuçlanır.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Burada, anestezi uygulanmış bir domuzdan kuadriseps kas örneği alınır ve mitokondri diferansiyel santrifüjleme ile izole edilir. Daha sonra, mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri I, II ve IV'ün solunum hızları, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanılarak belirlenir.

Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Tarla lokasyonlarında yakalanan vahşi hayvanların izole mitokondrilerindeki solunum hızlarını ölçmek için mobil bir laboratuvar tasarladık ve inşa ettik. Burada, mobil bir mitokondriyal laboratuvarın tasarımını ve donanımını ve ilgili laboratuvar protokollerini açıklıyoruz.

Sahada Mitokondriyal Enerjileri Ölçmek için Mobil Mitokondriyal Fizyoloji Laboratuvarının Geliştirilmesi

Mitokondri, iskelet kasında yüksek düzeyde fenotipik plastisite gösteren anahtar metabolik organellerdir. Sitozolden protein ithalatı, retikülün genişlemesi ve mitokondriyal fonksiyonun sürdürülmesi için gerekli olan organel biyogenez için kritik bir yoldur.  Bu nedenle, protein ithalatı hücresel sağlığın barometresi olarak hizmet eder.

İskelet Kas Mitokondrilerinin Protein İthalat Kapasitesinin Ölçümü

Burada, fare iskelet kasından mitokondri izolasyonu için ayrıntılı bir yöntem ve ardından mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak Oksijen Tüketim Hızı (OCR) ile solunum analizi için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu boru hattı, çoklu çevresel veya genetik müdahalelerin mitokondriyal metabolizma üzerindeki etkilerini incelemek için uygulanabilir.

Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu

Atlar olağanüstü bir aerobik egzersiz kapasitesine sahiptir, bu da at iskelet kasını hem at egzersiz fizyolojisi hem de memeli mitokondriyal fizyolojisi çalışmaları için önemli bir doku haline getirir. Bu makalede, at iskelet kasında mitokondriyal fonksiyonun kapsamlı değerlendirilmesi için teknikler açıklanmaktadır.

At İskelet Kasının Yüksek Çözünürlüklü Floro-Respirometrisi

Burada, insan veya fare kasından taze geçirgen iskelet kası liflerinde mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu ölçmek için kapsamlı bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, mevcut mitokondriyal ağları ve membran bütünlüğünü korurken mitokondriyal solunumun gerçek zamanlı olarak ölçülmesine ve yakıt tercihinin ve metabolik esnekliğin değerlendirilmesine olanak tanır.

İnsan ve Fare İskelet Kası Liflerinde Mitokondriyal Solunumun Yüksek Çözünürlüklü Respirometri ile Ölçülmesi

Öğrenin, perkütan iğne biyopsisiyle elde edilen iskelet kası dokusundan mitokondri izolasyonu ve respirometrik analiz yöntemini. Bu teknik minimal doku gereksinimiyle klinik araştırmalar için uygundur.

Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

Daha fazla video keşfet