Farelerde Hipokampal Bölgesi Dentate Gyrus dendritik arborization Değerlendirilmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir fare modelinin hipokampusundaki dendritik arborizasyonun derecesini incelemektir. Bu, iki farklı yöntemle elde edilir. İlk yöntemde, dendritler her bölümün tüm kalınlığı boyunca gerçek zamanlı olarak manuel olarak izlenir.

İzlemenin ardından, tüm dendritik ağaç yeniden yapılandırılabilir ve analiz edilebilir. Fan diyagramı kullanılarak, farklı farelerden türetilen çeşitli fan diyagramlarının analizi, objektif bir karşılaştırma aracı olarak kullanılabilir. İkinci yöntem, genişletilmiş alan derinliği görüntüleme ile dendritik arborizasyonu görselleştirmektir.

Son olarak, ilgilenilen tüm bölgedeki dendritlerin kalitatif ve kantitatif değerlendirmesi için tek bir yüksek çözünürlüklü kompozit görüntü elde etmek üzere birden fazla yüksek büyütmeli görüntüyü bir araya getirmek için panoramik bir yöntem kullanılır ve bu prosedürü gösteren GI mobi olacaktır. araştırması laboratuvarımdan akıyor. Bu tekniklerin mevcut metallere göre en büyük avantajı, kullanım kolaylığı ve elde etme ve veri toplama hızıdır.

Bu yöntem, etkilenen beyin bölgelerinde dendritik izasyonun değerlendirilmesi ve farklı tedavilerin dendritler üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi gibi nörobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedürde, fare beyni% 4 Paraform aldehit içinde sabitlendikten bir gün sonra, dört santigrat derecede 48 saat boyunca dehidrasyon için sükroz çözeltisine koyun. Beyinleri sakarozdan çıkarın ve doğrudan kuru buz üzerine yerleştirilmiş bakır blokların üzerine yerleştirin.

Bloğu OCT ile doldurun ve koku ampulünü bir dönüm noktası olarak kullanarak beynin yönünü işaretleyin. Bir kriyostat kullanarak eksi 20 santigrat derecede 70 mikron kalınlığında kesitler kesin ve bunları Kriyoprotektan solüsyonuna yerleştirin ve kullanana kadar eksi 20 santigrat derecede tutun. Hidrojen peroksit içindeki bölümleri metanol içinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, ardından TBS'de yarım saat boyunca 37 santigrat derecede ısıtın.

Ertesi gün DCX antikoru ile boyamadan önce bölümleri %0.3 Triton ve normal at serumu ile oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Bölümleri TBS'de art arda üç kez yıkayın ve bölümleri oda sıcaklığında iki saat boyunca biyotinile edilmiş bir at antigo ile inkübe edin. Bölümleri TBS'de art arda üç kez 10 dakika yıkayın ve 1.5 saat boyunca B, C ışığı ile inkübe edin.

Oda sıcaklığında, DAB çözeltisine hidrojen peroksit ekleyin ve bölümleri hemen bu çözeltide beş dakika inkübe edin ve buz gibi soğuk TBS ile üç kez ve ardından bir kez yıkayarak reaksiyonu sonlandırın. TT BS'de oda sıcaklığında yıkayın. Bir dizi etanol çözeltisi kullanarak bölümleri kurutun.

Her biri beş dakika, berrak ve ksilen ve ardından DPX kullanarak kapak kayması. Bölümler tamamen kuruduktan sonra, slayt yüzeylerindeki fazla DPX'i keskin bir bıçakla temizleyin ve bunları teker teker mikroskobun tarama aşamasına yerleştirin. Görselleştirme sistemi, bir tarama aşaması joystick'i ve 12 bit renkli kamera ile donatılmış bir mikroskoptan oluşur.

Ardından, neuro lucita programını başlatın ve yeni bir veri dosyası açın. Program penceresinin araç panelindeki tüm simgeleri etkinleştirmek için fare işaretçisiyle herhangi bir yere tıklayarak ekranda bir referans noktası yerleştirin. Ardından araç çubuğundaki joystick ücretsiz simgesine tıklayın ve hipokampusun dentat girusunu bulmak için joystick'i kullanın.

Program penceresinin araçlar sekmesindeki ilk bölümde, seri bölüm yöneticisini seçin. Seri bölüm kurulum penceresini açmak için pencerenin sol alt köşesindeki yeni bölüm simgesine tıklayın. Daha sonra, seri bölüm kurulum penceresini seçin ve hipokampal bölgeleri içeren toplam bölüm sayısını girin.

Ardından değerlendirme aralığını seçin ve bölümün kalınlığını girin. Araç çubuğundaki serbest el kontur çizimi simgesine tıklayarak dentat girus bölgesini izlemeye başlayın. Daha sonra dentat granüler hücre tabakasını ana hatlarıyla belirtin.

Büyütme menüsünden 100 x'i seçin. Ardından bölüme bir damla daldırma yağı ekleyin ve hedefi 100 x'e getirin. Bu amaç altındaki dentat granül hücre gövdelerini ve dendritleri bulun.

Ardından, seçilen bir nörona odaklanın ve nöron izleme simgesine tıklayın. Araç çubuğunda, dentat granül hücre gövdesinin çevresini izleyin. İzleme bittiğinde, hücre gövdesini bitir'i seçmek için sağ tıklayın.

Şimdi dendritleri manuel olarak ve X, Y ve Z yönlerini izlemeye başlayın ve joystick ve Z motor düğmesini kullanarak her dalı takip edin Bir çatallanma veya çatallanma düğümünde ilgili seçeneği seçin. Açılır menüden, her dalın sonunda bu düğümlerden ortaya çıkan dalların her birini izleyin. Sağ tıklayın ve açılır menüden bitişi seçin.

Yazılım penceresindeki ok tuşu simgelerini kullanma. Rastgele başka bir dentat granül hücresi seçin ve izleme prosedürünü az önce gösterildiği gibi tekrarlayın. Tüm izlemeyi kaydedin.

Şimdi nöron analizi için nöro lucita explorer'ı başlatın. Deney grubunun ilk faresinden ilk NRX veri dosyasını açın. Deney grubunun ikinci faresinin NRX dosyasını ekleyin ve bu gruptaki tüm NRX dosyaları eklenene kadar devam edin.

Analiz sekmesi altında, fanı analiz penceresinde açmak için diyagramda fanı seçin, dendritleri işaretleyin ve bu fare grubu için dendritlerin bağlantıları ve dallanma modelleri için görüntüle'ye tıklayın. Bu prosedürde, mikroskobu bir dijital kameraya bağlayın. Mikroskoba bağlı tarama aşamasına bir bölüm yerleştirin ve 10 x objektife geçin.

Ardından, sahneyi ilgilenilen alana taşıyın. Bir video yakalama programı başlatın ve kayıt düğmesine basın. Kayıt düğmesine basılır basılmaz, toplam dört saniye boyunca bölümün üstünden altına hareket etmek için makro odak düğmesini kullanın Ortaya çıkan video dosyasını kaydetmeden önce, şimdi a VI video dosyalarını sıkıştırılmamış bir formata dönüştürmek için ücretsiz Image J yazılımını kullanın.

Bir görüntü analiz programı başlatın ve a VI dosyasını açın. İşlem menüsüne gidin ve genişletilmiş alan derinliğine tıklayın. Çıktı seçeneklerinde ilgili video dosyasını seçin.

Odak analizi seçeneklerinde bileşik en iyi odak görüntüsü oluştur'u seçin. Normalleştirilmiş aydınlatmayı ve maksimum yerel kontrast seçeneklerini seçin. Ardından, Z ekseni boyunca odaklanılan tüm pikselleri temsil eden bir sonuç görüntüsü oluşturmak için oluştur'a tıklayın.

Daha sonra, ortaya çıkan görüntüyü kaydedin. Bu adımda, mikroskoba bağlı tarama aşamasına bir bölüm yerleştirin. Sahneyi ilgi alanına taşıyın.

Ardından, 10 x'lik bir objektif kullanarak görüntü alma programını başlatın, ilgilenilen bölgeden yüksek çözünürlüklü görüntüler alın ve kaydedin, görüntüler arasında en az %10 örtüşme olduğundan emin olun. Ardından, görüntüleri daha sonra dikmek için görüntü kompozit düzenleyiciyi çalıştırın. Dosya menüsüne gidin ve yeni panoramaya tıklayın.

Görüntülerin saklandığı klasörü seçin. Ardından, aynı bölgeye ait görüntüleri seçin ve Tamam'a basın. Diske aktar düğmesine basın ve görüntüyü kaydedin.

Bu görüntü, analiz için kullanılabilecek ilgi alanının son derece yüksek çözünürlüklü bir resmini temsil eder. Bu şekil, EDFI yöntemleri ile ve EDFI yöntemleri olmadan dendritik arborizasyonun görselleştirilmesini göstermektedir. En iyi odak düzlemini bulmanın geleneksel yöntemi, EDFI ve önemli ölçüde daha yüksek dendritik alan değerleri ile karşılaştırıldı.

EDFI yöntemi kullanılarak bulundu. Dendritlerin farklı dallanma sıralarında işgal ettiği uzunluk ve hacmin ölçülmesi burada gösterilmiştir. Maksimum uzunluk ve hacim birinci sırada elde edildi.

İşte dentat granül hücrelerinin dendritik uzunluğunun bir histogramı. DCX leke DDR'lerinin dendritik segmentlerinin çoğunluğu 13 ila 26 uzunluğundaydı. Bu kırmızı noktalı çizgi, bu prosedürü takiben sunulan verilerin normal dağılımını gösterir.

Nöro Lucid gibi diğer klasik yöntemler, dendritlerin kapladığı hacim ve alanla ilgili ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Burada size gösterdiğimiz bu teknik, nörobiyoloji alanındaki araştırmacılara sadece nöronal yapıların oluşumunu değerlendirmede değil, aynı zamanda kalın beyin bölümlerindeki mikroglia gibi nöronal olmayan küçük yapıları değerlendirmede de büyük ölçüde yardımcı olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, nispeten kısa bir süre içinde nöronal projeksiyonların kapsamını nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.