Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

Bu işlemin genel amacı, biyopsi yapılan iskelet kası dokusundan izole edilen mitokondride solunum kontrolünü incelemektir. Bu, önce perkütan iğne biyopsisi ile az miktarda kas elde edilerek gerçekleştirilir. İkinci adım, biyopsi yapılan kastan mitokondriyi homojenizasyon ile izole etmektir.

Daha sonra, izole edilen mitokondri yıkanır ve santrifüjleme yoluyla mitokondriyal olmayan fraksiyonlardan ayrılır ve numune evli bir tülbentten geçirilir. Son adım, oksijen tüketim oranını görselleştirmek için hücre dışı akı tahlilleri yoluyla respiro metrik analiz yapmak için izole edilmiş mitokondriyi plakalamaktır. Sonuç olarak, denizatı hücre dışı akı analizörü, izole mitokondride solunum kontrolünü incelemek için kullanılır.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, 20 miligram kadar düşük bir minimum miktarda kas dokusu gerektirmesi ve deneyler arası değişkenliği sınırlamasıdır. Bu özellikler, bu tekniği klinik araştırma uygulamaları için uygun hale getirir. Bu tekniğin çıkarımları, hastalarda mitokondriyal disfonksiyonu teşhis etmek içindir.

Kas biyopsisi ve mitokondriyal izolasyon, yalnızca metinde açıklanmaktan ziyade en iyi görsel olarak gösterilen hassas manipülasyonlar gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Biyopsiyi lokal olarak yapmak için, kasın içeri sızmamasına dikkat ederek% 1 lidokain uygulayın. Bunu 10 dakikalık bir bekleme süresiyle takip edin.

Yeterli uyuşturmaya izin vermek için, subfasyal ve miyotendonöz alanlardan kaçınarak, yerleştirme ve başlangıç arasındaki kasın orta bölgesinden biyopsileri alın. Bunu başarmak için önce perkütan bir iğne kullanın ve fasyanın fasyal popunu veya direncini kılavuz olarak takip edin. Anestezi iğnesi ile derinliği tahmin edin, ardından dar neşter bıçağıyla hissedin ve fasyadan dört ila beş milimetrelik bir kesi yapın.

İğneyi kas içine yerleştirilene kadar kesi boyunca ilerletin. Pencere farklı yönlere çevrilmiş olarak birden fazla örnek toplayın. Kas örneklerini perkütan iğneye farklı yönlerde iki ila dört kez ilerletirken ve çekerken 60 santimetreküplük bir şırınga kullanarak sürekli emme uygulayın.

Emmeyi durdurun ve iğneyi çıkarın. Bir asistanın delinme bölgesine beş dakika boyunca sıkı bir baskı uygulamasını sağlayın. Hemostaz oluşturmak için, iğneyi emme borusundan ayırın ve kas örneklerini pencereden ve namludan dikkatlice çıkarın.

Bu işlemi tekrarlayarak daha fazla kas gerekiyorsa ikinci bir geçiş yapın. Forseps kullanarak kas örneğinden görünür kan pıhtılarını çıkarın. Ardından numuneyi tartın ve hemen buz içeren bir tüpe yerleştirin.

Soğuk ECCO'lar fosfat tamponlu salin veya DPBS. Keskin makas ve cımbız kullanarak numuneden görünür bağ dokusunu çıkarın. İyice. Numuneleri buz gibi soğuk DPBS tamponu ile üç ila dört kez yıkayın.

Kanı çıkarmak için numuneleri buz gibi soğuk DPBS'de tutun ve mümkün olan en kısa sürede işleyin. Biyopsiden sonraki 45 dakika içinde, kas örneğinden herhangi bir tendon veya yağ dokusunu dikkatlice çıkarmak için önlem alın. Eksi 80 santigrat derecede saklamak için fazla dokunun küçük bir kısmını çıkarın.

Bu, Batı lekeleri gibi diğer deneyler için kullanılabilir. Kas dokusunu hemen ince parçalar halinde doğrayın. Steril bir makas kullanarak, 500 mikrolitrede bir mililitre Sistine proteini ACE inhibitörüne süspanse edin, örneğin CP içinde çözülen nagarlar gibi, bir gram doku başına 0.2 miligram konsantrasyonda bir tampon

Numuneyi iyice askıya alınana kadar kıyın. Bunu, buza aktarmadan önce oda sıcaklığında beş dakikalık bir inkübasyon ile takip edin ve homojenizatörün iyice yıkandığından emin olun. Önceden. Nagarlarla tedavi edilen kıyma dokusunu homojenize edin.

Otomatik bir homojenizatör kullanarak. Bu işlem boyunca numuneyi buz üzerinde tutun. Her doku örneğini iki saniyelik bir darbe için her seferinde dört kez homojenize edin.

Otomatik homojenizatörü 10.000 RPM hız ayarında kullanarak numuneyi tekrar buzun üzerine yerleştirin. Probu %70 etanol ile yıkayın ve ardından dokular arasında damıtılmış su ile yıkayın. Şimdi, homojenize dokuyu eşit hacimde chapel Perry one veya CP one tamponu ile yıkayın.

Daha sonra dokuyu CP hacminin iki katı iki tampon ile yıkayın. Başka bir konik tüpte aynı hacme kadar su getirerek denge tüpünü ekleyin. İçeriği bir santrifüj tüpünde toplayın ve 600 GS'de, dört santigrat derecede veya 10 dakikada santrifüjleyin, tüm parçacıkların geçmesine ve beze takılmamasına izin vermek için tülbenti önceden ıslatın.

Süpernatanı evli bir tülbentten geçirin, süzüntüyü toplayın ve peleti atın, böylece mitokondriyal olmayan fraksiyonların çoğunu çıkarın. Daha sonra süpernatanı 10.000 GS'de 10 dakika boyunca dört santigrat derecede ultrasantrifüj edin. Santrifüjlemeyi takiben aynı şekilde ikinci kez santrifüjlemeden önce peleti dört mililitre CP iki tampon içinde askıya alın.

Süpernatanı atın ve pate'yi iki mililitre CP bir tamponda yeniden süspanse edin. Bu noktada, bu süspansiyondan küçük bir alikotu protein tahmini için kullanılacak ayrı bir test tüpüne yerleştirin. Resus, kalan numuneyi CP bir tampon ve santrifüjde askıya alın.

Daha önce olduğu gibi, protein plakasının daha önceki santrifüj adımları sırasında standartlara göre ayarlanması gerektiğini unutmayın. Son olarak, son peleti minimum miktarda mitokondriyal tahlil çözeltisi veya kütle içinde yeniden süspanse edin. Oksijen tüketim oranını veya OCR'yi dakikada piko mol oksijen cinsinden veya mutlak oksijen ve pH seviyelerinde görselleştirmek için XF testleri gerçekleştirin.

Veri çıkışında. Metin protokolünde listelendiği gibi nihai bir konsantrasyon vermek için plaka bazlı respirometrenin A'dan D'ye kadar olan portlarına bir X kütlesindeki bileşiklerin 10 x konsantrasyonunu ekleyin. Gerekli sayıda kuyu için yeterli miktarda bileşik hazırlayın.

Eklenecek mitokondri konsantrasyonlarını belirlemek için daha önce ölçülen protein hesaplamalarını kullanın. Kuyucuk başına bir mikrogram, 2.5 mikrogram ve beş mikrogram mitokondri titre ederek optimum mitokondri miktarını belirleyin. Kuyular arasındaki değişkenliği en aza indirmek için 24 kuyulu plakadan.

Önce 10 x mitokondriyi soğukta, bir x kütle artı substratta seyreltin. Ardından, bu süspansiyondan 50 mikrolitreyi her kuyucuğa verin. Arka plan okumaları olarak kullanılmak üzere sadece 50 mikrolitre kütle içeren dört kuyu bırakmak.

Cihaz kalibrasyonunu gerçekleştirmek için önceden ıslatılmış kalibrasyon plakasını daha önceki üst kartuşla birlikte respirometreye yerleştirin. Test plakası çalışması için hazırlanırken, plakayı 2000 GS'de dört santigrat derecede 20 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra.

Yavaşça 450 mikrolitre bir x kütle, ayrıca her biri tarafından bilinen süksinat ve çürük ekleyin. Plakayı XF analizörüne aktarmadan önce kuyuya homojen bir yapışma sağlamak için mitokondriyi mikroskop altında iyi görüntüleyin. Sırayla. Mitokondriyal solunumu, respirometreyi kullanarak gerçek zamanlı olarak ölçün, burada gösterilen metin protokolünde sağlanan respirometre ayarlarını kullanarak programlayın, beklendiği gibi bir mikrogram, 2.5 mikrogram ve beş mikrogram mitokondri kullanan karmaşık iki tarafından yönlendirilen tipik Respiro metrik profilleridir.

Genel olarak, OCR daha yüksek miktarda mitokondri ile artar. Bu test için hesaplanan solunum kontrol oranı veya RCR 7.95'tir, bu da mitokondriyal preparatın yüksek kalitede olduğunu gösterir, varyantların veya Inova'nın farklı miktarlarda mitokondri analizi yapılırken sonuçların tutarlılığını karşılaştırmak için yapılır ve karelerin toplamı hesaplanır. Karelerin toplamı veya SS, durum iki, durum üç, durum üç, eşleşmemiş antimisin A ve RCR durum iki ve durum üç ölçümleri için tek yönlü olarak sunulur.

İnnova, ANTIMYCIN ve RCR için olduğu gibi istatistiksel olarak da anlamlıydı. Gruplar arasında ayrılmamış üçüncü durum için anlamlı bir fark görülmedi. Bu sonuçlar, kuyu başına beş mikrogram mitokondrinin diğer konsantrasyonlara kıyasla en düşük SS'yi verdiğini göstermektedir.

Bu grafik, ilk kas örneklem boyutuna bağlı olarak ne kadar mitokondriyal proteinin beklenebileceğini göstermek için bir kılavuz görevi görür. Beklendiği gibi, işlenen kas miktarı ile nihai numunenin toplam mitokondriyal protein içeriği arasında güçlü bir korelasyon vardır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa üç saatten daha kısa sürede tamamlanabilir.

Kas biyopsisini takiben, biyopsi yaptığımız dokuların iyi bir şekilde iyileşmesini sağlamak için hastanın önümüzdeki üç gün boyunca herhangi bir aspirin veya ibuprofen veya diğer reçetesiz satılan steroidal almadığından emin olmak önemlidir. Bir sonraki şey, önümüzdeki bir buçuk gün boyunca da yorucu bir aktivite yapmadıklarından emin olmak istiyoruz, bu yüzden sarsıcı bir şey yok. Bu basketbol trambolin tillery olurdu, ancak kendi normal aktivitelerini yapabilirler.

Ayrıca bölgeyi 24 saat kuru tutmalarını rica ediyoruz, ancak ilk kez ıslanıp duşta bulunmalarını istiyoruz, böylece ciltte olabilecek ve temizlemediğimiz herhangi bir bakteri türü kesiye girmez. Bu videoyu izledikten sonra, S lateral iskelet kası dokusuna nasıl biyopsi yapılacağını, mitokondriyi nasıl izole edeceğinizi ve solunum kontrolünü nasıl ölçeceğinizi daha iyi anlamış olmalısınız.