Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde Escherichia coli

Bu prosedürün genel amacı, yapısal ve fonksiyonel analizler için SIA coli'de eksprese edilen membran proteinlerini tanımlamaktır. İlk olarak, bakteriler hasat edilir, yalan söyler ve doğru şekilde katlanmış GFP proteinlerinin Ingel floresan ile görselleştirilmesi için SDS sayfası tarafından analiz edilir. İkinci adımda, ilgilenilen zar proteinlerini ifade etmek için belirlenen e coli'nin üretimi ölçeklendirilir ve protein ekspresyonunun indüksiyonunu takiben hücrelerden toplam bir zar fraksiyonu hazırlanır.

Son olarak, toplam membran fraksiyonu dört farklı deterjanda ve deterjanın mono dispersitesinde çözündürülür. Çözündürülmüş. GFP proteinleri, boyut dışlama kromatografisi ile analiz edilir. Sonuç olarak, proteinler floresan ve numunelerdeki agregasyon mono dağılımını ve serbest GFP'yi değerlendirmek için çizilen elucian profilleri ile izlenebilir.

Yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için rekombinant membran proteinlerinin üretimi, düşük çözünürlükleri nedeniyle teknik olarak zor olmaya devam etmektedir ve deterjanlara ekstrakte edildikten sonra kararsızlığı miras alırlar. Deneyimler, farklı türlerden ortologlar gibi çoklu zar proteinleri varyantının taranmasının, zar proteini ekspresyonunun başarı oranını artırabileceğini göstermiştir. Otantik katlanmayı bildirmek için kullanılan yeşil floresan proteinlerine füzyon.

Membran proteinlerinin ve e coli'nin ekspresyon taraması için GFP tabanlı protokolümüzün ilk adımı, ekrandaki ekspresyon seviyesine dayalı olarak daha fazla analiz için membran protein yapılarını tanımlamak için tüm hücrelerden deterjan lizatlarının ingel floresansını kullanır, Membran proteinlerinin ve farklı deterjanların seçilmesinin davranışı daha sonra boyut dışlama kromatografisine bağlı floresan tespiti kullanılarak değerlendirilir. Bu, deterjan protein komplekslerinin mono dağılımı hakkında bilgi sağlar. IPTG'nin neden olduğu bakteri ekspresyonunu analiz etmek için, gece boyunca 24 derin kuyu bloğundan bir mililitre IPTG ile muamele edilmiş e koline kopyasının 96 derin kuyu bloğuna aktarılmasıyla başlayın, blokları kapatın ve daha sonra hücreleri oda sıcaklığında 6.000 kez G'de 10 dakika boyunca döndürün.

Daha sonra, kalan sıvıyı boşaltmak için bir kağıt havluya hafifçe vurarak ortamı boşaltmak için bloğu ters çevirin. Plakayı tekrar kapatın ve hücreleri en az 20 dakika sonra eksi 80 santigrat derecede saklayın. Peletleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca çözün ve ardından hücreleri 200 mikrolitre lizis tamponunda tamamen yeniden süspanse etmek için çok kanallı bir pipet kullanın.

Hücreleri 20 mikrolitre DLPI çözeltisi ile tedavi edin, 1000 RPM'de ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede çalkalandı. Daha sonra her bir oyuğa 25 mikrolitre% 10 doda multiside ekleyin ve hücreleri çalkalayarak 60 dakika daha inkübe edin. DDM tedavi santrifüjünden sonra, derin kuyu bloğu ve ardından temizlenmiş lizatın 10 mikrolitresini bir mikrotitre plakasına aktarın ve 10 mikrolitre SDS sayfa jel yükleme tamponu ekleyin.

Şimdi jeli kuyu başına 10 mikrolitre lizat tampon çözeltisi ile yükleyin ve jeli, diyafram dibe ulaştığında iki ila 2,5 saat boyunca soğuk bir odada 100 ila 120 volt arasında sabit voltajda çalıştırın. Hücre kültürlerini büyütmek için füzyon proteinlerini algılamak için jeli mavi ışık filtreli bir görüntüleyiciye yerleştirin. Yetkin bir e coli'nin bir Eloqua'sını dönüştürdükten sonra, 37 santigrat derecede gece boyunca büyümek için bir koloniyi 10 mililitre güç suyuna dönüştürün.

Ertesi sabah, gece boyunca beş mililitre kültürü 500 mililitre güç suyuna seyreltin ve kültürleri 250 RPM ve 37 santigrat derecede çalkalanarak büyütmeye devam edin. 595 nanometredeki OD yaklaşık 0.5 olduğunda, bir milimolar nihai konsantrasyona IPTG ekleyerek ekspresyon indükleyin ve ardından kültürü bu sefer 20 santigrat derecede gece boyunca çalkalayıcıya geri yerleştirin. Ertesi sabah, hücreleri santrifüjleme ile hasat edin ve peletleri eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Hücre zarlarını hazırlamak. Üçüncü oda sıcaklığındaki peletleri, hücre peletinin gramı başına beş mililitre PBS'de yeniden askıya alın ve viskozite akıcı bir kıvama gelene kadar hacmi gerektiği gibi artırın. Daha sonra, mililitre başına 10 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar bir milimolar DNA'nın nihai konsantrasyonuna magnezyum klorür ve hücrelere 20 gram hücre peleti başına bir önceden paketlenmiş proteaz inhibitör tableti ekleyin.

Daha sonra, 30 KPSI'lik bir basınçta soğutulmuş bir hücre bozucu kullanarak hücreleri kırın ve ardından kırılmamış hücreleri ve kalıntıları 30.000 kez G ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca peletleyin. Supinatı bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve supinatı 200.000 kez G ve dört santigrat derecede bir saat aşağı döndürerek toplam membran fraksiyonunu toplayın. Ardından, kullanılacak her deterjan için zarları çözündürmek üzere zar peletini 10 mililitre buz gibi soğuk PBS'de yeniden süspanse etmek için hücre homojenizatörünü kullanın.

900 mikrolitre membran süspansiyonunu 1.5 mililitrelik poli santrifüj tüpüne alikot edin. Daha sonra, uygun 1,5 mililitrelik tüplere taze hazırlanmış her bir deterjandan 100 mikrolitre ekleyin ve karışımları hafif bitki örtüsü ile dört santigrat derecede inkübe edin. Bir saat sonra, deterjanı ve çözünür fraksiyonları bir tezgah üstü ultra santrifüj ile peletleyin, tüplerin en az yarısının dolu olduğundan emin olun ve floresan tespit edilen boyut dışlama kromatografisi veya FEC analizi için sırtüstü ajanı saklayın.

Daha sonra, dakikada 0,3 mililitre hızında çalışan akış tamponu ile geniş bir fraksiyonlama aralığına sahip bir ekvator boyutu dışlama kolonu. Daha sonra 100 mikrolitre çözünmüş membran numunesini aynı akış hızında kolona enjekte edin ve floresan optiği kullanarak elusiyen profilini izleyin. Son olarak, elüsiyen hacim ve floresan yoğunluğu verilerini grafiksel görüntüleme için bir elektronik tablo programına aktarın ve kalan çözünmüş membran malzemesini ingel floresan ile analiz edin.

Daha önce gösterildiği gibi, söz konusu protein ailesi bakteri hücre bölünmesi için gereklidir. Bu görüntülerde, söz konusu 24 OUTTA 47 yapının jel floresan görselleştirmesinde bir temsilci gösterilmektedir. Bantların yoğunluğu, ifade seviyesinin bir göstergesidir.

Örneğin, dördüncü şerit sahnesindeki füzyon proteini her iki suşta da iyi bir şekilde ifade edilir. Bununla birlikte, ek düşük moleküler ağırlık bantları, proteinin birçok şeritte kısmen bozulduğunu göstermektedir. Boyut olarak yalnızca GFP'ye karşılık gelen bir bant vardır.

Örneğin, G dört ve H dört, C 41 DE üç P lie S suşunda serbest GFP'ye tamamen parçalanır. LEMO 21 DE üç'te ise bu grafiklerde bir miktar bozulmamış protein bulunmaktadır. Floresan tarafından tespit edilen boyut dışlaması ile birincil ekranda iyi performans gösteren iki yapının analizi, dört deterjandan hangisinin test edildiğine bağlı olarak proteinlerin nasıl farklı davrandığını göstermektedir.

Örneğin, bu protein, Dool Multiside'da çöp agregasyonu ile yalnızca simetrik bir tepe verdi ve bu da onu sonraki saflaştırma için tercih edilen deterjan haline getirdi. Buna karşılık, diğer füzyon proteini, test edilen tüm deterjanlarda benzer bir profil sergiledi. Bu protokol, örneğin, farklı ekspresyon koşulları altında yetiştirilen farklı e coli suşlarını ve hem birincil hem de ikincil ekranlarda ek caydırıcıları içerecek şekilde kolayca genişletilebilir.

Özetle, bu protokolün temel amacı, daha ileri analizler için adayları belirlemek için çok sayıda zar proteininin ekspresyon ve deterjanizasyon açısından taranmasını sağlamaktır.