Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

Bu prosedürün genel amacı, biyopsiyle alınan iskelet kası dokusundan izole edilen mitokondrilerdeki solunum kontrolünü incelemektir. Bu işlem, öncelikle perkütan iğne biyopsisi ile az miktarda kas dokusu elde edilerek gerçekleştirilir. İkinci adım ise, biyopsiyle alınan kastan homojenizasyon yoluyla mitokondrilerin izole edilmesidir.

Ardından, izole edilen mitokondriler yıkanır ve santrifüjleme ile örneğin katlanmış bir tülbentten geçirilmesi yoluyla mitokondriyal olmayan fraksiyonlardan ayrıştırılır. Son adım, oksijen tüketim hızını görselleştirmek amacıyla hücre dışı akış analizleri (extracellular flux assays) aracılığıyla respirometrik analiz gerçekleştirmek için izole mitokondrilerin plakaya ekilmesidir. Nihayetinde, izole mitokondrilerdeki solunum kontrolünü incelemek için seahorse hücre dışı akış analizörü kullanılır.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, 20 miligram kadar düşük bir minimum kas dokusu miktarının yeterli olması ve deneyler arası değişkenliği sınırlamasıdır. Bu özellikler, tekniği klinik araştırma uygulamaları için uygun hale getirmektedir. Bu tekniğin uygulama alanı, hastalarda mitokondriyal disfonksiyonun teşhis edilmesidir.

Kas biyopsisi ve mitokondri izolasyonu, yalnızca metinle anlatılmak yerine görsel olarak gösterilmesinin daha etkili olduğu hassas manipülasyonlar gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Biyopsiyi lokal olarak gerçekleştirmek için, kas dokusuna sızdırmamaya dikkat ederek %1 lidokain uygulayın. Bunu 10 dakikalık bir bekleme süresiyle takip edin.

Yeterli uyuşmayı sağlamak için, subfasial ve miyotendinöz bölgelerden kaçınarak, kasın insersiyo ve origo arasındaki orta bölgesinden biyopsiler alın. Bunu başarmak için öncelikle perkütan bir iğne kullanın ve kılavuz olarak fasyanın yırtılma sesini (pop) veya fasyanın direncini takip edin. Derinliği anestezi iğnesi ile tahmin edin, ardından dar neşter ucuyla hissederek fasya boyunca dört ila beş milimetrelik bir insizyon yapın.

İğneyi, kas dokusuna girene kadar insizyondan ileri sürün. Pencere farklı yönlere çevrilerek birden fazla örnek toplayın. Kas örneklerini perkütan iğneye farklı yönlerde iki ila dört kez sokup çıkarırken, 60 cubic centimeter'lik bir şırınga kullanarak sürekli vakum uygulayın.

Vakumlamayı durdurun ve iğneyi çıkarın. Bir asistana, ponksiyon bölgesine beş dakika boyunca sıkıca baskı uygulamasını söyleyin. Hemostazı sağlamak için iğneyi vakum hortumundan ayırın ve kas örneklerini pencereden ve gövdeden dikkatlice çıkarın.

Daha fazla kasa ihtiyaç duyulursa, bu işlemi tekrarlayarak ikinci bir geçiş yapın. Kas örneğindeki görünür kan pıhtılarını pens yardımıyla temizleyin. Ardından örneği tartın ve derhal buz içeren bir tüpe yerleştirin.

Fosfat tamponlu salin veya DPBS ile soğutun. Keskin makas ve cımbız kullanarak örnekteki görünür bağ dokusunu temizleyin. Örnekleri buz gibi soğuk DPBS tamponu ile üç ila dört kez iyice yıkayın.

Kanı uzaklaştırmak için örnekleri buz gibi soğuk DPBS içinde tutun ve mümkün olan en kısa sürede işleyin. Biyopsiden sonraki 45 dakika içinde, kas örneğindeki tendonları veya adipoz dokuları dikkatlice uzaklaştırmak için önlem alın. Saklamak amacıyla, herhangi bir ekstra dokunun küçük bir kısmını eksi 80 °C'de depolamak üzere ayırın.

Bu yöntem, Western blot gibi diğer deneyler için de kullanılabilir. Kas dokusunu derhal küçük parçalara ayırın. Steril bir makas kullanarak, ardından dokuyu; CP 1 tamponunda doku başına 0,2 mg konsantrasyonda çözünmüş nagars gibi bir Sistine protein ACE inhibitörünün 500 µL ile 1 mL'lik hacmi içerisinde süspande edin.

Numune, iyice süspande olmuş görünene kadar kıyılır. Homojenizatörün önceden tamamen yıkanmış olduğundan emin olarak, bu işlemi oda sıcaklığında beş dakikalık bir inkübasyonla izleyin ve ardından örneği buza aktarın. Nagarlar ile işlem görmüş kıyılmış dokuyu homojenize edin.

Otomatik bir homojenizatör kullanın. Bu işlem boyunca numuneyi buz üzerinde tutun. Her doku numunesini, her seferinde iki saniyelik darbelerle dört kez homojenize edin.

Otomatik homojenizatörü 10,000 RPM hız ayarında kullanarak örneği tekrar buz üzerine yerleştirin. Dokular arasında probu önce %70 etanol ile, ardından distile su ile yıkayın. Şimdi, homojenize edilmiş dokuyu eşit hacimde chapel Perry one veya CP one tamponu ile yıkayın.

Ardından dokuyu, CP two tamponu ile hacminin iki katı kadar yıkayın. Başka bir konik tüpte suyu aynı hacme getirerek denge tüpünü ekleyin. İçeriği bir santrifüj tüpüne toplayın ve 4 °C'de 600 g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin; tüm partiküllerin geçmesini sağlamak ve bezde takılmasını önlemek için tülbenti önceden ıslatın.

Süpernatantı ıslatılmış bir tülbentten geçirerek filtratı toplayın ve pelletini atın; böylece mitokondriyal olmayan fraksiyonların çoğunluğunu uzaklaştırın. Ardından süpernatantı 4 °C'de 10 dakika boyunca 10,000 g'de ultrasantrifüjden geçirin. Santrifüjleme işleminin ardından, pelletini 4 mL CP 2 tamponunda süspanse edin ve aynı şekilde ikinci kez santrifüjleyin.

Süpernatanı atın ve pellet'i iki mililitre CP one tamponunda yeniden süspande edin. Bu aşamada, protein tayini için kullanılmak üzere bu süspansiyondan küçük bir alikotu ayrı bir test tüpüne aktarın. Kalan örneği CP one tamponunda yeniden süspande edin ve santrifüjleyin.

Daha önce belirtildiği gibi, protein plakasının önceki santrifüj aşamaları sırasında standartlarla birlikte hazırlanması gerektiğini unutmayın. Son olarak, elde edilen son peleti minimal miktarda mitokondriyal analiz çözeltisi veya kütlesi içinde yeniden süspande edin. Dakika başına pikomol oksijen cinsinden oksijen tüketim hızını veya OCR'yi ya da oksijen ve pH'ın mutlak seviyelerini görselleştirmek için XF analizlerini gerçekleştirin.

Veri çıkışında. Metin protokolünde listelenen nihai konsantrasyonu sağlamak için, bir X kütlesindeki bileşiklerin 10 x konsantrasyonunu plaka bazlı respirometrenin A'dan D'ye kadar olan portlarına ekleyin. Gerekli kuyu sayısı için yeterli miktarda bileşik hazırlayın.

Eklenecek mitokondri konsantrasyonlarını belirlemek için daha önce yapılan protein hesaplamalarını kullanın. Kuyuklar arası değişkenliği en aza indirmek için 24 kuyulu plakadaki her kuyuğa bir mikrogram, 2.5 mikrogram ve beş mikrogram mitokondri titre ederek optimum mitokondri miktarını belirleyin.

Öncelikle 10 x mitokondriyi, soğuk, bir x kütle artı substrat içinde seyreltin. Ardından, bu süspansiyonun 50 µL'sini her bir kuyucuğa aktarın. Arka plan okumaları olarak kullanılmak üzere, yalnızca 50 µL kütle içeren dört kuyucuğu boş bırakın.

Cihaz kalibrasyonunu gerçekleştirmek için önceden ıslatılmış kalibrasyon plakasını ve daha önce hazırlanan üst kartuşu respirometreye yerleştirin. Test plakası çalışmasına hazırlık için plakayı 4 °C'de 20 dakika boyunca 2000 GS hızında santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra.

Her bir kuyuya 450 µL bir x kütle, artı süksinat ve rotten ekleyin. Plakayı XF analizörüne aktarmadan önce, kuyulara homojen yapışmayı sağlamak için mitokondrileri mikroskop altında inceleyin. Respirometre, burada gösterilen metin protokolünde sağlanan respirometre ayarları kullanılarak programlanıp gerçek zamanlı mitokondriyal solunum ölçümleri sırayla gerçekleştirilir. Beklendiği üzere, 1 µg, 2,5 µg ve 5 µg mitokondri kullanılarak kompleks iki ile tetiklenen tipik respirometrik profiller elde edilmiştir.

Genel olarak, OCR daha yüksek mitokondri miktarlarıyla artış gösterir. Bu analiz için hesaplanan solunum kontrol oranı veya RCR 7,95'tir; bu değer, farklı mitokondri miktarlarının profillenmesi sırasında sonuçların tutarlılığını karşılaştırabilmek için mitokondri preparasyonunun yüksek kalitede olduğunu göstermektedir. Varyansların analizi veya Inova gerçekleştirilmiş ve kareler toplamı hesaplanmıştır. Kareler toplamı veya SS; durum iki, durum üç, durum üç, ayrıştırılmış antimisin A ve durum iki ile durum üç ölçümleri için tek yönlü RCR şeklinde sunulmuştur.

Innova'nın yanı sıra ANTIMYCIN ve RCR için de istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde edilmiştir. Gruplar arasında durum üç ayrıklaşmış (uncoupled) için anlamlı bir fark görülmemiştir. Bu sonuçlar, kuyucuk başına beş mikrogram mitokondrinin diğer konsantrasyonlara kıyasla en düşük SS değerini verdiğini göstermektedir.

Bu grafik, başlangıç kas örneği boyutuna bağlı olarak ne kadar mitokondriyal protein beklenebileceğini göstermek için bir kılavuz görevi görür. Beklendiği üzere, işlenen kas miktarı ile final örneğinin toplam mitokondriyal protein içeriği arasında güçlü bir korelasyon vardır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde üç saatten kısa sürede tamamlanabilir.

Kas biyopsisinin ardından, biyopsi yapılan dokuların iyi iyileşmesini sağlamak amacıyla, hastanın sonraki üç gün boyunca aspirin, ibuprofen veya diğer reçetesiz satılan steroid dışı antiinflamatuar ilaçları kullanmadığından emin olmak önemlidir. Bir sonraki nokta ise, hastanın sonraki bir buçuk gün boyunca sarsıntılı aktiviteler gibi ağır fiziksel aktivitelerde bulunmadığından emin olmaktır; basketbol veya trambolin gibi aktiviteler buna örnektir, ancak normal günlük aktivitelerini gerçekleştirebilirler.

Ayrıca, bölgenin 24 saat boyunca kuru tutulmasını, ancak ilk kez ıslandığında bunun bir duş sırasında olmasını istiyoruz; böylece temizlemediğimiz ve ciltte bulunabilecek herhangi bir bakteri türü kesiye girmez. Bu videoyu izledikten sonra, S lateral iskelet kası dokusundan nasıl biyopsi yapılacağı, mitokondrilerin nasıl izole edileceği ve solunum kontrolünün nasıl ölçüleceği konusunda daha iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.