Name: Bakım Glioblastoma Standardı Kapsamında Adoptif Tedavisi için CAR T hücrelerinin üretilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Öğrenin, glioblastoma standart tedavisiyle birlikte EGFRvIII-spesifik CAR T hücreleri üretme ve farelerde etkinliğini değerlendirme yöntemini. Bu yaklaşım, immünoterapi sonuçlarını iyileştirmeye yönelik içgörüler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, CAR retroviral yapısını sağladıkları için Dr. Laura Johnson ve Dr. Richard Morgan'a teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Giao Ngyuen'e tüm beyin ışınlaması için dozimetri konusundaki yardımı için teşekkür ediyor. Bu çalışma, bir NIH NCI hibesi 1R01CA177476-01 ile desteklenmiştir.

Bu protokol 10 fareler 10 7 ARAÇ T hücreleri, her ile tedavi edilir bir deneysel tasarım dayanmaktadır. Bu durum, 10 8 ARAÇ T hücreleri gerektiği anlamına gelir; verim canlılığı kaybı hesabına 5 x 10 7 -1 x 10 8 tarafından abartılmıştır edilmelidir. Aşağıdaki protokol yaklaşık 200 x 10 6 hücre oluşturmak için ölçeklenir. Hücreler daha sonra, mevcut KR158B astrositom veya B 16 melanoma hücre hatları geliştirilen, 9 gün kurulmuş singeneik EGFRvIII pozitif kafatası içi tümörlerine sahip dişi C57BL / 6 farelerine damar içinden tatbik edilir. Buna paralel ARAÇ T hücresi üretimi ile, tümör taşıyan farelerin lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) ve WBI (16.5 Gy) klinik açıdan anlamlı dozlarda tatbik edilmektedir. Fareler muhafaza ve Duke Üniversitesi Tıp Merkezi (DUMC) ile patojensiz şartlar altında yetiştirildi. Tüm hayvan deneyleri Duke Üniversitesi Kurumu tarafından onaylanan protokollere göre yapıldıEl Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC). Tümör taşıyan fareler için temozolomidin 1. İdare Gün ile 4 0: <ol><li> Farelerin sayısı enjekte edilecek hesaplayın ve yayılma (16.5 mi TMZ hesaba (örneğin, 30 farenin x 0,5 ml = 15 mi TMZ) ihtiyaç TMZ çözeltisi miktarını belirlemek ve bu birime 1.5 mi eklemek için 0.5 ile çarpın ). </li><li> 3 mg bu toplam hacmi çarpın / ml gerekli liyofilize TMZ ağırlığını belirlemek için (örneğin, 16,5 x 3 = 49,5 mg TMZ). 50 ml&#39;lik konik içine bu tartılır. DİKKAT: TMZ inhalasyon, sindirim ve gözlerle, cilt ile temasında ve mukozal membranlar tarafından toksiktir. Maruz kalma riskini azaltmaya yönelik öneriler için kurumun iş güvenliği ve / veya çevre sağlığı ve sağlıklı yaşam departmanı danışın. </li><li> Dimetil sülfoksit hacmini belirlemek için 0.15 ile toplam hacmi çarpın (DMSO) (örn, 16.5 x gerekli0.15 = 2,475 mi DMSO). Filtre, bir steril tüp içine, bir 0.2 mikron filtre içinden DMSO Bu hacim (artı yayılma için hesap ilave 2 ml) içinde sterilize edilir. TMZ toz, steril DMSO 2,475 mL ekleyin. </li><li> 10-15 dakika süre ile 65 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerinde, su içinde bir çanak içinde TMZ / DMSO çözeltisi yerleştirin. TMZ tamamen çözüldükten sonra çözelti, renk soluk sarı bir olmalıdır; Çözelti pembe olursa, o zaman TMZ parçalanır ve yeni bir solüsyon TMZ taze bir çok hazırlanmalıdır. </li><li> Toplam hacmi (0.85 x 16.5 ml = 14,025 ml serum fizyolojik) tarafından 0.85 çarpılarak gerekli steril serum fizyolojik uygun hacmini hesaplayın. 50 ml&#39;lik bir konik steril tuzlu su içinde 15 ml ilave edilir. TMZ DMSO, 65 ° C ısı tuzlu su içinde eritilmesi iken. </li><li> Girdap TMZ / DMSO çözeltisi TMZ tozu tamamen çözündürüldü ve yavaş yavaş TMZ / DMSO çözeltisi ısıtılmış tuzlu su eklemek olduğundan emin olmak için. </li><li> Hemen hazırlandıktan sonra, tam 15 x 1 ml tüberkülin syring yük4 gün yerleşik tümör taşıyan farelere tatbikat için TMZ çözeltisi ile es. </li><li> Beş TMZ idarelerinin toplam 4 arasındaki günlerde 1 bu işlemi tekrarlayın. </li></ol> Tümör taşıyan fareler 2. Tüm Beyin Işınlama Gün 2 ile 4: <ol><li> X-ışını irradiator Güç ve ısınma tam gerilime izin verir. Uygun filtre yeri ve giriş doğru voltaj ve akım ayarları (Şekil 2A) olduğundan emin olun. NOT: irradiator ve dozimetre gerilim ayarları ve ızgara düzeni (Şekil 2A, B) Uygun belirlemek için önceden tesis edilmelidir. </li><li> 5.5 Gy X-ışınlarıyla neden gerekli süreyi hesaplayın. X-ışınları 2 Gy / dk&#39;lık bir hızda verilmektedir, örneğin, daha sonra 2.75 dakika 5.5 Gy toplam sağlamak için gereklidir. Giriş uygun zaman süresi. Not: Tablo 2 fare WBI bir ölçerleri sağlarİnsanlarda ND klinik benzerleri. Yüksek dereceli gliomlarda bağlamında, 60 Gy TBI (6 hafta boyunca 2 Gy fraksiyonları, 5 gün / hafta) parçalandı bakım klinik standart ve burada kullanılan kemirgen eşdeğer 16.5 Gy (Gy x 3 5.5) &#39;dir. </li><li> 2 mi ketamin ve nihai çözelti, 10 mg / ml ketamin ve 1 mg / ml ksilazin olduğu şekilde, 1 ml ksilazin mi 17 tuzlu su ekleyerek sistemik anestezi için, ketamin / ksilazin taze bir çözelti hazırlayın. </li><li> Fareler tartılır ve hayvanlar 100 mg / kg ve 10 mg / kg ksilazin ile ketamin dozu almış gibi vücut ağırlığının gramı başına karın içinden ketamin / ksilazin 10 ul yönetmek. Fareler tamamen uyuşturulmuş ve gözle görülür ketamin / ksilizin yönetiminin 2 dakika içinde nefes olmalıdır. </li><li> Sedasyon hayvanlarda göz nemi korumak için, yavaşça her göz yapay gözyaşı merhem küçük bir miktar sürün. </li><li> Kafaları en yüksek X-ray aldığı alanda konumlandırılmış şekilde ızgara üzerinde sedasyon fareler yerleştirintensit (Şekil 2B, C). Aşağı uygun olan boyundan kalkan organları sistemik X-ışını teslim (Şekil 2B) engellemek için kurşun boru büyüklüğünde. </li><li> Izgara düzeni X-ışını demetinin odak noktasını gösteren lazer koordinat (0,0) olacak şekilde X-ışını altında konumlandırılmış fareler yerleştirin. X-ışını teslim başlayın. </li><li> X-ışını teslim tamamlandığında, sıcak ısıtma yastığı irradyatör ve yerden hayvanları kaldırın. Hayvanlar sternum recumbence korumak için yeterli bilinci yerine kadar bilinçli hayvanlar ile sedasyon hayvanları ev etmeyin. Hayvanlar, sternum recumbence korumak geri uygun kafeslerinde bilinçli hayvanları yerleştirebilirsiniz kez. </li><li> Radyasyon üç bölünmüş dozlarda olmak üzere toplam gün 3 ve 4 bu prosedürü yineleyin. </li></ol> 3. Transfeksiyon Gün -1: <ol><li> Dulbecco M, 500 ml, 50 ml cenin sığır serumu (FBS) ilave edilerek D10 ortamı hazırlamakdeğişmemiş Eagle Ortamı (DMEM). </li><li> 500 ml RPMI-1640 ortamı için 5,5 ml L-glutamin, 5.5 ml sodyum piruvat, 5.5 mi temel olmayan amino asitler ve 5,5 ml penisilin / streptomisin (pen / strep) ilave edilerek, T hücre ortamı (TCM) hazırlayın. Daha sonra, 2-merkaptoetanol ve 550 ul gentamisin 550 ul ilave edin. Son olarak, 50 mi FBS ekleyin. </li><li> Hasat, in vitro kültürlenmiş HEK293T hücreleri ve D10 ortam içinde 7.5 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyona getirin. </li><li> Levha 10 mi D10 ortamı ve 16 x 10 cm, poli-D-lisin (PDL) kaplı plakalar her HEK293T hücre süspansiyonu 1 ml. </li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de bir gece boyunca inkübe edin. </li></ol> Gün 0: <ol start="6"><li> Hücreleri transfecting önce 10 ml taze D10 en az 30 dakika Ortamı değiştirin. </li><li> + 1 (= 17 + 16 1) 14.1 ng plakalar toplam sayısı ile çarpılarak transfeksiyon için gerekli olan vektör plazmidinin miktarı, PCL-Çevre vektörü ve lipozomal transfeksiyon reaktifi belirlemekvektör plazmid (14.1 x 17 = 239,7 mikrogram), 9.9 ug PCL-Eko vektörü (9.9 x 17 = 168,3 mikrogram) ve 60 ul lipozomal transfeksiyon reaktif (60 x 17 = 1.020 ul). Tüm reaktifler çözeltilerin hazırlanması önce oda sıcaklığında olmalıdır. </li><li> Tüp A içinde iki boruyu, A ve B Etiket 239,7 ug vektör plazmidi ile (1.5 x 17) ile 168.3 mg PCL-Çevre vektörü eklemek indirgenmiş serum kartal ortamı (RS-MEM) modifiye ml olmuştur. Tüp B&#39;de, (1.5 x 17) ml&#39;lik RS-MEM 1020 ul lipozomal transfeksiyon reaktif ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ayrı ayrı A ve B inkübe edin. </li><li> (1-2 saniye boyunca girdap ya da birkaç kez ters çevirin) hafifçe bir arada A ve B karıştırın ve lipid / DNA kompleksi oluşturmak üzere oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. </li><li> 10 cm&#39;lik bir tabakta HEK293T hücrelere damla Lipid / DNA kompleksi damla ekleyin. </li><li> 6-8 saat için 37 ° C&#39;de inkübe veya gece (24 saat aşmayın). </li><li> 6-8 saat kuluçkadan sonra viral üretim için taze TCM 12 ml orta yerine. Bu medya kaplamaT hücre transdüksiyonu için viral süpernatan olarak 2 gün kullanılacaktır. </li></ol> 4. splenektomi ve T-hücresinin hazırlanması Gün 0: <ol><li> Dalak toplama süre ile buz üzerinde 50 ml konik ve yerine TCM 10 ml dökün. </li><li> CO2 asfiksiyasyonu ve ikincil başları kesilerek hayvanların uygun sayıda Kurban: Talep hayvanlar Amerikan Veteriner Tıp Derneği kılavuzlar (en fazla 5 hayvan olabilir başına% 10-30 kafes hacim / dakikalık bir akış hızında CO2 alan bir kafeste solunum sonlandığı kadar ve bundan sonra iki dakika için) aynı anda kurban. CO 2 odasından hayvanları kaldırın ve başını kesmek. Not: Yaklaşık 4.5-5 x 10 7 splenositlerin verecek bir 6-12 haftalık dişi C57BL / 6 fare dalak biri. Burada, 4 dalakları yaklaşık 200 x 10 6 hücre hasat edilir. </li><li> Sağ tarafı yukarı bakacak şekilde fareyi Lay, ve% 70 etanol ile sprey. Forseps ile, sol göğüs kafesi altında derinin ince bir kat kapmak ve makas ile hafif bir kesi kesti. Peel geri cilt, dikkatle forseps ile periton ince bir kat kapmak ve bir küçük boşluğu kesti. </li><li> dalak düzleştirilmiş fasulye benzer bir küçük, ince uzun, koyu kırmızı bir organdır; ince çevreleyen bağ dokusu uzak keserek forseps ve tüketim ile dalak kapmak. Buz üzerinde TCM 10 ml içeren konik içine eksize dalak yerleştirin. </li><li> 70 mikron gözenekli bir hücre süzgecinden fazla dalak dökün ve tek bir hücre süspansiyonu üretmek için 5 ml&#39;lik bir şırınga içinde bir kör ucu olan ezme ile ayrıştırılacaktır. İki dalak maksimum örgü süzgeç başına tasnif edilmiş olmalıdır. </li><li> Dikkatle kalan splenositlerin toplamak için parçalanmalanna aşağıdaki süzgeç yıkamak için TCM küçük bir hacim kullanın. Bir tek hücre süspansiyonu halinde tüm ayrıştırılmış dalak havuzda toplayın. Bir yıkama bir TCM&#39;nin ile 50 ml nihai hacim getirin10 dakika için 300 xg&#39;de dönmeye d. </li><li> 5 mi 10x lisis tamponu ile 45 ml steril suyun eklenmesiyle 1x lisis tamponu içinde bir çözeltisi hazırlandı. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme iyi karıştırma, kırmızı kan hücreleri, 50 ml&#39;lik konik dalak başına 1x lizis tamponu 5 ml tekrar süspansiyon pelet, ortadan kaldırmak için. 5 dalak aşan Eğer, bir 250 ml santrifüj tüp kullanın. 5 dakika için bir 37 ° C su banyosu içinde konik ya da santrifüj tüpü yerleştirin. </li><li> Su banyosu parçalama reaksiyonu çıkarın ve 1 at TCM ekleyin: reaksiyonu nötralize etmek lizis tamponu ile 1 oranında. 10 dakika için 300 xg&#39;de iplik yıkayın. </li><li> Yukarı ve aşağı pipetleme TCM aspire süpernatant ve tamamen tekrar süspansiyon pelet (2 ml / dalak, 4 dalak için 8 ml toplam). </li><li> 190 ul tripan mavisi (01:20 seyreltme) hücre süspansiyonu 10 ul ekleyerek hücreleri saymak. Toplam hücre sayısını elde etmek için 20 x 10 x 4, toplam hacmi (8 ml) dört kareli meydanlarından birinde elde edilen numarayı çarpın (örneğin, 125 hücre x 20 x 10 4 </skadar&gt; x 8 ml = 200 x 10 6 splenositleri). </li><li> 2 ug / ml konkanavalin A (Con A) ve 50 lU / ml rekombinant insan interlökin-2 (rhlL-2) ile desteklenmiş TCM, 2 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda, hücrelere seyreltin. Bu durumda, 200 x 10 6 splenosit, 8 mi hücreleri, 200 ug ConA ve 5000 IU rhlL-2 92 ml ortamı eklenir. </li><li> 4 x 10 6 hücre de her olmak için, 24-çukurlu doku kültürü tedavi levhaların her çukuruna 2 ml hücre ekleme (örneğin, hücre 100 mi, yaklaşık 4 plakayı gerektirir). </li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de bir gece boyunca inkübe edin. </li></ol> 5. İletimi 1. Gün: <ol><li> Olmayan doku kültürü sayısı 2 ile hasat dalak numarası (8 plaka 4 dalak için gerekli olan) çarpılması suretiyle transdüksiyonu için gerekli olan, 24 oyuklu plakalar tedavi hesaplar. </li><li> Daha sonra, yeniden birleştirici insan fibronektin parçası (RHFF) çözeltisi gerekli hacmi hesaplamakçarpılarak kat plakalarına gerekli (kuyuların toplam sayısı + 3) 0.5 ml x (8 tabak x 24 kuyu = 192 + 3 = 195) 0.5 ml = 97.5 ml x. </li><li> 25 ug (97.5 x 25 = 2437,5 ug) ile toplam hacmi çarpılarak 25 ug / ml&#39;lik bir konsantrasyonda RHFF içeren 97.5 ml fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) hazırlayın. 97.5 ml PBS RHFF bu miktar ekleyin. </li><li> Kat olmayan doku kültürü başına 0.5 ml PBS / RHFF çözeltisi ilave edilerek, 24 oyuklu plakalar işlemden geçirildi. </li><li> 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. </li></ol> Gün 2: <ol start="6"><li> Olmayan doku kültüründen, PBS / RHFF çözeltisi dökümü 24 oyuklu plakalar işlemden geçirildi. </li><li> PBS içinde 1 ml / göz,% 2 sığır serum albümini (BSA) ilave edilir ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Sıkıca plaka upending tarafından BSA çıkarın. 2 ml PBS eklenerek yıkanır. </li><li> 250 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içine, her HEK293T PDL plaka ortamı transfer ederek viral süpernatan toplamak ve 500 x g&#39;de 10 dakika dönerler. </li><li> Dikkatle viral SU aktarmakemin oluşmuş olabilecek hücre pelletini rahatsız etmemek için, tatlı bir 250 ml&#39;lik santrifüj tüpüne pernatant. </li><li> Nihai hacim RHFF kaplı oyuklara için gereken miktardan daha 3 mi daha gibi viral süpernatan taze TCM ekleyin. Örneğin, 192 RHFF kaplı oyuklara için, 192 + 3 ml = 195 mi, viral süpernatanın hacmi getirmek. </li><li> 3 kez her iyi - hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme 2 ile kuvöz ve tekrar süspansiyon kültüründe splenositlerin çıkarın. 250 ml&#39;lik konik transfer. Bu adımı hızlandırmak yardımcı olacak transfer edilmeden önce bir steril hazne ile bir çok kanallı pipet kullanarak edin. Daha önce, 10 dakika boyunca 300 x g de tarif edilen ve sıkma sayısı. </li><li> RhlL-2 ekleyin, viral süpernatanın 50 IU / ml&#39;lik bir konsantrasyonda ilave edilebilir. Örneğin, ekleme 50 x 195 = 9,750 IU viral süpernatant 195 ml-2 rhIL. </li><li> 1 x 10 6 hücre / ml&#39;de, viral süpernatan içinde yeniden süspanse splenositlerin </li><li> RHFF kaplı 24 oyuklu plakalara / oyuk splenosit süspansiyonu 1 ml ilave edilir. </li><li>Aşağıdaki ayarlara göre 90 dakika Spin: 770 xg, hızlanma = 4, fren / yavaşlama = 0, 32 ° C. </li><li> 50 lU / ml rhIL-2 ile bir TCM çözelti hazırlayın. Örneğin, 10.000 IU rhlL-2 eklenerek 200 TCM solüsyon hazırlanır. Santrifüj işleminden sonra her bir oyuğa rhlL-2 / TCM 1 ml ilave edilir. </li><li> % 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de gece boyunca kültür. </li></ol> 6. CAR T hücresi Kültür ve Hasat Gün 3 ve 4: <ol><li> T hücreleri&gt;% 80 izdiham elde ederse, hücreler (bu genellikle günde 3 ya da 4 gün gerçekleşir) bölünmüş olabilir. Hücreleri ayırmak için, hafifçe yukarı pipetleme ve her bir çukura 2-3 kez aşağı ve bir taze 24-yuvalı doku kültürü tedavi plakanın yeni kuyu içine her bir 1 ml hareket eder. Daha sonra, son hacmi, tüm kaynaklarda 2 mi olduğunu, her bir oyuğa bu 50 lU / ml IL-2 ile taze TCM 1 ml. </li><li> Hücreler&gt;% 80 izdiham ulaşmak yoksa, yavaş yavaş her üst medyanın 1 ml kapalı pipetle iyi bir buçuk medya değişikliği gerçekleştirmek. D kaçınınmedya çıkarırken alt yerleşmiş hücreler isturbing. RhIL-2 ml 50 IU / içeren taze TCM 1 ml ekleyin. </li></ol> 5. Gün: <ol start="3"><li> 250 ml&#39;lik santrifüj tüpüne süspanse CAR T hafifçe yukarı pipetleme hücreleri ve her bir aşağı 3 kere transfer. 10 dakika için 300 xg&#39;de hücreleri Spin. </li><li> Pelet bozmadan Tamamen aspire süpernatant. İkinci bir zaman daha önce tarif edildiği gibi hücre sayımı ve PBS ile yıkayın, bir kez PBS ile yıkayın. Tipik bir ARAÇ T hücre verimi kuyu başına yaklaşık 1 x 10 6 hücre (8 plakaları x 24 kuyu = 192 x 10 6 ARAÇ T hücreleri) &#39;dir. </li><li> 200 ug hacim içinde 1 x 10 7 bir enjeksiyon için 5 x 10 7 / ml&#39;lik bir konsantrasyonda, PBS içinde yeniden süspanse hücreler (örneğin, 192 x 10 6 ARAÇ T hücreleri için, tekrar süspansiyon 3.84 ml PBS pelet yıkanmış). </li></ol> Tümör taşıyan fareler 7. CAR T hücre İdaresi 5. Gün: <ol><li> Transpodamardan enjeksiyon için hayvan tesisine buz üzerinde oda sıcaklığı hücreleri. Yük 27 ile insülin şırınga içine 500-1000 ul - tüm kabarcıklar sınırdışı olmasını sağlamak 31 G iğne. </li><li> Kuyruk dibinde bir fare tut ve tüp süzgeç olarak yerleştirin. </li><li> Ven yukarı bakacak şekilde gergin kuyruk çekin, ve kuyruk ven paralel takarak damara iğne deri altında yaklaşık 1-2 mm kayma. Yavaş yavaş damara 200 ul sınırdışı. İğne doğru damar içine takılırsa, hacim kolayca akacak; Aksi takdirde orada direniş olacak ve iğne kuyruk kaldırılacak ve doğru-takılı yeniden gerekir. </li></ol>

<ol><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sipuleucel-T+immunotherapy+for+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer.</a> N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).</li>
<li>Hodi, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+with+ipilimumab+in+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma.</a> N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).</li>
<li>Schwartzentruber, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gp100+peptide+vaccine+and+interleukin-2+in+patients+with+advanced+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).</li>
<li>Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+effector+T+cells+expressing+chimeric+T+cell+receptor+with+antibody+type-specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity.</a> Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).</li>
<li>Pule, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-specific+T+cells+engineered+to+coexpress+tumor-specific+receptors%3A+persistence+and+antitumor+activity+in+individuals+with+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma.</a> Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+depletion+and+remissions+of+malignancy+along+with+cytokine-associated+toxicity+in+a+clinical+trial+of+anti-CD19+chimeric-antigen-receptor-transduced+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells.</a> Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+persistence+of+adoptively+transferred+autologous+CD19-targeted+T+cells+in+patients+with+relapsed+or+chemotherapy+refractory+B-cell+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias.</a> Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).</li>
<li>Wikstrand, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+EGFRvIII+are+tumor+specific+and+react+with+breast+and+lung+carcinomas+and+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas.</a> Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).</li>
<li>Sampson, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFRvIII+mCAR-modified+T-cell+therapy+cures+mice+with+established+intracerebral+glioma+and+generates+host+immunity+against+tumor-antigen+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss.</a> Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).</li>
<li>Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+lymphocyte+function+by+glioblastoma-derived+transforming+growth+factor+beta+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2.</a> J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).</li>
<li>Wintterle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+B7-related+molecule+B7-H1+by+glioma+cells%3A+a+potential+mechanism+of+immune+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis.</a> Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).</li>
<li>Fecci, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+regulatory+T-cell+fraction+amidst+a+diminished+CD4+compartment+explains+cellular+immune+defects+in+patients+with+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma.</a> Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).</li>
<li>Wilmotte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-homolog+1+expression+by+human+glioma%3A+a+new+mechanism+of+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion.</a> Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).</li>
<li>Yang, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediation+of+enhanced+transcription+of+the+IL-10+gene+in+T+cells%2C+upon+contact+with+human+glioma+cells%2C+by+fas+signaling+through+a+protein+kinase+A-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway.</a> Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).</li>
<li>Reilly, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temozolomide%3A+a+new+oral+cytotoxic+chemotherapeutic+agent+with+promising+activity+against+primary+brain+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours.</a> Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).</li>
<li>Newcomb, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Combination+of+Ionizing+Radiation+and+Peripheral+Vaccination+Produces+Long-term+Survival+of+Mice+Bearing+Established+Invasive+GL261Gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas.</a> Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).</li>
<li>Park, B., Yee, C., Lee, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+radiation+on+the+immune+response+to+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of radiation on the immune response to cancers.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).</li>
<li>Fritzell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+temozolomide+synergizes+with+immunotherapy+in+a+T+cell-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion.</a> Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).</li>
<li>Park, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-priming+by+temozolomide+enhances+antitumor+immunity+of+dendritic+cell+vaccination+in+murine+brain+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model.</a> Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).</li>
<li>Emens, L. A., Jaffee, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+the+activity+of+tumor+vaccines+with+cytotoxic+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy.</a> Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).</li>
<li>Murphy, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+immunotherapy+screen+of+costimulatory+molecules+identifies+Fc-OX40L+as+a+potent+reagent+for+the+treatment+of+established+murine+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas.</a> Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).</li>
<li>Newcomb, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+enhances+antitumor+effect+of+anti-CD137+therapy+in+a+mouse+Glioma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model.</a> Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).</li>
<li>Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+lymphotoxic+is+dose-intensified+temozolomide%3F+The+glioblastoma+experience%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience.</a> J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).</li>
<li>Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dense+temozolomide+regimens%3A+antitumor+activity%2C+toxicity%2C+and+immunomodulatory+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects.</a> Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).</li>
<li>Muranski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intensity+lymphodepletion+and+adoptive+immunotherapy-how+far+can+we+go%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Clin+Pract+Oncol%22%5BJournal%5D)">Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go.</a> Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).</li>
<li>Wrzesinski, C., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Less+is+more%3A+lymphodepletion+followed+by+hematopoietic+stem+cell+transplant+augments+adoptive+T-cell-based+anti-tumor+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy.</a> Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).</li>
<li>Dudley, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+therapy+for+patients+with+metastatic+melanoma%3A+evaluation+of+intensive+myeloablative+chemoradiation+preparative+regimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens.</a> J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).</li>
<li>Sanchez-Perez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloablative+Temozolomide+Enhances+CD8%28%2B%29+T-Cell+Responses+to+Vaccine+and+Is+Required+for+Efficacy+against+Brain+Tumors+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice.</a> Plos One. 8 (3), (2013).</li>
<li>Su, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+CD4%2B+lymphopenia+in+melanoma+patients+treated+with+temozolomide%3A+a+toxicity+with+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications.</a> J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).</li>
<li>Dummer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+homeostatic+proliferation+elicits+effective+antitumor+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity.</a> J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+homeostatic+cytokine+sinks+by+lymphodepletion+enhances+the+efficacy+of+adoptively+transferred+tumor-specific+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).</li>
<li>Wrzesinski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intensity+lymphodepletion+enhances+tumor+treatment+efficacy+of+adoptively+transferred+tumor-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells.</a> J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).</li>
<li>Hughes, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+a+TCR+gene+derived+from+a+patient+with+a+marked+antitumor+response+conveys+highly+active+T-cell+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions.</a> Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).</li>
<li>Morgan, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+glioma+stem+cells+by+genetically+modified+T+cells+targeting+EGFRvIII+and+development+of+adoptive+cell+therapy+for+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma.</a> Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).</li>
<li>Kerkar, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+murine+CD8%2B+and+CD4%2B+T+cells+for+preclinical+adoptive+immunotherapy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies.</a> J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Burada anlatılan tedavi çizelgesi bakım, klinik standart modeli ve ARAÇ evlat edinen tedavisi için etkisini kaldıraç için tasarlanmıştır. ARAÇ T hücresi doz TMZ rejimleri ve radyoterapi uygulama vivo T hücre aktivitesi, lymphodepletion ve tümör öldürülmesi geliştirmek için modifiye edilebilir. TMZ rejimleri ana miyeloablasyon ile adoptif transfer hücreler 30 artmış genişleme elde etmek için arttırılabilir. Böylece SOC tümörisidal özelliklerini engellemeyi, - (6 Gy 4) Tek fraksiyonu total vüc...

Glioblastoma (GBM) en sık görülen habis beyin tümörü ve daima ölümcüldür. Bakım kemoterapi ve radyoterapi non-spesifik standart ile birleştiğinde cerrahi rezeksiyon tamamen bu hastalığı 1 olan hastalarda en az 15 ay kasvetli prognoz sonuçlanan malign hücreleri ortadan kaldırmak için başarısız olur. Bunun aksine, immüno spesifik olarak tümör hücrelerini hedef alan için kesin bir yaklaşım sunmaktadır ve bu nedenle yan toksisite 2-4 riskinin azalması ile, yüksek ölçüde etkili bir tedavi platformu olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir. T hücreleri kimerik antijen reseptörleri (arabaların) tümör immünoterapi için çok yönlü bir strateji sunmak ifade ex vivo mühendislik. Arabaların kompleks, tam uzunlukta, başlıca doku uyumu yerine, bir ya da daha fazla hücre içi T hücresi sinyal molekül (ler) ile bir antikorun hücre dışı değişken bölgesini füzyon tarafından üretilen (MHC) bir T hücresi reseptörü 5 -restricted. Antikor benzeri antijen Tanıma ve ödüller Bu modreaktif antijen spesifik T hücreleri tanımak ve MHC olmadığı halde tümör antijenlerine yanıt ve hemen hemen sonsuz bir antijen repertuar için uyarlanabilir edilmesi için, izin verir. Tümör antijenlerinin çeşitli karşı tasarlanmış ARAÇ T hücreleri klinikte 6-9 preklinik etkinliğini ve üstün söz göstermiştir. Özellikle, GBM kapsamında, bir ARAÇ T hücresi platformu hedefleme epidermal büyüme faktörü reseptörü varyantı III (EGFRvIII), tümöre özel bir mutasyon hücre yüzeyi 10 üzerinde eksprese, gliom taşıyan farelere 11 ömrünü uzattığı gösterilmiştir. Çeşitlilikleri rağmen, ARAÇ adoptif tedavi klinik yarar tamamen bağlı tümör bağlantılı bağışıklık bastırma ve bağışıklık kaçırma 12-16 olarak oluşturulması ve in vivo olarak antijen-spesifik T hücrelerinin korunmasında zorluklar kısmen fark edilmemiştir. Immünoterapi ile bakım (SOC) standardını yararlanan potansiyel bu l birkaç üstesinden gelebilirtaklidi, hem klinik öncesi ve klinik ortamda gelişmiş etkinlik ile sonuçlanmaktadır. Sonrası rezeksiyon GBM için SOC yüksek doz temozolomide (TMZ), bir DNA alkilleyici ajan 17, ve tüm beyin ışınlaması (TBI) oluşur 1. Bu tedaviler, tümör MHC ekspresyonunun 18-20 yukarı regülasyonu ve ölü tümör hücreleri 17,19,21,22 ile antijen dökülme ile tümör aşıları ile sinerji olduğu kabul edilir. Nitekim, klinik öncesi ortamda bağışıklık temelli tedaviler geliştirilmiş antitümör etkinliğine TMZ 20,23 veya 18,24 WBI potansiyel eklenmesi. Ayrıca, birçok non-spesifik sitotoksik kemoterapötik gibi, TMZ evlatlık tedavi platformları 27-29 host-klima aracı olarak kaldıraçlı olabilir sistemik lenfopeni 25,26, neden olduğu bilinmektedir. TMZ aracılı lymphodepletion bir ADOP artan etkinliğine yol açan antijen-spesifik T hücrelerinin frekansı ve fonksiyonunu artırmak için gösterilmiştirintrakranial tümörlere karşı 30 tif tedavi platformu. ARAÇ tedavisi bağlamında, lymphodepletion hem böylece anti-tümör aktivitesi 11,34 artırılması, endojen bastırıcı T hücreleri 31 sayısını azaltır ve sitokinlerin 33 için daha az rekabet ettirilerek homeostatik proliferasyonu 32 uyararak konakçı klima bir araç olarak hizmet eder. SOC bağlamında yeni evlat edinen tedaviler ve aşı platformları değerlendirilmesi etkinliğine ilişkin anlamlı sonuçlar çizim için kritik GBM SOC ve immünoterapi platformlar arasında sinerjik bir ilişki göz önüne alındığında. Bu protokol, EGFRvIII pozitif tutan tümörler (tedavi zaman çizelgesi için bakınız Şekil 1) taşıyan farelerde TMZ ve WBI birlikte sıçangil EGFRvIII özgü ARAÇ T hücrelerinin üretimi ve damar içine uygulama için bir yöntem özetlemektedir. Kısaca, ARAÇ T hücreleri retroviral transdüksiyon tarafından ex vivo yapılır. İnsan embriyonik böbrek (HEK) 293T Hücreler daha sonra hasat edilmiş ve paralel olarak kültürlenir aktif sıçangil splenositlerin nakletmek için kullanılan virüs üretmek için (ARAÇ vektör ve PCL-Çevre plazmidleri içeren) bir DNA / lipid kompleksi kullanılarak transfekte edilir. ARAÇ üretimi sırasında, EGFRvIII pozitif intrakraniyal tümörleri taşıyan sıçangil ana klinik SOC kıyaslanabilir dozlarda parçalanmış tüm beyin X-ışını radyasyon ve sistemik TMZ tedavisi uygulanır. ARAÇ T hücreleri daha sonra lymphodepleted bilgisayarlar intravenöz teslim edilir. Aşağıdaki prosedür, yedi ayrı haldeki evreler içinde tarif edilmektedir: Tümör taşıyan, Tümör taşıyan fareler (2) tüm beyin ışınlama, fareler (3) Transfeksiyonu için temozolomid (1) Uygulama (4) splenektomi ve T hücre hazırlanması, (5 Tümör taşıyan fareler için (6) CAR T hücre Kültür ve Hasat ve (7) CAR T hücre yönetimi) İletimi. Bu aşamalar 6-7 güne yayılan ve aynı anda yapılmaktadır birkaç adım oluşmaktadır.

<table><tbody><tr><td>pCL-Eco Retrovirüs Paketleme Vektörü</td><td>Imgenex</td><td>10045P</td><td>CAR retrovirüsü oluşturmak için yardımcı vektör</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2010</td><td>T hücresi proliferasyonunu ve viral transdüksiyonu indüklemek için spesifik olmayan mitojen</td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>ClonTech/Takara</td><td>T100B</td><td>T hücrelerinin retroviral transdüksiyonunu kolaylaştırır</td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11668-019</td><td>Transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, piruvat</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>11995-065</td><td>HEK293 kültür ortamı</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11875-093</td><td>T hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Opti-MEM I İndirgenmiş Serum Ortamı</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>11058-021</td><td>Transfeksiyon ortamı</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamin</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>25030-081</td><td>T hücre kültürü ortamı takviyesi</td></tr><tr><td>100 mM Sodyum Pirüvat</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>11360-070</td><td>T hücre kültürü ortamı takviyesi</td></tr><tr><td>100X MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi Yaşam</td><td>teknolojileri</td><td>11140-050</td><td>T hücre kültürü ortamı takviyesi</td></tr><tr><td>55 mM 2-Merkaptoetanol</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>21985-023</td><td>Serbest radikalleri uzaklaştırmak için indirgeyici ajan</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml)</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>15140-122</td><td>T hücre kültürü ortamı takviyesi</td></tr><tr><td>Gentamisin (50 mg/ml)</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>15750-060</td><td>T hücre kültürü ortamı takviyesi</td></tr><tr><td>GemCell U.S. Origin Fetal Sığır Serumu</td><td>İkizler Biyo Ürünler</td><td>100-500</td><td>in vitro hücre büyümesi için büyüme faktörleri ve besinler sağlar</td></tr><tr><td>. Sığır Serum Albümini (BSA), Fraksiyon V&ndash; Standart Sınıf</td><td>Gemini Bio Products</td><td>700-100P</td><td>Retrovirüsün retronektin kaplı plakalara spesifik olmayan bağlanmasını engeller</td></tr><tr><td>Pharm Lyse (10x konsantre)</td> <td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>Splenosit işleme sırasında kırmızı kan hücrelerini parçalar</td></tr><tr><td>70 & mu; m Steril Hücre Süzgeçleri</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Splenosit işleme sırasında büyük doku parçacıklarını filtreler</td></tr><tr><td>100 mm Poly-D-Lizin Corning 356469 İçeren BioCoat Kültür Kapları</td><td></td><td></td><td>Transfeksiyondan sonra proliferasyonu en üst düzeye çıkarmak için HEK293 hücre yapışmasını destekler</td></tr><td colspan="4">[header]Temozolomide En İyi Pharmatech N/A Uygulama gününde hazırlanan liyofilize toz <tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit</td><td>Sigma Yaşam Bilimleri</td><td>D2650</td><td>Temozolomid</td></tr><tr><td>Salin</td><td>Hospira</td><td>IM 0132'nin tamamen çözünmesi için gerekli (5/04)</td><td>Temozolomid ve ketamin/ksilazin için çözücü</td></tr><tr><td>Ketathesia HCl</td><td>Henry Schein Hayvan Sağlığı</td><td>11695-0701-1</td><td>Ketamin çözeltisi</td></tr><tr><td>AnaSed</td><td>Lloyd Inc</td><td>N/A</td><td>Ksilazin steril çözeltisi 100 mg/ml</td></tr></tbody></table>

bakım glioblastoma standardı kapsamında adoptif tedavisi için car t hücrelerinin üretilmesi

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Evlat edinen T hücre immünoterapisi, malign gliomları spesifik olarak hedeflemek ve ortadan kaldırmak için umut verici bir strateji sunar. T hücreleri, glioma antijenlerine (CAR T hücreleri) özgü kimerik antijen reseptörlerini eksprese etmek için ex vivo olarak tasarlanabilir. Evlat edinerek transfer edilen CAR T hücrelerinin genişlemesi ve işlevi, standart bakım kemoterapisi ve radyoterapinin lenfodepletive ve tümörisidal etkileri ile güçlendirilebilir. Glioma spesifik bir antijen olan EGFRvIII'ü hedefleyen CAR T hücreleri üretmek ve glioblastoma bakım standardının bir murin modeli ile birleştirildiğinde etkinliklerini değerlendirmek için bir yöntem tanımladık. T hücreleri, anti-EGFRvIII CAR genini içeren retroviral bir vektör ile transdüksiyon yoluyla tasarlanır. Tümör taşıyan hayvanlar, klinik bakım standardını modellemek için tasarlanmış doz rejimlerinde bir temozolomid ve tüm beyin ışınlaması ile konakçı koşullandırmaya tabi tutulur. CAR T hücreleri daha sonra intravenöz olarak hazırlanmış konakçılara verilir. Bu yöntem, bakım standardı bağlamında CAR T hücrelerinin antitümör etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.

ARAÇ T hücreleri EGFRvIII ARAÇ retroviral vektör 11 transdüksiyonu ile üretilmiştir. Bu vektör, MSGV1, murin stem hücre virüsü (MSCV) uzun terminal tekrarı, genişletilmiş öğürme bölgesi ve zarf ekleme sahası içeren SFGtcLuc_ITE4 vektörü 35, geliştirilmiş (bağlayıcı verici, SD, ve alıcı ekleme sa) ve viral edildi paketleme sinyali (ψ). Sıçangil CD8TM ile birlikte insan anti-EGFRvIII tek zincirli değişken fragmanı (scFv) 139 ihtiva eden EGFRvIII ARAÇ CD28, 4-1BB ve CD3ζ hücre içi bölgeleri, alt-retro...

Kemoterapi ve radyasyon bakım standardının lenfodepletiktif ve immünomodülatör etkileri, T hücresi immünoterapisinin antitümör etkinliğini artırmak için kullanılabilir. EGFRvIII'e özgü kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücrelerinin üretilmesi ve bunların glioblastoma bakım standardı bağlamında uygulanması için bir yöntemin ana hatlarını çiziyoruz.

Bakım Glioblastoma Standardı Kapsamında Adoptif Tedavisi için CAR T hücrelerinin üretilmesi

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

Bu prosedürün genel amacı, genetik olarak modifiye edilmiş kimerik antijen reseptörlü fare T hücreleri üretmek ve bunların standart bakım bağlamındaki etkinliğini değerlendirmektir. Yüksek dereceli gliom için bu işlem, öncelikle farelere standart bakım olan tüm beyin radyasyonu ve temozolomid uygulamasıyla başlanarak gerçekleştirilir. Ardından, CAR vektörünü eksprese eden bir retrovirüs üretilir ve sonrasında fare T hücreleri bu CAR retrovirüsü ile transdukte edilir.Son olarak, CAR T hücreleri standart bakım tedavisi uygulanan farelere, nihayetinde tüm beyin ışınlaması ve temozolomid ile birlikte iletilir. Bu uygulama, standart bakım ile yapılan konakçı koşullandırmasının, adaptif T-hücresi platformunun etkinliğini artırıp artırmadığını test etmek için kullanılır. Bu yöntem, yüksek dereceli gliomlar için standart bakım bağlamında yeni immünoterapilerin antitümör etkinliği gibi, beyin tümörü immünoterapi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu yöntem, genle modifiye edilmiş mi ve T-hücrelerinin yüksek dereceli gliomlara karşı etkinliği hakkında bilgi sağlayabilse de, melanom, akciğer ve diğer beyin metastazı tümör modellerine karşı T-hücre terapisinin değerlendirilmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak konuşmak gerekirse, bu yöntemde yeni olan kişiler, prosedürün paralel olarak gerçekleştirilmesi gereken birkaç adım gerektirmesi nedeniyle zorluk yaşayabilirler.Bu nedenle görevleri planlamak ve organize etmek kritik önem taşır. Prosedürü, laboratuvarımdaki yetenekli lisansüstü öğrenciler Catherine Uni ve Carter s Deva uygulamalı olarak gösterecekler. DMSO içinde 3 mg/mL temozolomid veya TMZ hazırladıktan sonra, çözeltiyi bir ısıtıcı tabla üzerinde, 65 °C sıcaklıktaki bir beher suyun içine yerleştirip 10 ila 15 dakika bekletin.TMZ tamamen çözündüğünde, çözelti soluk sarı bir renk almalıdır. 15 adet bir mililitrelik şırıngayı tamamen TMZ çözeltisi ile doldurun. Çözeltiden herhangi bir TMZ çökelmesini önlemek için TMZ, hazırlandıktan sonra 90 dakika içinde uygulanmalıdır; X-ışını ışınlatıcısını açarak tüm beyin ışınlamasını başlatın ve cihazın ısınmasını bekleyin, uygun filtrenin yerinde olduğundan emin olun ve doğru voltaj ve akım ayarlarını girin.Metin protokolüne uygun olarak fareler sedatize edildikten sonra, sedatize edilen fareleri başları en yüksek x-ışını yoğunluğunun olduğu bölgeye gelecek şekilde ızgara üzerine yerleştirin. Sistemik x-ışını iletimini engellemek için boyun hizasından aşağıya doğru gövdeleri korumak amacıyla kurşun borular kullanın. X-ışını iletimi tamamlandığında fareleri x-ışını cihazının içine yerleştirin.Hayvanları ışınlatıcıdan çıkarın. Hayvanlar yeterli bilinç düzeyine ulaştığında ve sternal rekümbent pozisyonu koruduğunda, onları uygun kafeslerine geri yerleştirin. Metin protokolüne uygun olarak D 10 medyumu hazırlayıp HEC 2 93 T hücrelerini topladıktan sonra, 10 mL D 10 medyumu içeren 16 adet 10 cm poly L lysine kaplı plakların her birine, mililitrede 7,5 × 10⁶ hücre konsantrasyonunda bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin ve bir gece boyunca inkübe edin.Metin protokolünde belirtildiği şekilde plasmid ve transfeksiyon reaktifi hazırlandıktan sonra, lipid DNA kompleksini HEK 293 T hücrelerine damla damla ekleyin ve altı ila sekiz saat inkübe edin. Ardından besiyerini 12 mL taze T hücresi besiyeri veya TCM ile değiştirin. Sonrasında, bir dalak dokusunu 70 µm'lik hücre süzgecinin üzerine dökün ve tek hücre süspansiyonu oluşturmak için beş mL'lik bir şırınganın iç kısmının küt ucunu kullanarak dokuyu ayrıştırın.Taze TCM havuzu hazırlandıktan sonra, TCM içindeki 50 mililitrelik konik tüpteki disgrege dalak hücreleri pelletlenir; hücrelerdeki kırmızı kan hücrelerini uzaklaştırmak için dalak başına beş mililitre 1x lizis tamponu eklenerek hücreler resüspande edilir ve nazikçe pipetleme yapılarak iyice karıştırılır. Hücre süspansiyonu 37 °C sıcaklıktaki su banyosunda beş dakika bekletilir. Lizis reaksiyonu su banyosundan çıkarılır ve reaksiyonu nötralize etmek için lizis tamponu ile bire bir oranda TCM eklenir, ardından 300 G'de 10 dakika santrifüj edilerek yıkanır.Süpernatant aspire edildikten sonra, pelletini yeniden süspande etmek için dalak başına iki mililitre TCM kullanın. Hücreleri saymak için, 190 mikrolitre tripan mavisine 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Toplam hücre sayısı hesaplandığında, hücreleri iki kez 10 üzeri 6 hücre/mililitre konsantrasyonuna seyreltmek için mililitre başına iki mikrogram Con A ve mililitre başına 50 uluslararası birim rekombinant insan interlökin iki ile takviye edilmiş TCM kullanın. Splenektomiden bir gün sonra, 24 kuyucuklu işlem görmüş bir doku kültürü plağının her bir kuyucuğuna iki mililitre veya dört kez 10 üzeri 6 hücre ekleyin ve 37 °C sıcaklık ile %5 karbondioksit altında gece boyunca inkübe edin.Mililitre başına 25 µg rekombinant insan fibronektin fragmanı veya RHFF içeren PBS hazırlayın. Ertesi gün, her kuyucuğa 0,5 mL çözelti ekleyerek doku kültürü için işlem görmemiş 24 kuyucuklu plakları kaplayın. Çözeltiyi kuyucuklardan uzaklaştırın ve her kuyucuğa 1 mL %2 BSA içeren PBS ekleyip oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.Ardından, yıkama için iki mililitre PBS eklemeden önce plakayı sıkıca ters çevirerek BSA'yı uzaklaştırın. HEC 2 93 T hücrelerinden viral süpernatantı topladıktan sonra, RHFF kaplı kuyucuk sayısına eşit mililitre hacme ek olarak üç mililitre daha taze TCM ekleyin. Kültürlenen dalak sitlerini inkübatörden çıkarın ve her birinde iki ila üç kez nazikçe pipetleyerek yeniden süspanse edin.Hücre süspansiyonlarını 50 ml'lik konik bir tüpe aktarın. Ardından, hücreleri viral süpernatanda 1 × 10⁶ hücre/ml olacak şekilde yeniden süspande edin. Daha sonra, RHFF kaplı plakaların kuyucuklarına, kuyucuk başına 1 ml süspansiyon ekleyin.Şimdi plakları 32 °C'de, 770 ×g merkezkaç kuvvetinde, dört hızlanma ve sıfır fren ayarıyla 90 dakika boyunca santrifüjleyin. TCM içerisinde mililitrede 50 international unit rekombinant insan IL2 hazırlayın. Santrifüj sonrası, plaklardaki her bir kuyucuğa bir mililitre ortam ekleyin ve gece boyunca inkübe edin.T hücreleri %80 konfluens değerini aşarsa, her kuyucukta pipetle iki üç kez nazikçe yukarı aşağı çekerek hücreleri ayırın. Ardından, her kuyucuktan bir mililitreyi, doku kültürü için işlem görmüş yeni bir 24 kuyucuklu plakadaki yeni kuyucuklara aktarın. Her kuyucuğa, mililitre başına 50 uluslararası ünite IL two içeren bir mililitre taze TCM ekleyin; hücreler %80 konfluens değerini aşmamışsa, her kuyucuğun üzerinden bir mililitre medyumu yavaşça pipetleyerek çekin ve yerine mililitre başına 50 uluslararası ünite rekombinant insan IL two içeren bir mililitre taze TCM ekleyerek medyumun yarısını değiştirin; CAR T hücrelerini her kuyucukta nazikçe üç kez yukarı aşağı pipetleyerek yeniden süspande edin ve 250 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Hücreleri 300 GS'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, peleti bozmadan süpernatanı tamamen aspire edin. Hücreleri yıkamak için PBS kullanın, ardından ikinci kez yıkamadan önce hücreleri sayın.Tipik bir CAR T hücresi verimi, PBS Resus ile kuyu başına yaklaşık 1 × 10⁶ hücredir. Tümör taşıyan farelere 200 µL hacimde 1 × 10⁷ hücre enjekte etmek için hücreleri mL başına 5 × 10⁷ konsantrasyonda süspande edin; tüm hava kabarcıklarının çıkarıldığından emin olarak bir insülin şırıngasına 27 ila 31 gauge iğne ile 500 ila 1000 µL yükleyin. CAR T hücreleri, rine kök hücre virüsü veya MSCV uzun terminal tekrarlarını içeren E GFR V three CAR retroviral vektörü ile transduksiyon yoluyla üretilmiştir.Genişletilmiş gag bölgesi ve zar ekleme bölgesi ile viral paketleme sinyali. İnsan anti EEG FRV üç tek zincirli değişken fragmanını içeren EG FFR V üç CAR, fare CD eight, tm CD 28 4 1 BBB ve CD üç zeta hücre içi bölgeleriyle tandem şeklinde retroviral vektöre klonlandı. Transdüksiyonun ardından, EG FFR V üç CAR T hücreleri; streptavidin konjuge biotinillenmiş, EG FFR V üç türevli multimer ve anti CD üç fit C'den oluşan iki renkli bir panel ile akış sitometrisi kullanılarak kantifiye edilebilir ve fenotiplendirilebilir. Bu videoda açıklanan protokol kullanılarak, CAR ekspresyonu rutin olarak CD üç pozitif fare T hücrelerinin %55 ila %70'inde gözlemlenmektedir.CAR T hücreleri, bu örnekte görüldüğü gibi, iki renkli CAR paneline diğer floresan işaretli antikorların eklenmesiyle daha detaylı olarak fenotipleştirilebilir; CD8 ve CD4 için yapılan boyama, transdükte edilen CAR'ların %70'inin CD8 pozitif T hücreleri, %20'sinin ise CD4 pozitif T hücreleri olduğunu göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde bir haftalık süre içinde 12 saatte tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, ek soruları yanıtlamak amacıyla ELISA, ELISpot ve/veya hücre içi sitokin boyama gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Örneğin, kimerik antijen reseptörü transduksiyonu yapılmış T hücreleriniz antijen tanımaya fonksiyonel olarak yanıt veriyor mu ve fonksiyonellikleri antijene özgü mü? Retrovirüsler, temozolomid ve x-ışını radyasyonu ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve BSL-2 koşulları altında çalışmak, kişisel koruyucu donanım kullanmak, deneyleri belirlenmiş alanlarda gerçekleştirmek ve hayvan kullanımı için uygun eğitim almak gibi önlemlerin gerektiğini unutmayın.Bu prosedürler uygulanırken röntgen ekipmanı kullanımı konusunda her zaman gerekli önlemler alınmalıdır.

generation-car-t-cells-for-adoptive-therapy-context-glioblastoma

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, tümör antijenine özgü kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücrelerinin ex vivo üretimi için bir teknik gösterilmektedir. Transgenik RNA taşıyan retroviral vektörler, T hücresi sağkalımını ve proliferasyonunu teşvik etmek için interlökin-2 ile takviye edilmiş bir ortamda dalak hücreleri ile karıştırılır. Karışım daha sonra rekombinant insan fibronektin fragmanları ile kaplanmış bir plakaya aktarılır ve virüsün hücre ile füzyonunu kolaylaştırmak için santrifüjlenir, bu da RNA'nın...

Tümöre özgü kimerik antijen reseptör T hücreleri oluşturmak için bir ex vivo teknik

Tekrarlayan glioblastomlar tedavisi için kullanılmakta olan yeni bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yaklaşım, bevacizumab, şu anda FDA monoterapi olarak onaylanmıştır hedeflenen bir madde ile kombinasyon halinde tipi Terapi olarak bilinen elektrikli tümör alanları (TTFields) bileşiğinin, alternatif bir uygulama kullanmaktadır.

Tekrarlayan Glioblastoma&#39;nın Tedavisinde Bevacizumab ile Kombine Alan Terapi Tedavisi Tümör

Burada, orthotopic insan birincil beyin tümörü taşıyan immünyetmezligi farelerde hazırlık ve allojenik insan lenfosit stereotaksik yönetim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çalışmada bir kanıtı-of-concept fizibilite ve hücresel immunotherapies intrabrain teslim antitümör etkinliği için sağlar.

Orthotopic insan Glioblastoma Multiforme Xenografts fare modelleri sitotoksik bağışıklık hücrelerinin stereotaksik evlat edinen Transfer

Burada, üretim ve retroviral iletim ve kullanımı karşı kurulan syngeneic A20 B hücreli lenfoma veya lymphodepleting olmadan BALB/c farelerde tedavi olarak fare CD19 araba T hücrelerinin önceden klinik test için bir iletişim kuralı mevcut önceden Klima.

Syngeneic fare B hücreli lenfoma manken CD19 araba T hücrelerinin önceden klinik değerlendirme için

Burada, antitümör T hücre etkinlik fenotipik ve fonksiyonel analiz için izin veren bir tüp bebek ortak kültür yöntemi yinelemeli olarak meydan tümör hedefli T hücreleri, açıklayın.

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

Biz güvenilir şemerik antijen reseptörü oluşturmak için bir yaklaşım tarif (CAR) T hücreleri ve in vitro ve in vivo onların farklılaşma ve fonksiyon test.

İmal İmmünoterapi için İmkanerik Antijen Reseptör (CAR) T Hücreleri

Merkezi sinir sistemi (MSS) tümörleri, çocuklarda kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenidir ve lokorejyonel bağışıklık temelli tedaviler, klinik çalışmalardaki hastalar için giderek daha fazla test edilmektedir. Bu protokol, MSS tümörlerini hedef alan immünoterapötik infüzyonların preklinik değerlendirmesi için farelerde lokorejyonel kanül implantasyonu yöntemlerini açıklamaktadır.

Farelerde Seri Lokorejyonel Kimerik Antijen Reseptörü (CAR) T Hücre İnfüzyonları için İntrakraniyal Kanül İmplantasyonu

Bu protokol, retroviral vektör üretimini ve murin T hücresi transdüksiyonunu kolaylaştırarak fare CAR-T hücrelerinin verimli bir şekilde üretilmesini kolaylaştırır.

Murin kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin verimli üretimi

Bu protokol, insan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücreleri (CAR Treg'ler) oluşturmak ve test etmek için kolaylaştırılmış bir iş akışı sağlar.

İnsan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücrelerinin üretimi

Bu protokol, kanser immünoterapisi için entegre olmayan mRNA kullanarak geçici kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri oluşturmak için ayrıntılı bir prosedürü ana hatlarıyla belirtir ve CAR-T hücrelerini ve sitotoksik işlevlerini değerlendirmek için güvenilir yöntemler sağlar.

Kanser İmmünoterapisi için mRNA Kullanarak Geçici Kimerik Antijen Reseptörü T Hücreleri Oluşturmak İçin Viral Olmayan Bir Yaklaşım

Öğrenin, glioblastoma standart tedavisiyle birlikte EGFRvIII-spesifik CAR T hücreleri üretme ve farelerde etkinliğini değerlendirme yöntemini. Bu yaklaşım, immünoterapi sonuçlarını iyileştirmeye yönelik içgörüler sunar.

Bakım Glioblastoma Standardı Kapsamında Adoptif Tedavisi için CAR T hücrelerinin üretilmesi

Daha fazla video keşfet