Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde

Bu prosedürün genel amacı, yapısal ve fonksiyonel analizler için SIA coli'de eksprese edilen membran proteinlerini tanımlamaktır. İlk olarak, bakteriler hasat edilir, lizlenir ve doğru katlanmış GFP proteinlerinin InGel floresans ile görselleştirilmesi için SDS page ile analiz edilir. İkinci adımda, ilgilenilen membran proteinlerini eksprese ettiği belirlenen e coli üretimi ölçeklendirilir ve protein ekspresyonunun indüksiyonunu takiben hücrelerden toplam membran fraksiyonu hazırlanır.

Son olarak, toplam membran fraksiyonu dört farklı deterjanla çözündürülür ve deterjanla çözündürülmüş GFP proteinlerinin monodispersitesi boyut dışlama kromatografisi ile analiz edilir. Nihayetinde, proteinler floresan ile izlenebilir ve örneklerdeki agregasyon, monodispersite ve serbest GFP'yi değerlendirmek için elüsyon profilleri çizdirilebilir.

Rekombinant membran proteinlerinin yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için üretimi, düşük çözünürlükleri ve deterjanlar ile ekstrakte edildiklerinde ortaya çıkan kararsızlıkları nedeniyle teknik olarak zor olmaya devam etmektedir. Deneyimler, farklı türlerden ortologlar gibi membran proteinlerinin birden fazla varyantının taranmasının, membran proteini ekspresyonu başarı oranını artırabileceğini göstermiştir. Otantik katlanmayı raporlamak için yeşil floresan proteinlerle füzyon gerçekleştirilmiştir.

Membran proteinlerinin ve e coli'nin ekspresyon taraması için GFP tabanlı protokolümüzün ilk adımı, taramadaki ekspresyon seviyesine dayanarak daha ileri analizler için membran protein konstrüktlarını belirlemek amacıyla tüm hücrelerden elde edilen deterjan lizatlarının jel içi floresansını kullanır. Membran proteinlerinin seçilme davranışı ve farklı deterjanlar, ardından boyut dışlama kromatografisine bağlı floresans deteksiyonu kullanılarak değerlendirilir. Bu, deterjan protein komplekslerinin monodisperliği hakkında bilgi sağlar. IPTG indüklü bakteriyel ekspresyonu analiz etmek için, gece boyunca kültürlenen 24'lü derin kuyucuk bloklarındaki IPTG işlem görmüş e coli'den bir mililitreyi duble olarak 96'lı derin kuyucuk bloklarına aktararak başlayın, blokları mühürleyin ve ardından hücreleri oda sıcaklığında 6.000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, besiyerini boşaltmak için bloğu ters çevirin ve kalan sıvıyı süzmek için bir kağıt havlu üzerine hafifçe vurun. Plakayı tekrar kapatın ve en az 20 dakika sonra hücreleri -80 °C'de saklayın. Peletleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca çözdürün ve ardından hücreleri 200 µL lizis tamponu içinde tamamen resüspande etmek için çok kanallı bir pipet kullanın.

Hücreleri, 1000 RPM'de ve 4 °C'de 10 dakika boyunca çalkalayarak 20 µL DLPI çözeltisi ile muamele edin. Ardından her kuyucuğa 25 µL %10 DDM ekleyin ve hücreleri çalkalama ile 60 dakika daha inkübe edin. DDM uygulamasının ardından derin kuyucuk bloğunu santrifüjleyin, ardından berraklaşmış lizattan 10 µL'yi bir mikrotitrasyon plakasına aktarın ve 10 µL SDS-PAGE jel yükleme tamponu ekleyin.

Şimdi jelin her kuyucuğuna 10 µL lizat tampon çözeltisi yükleyin ve diyafram tabana ulaşana kadar jeli soğuk odada, 100 ile 120 volt arasındaki sabit voltajda 2 ila 2,5 saat boyunca çalıştırın. Hücre kültürlerini ölçeklendirmek için füzyon proteinlerini saptamak amacıyla jeli mavi ışık filtreli bir görüntüleme cihazına yerleştirin. Yetkin E. coli'yi transforme ettikten sonra, bir koloniyi 37 °C'de gece boyu büyütmek üzere 10 mL besiyerine ekleyin.

Ertesi sabah, gece boyu inkübe edilen kültürden beş mililitreyi 500 mililitre power broth içinde seyrelterek kültürleri 250 RPM hızında çalkalama ile 37 °C'de büyütmeye devam edin. 595 nanometredeki OD yaklaşık 0,5 olduğunda, nihai konsantrasyonu bir milimolar olacak şekilde IPTG ekleyerek ekspresiyonu indükleyin ve ardından kültürü bu kez 20 °C'de gece boyu çalkalayıcıya geri yerleştirin. Ertesi sabah, hücreleri santrifüjasyon ile hasat edin ve pelletleri -80 °C'de saklayın.

Hücre membranlarını hazırlamak için; oda sıcaklığındaki üçüncü peletleri, her bir gram hücre peleti başına beş mililitre PBS içerisinde, viskozite akışkan bir kıvama gelene kadar hacmi gerektiği şekilde artırarak yeniden süspande edin. Ardından hücrelere, nihai konsantrasyonu 1 mM olacak şekilde magnezyum klorür, nihai konsantrasyonu 10 µg/mL olacak şekilde DNA'lar ve her 20 gram hücre peleti için bir adet paketlenmiş proteaz inhibitörü tableti ekleyin.

Ardından, hücreleri 30 KPSI basınçtaki soğutulmuş bir hücre parçalayıcı kullanarak parçalayın ve ardından parçalanmamış hücreler ile kalıntıları 30,000 ×g ve 4 °C'de 15 dakika boyunca çöktürün. Süpernatantı bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve süpernatantı 200,000 ×g ve 4 °C'de bir saat boyunca döndürerek toplam membran fraksiyonunu toplayın. Daha sonra, kullanılacak her deterjan için membranları çözünür hale getirmek amacıyla membran peletini 10 mL buz gibi soğuk PBS içinde yeniden süspand etmek için hücre homojenizatörünü kullanın.

Membran süspansiyonundan 900 µL'lik alikotları 1,5 mL'lik polisentrifüj tüplerine aktarın. Ardından, taze hazırlanmış her bir deterjandan 100 µL'yi uygun 1,5 mL'lik tüplere ekleyin ve karışımları 4 °C'de hafif ajitasyonla inkübe edin. Bir saat sonra, tüplerin en az yarıya kadar dolu olduğundan emin olarak deterjan ve çözünür fraksiyonları masaüstü bir ultrasantrifüj ile çöktürün ve süpernatanı floresan tespitli boyut dışlama kromatografisi veya FEC analizi için saklayın.

Ardından, 0,3 ml/dakika akış hızıyla çalışma akış tamponu kullanan, geniş fraksiyonlama aralığına sahip bir boyut dışlama kolonuna geçin. Daha sonra, çözünür hale getirilmiş 100 µL membran örneğini aynı akış hızında kolona enjekte edin ve elüsyon profilini floresan optikler kullanarak izleyin. Son olarak, grafiksel gösterim için elüsyon hacmi ve floresan yoğunluk verilerini bir hesap çizelgesi programına aktarın ve geri kalan çözünür membran materyalini jel içi floresan ile analiz edin.

Daha önce gösterildiği üzere, söz konusu protein ailesi bakteriyel hücre bölünmesi için gereklidir. Bu görüntülerde, söz konusu konstrüktların 24/47'sinin jel içi floresan görselleştirmesine ait temsili bir görünüm sunulmuştur. Bantların yoğunluğu, ekspresyon seviyesi hakkında bir gösterge sağlamaktadır.

Örneğin, dördüncü sahnedeki kuyucuktaki füzyon proteini her iki suşta da iyi eksprese edilmiştir. Ancak, ek düşük moleküler ağırlıklı bantlar, proteinin birçok kuyucukta kısmen degrade olduğunu göstermektedir. Boyutu tek başına GFP ile örtüşen bir bant mevcuttur.

Örneğin, C 41 DE three P lies S suşunda G four ve H four tamamen serbest GFP'ye parçalanır. Buna karşın LEMO 21 DE three'de, bu grafiklerde bazı sağlam proteinler bulunmaktadır. Birincil taramada iyi performans gösteren iki konstrüktün floresan tespitli boyut dışlama ile analizi, proteinlerin test edilen dört deterjanın hangisi olduğuna bağlı olarak nasıl farklı davrandığını göstermektedir.

Örneğin, bu protein Dool Multiside ile sadece düşük agregasyonlu simetrik bir pik verdi ve bu durum onu sonraki saflaştırma işlemi için tercih edilen deterjan haline getirdi. Buna karşılık, diğer füzyon proteini test edilen tüm deterjanlarda benzer bir profil sergiledi. Bu protokol, örneğin farklı ekspresyon koşulları altında büyütülmüş farklı e coli suşlarını ve hem birincil hem de ikincil taramalarda ek deterjanları içerecek şekilde kolayca genişletilebilir.

Özetle, bu protokolün temel amacı, daha ileri analizler için adayları belirlemek amacıyla, çok sayıda membran proteininin ekspresyon ve deterjanla çözünürlük açısından taranmasını sağlamaktır.