Name: Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Keşfedin, insan sinir kök hücrelerinin üç boyutlu kültürde mikroRNA profillemesi ve hedef mRNA doğrulaması için hesaplamalı analiz yöntemini. Bu yaklaşım, kök hücre biyolojisi araştırmalarında gen düzenlemesi mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz HeLa kültürleme ve transfeksiyon ona teknik destek için hNSCs hazırlanmasında yardımcı olmak için Julie Heward ve Lavaniya Thanabalasundaram kabul.

Üç Boyutlu (3D) Kültür 1. HNSC farklılaşması NOT: izole ve bir önceki yayında 2 açıklanan etik onaylanmış dokudan gelen, hNSCs elde. Bu prosedürü takip ederken etik ve kurumsal yönergeleri takip edin. 1.1) 3D Kültür 12-kuyu Plate Kullanımı <ol><li> Prosedür boyunca aseptik tekniği kullanın. Biyolojik güvenlik kabininde / göz% 70 etanol içinde 2 ml ilave etmek suretiyle yeniden hidrat iskeleleri sulama (WFIr) su kullanılarak hazırlanabilir. Her bir duvarı aşağı% 70 etanol dağıtarak iskeleleri dokunmaktan kaçının. </li><li> Dikkatle% 70 etanol aspire ve hemen 2 ml / DMEM ile iskeleleri yıkayın: 1 dakika F12. Iki kez yıkama işlemi tekrarlayın. Dikkatle DMEM aspire: F12 son yıkamadan sonra. </li><li> F12: DMEM laminin 2 mi / oyuk (10 ng / ml) ile kaplayın iskeleleri. % 5 CO2 uğultu 37 ° C &#39;de plaka inkübe2 saat içinde en az idified kuluçka makinesine kondu. Sıcak DMEM ile Plakayı: F12. </li><li> RMM + GF 150 ul bir hacim içinde, yaklaşık 500,000 hNSCs her iskelesi Seed. </li><li> Hücre iskeleleri yerleşmeye izin vermek için, bir% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde 37 ° C&#39;de 3 saat plaka inkübe edin. </li><li> Iskeleleri hücreleri çıkarmak için değil, her iyi alarak bakım RMM 3.5 ml ekleyin. </li><li> 7 gün boyunca plaka inkübe; 1 gün (birinci besleme) sonra (3.5 ml / çukur) ve RMM orta yerine tekrar birinci besleme 2-3 gün sonra yapıldı. </li><li> 7 gün sonra, ortam çıkarın ve immunositokimya (ICC) için% 4 paraformaldehit (PFA) ile hücrelerin saptamak ve / veya iyi bir toplam RNA ekstraksiyonu için, liziz reaktif maddesi 500 ul (≤ -80 ° C&#39;de saklayın levha veya toplam RNA ekstraksiyonu devam) . </li></ol> Akson Süreci kıbet 1.2) ölçümü <ol><li> % 4 PFA standart ICC protokolü 20 kullanılarak β göre farklılaştırılmış hNSCs sabit Leke3-tubulin (TUBB3) bir florokrom konjuge sekonder antikor ile belirlenmiştir birincil antikor. Hoechst (1 uM) ile Counterstain hücre çekirdekleri. </li><li> Bir floresan mikroskop kullanılarak β3-tubulin lekeli hücrelerin temsili görüntüler yakalayın; tiff veya jpeg olarak kaydedin. Bir yazılım ölçüm aracı (örn Resim-Pro Plus) kullanarak akson süreci akıbet Tedbir. </li><li> Görüntüyü, araç çubuğunda seçin ölçümler seçeneğini açın ve iz özelliğini seçin. </li><li> Izlemeyi başlatmak için, fare düğmesini tıklayarak akson akıbet üzerinde başlangıç ​​noktasını belirleyin. Akson büyümesinin tüm uzunluğu boyunca izini; Doğru, her iz bitirmek için tıklayın. Görüş alanındaki tüm akson outgrowthswith ölçmek için tekrarlayın. </li><li> Piksel veya mikron (beklemede kalibrasyon kurmak) gibi ölçümleri ifade eder. Örnek karşılaştırmalı ve istatistiksel analiz için bir elektronik tablo programı İhracat uzunluğu ölçümleri. </li></ol> 2. Mirna İfade bir Kök Hücreler kullanma veGelişim Yolları Odaklı miRNA PCR Dizisi 2.1) miRNA toplam RNA ekstraksiyon <ol><li> Iskeleleri ve 2D yetiştirilen numuneler üzerinde miRNA çıkarma gerçekleştirin (farklılaşmış ve farklılaşmamış, hNSC kontrolü). </li><li> Gerekirse Çözülme iskeleleri, 12 plaka takılı. Nihai hacim, liziz reaktif maddesi 1 ml aynı 1.5 ml&#39;lik Eppendorf tüpü içinde 2 kuyu liziz reaktif içeriğini (500 ul) birleştirin. Kuyudaki iskele bırakmak özen gösterin. </li><li> Daha önce toplanan kuru hücre topaklandı 2D yetiştirilen numuneler (farklılaştırılmış hNSC 2D kültürleri ve farklılaşmamış kontrol) için parçalama reaktifi 1 ml ekleyin ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine içeriğini aktarmak. </li><li> Bir tane 1 ml&#39;lik şırınga ve bir tane kısa 20-25 ölçü iğne kullanılarak, her bir test örneği homojenize edilmiştir. Homojen bir lizat elde edilene kadar, 1 ml 5 kata kadar şırınga kullanılarak bir iğne içinden lizat geçirin. </li><li> Her bir Eppendorf tüpüne, kloroform ve 200 ul ilave edin ve güvenli bir kap. Invert ve vorteks tüpler içiniçerikleri karıştırmak. </li><li> Santrifüj ≥12,000 x g&#39;de 15 dakika boyunca her biri 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içeren homojenat. </li><li> % 100 etanol içinde 750 ul ihtiva eden yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne (herhangi bir interfaz, pembe renkli bir sıvı geçişini engelleyecek) her numunenin üst sulu faz transfer. Tersine çevirerek iyice karıştırın. </li><li> 2 ml&#39;lik bir toplama tüpü içinde bulunan küçük bir kolon içine, bir çökelti de dahil olmak üzere, her bir test numunesinin 700 ul kadar Pipet. Oda sıcaklığında, yaklaşık 30 saniye boyunca ≥8,000 xg&#39;de kapak ve santrifüj kapatın. Flow-through atın. Numunenin geri kalan kullanarak bu adımı tekrarlayın. </li><li> 15 dakika boyunca bir DNA özet yapın. </li><li> ≥8,000 x g&#39;de yaklaşık 30 saniye için küçük bir sütun ve santrifüj 700 ul tampon RWT ekleyin. Flow-through atın. </li><li> 500 ul tampon RPE eklenmesi ve ≥8,000 x g, yaklaşık 30 saniye için santrifüjleme ile küçük bir sütun yıkayın. Flow-through atın. Tekrar wash.Ce1 dakika boyunca ≥12,000 xg&#39;de ntrifuge ayrıca membran kuru. </li><li> Mini kolonuna RNaz içermeyen su, 40 ul ilave edilmesi ve ≥8,000 x g, 1 dakika için santrifüjleme ile, 1.5 ml&#39;lik Eppendorf tüpü içinde toplam RNA Zehir. Uygun bir spektrofotometre yardımıyla, total RNA konsantrasyonu ölçümü. </li></ol> 2.2) MiRNA cDNA hazırlanması <ol><li> Ters-transkripsiyon ana karışımı hazırlayın. Her numune 5x miScript Hispec tampon 4 ul, 10x Nucleics karışımı 2 ul gerektirir, 2 ul transkriptaz karışımı ters miScript. </li><li> PCR tüpü içinde ana karışımı kısım 8 ul toplam RNA (250 ng), gerekli hacmi ekleyin ve 20 ul bir son hacme kadar, RNaz içermeyen su ilave edin. </li><li> MiScript Ters Transkriptaz Mix inaktive etmek için 95 ° C&#39;de 5 dakika için 37 ° C.Incubate C&#39;de 60 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> -20 ° C de, her biri 20 ul ters transkripsiyon reaksiyonu deposu 200 ul RNaz içermeyen su ilave, ya da gerçek-ti ile devamBeni hemen PCR. </li></ol> 2.3) Kök Hücreler ve Gelişim Yolları miRNA PCR Array Odaklı <ol><li> 2x SYBR yeşil ana karışımı 1375 ul 100 ul MiRNA cDNA hazırlanmasını 10x miScript Evrensel Primer 275 ul ve RNase-barındırmayan su ile (toplam hacim 2750 ul) 1000 ul ekleyerek 15 ml tüp içinde, PCR parçaları karışımı hazırlayın. </li><li> PCR yükleme rezervuar üzerinde PCR bileşenleri karışımını aktarın. Dikkatlice kapalı çantasından 96-plaka PCR dizisini kaldırmak. </li><li> 8 kanallı pipet ya da sadece 8 uçları kullanılarak için 12 kanallı bir pipet kullanılarak, PCR dizisi, her sıra için 25 ul PCR bileşenleri karışımını ekleyin. Kuyular arasındaki çapraz bulaşmayı önlemek için her pipetleme adımı aşağıdaki pipet ipuçlarını değiştirin. </li><li> Kabarcıklarını çıkarmak için oda sıcaklığında (15-25 ° C) 1,000 xg&#39;de 1 dakika için optik yapışkan film ile plaka ve santrifüj kapatın. Görme kabarcıklar kuyularda mevcut sağlamak için alttan plaka kontrol edin. </li><li> Gerçek zamanlı döngüleyici içinde 96 çukurlu levha PCR dizisi yerleştirin. </li><li> Programı buna uygun olarak gerçek zamanlı cycler: 10 dakika ve 95 ° C&#39;de 15 saniye, 45 döngü ve 60 ° C&#39;de 1 dakika boyunca 95 ° C &#39;de 1 döngü, tek bir (floresans veri toplama) ayarlayın. </li><li> PCR Dizi Veri Analizi Şablon Excel ve web tabanlı yazılım ile kullanılmak üzere boş bir Excel elektronik tüm kuyuları için Ct değerleri verin. NOT: Yazılım mevcuttur <a href="http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php">www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php</a> . </li></ol> 3. Hesaplamalı Analiz miRNA Hedef Tahmin ve Hedef mRNA&#39;larının Doğrulama Reporter plazmid Transfaksiyon ve Ddual Lüsiferaz Testi tarafından. 3.1) miRNA Hedef Tahmin Hesaplamalı Analizi <ol><li> Araştır PicTar ( <a href="http://pictar.mdc-berlin.de/">http://pictar.mdc-berlin.de/</a> ) 21, miR tanımlanması için online bulunabilirlik algoritmaNA tahmin mRNA&#39;ları hedef. </li><li> &quot;Omurgalılar üzerinde PicTar tahmini için tıklayınız&quot; üzerine tıklayın. Yeni bir sayfa açılacaktır. </li><li> Yeni sayfa, PicTar web arayüzünde, açılan menüde türleri seçmek ve miRNA Kimlik kutusuna ilgi miRNA yerleştirin. Bir miRNA hedefler için arama tıklayınız. </li><li> APicTar skoru göre sıralanmış hedef mRNA&#39;ların bir listesini gözlemleyin. NOT: PicTar verilen UTR seçilmiş miRNA tarafından hedeflenen, ve tohum tamamlayıcılık, termodinamik ve birlikte ifade miRNA&#39;lar 22 setleri ortak hedefler için bir birleştirici tahmine dayalı olacağı olasılığını yansıtan bir puan hesaplar. </li><li> Benzer DIANA-LAB (kullanarak hedef mRNA&#39;ların listesini almak <a href="http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/">http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/</a> ) 23, ve TargetScan ( <a href="http://www.targetscan.org/">http://www.targetscan.org/</a> mevcut hat üzerine) 24, alternatif algoritmaları. </li><li> M karşılaştırmalı tablo DerlemeiRNAs farklı yazılım araçları kullanılarak elde edilen sıralama dayalı. PicTar toplam PCT tarafından ve TargetScan (gürültü oranı ve tahmin sonuçların önemi değerlendirilmesi için bir hassas skoru sinyaline dayalı) hassasiyet ile skoru, DianaLab tarafından rütbeleri (tohum tamamlayıcılık, bağlayıcı termodinamik serbest enerji, koruma üzerinde dayalı Farklı türler), Tablo 1. </li></ol> Muhabir Plazmid Transfaksiyon ve Çift Lusiferaz Testi tarafından hedef mRNA 3.2) Doğrulama. NOT: mRNA olmuştur hedefin doğrulanması için 3 &#39;UTR lusiferaz gazetecilere daha önce 25 nitelendirdi. <ol><li> Transfeksiyon <ol><li> / Oyuk, 24 oyuklu bir plaka içerisinde 10 5 hücre yoğunluğunda Tohum HeLa hücreleri. </li><li> Transfeksiyon tepkin maddesi ve NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTR, plazmid, 100 ng ya da 1.5 ul, aynı zamanda, 20 nM MiRNA taklit (SOX5 3 hsa-miR-96-5p ile 24 saat, ko-transfeksiyonu HeLa hücrelerinde sonra217; Oyuk başına UTR ve hsa-miR-7-5p ve sırasıyla NR4A3 3 &#39;UTR için hsa-miR-17-5p). </li><li> NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTRplasmid ve florokrom etiketli negatif kontrol siRNA&#39;lar ile birlikte transfekte edilmesi, kontrol kuyuları. florokrom etiketli negatif kontrol siRNA&#39;lara kontrol kuyuları transfeksiyon transfeksiyon verimliliği değerlendirmeyi sağlar ve taklit miRNA 3&#39;UTR bağlama özgüllüğü hesapları. </li></ol></li><li> Çift Lusiferaz Faaliyetlerinin Ölçülmesi <ol><li> Firefly ve Renilla lusiferaz faaliyetlerinden 24 saat sonrası transfeksiyon ölçün. Hücre büyüme ortamı çıkarın. </li><li> 10 Çözüm I ml içine substrat ben 50 ul ekleyerek çözüme I çalışma hazırlayın; iyice karıştırın. Ben de her 24 içine çözüm çalışma 300 ul ekleyin. </li><li> Iyi bir 96 beyaz plaka 3 kuyuları, her ul 100 içine her 24 içeriğini aktarmak. 10 dakika bekleyin ve ışıldama edinimi için luminometre sette Ateşböceği lusiferazı ölçmek. </li><li> Çalışma solut hazırlayıniyon II çözeltisi II 10 ml alt-tabaka II 50 ul ekleyerek; iyice karıştırın. Zaten çalışma çözeltisi I 100 ul ihtiva eden her 96 oyuğuna hazır çözelti bir 100 ul ekle </li><li> 10 dakika bekleyin ve ışıldama edinimi için luminometre seti Renilla lusiferaz ölçmek. Renilla lusiferaz Firefly lusiferaz gelen ışıma oranını hesaplayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+tissue+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Stem cells in tissue repair and regeneration.</a> J Invest Dermatol. 132 (6), 1538-1541 (2012).</li>
<li>Pollock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditionally+immortal+clonal+stem+cell+line+from+human+cortical+neuroepithelium+for+the+treatment+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke.</a> Exp Neurol. 199 (1), 143-155 (2006).</li>
<li>Hodges, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+stem+cell+lines+suitable+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Making stem cell lines suitable for transplantation.</a> Cell Transplant. 16 (2), 101-115 (2007).</li>
<li>Smith, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+site+and+lesion+topology+determine+efficacy+of+a+human+neural+stem+cell+line+in+a+rat+model+of+chronic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke.</a> Stem Cells. 30 (4), 785-796 (2012).</li>
<li>Stroemer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+stem+cell+line+CTX0E03+promotes+behavioral+recovery+and+endogenous+neurogenesis+after+experimental+stroke+in+a+dose-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion.</a> Neurorehabil Neural Repair. 23 (9), 895-909 (2009).</li>
<li>Kalladka, D., Muir, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+repair%3A+cell+therapy+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Cloning%22%5BJournal%5D)">Brain repair: cell therapy in stroke.</a> Stem Cells Cloning. 7, 31-44 (2014).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Anokye-Danso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+miRNA-mediated+reprogramming+of+mouse+and+human+somatic+cells+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).</li>
<li>Li, X., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+small+regulatory+RNAs+in+determining+neuronal+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 329-338 (2010).</li>
<li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+as+a+scaffold+for+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction.</a> Semin Cell Dev Biol. 13 (5), 377-383 (2002).</li>
<li>Buxboim, A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+feel+the+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Stem cells feel the difference.</a> Nat Methods. 7 (9), 695-697 (2010).</li>
<li>Li, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+nanofibrous+scaffold+for+cartilage+tissue+engineering+using+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 26 (6), 599-609 (2005).</li>
<li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li>
<li>Ortinau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+3D-scaffold+formation+on+differentiation+and+survival+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells.</a> Biomed Eng Online. 9 (1), 70(2010).</li>
<li>Saha, K., Pollock, J. F., Schaffer, D. V., Healy, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+synthetic+materials+to+control+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Designing synthetic materials to control stem cell phenotype.</a> Curr Opin Chem Biol. 11 (4), 381-387 (1016).</li>
<li>Knight, E., Murray, B., Carnachan, R., Przyborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alvetex%28R%29%3A+polystyrene+scaffold+technology+for+routine+three+dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture.</a> Methods Mol Biol. 695, 323-340 (2011).</li>
<li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulsion-+templated+porous+polymers+as+scaffolds+for+three+dimensional+cell+culture%3A+effect+of+synthesis+parameters+on+scaffold+formation+and+homogenity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">Emulsion- templated porous polymers as scaffolds for three dimensional cell culture: effect of synthesis parameters on scaffold formation and homogenity.</a> J. Mater. Chem. 17, 4088-4094 (2007).</li>
<li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+culture+device+enabling+three-dimensional+cell+growth+and+improved+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function.</a> Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).</li>
<li>Stevanato, L., Sinden, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+microRNAs+on+human+neural+stem+cell+differentiation+in+two-+and+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">The effects of microRNAs on human neural stem cell differentiation in two- and three-dimensional cultures.</a> Stem Cell Res Ther. 5 (2), 49(2014).</li>
<li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+synapses%3A+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse+number%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
<li>Chen, K., Rajewsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+selection+on+human+microRNA+binding+sites+inferred+from+SNP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data.</a> Nat Genet. 38 (12), 1452-1456 (2006).</li>
<li>Krek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+microRNA+target+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Combinatorial microRNA target predictions.</a> Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).</li>
<li>Maragkakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+microRNA+target+prediction+correlates+with+protein+repression+levels%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Accurate microRNA target prediction correlates with protein repression levels.</a> BMC Bioinformatics. 10, 295(2009).</li>
<li>Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+seed+pairing%2C+often+flanked+by+adenosines%2C+indicates+that+thousands+of+human+genes+are+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets.</a> Cell. 120 (1), 15-20 (2005).</li>
<li>Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+targets+of+human+micrornas+with+the+LightSwitch+Luciferase+Assay+System+using+3%27UTR-reporter+constructs+and+a+microRNA+mimic+in+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li>
<li>Ponnio, T., Conneely, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nor-1+regulates+hippocampal+axon+guidance%2C+pyramidal+cell+survival%2C+and+seizure+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility.</a> Mol Cell Biol. 24 (20), 9070-9078 (2004).</li>
<li>Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX5+controls+cell+cycle+progression+in+neural+progenitors+by+interfering+with+the+WNT-beta-catenin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway.</a> EMBO Rep. 11 (6), 466-472 (2010).</li>
<li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX5+postmitotically+regulates+migration%2C+postmigratory+differentiation%2C+and+projections+of+subplate+and+deep-layer+neocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).</li>
<li>Lai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX5+controls+the+sequential+generation+of+distinct+corticofugal+neuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes.</a> Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).</li>
</ol>

Tüm yazarlar çalışanlar, hisse senedi ve / veya ReNeuron Ltd veya ana şirket hisse senedi opsiyon sahipleri vardır. Bu çalışma ReNeuron (RENE.L) tarafından desteklenmiştir.

değerlendirmek ve kök hücrelerin farklılaşmasını geliştirmek için in vitro deneylerde yeni gelişme her zaman işlevleri ve terapötik yetenekleri soruşturma için bir meydan okuma sunmuştur. Uzun vadeli ve in vitro farklılaştırma denemesinde sağlam bir 3D gelişimi için gerekli hNSCs istikrarlı eki, malzeme ve yapıların vadede farklı özelliklere sahip birkaç 3D yüzeylerde test hitap etti. Tahlil gelişmenin bir parçası olarak biz de optimum hücre ekim konsantrasyonunu değerlendirildi ve iskeleler laminin kaplı olması gerekliliğini tespit. Bizim hNSCs kendiliğinden üzerine ayırt rağmen standart 2D farklılaşmış hNSCs göre akson işlemi büyümesinin ile ölçüldüğü gibi 4-OHT ve büyüme faktörü kaldırılması, 3B, kültür sisteminin uygulanması farklılaşma kabiliyeti açısından önemli bir gelişme gösterdi. 3D bağlı differe etkisini araştırmak içinhNSC MiRNA ifadesi üzerindeki ntiation bir PCR dizisi kullanılır. Standart çip mikroarray ile karşılaştırıldığında PCR dizi ilgi miRNA doğrudan ölçümü ve doğrulama avantajlar sunuyor. PCR dizisi, 96 burada daha az, örneğin dizi başına miRNA toplam sayısının vadede sınırlı olsa da, daha önce kök hücre gelişme rapor eden durumunda özellikle ilgi miRNA&#39;lar dahil etmek uygun olabilir. yolu odaklı miRNA&#39;lar ifade farklılaşmamış hNSCs ile karşılaştırıldığında 3D ve 2D farklılaşmış hNSCs profilli edildi. En önemli ölçüde aşağı-regüle miRNA&#39;lar seçilmiş ve çevrimiçi mevcut algoritmaları (DIANA Lab, PicTar ve TargetScans) kullanarak işlevselliğini ve biyolojik yorumunu belirlenmesi amacı ile kendi varsayılan hedef mRNA&#39;ları değerlendirmek için analiz edildi. Tek bir miRNA&#39;ların hedeflerinin yüzlerce kabul edilebilir ve bu nedenle, bir uygun aday olabilir 3 &#39;UTR mRNAsthat ile MiRNA etkileşimleri doğrulanmışxonal düzenleme. NR4A3, HSA miR-7, ve miR-17 ailesinin bir hedef, hipokampal akson farklılaşma, hayatta kalma, apoptoz ve düzenlenmesinde rol olan, ifade düzeylerine bağlı olarak NR4A aile nükleer reseptörlerin bir üyesi olan Rehberlik 26. Benzer SOX5, hsa-miR-96 hedef, sinir atalarıdır 27 akson uzunluğu 28, göç, post-göçmen farklılaşma ve nöronların 29 projeksiyonları hücre döngüsü ilerlemesini kontrol etmek bildirilmiştir. SOX5 ve NR4A3 Hem hsa-miR-96 doğrudan bir hedef mRNA olarak tanımlanan ve çift lusiferaz raportör tahlilleri sırasıyla hsa-miR-7 ve 17 edildi. Çift lusiferaz (Firefly ve Renilla) aynı plazmid iki farklı muhabiri genler dayanır ve optimal transfeksiyon ve tek lusiferaz plazmid sistemi ile karşılaştırıldığında sitotoksik etkileri nedeniyle etkileri normalleşme sağlayan geliştirilmiş bir sistem sunmaktadır. Bizim tahlil gelişmenin bir parçası olarak biz de transfeksiyon conditi optimizesırayla ons yüksek verim elde etmek. protocolsdescribed bundan başka, en iyi duruma getirmek ve ön klinik çalışmalarda ve gelecekte yapılacak klinik uygulamalarda intransplantation protokolleri beimplemented olabilir, in vitro hNSC farklılaşma karakterize etmek için yararlanılabilir.

Kök hücre araştırmaları da doku mühendisliği, gelişimsel hücre biyolojisi, hücresel tedavilerin, gen terapisi disiplinleri yayılan rejeneratif tıp, merkezi bir rol oynar, ve biyomalzemeler (iskeleleri ve matrisler). Kök hücreler, hem Organ GELİŞTİRME doku onarımında önemli; Kök hücreler nasıl çalıştığını anlamak, yeni kök hücre tabanlı tedaviler 1 geliştirmek için çok önemlidir. CTX0E03 birinci trimester insan fetal korteks izole bir klonal, şartlı ölümsüzleştirdi insan nöral kök hücre (hNSC) hattı 2. CTX0E03 iyi imalat uygulamaları (GMP) 3 altında klinik hücre bankacılığı için gerekli olan kalite özellikleri tanımlamıştır. HNSCs kendiliğinden nöronlar, glia, ve oligodentrositlere ayırt edebilir ve fokal iskemi 2,4,5 bir kemirgen modelinde nakledilen zaman nörolojik iyileştirmek için kanıtlanmıştır. CTX0E03 hNSCs inme disabil için klinik deneylerde şu andaSığ (NCT01151124 6 ve NCT02117635, Clinicaltrials.gov). MiRNA uzunluğunda ortalama 22 nükleotid bulunacaktır ve düzenleyici moleküller 7 kanıtlanmış, onlar proteinleri kodlamak değil, daha ziyade proteinler onların istikrar ve çeviri düzenleyen, mRNA 3 asal çevrilmemiş bölge (3&#39;UTR) bağlamak. MiRNA&#39;lar geliştirme, proliferasyon ve farklılaşma 8 de dahil olmak üzere, hücresel süreçlerin bir dizi düzenlenmesinde rol bildirilmektedir. Birkaç miRNA&#39;ların nöral kök hücrelerin 9 kaderi ve şartname düzenleyen suçlanmıştır. Standart kültür ortamı, iki boyutlu (2D) in vivo ortamda karmaşıklığı uyumlu değildir, ve bu nedenle hNSC farklılaşmasının indüksiyonu ve ayarlama optimal değildir. İn vivo koşullarında, hücreler, diğer oluşan bir üç boyutlu (3D) mikro-ortamı tarafından çevrelenmiştir dahil olmak üzere birçok hücre ve hücre-dışı ligandlarkollajenler, laminin, ve diğer matris proteinleri (hücre dışı matris ECM) türleri. Önceki çalışmalar rapor olduğunu ECMs ve onların geometri etkisi, hücre fenotipi ve kader 10-15 taklit malzeme mimari topoğrafyası. Piyasada mevcut 3D iskelelerinin bir dizi vardır; Biz hücreleri istila ve 16-18 ayırt edebilirsiniz içine bir 3D alan sağlayan bir 200 mikron kalınlığında zarı içine iyi tanımlanmış ve düzgün mimarisi ile tasarlanmış bir çok gözenekli polistiren iskelesi kullanılır. Burada 2D ve 3D farklılaşma deneyleri axonprocess gelişimini değerlendirmek için kullanılır. Ayrıca, daha da farklılaşma üzerinde miRNA etkilerini araştırmak için bir klinik sınıf hNSC hattının miRNA ifade profil bir yöntem açıklanmaktadır. gösterilen burada yöntem orjinal 19 açıklananlara dayanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>DMEM: F12</td><td>Invitrogen</td><td>21331-020</td><td>RMM ortam hazırlığı için</td></tr><tr><td>İnsan Albümin Çözeltisi&nbsp;</td><td>Baxter sağlık hizmetleri limited&nbsp;</td><td>1501052</td> &<td>nbsp;% 0.03 Transferrin nihai konsantrasyonunda kullanılan RMM</td></tr> <tr>ortamı için<td>, İnsan rekombinant</td><td>Sigma</td><td>T8158</td> &<td>nbsp; 5 & mikro nihai konsantrasyonda kullanılan RMM ortamı için; g/ml</td></tr><tr><td>Putresin DiHCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>& 16.2 & mikro nihai konsantrasyonda kullanılan RMM ortamı için; g/ml</td></tr><tr><td>İnsülin, İnsan rekombinant&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td>&nbsp; 5 & mikro nihai konsantrasyonda kullanılan RMM ortamı için; g/ml</td></tr><tr><td>Progesteron&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6149</td><td>&nbsp; 60 ng/ml</td></tr><tr><td>L-Glutamin&nbsp;</td> nihai konsantrasyonda kullanılan RMM ortamı için;<td>Invitrogen</td><td>25030-24</td> 2 mM Sodyum Selenit <td>nihai konsantrasyonunda kullanılan RMM ortamı için</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td>40 ng/ml bFGF&nbsp nihai konsantrasyonda kullanılan RMM ortamı için</td></tr><tr><td>; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>RMM besiyerine ilave edilmek üzere, 10 ng/ml EGF</td></tr><tr><td>&nbsp nihai konsantrasyonda kullanılır; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-188</td><td>RMM ortamına eklenecek, 20 ng/ml nihai konsantrasyonda kullanılacak</td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>RMM ortamına eklenecek, 100 nM nihai konsantrasyonda kullanılacak</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>AMS Biotech</td><td>3400-010-10</td><td></td></tr><tr><td>TrypZean/EDTA</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>BE02-034E Sulama</td><td></td></tr><tr><td>için su</td><td>Baxter Healthcare</td><td>UKF7114</td><td></td></tr><tr><td>Tanımlanmış Tripsin İnhibitörü (DTI) (mağaza -20 derece; C)</td> <td>Invitrogen</td><td>R007-100</td><td></td></tr><tr><td>Alvetex 12 kuyulu plaka&nbsp;</td><td>Reinnervate Ltd</td><td>AVP002</td><td></td></tr><tr><td>Etanol & nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>1.00986.1000</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; III tübülin antikoru</td><td>Sigma</td><td>T8660</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini kiti</td><td>Qiagen ve nbsp;</td><td></td><td></td>217004</tr><tr><td>RNaz içermeyen DNase&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kiti&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>218160</td><td></td></tr><tr><td>SYBR yeşil PCR kiti</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td></td><td></td>218073</tr><tr><td>Hücre Gelişimi & Farklılaşma miScript miRNA PCR Dizisi</td><td>Qiagen/ SABiosciences</td><td>MIHS-103Z</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 beyaz 96 plaka</td><td>Roche</td><td>&nbsp; </td><td></td>4729692001</tr><tr><td>Lightcycler 480&nbsp; sızdırmazlık folyosu</td><td>Roche</td><td>&nbsp; </td><td></td>4729757001</tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Vektör NR4A3 miRNA 3' UTR hedef klonları&nbsp;</td><td>GeneCopeia</td><td>HmiT019538-MT0</td><td></td></tr><tr><td>Vektör SOX5 miRNA 3' UTR hedef klonları&nbsp;</td><td>GeneCopeia</td><td>HmiT017632-MT01</td><td></td></tr><tr><td>Allstars negatif kontrol siRNA AF 488 (Qiagen).</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>1027284</td><td>MiRNA transfeksiyon kontrolü</td></tr><tr><td>Luc-Pair miR Luciferase Testi</td><td>GeneCopeia</td><td>LPFR-M010</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480&nbsp;</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GloMax 96 mikroplaka luminometresi&nbsp;</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Fuar

Üç boyutlu kültürleri, mıkrorna analizi ve putatif hedef genler üzerinde bir İnsan sinir kök hücre hattı farklılaşma

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde) Yerel mikroçevrelerde altında nöronlar, astrositler ve oligodendrositler kendini yenileme ve farklılaşma yeteneğine sahiptirler. Burada, şu anda inme sakatlık (NCT01151124 ve NCT02117635, Clinicaltrials.gov) için klinik çalışmalarda, üç boyutlu (3D) farklılaşma ve klonal insan nöral kök hücre (hNSC) hattının miRNA analizi için kullanılan yöntemlerin bir dizi sunuyoruz. HNSCs etik onaylanmış ilk trimester insan fetal korteks türetilen ve koşullu inşa c-mycER TAM tek bir kopyasının retroviral entegrasyonu kullanılarak ölümsüzleştirdi edildi. Biz 3D iskeleler ve nasıl PCR dizi kullanarak miRNA ifade ilişkilendirilmiş değişiklikleri ölçmek için farklılaştırılmış hNSCs akson süreci akıbet ölçmek için nasıl açıklar. Ayrıca biz miRNA varsayılan hedefleri seçme amacıyla hesaplama analiz örnek. SOX5 ve NR4A3 önemli ölçüde seçilen uygun miRNA varsayılan hedef olarak belirlenmiştir aşağı-regülefarklılaşmış hNSC d miRNA&#39;ların. MiRNA hedef doğrulama çift raportör plazmid transfeksiyon ve çift lusiferaz deneyi ile SOX5 ve NR4A3 3&#39;UTRs gerçekleştirilmiştir.

Şekil 1 geleneksel düz bir yüzey kültürleri (2D) ile karşılaştırıldığında 3D iskelelerde hNSC farklılaşma soruşturma ve miktarının görsel ve akson süreci akıbet ölçümleri expressedas edilir. Şekil 2&#39;de representedthe iş akışı ve kök hücrelerini kullanarak miRNA ölçümü sonuçları ve gelişimsel yollar farklılaşmamış kontrol ile karşılaştırıldığında 2D ve 3D farklılaşmış hNSCs içinde miRNA&#39;lar diferansiyel ifadesini araştırmak için miRNA PCR dizi duruldu. Farklılaşmış ve farklılaşmamış hNSCs ve hedef tahmini, SOX5 ve NR4A3 (NOR1) için hesaplama analiz arasındaki aşağıdaki miRNA karşılaştırmalı analizi, farazi hedef mRNA&#39;lara olarak tespit edilmiştir. MiRNA&#39;lar ve SOX5 veya NR4A3 3&#39;UTR dizisini birini içeren 2 piyasadan temin plazmidler ateş böceği lusiferaz raportör geninin aşağısında eklenen kullanılan 3&#39;UTR mRNA, kendi varsayılan site arasında doğrudan etkileşim incelemek için bir<html> nd normalleştirilmesi için aynı plazmid Renilla lusiferaz geni ihtiva eden. 3 &#39;UTR, lusiferaz aktivitesinin aşağı doğru düzenlenmesi için temsili sonuçlar Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52410/52410fig1.jpg" /> Şekil 1:. 3D iskelelerde hNSCs farklılaşması ve akson sürecin es akıbet ölçümü (A) β3-tubulin (yeşil) ve Hoechst (mavi) temsil mikrofotoğraflarından ile zıt çekirdekleri için standart ICC boyama sonrasında elde edildi ve akson süreçlerinin ölçümü vardı Bir görüntü analizi yazılımı yardımı ile gerçekleştirilir. (B) 1 (1W) veya 3 hafta (3W) için 2D ve 3D farklılaşmış hNSCs yapılan akson süreci akıbet ölçümü raporlama Diyagramları.com / files / ftp_upload / 52.410 / 52410fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52410/52410fig2.jpg" /> Şekil 2:. Farklılaşmış hNSCs içinde MiRNA profil şematik akışı Toplam RNA, miRNA&#39;ların de dahil olmak üzere, 3 boyutlu iskeleler ve standart 2B kültürleri veya farklılaşmamış kontrolü farklı hNSCs birinden ekstre edilmiştir. Toplam RNA 250 ng retro transkripsiyonu insan hücre farklılaşması ve geliştirme miScript miRNA PCR dizisi ile miRNA ölçümü için uygun cDNA içine olgun miRNA&#39;lar seçici dönüşüm kolaylaştıran bir yöntem vardı. SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A ve RNU6-2 jeo-ortalama 2 -ΔΔct yöntemine dayalı veri analizi için kullanılmıştır. Önemli değişiklikler sta kadar katlayın +/- 1.5 ve aşağı düzenleme olarak tanımlandıistatistiksel olarak anlamlı ölçüde. Veriler clustergram olarak ifade edilmiştir Sonuçlar mevcut web tabanlı yazılım kullanılarak analiz edildi. Şekil 3 19 den Modifiye. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52410/52410fig3.jpg" /> Şekil 3: miRNA hedef Doğrulama çift lusiferaz rapor deneyi kullanılarak mRNA öngördü. (A) miRNA doğrudan hedef olarak 3&#39;UTR sekansı doğrulamak için bir araç olarak kullanılabilir çift lusiferaz raportör plasmidinin Örnek diyagramıdır. (B) transfeksiyon verimini gösteren Temsilcisi mikroskobu. (C) &#160; Sinyaller, insan 3 ve # ile ilgili, olan nisbi lusiferaz aktivesi olarak ifade39 UTR muhabirleri ofSOX5 ve NR4A3 genleri önemli ölçüde hsa-miR-96 varlığında yıkıldı ve hsa-miR-7 ve 17 miRNA taklit sırasıyla. Şekil 5 19 den Modifiye. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> DIANALAB </td><td> PicTar </td><td> TargetScan </td></tr><tr><td> miRNA </td><td> Hedef gen </td><td> Hedef siteleri / genler bulundu </td><td> Hassas </td><td> Gol </td><td> Agrega P CT </td></tr><tr><td> hsa-miR-96 </td><td> SOX5 </td><td> 1214/763 </td><td> 1 </td><td> 6.74 </td> &lt;td&gt; 0.94 </td></tr><tr><td> hsa-miR-183 </td><td> DUSP10 </td><td> 302/190 </td><td> 0.72 </td><td> 4.75 </td><td> 0.85 </td></tr><tr><td> hsa-miR-302a </td><td> NR4A3 </td><td> 863/473 </td><td> 0.84 </td><td> 3.05 </td><td> NF </td></tr><tr><td> hsa-miR-182 </td><td> FOXN3 </td><td> 1358/794 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> 0.96 </td></tr><tr><td> hsa-miR-7 </td><td> NR4A3 </td><td> NF </td><td> NF </td><td> 1.61 </td><td> 0.17 </td></tr><tr><td> hsa-miR-7 </td><td> FOXN3 </td><td> 399/136 </td><td> 0.17 </td><td> NF </td><td> 0.88 </td></tr><tr><td> hsa-miR-20a </td><td> NR4A3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.85 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td><strong&gt; hsa-miR-20b </td><td> NR4A3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.9 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td> hsa-miR-17 </td><td> NR4A3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.9 </td><td> 5.38 </td><td> 0.63 + 0.37 </td></tr><tr><td> hsa-miR-20a </td><td> EIF4G3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.97 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> hsa-miR-20b </td><td> EIF4G3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> hsa-miR-17 </td><td> EIF4G3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr></tbody></table> Tablo 1: miRNA hedef tahmin mRNA&#39;sından listesi. MiRNA&#39;ların Temsilcisi tablo, öngörü genleri hedef ve algoritmalar analizi (tahminiyon / Skor / agrega sırasıyla Diana Lab, PicTar ve TargetScan kullanılarak sağlanır). Tablo 3 19 den Modifiye.

Farklılaşmış insan nöral kök hücreleri (hNSC'ler) üzerindeki miRNA'lardaki değişiklikleri karakterize etmek amacıyla, üç boyutlu bir sistemde hNSC farklılaşmasını, miRNA PCR dizisi ile mikroRNA ekspresyonundaki değişikliklerin değerlendirilmesini ve miRNA hedef tahmini için hesaplamalı analizi ve ikili lusiferaz testi ile doğrulanmasını açıklıyoruz.

Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir insan nöral kök hücre hattının diferansiyasyon mikro RNA profilini belirlemek ve hedef mRNA validasyonunu gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle hücre diferansiyasyonunu indüklemek için insan nöral kök hücrelerinin üç boyutlu bir kültür sisteminde kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, aksonal süreç uzamasını ölçerek diferansiyasyonu nicelleştirmektir.Ardından, mikro RNA ekspresyonundaki değişiklikler mikro R-N-A-P-C-R dizisi ile değerlendirilir. Daha sonra, muhtemel hedef mRNA setini belirlemek amacıyla seçilen diferansiyel eksprese mikroRNA'ların bilgisayar tabanlı analizi gerçekleştirilir. Son olarak, hedef mRNA'lar raporlayıcı plazmit, transfeksiyon ve dual lusiferaz testi ile doğrulanır.Bu nedenle, burada sunulacak olan yöntem, insan nöral kök hücreleri diferansiyasyon sürecindeyken eksprese edilen mikroRNA'ların karakterizasyonu ve bu mikroRNA'ların hedeflediği haberci RNA'lar gibi nöral kök hücre alanıyla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem nöral kök hücre biyolojisine dair içgörü sağlayabilmesinin yanı sıra, mezenkimal kök hücreler, indüklenmiş pluripotent kök hücreler veya diferansiyasyon indüksiyonu ve moleküler karakterizasyon gerektiren diğer kök hücre sistemlerine de uygulanabilir.Bu yöntemin görsel sunumu, bir insan nöral kök hücre hattının farklılaşmasındaki kritik adımları, mikroRNA profilleme incelemesini ve hedef mRNA'nın doğrulanmasını detaylandırmaktadır; prosedürün bir bölümü laboratuvarımdan bilim insanı Lavania tarafından gösterilecektir. Tüm bu işlem, aseptik teknikler kullanılarak bir biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. AL VX 12'nin her kuyucuğuna ekleme yaparak iskeleleri yeniden hidrate edin.Sulama suyu kullanılarak hazırlanan %70 etanolün her bir kuyucuğa iki mililitre olacak şekilde ekleyin. %70 etanolü her kuyucuğun kenarından yavaşça ekleyerek iskeletlere temas etmemesini sağlayın. %70 etanolü dikkatlice aspire edin ve iskeletleri derhal kuyucuk başına iki mililitre D-M-E-M-F 12 ile bir dakika boyunca yıkayın.Yıkama prosedürünü tekrarlayın ve son yıkamadan sonra D-M-E-M-F 12'yi dikkatlice aspire edin. Her bir kuyucuğa iki mililitre D-M-E-M-F 12 içerisinde laminin ekleyerek iskeleleri kaplayın. Plakayı, %5 karbon dioksit içeren nemli bir inkübatörde, 37 °C'de en az iki saat boyunca inkübe edin.Ardından, plakayı ılık D-M-E-M-F ile yıkayın ve her bir iskeleye, büyüme faktörleri içeren 150 µL RMM besiyeri hacminde yaklaşık 500,000 insan nöral kök hücre veya Hnsc ekleyin. Hücrelerin iskelelere yerleşmesi için plakayı üç saat boyunca inkübe edin. Üç saat sonra, hücrelerin iskelelerden yerinden çıkmamasına dikkat ederek her bir kuyucuğa 3,5 mL RMM ekleyin.Plakayı yedi veya 21 gün boyunca inkübe edin. İlk besleme olan birinci günün ardından RMM ortamını değiştirin ve ilk beslemeden iki ila üç gün sonra ortamı tekrar değiştirin. H nsc'lerin 3D kültüründen sonra yedi ve 21 gün.RMM ortamını uzaklaştırın ve diferansiye hücreleri %4 paraformaldehit ile fikse edin. Fikse edilen hücreler daha sonra florokrom konjuge bir sekonder antikor ile tespit edilen beta üç tübülin primer antikoru kullanılarak boyanır. Hücre çekirdekleri Hoechst ile karşı boyanır.Beta üç tubulin ile boyanmış hücrelerin temsili görüntülerini yakalayın. Floresan mikroskop kullanarak görüntüleri TIFF veya JPEG formatında kaydedin. Akson uzantısı büyümesinin ölçümü, image PRO plus seven yazılımının ölçüm aracı kullanılarak gerçekleştirilir.Başlamak için görüntüyü açın, araç çubuğundaki ölçüm seçeneğini belirleyin ve izleme (trace) özelliğini seçin. İzlemeyi başlatmak için fare düğmesiyle akson uzantısı üzerinde bir başlangıç noktası seçin, akson uzantısının tüm uzunluğu boyunca izleme yapın ve her izlemeyi bitirmek için sağ tıklayın. Bu yöntemle, görüş alanı içindeki tüm akson uzantılarını ölçün ve ölçümleri piksel veya mikrometre cinsinden ifade edin.Üç boyutlu kültürlenen HSC'lerin mikro RNA ekspresyonundaki değişimleri değerlendirmek amacıyla, örnek karşılaştırmalı ve istatistiksel analizler için uzunluk ölçümlerini bir hesap tablosu programına aktarın. Öncelikle, beraberindeki protokolde açıklandığı şekilde mikro RNA ekstraksiyonu ve mikro RNA cDNA hazırlama işlemlerini gerçekleştirin. Metin, mikro RNA cDNA elde edildikten hemen sonrasını kapsamaktadır.Real-time PCR için PCR bileşenleri karışımını 15 mililitrelik bir tüpte hazırlayın. 1375 mikrolitre iki X-S-Y-B-R green master mix ekleyin. 100 mikrolitre micro RNA CD NA, 275 mikrolitre üniversal primer ve 1000 mikrolitre RNA'sız su aktarın.PCR bileşenleri bir PCR yükleme rezervuarına karıştırılır. 96 kuyucuklu plaka PCR dizisi, mühürlü poşetinden dikkatlice çıkarılır. Çok kanallı bir pipet kullanarak 25 µL PCR bileşeni ekleyin.PCR dizisinin her kuyucuğuna karıştırın. Kuyucuklar arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için her pipetleme adımından sonra pipet uçlarını değiştirin. 96 kuyucuklu plakayı optik yapışkan film ile mühürleyin ve kabarcıkları gidermek için oda sıcaklığında 1000 GS'de bir dakika boyunca santrifüjleyin; kuyucuklarda kabarcık bulunmadığından emin olmak için plakayı görsel olarak inceleyin.Realtime cycler programındaki 96 kuyucuklu plak PCR dizisi. Realtime cycler buna uygun olarak ayarlanır. Ardından, PCR dizisi veri analizi için tüm kuyucukların CT değerleri boş bir Excel hesap tablosuna aktarılır; öngörülen mikro RNA hedeflerinin belirlenmesi için çevrimiçi olarak erişilebilen PIC ktar algoritması kullanılır.PIC KTAR web arayüzünde yeni bir sayfa açmak için omurgalılar üzerinde pic ktar tahmini için buraya tıklayın. Açılır menüden türü seçin ve ilgilendiğiniz mikro RNA'yı mikro RNA ID kutusuna girin. Bir mikro RNA'nın hedeflerini aramak için search butonuna tıklayın.Bir PIC KTAR skoruna göre sıralanmış hedef mRNA'ların bir listesi sunulacaktır. Elde edilen sıralamalar daha sonra mikroRNA'ların karşılaştırmalı bir tablosunu oluşturmak için kullanılır. Hedef mRNA'ları doğrulamak için bir araç olarak çift lüsiferaz raporlayıcı plazmit kullanılır; HeLa hücrelerinin transfeksiyonundan 24 saat sonra ateş böceği ve böbrek lüsiferaz aktiviteleri ölçülür.50 µL substratı 10 mL çözelti bir içerisine ekleyerek ve iyice karıştırarak çalışma çözeltisi bir'i hazırlayın. 24 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğundan hücre büyüme ortamını uzaklaştırın ve her birine 300 µL çalışma çözeltisi bir ekleyin. 24 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğundaki içeriğin 100 µL'sini, 96 kuyucuklu bir plakanın üç kuyucuğuna aktarın. 10 dakika bekleyin ve ardından lüminesans kazanımı için ayarlanmış bir lüminometrede ateş böceği lüsiferaz aktivitesini ölçün.50 µL substrat ve 2 ila 10 mL çözelti iki ekleyip iyice karıştırarak çalışma çözeltisi ikiyi hazırlayın. Halihazırda 100 µL çalışma çözeltisi bir içeren 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 100 µL çalışma çözeltisi iki ekleyin. 10 dakika bekleyin ve ardından renal el luciferase aktivitesini ölçün.Ardından, ateş böceği lusiferazından gelen lümineansın renal lusiferaza oranı hesaplanır. 3D iskeleler üzerindeki H NSCS'lerin, yeşil renkte gösterilen beta three tubulin için immünokimyasal boyama ve mavi renkte gösterilen HOECHST ile çekirdek karşıt boyaması sonrası temsili mikro fotoğrafları elde edilmiştir; akson çıkıntılarının ölçümü görüntü analiz yazılımı yardımıyla gerçekleştirilmiştir. 3D iskelelerle büyütülen H nsc'ler ile geleneksel düz yüzey veya 2D kültürler arasındaki akson çıkıntısı büyümesinin karşılaştırılması, bir hafta veya üç hafta sonunda 3D diferansiye HSC'lerin daha fazla akson çıkıntısı büyümesi sergilediğini göstermektedir.Hedef tahmini için yapılan hesaplamalı analiz, burada sunulan mikroRNA tahmin edilen hedef gen listesi, kesinlik puanı ve toplam değer bilgilerini sağlamıştır. SOX5 ve NR4A3, olası hedef genler olarak tanımlanmıştır. Burada gösterildiği üzere, mikroRNA'ların hedeflerini doğrulamak için çift lüsiferaz raporlayıcı deneyi kullanılmıştır.SOX5 ve NR4A3 genlerinin insan üç prime UTR raporterlarından elde edilen göreceli lusiferaz aktivitesi, belirtilen mikroRNA'ların varlığında önemli ölçüde azaltılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, nöral kök hücrelerde ayırımı nasıl yapacağınız, mikroRNA ekspresyonunu nasıl araştıracağınız ve hedef Messenger RNA'nın validasyonunu nasıl gerçekleştireceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

differentiation-human-neural-stem-cell-line-on-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video, üç boyutlu bir yapı iskelesi içinde insan nöral kök hücrelerinin gelişimini ve farklılaşmasını göstermektedir. İskele üzerindeki bir laminin kaplama, hücre bağlanmasını teşvik ederken, büyüme faktörü içermeyen bir nöral ortam, süreçlerini gözenekli bir mimari içinde birden çok yöne uzatan ve üç boyutlu bir kültür oluşturan nöral progenitör hücrelere hücre farklılaşmasını...

İnsan Nöronal Kök Hücrelerinin Gözenekli İskele Kullanılarak 3D Kültüre Ayırt Edilmesi

Bu video, insan embriyonik kök hücrelerinin veya hESC'lerin, besleyici hücreler veya herhangi bir ara adım kullanmadan doğrudan nöral progenitör hücrelere farklılaşmasını göstermektedir. Kemik morfogenetik proteininin veya BMP'nin seçici inhibisyonu ve transforme edici büyüme faktörü-beta veya TGF-β sinyal yolakları, hESC'lerin nöral progenitör hücrelere veya NPC'lere farklılaşmasına yol açar.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Nöral Progenitörlere Farklılaşması

Bu video, transgenik olmayan ve transgenik insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) nöral progenitör hücrelerin oluşumunu göstermektedir. hPSC'ler, bir nöronal farklılaşma ortamı kullanılarak nöral progenitör hücrelere farklılaştırılır. Farklılaşma, küçük moleküller kullanılarak transgenik olmayan hücrelerde indüklenirken, transgenik hPSC'ler, nöronal farklılaşmaya özgü bir transkripsiyon faktörü için promotörü indükleyen bir antibiyotik eklenerek farklılaştırılır.

Transgenik Olmayan ve Transgenik İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin Nöral Progenitör Hücrelere Ayırt Edilmesi

Bu videoda, İnsan embriyonik kök hücrelerinin nöral organoidlere dönüştürülmesi için aşamalı bir protokol gösterilmektedir. Yöntem, nöronal rozet oluşumunun indüklenmesini, ardından tam gelişmiş nöral organoidler elde etmek için kontrollü olgunlaşmayı ve hidrofobik bir zar üzerinde son kültürlemeyi içerir.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Nöral Organoidlere Farklılaşması ve Olgunlaşması

Bir yöntem de periferik kan hücrelerinden zenginleştirilen hematopoietik projenitör hücrelerinden insan nöral kök hücrelerini elde etmek için geliştirilmiştir.

Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon

İki ya da üç boyutlu bir embriyoit gövdeleri oluşturmak için fare embriyonik kök hücreleri kullanılarak bir tekniği açıklar. Daha sonra progenitör hücre işaretleyici immünofloresan ve immün farklılaşma hallerindeki analiz retinoik asit ve ne göre embriyoit vücut hücrelerinin sinir farklılaşmasını uyarmak üzere açıklar.

İki ve Üç boyutlu Embriyoid Oluşumu Fare Embriyonik Kök Hücreler Retinoik Asit kaynaklı sinir Farklılaşma analizi

Bu çalışmada, iki spesifik insan nöral organoidleri, insan sinirsel organoidlerin içinde sadece insanlarda ve 2) nöron dopaminerjik olarak eğitim için ilgili ve doğru bir model olarak 1) insan glioblastoma gelişimi türetmek için protokoller tanıtır ve açıklanmaktadır üç boyutlu bir organoid üreten farklılaşma.

Beyin kanseri ve nörodejeneratif hastalıkların Incelenmesi için insan nöral Organoidler

Burada sunulan insan embriyonik kök hücrelerinin tek hücreli kültür ve nöral progenitor hücrelere sonraki farklılaşma için bir protokoldür. Protokol basit, sağlam, ölçeklenebilir ve ilaç tarama ve rejeneratif tıp uygulamaları için uygundur.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

Fare embriyonik kök hücrelerinin asma damlası yöntemini kullanarak nöronal hücrelere in vitro farklılaşması prosedürünü açıklıyoruz. Ayrıca RT-qPCR, immünofluoresans, RNA-seq ve akış sitometrisi ile kapsamlı bir fenotipik analiz gerçekleştiriyoruz.

Nöral Progenitörlerin ve Nöronların Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Farklılaşması ve Karakterizasyonu

Bu çalışma, mitokondriyal hacim, mitokondriyal membran potansiyeli, reaktif oksijen türleri seviyesi, mitokondriyal solunum zinciri bileşimi ve mitokondriyal DNA'daki değişiklikleri tespit etmek için iki floresan muhabir veya antikor ile akış sitometrisine ve çift boyamaya dayalı çoklu mitokondriyal fonksiyonel parametreleri ölçmek için yeni bir yaklaşım sunmaktadır.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerde Multipl Mitokondriyal Parametrelerin ve Nöral ve Glial Türevlerinin Akış Sitometrik Analizi

Keşfedin, insan sinir kök hücrelerinin üç boyutlu kültürde mikroRNA profillemesi ve hedef mRNA doğrulaması için hesaplamalı analiz yöntemini. Bu yaklaşım, kök hücre biyolojisi araştırmalarında gen düzenlemesi mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Daha fazla video keşfet