Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir insan nöral kök hücre hattının farklılaşmasını, mikro RNA'sını, profilini çıkarmayı ve hedef Mr.NA doğrulamasını değerlendirmektir. Bu, hücre farklılaşmasını indüklemek için önce insan nöral kök hücrelerinin üç boyutlu bir kültür sistemi üzerinde kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, akson süreci büyümesini ölçerek farklılaşmayı ölçmektir.

Daha sonra, mikro RNA ekspresyonundaki değişiklikler mikro R-N-A-P-C-R dizisi ile değerlendirilir. Seçilen diferansiyel olarak ifade edilen mikroRNA'ların hesaplamalı analizi daha sonra bir dizi varsayılan hedef mRNA'yı tanımlamak için gerçekleştirilir. Sonuç olarak, hedef mRNA'lar raportör plazmid, transfeksiyon ve ikili lusiferaz testi ile doğrulanır.

Bu nedenle, burada sunulacak yöntem, ifade edilen mikroRNA'ların karakterizasyonu gibi nöral kök hücre alanındaki temel sorunları yanıtlamaya yardımcı olabilir ve farklılaşma geçirdiklerinde insan nöral kök hücrelerindeki haberci RNA'ları hedeflerler. Bu yöntem nöral kök hücre biyolojisi hakkında bilgi sağlayabilir. Mezenkimal kök hücreler, indüklenmiş pluripotent kök hücreler gibi diğer kök hücre sistemlerine veya farklılaşma ve moleküler karakterizasyonun indüksiyonunu gerektiren diğer sistemlere de uygulanabilir.

Bu yöntemin görsel gösterimi, bir insan nöros kök hücre hattının farklılaşmasındaki kritik adımları ve mikroRNA profillemesinin araştırılmasını ve prosedürün bir kısmını gösteren hedef mRNA'nın doğrulanmasını gösteren laboratuvarımdan bir bilim adamı olan Lavania olacaktır. Tüm bu prosedür, aseptik teknikler kullanılarak bir biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. AL VX 12'nin her bir kuyucuğuna ekleyerek iskeleleri yeniden sulandırın.

Sulama için su kullanılarak hazırlanan iki mililitre% 70 etanol kuyu plakası. %70 etanolü her birinin duvarından aşağı dağıtarak iskelelere dokunmaktan kaçının. % 70 etanolü dikkatlice aspire edin ve iskeleleri hemen bir dakika boyunca D-M-E-M-F 12 kuyusu başına iki mililitre ile yıkayın.

Yıkama işlemini iki kez tekrarlayın: son yıkamadan sonra D-M-E-M-F 12'yi dikkatlice aspire edin. Her birine D-M-E-M-F 12'de iki mililitre laminin ekleyerek iskeleleri kaplayın. Plakayı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde en az iki saat inkübe edin.

Daha sonra, plakayı ılık D-M-E-M-F 12 tohum ile her iskelede yaklaşık 500.000 insan nöral kök hücresi veya büyüme faktörleri ile 150 mikrolitre RMM ortamı hacminde H nscs ile yıkayın. Hücrelerin üç saat sonra iskelelere yerleşmesini sağlamak için plakayı üç saat inkübe edin. Her kuyucuğa 3,5 mililitre RMM ekleyin: Hücreleri iskelelerden çıkarmamaya dikkat edin.

Plakayı yedi veya 21 gün boyunca inkübe edin. İlk besleme olan bir gün sonra RMM ortamını değiştirin ve ilk beslemeden iki ila üç gün sonra ortamı tekrar değiştirin. H nscs'nin 3D kültüründen yedi ve 21 gün sonra.

RMM ortamını çıkarın ve farklılaşmış hücreleri %4 paraform aldehit ile sabitleyin. Sabitlenmiş hücreler daha sonra bir florokrom konjuge ile tespit edilen bir beta üç tübülin primer antikoru kullanılarak boyanır. İkincil antikor hücre çekirdekleri kancalarla karşı boyanır.

Beta üç tübülin lekeli hücrelerin temsili görüntülerini yakalayın. Floresan mikroskop kullanarak görüntüleri TIFF veya JPEG formatında kaydedin. Akson proses büyümesinin ölçümü, image PRO plus yedi yazılım ölçüm aracı kullanılarak gerçekleştirilir.

Görüntüyü açmaya başlamak için araç çubuğundaki ölçüm seçeneğini belirleyin ve izleme özelliğini seçin. İzlemeyi başlatmak için, akson büyümesinin tüm uzunluğu boyunca fare düğmesi izine tıklayarak akson büyümesinin başlangıç noktasını seçin, her izi bitirmek için sağ tıklayın. Bu şekilde, görüş alanı içindeki tüm akson çıkıntılarını ölçün, ölçümleri piksel veya mikrometre olarak ifade edin.

Üç boyutlu olarak kültürlenmiş HSC'lerin mikro RNA ekspresyonundaki değişiklikleri değerlendirmek için numune karşılaştırmalı ve istatistiksel analizi için uzunluk ölçümlerini bir elektronik tablo programına aktarın. İlk olarak, ekteki protokolde tarif edildiği gibi mikro RNA ekstraksiyonu ve mikro RNA CD NA hazırlığı gerçekleştirin. Mikro RNA'dan hemen sonra metin CD NA elde edilir.

PCR bileşenleri karışımını 15 mililitrelik bir tüpte gerçek zamanlı PCR için hazırlayın. İki X-S-Y-B-R yeşil ana karışımından 1375 mikrolitre ekleyin. 100 mikrolitre mikro RNA CD, NA 275 mikrolitre üniversal astar ve 1000 mikrolitre RNA serbest su transferi.

PCR bileşenleri bir PCR yükleme rezervuarına karışır. 96 kuyulu plaka PCR dizisini kapalı çantasından dikkatlice çıkarın. Çok kanallı bir pipetleyici kullanarak 25 mikrolitre PCR bileşeni ekleyin.

PCR dizisinin her bir kuyucuğuna karıştırın. Kuyu contası arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için her pipetleme adımından sonra pipet uçlarını değiştirin. Optik yapışkan filmli 96 oyuklu plaka ve kabarcıkları çıkarmak için oda sıcaklığında 1000 GS'de bir dakika santrifüjleyin, kuyu yerinde kabarcık olmadığından emin olmak için plakayı görsel olarak inceleyin.

Gerçek zamanlı döngüleyici programındaki 96 kuyulu plaka PCR dizisi. Buna göre gerçek zamanlı döngüleyici. Daha sonra, tüm kuyucuklar için CT değerlerini PCR dizisi için boş bir Excel elektronik tablosuna aktarın Veri analizi, çevrimiçi olarak kullanılabilen bir algoritma olan PIC ktar, tahmin edilen mikro RNA hedeflerinin tanımlanması için kullanılır.

PIC KTAR web arayüzünde yeni bir sayfa açmak için omurgalılar hakkında pic ktar tahmini için tıklayınız. Açılır menüden türü seçin ve ilgilendiğiniz mikro RNA'yı mikro RNA ID kutusuna ekleyin. Bir mikro RNA'nın hedeflerini ara'yı tıklayın.

PIC KTAR skoruna göre sıralanan hedef mRNA'ların bir listesi sunulacaktır. Elde edilen sıralamalar daha sonra karşılaştırmalı bir mikroRNA tablosu derlemek için kullanılır. Hedef mRNA'ların ateşböceğini doğrulamak için bir araç olarak bir çift lusiferaz raportör plazmidi kullanılır ve renal lusiferaz aktiviteleri, hela hücrelerinin transfeksiyonundan 24 saat sonra ölçülür.

50 mikrolitre substrat, 10 mililitre çözeltiye bir tane ekleyerek ve iyice karıştırarak, 24 oyuklu plakanın her bir oyuğundan hücre büyüme ortamını çıkararak ve her birine bir tane olmak üzere 300 mikrolitre çalışma çözeltisi ekleyerek çalışma çözeltisini hazırlayın. Her kuyucuğun içeriğinin 100 mikrolitresini iyi aktarın. 24 kuyulu plakadan 96 oyuklu bir plakanın üç kuyusuna kadar 10 dakika bekleyin ve ardından lüminesans elde etmek için ayarlanmış bir luminometrede ateşböceği lusiferaz aktivitesini ölçün.

50 mikrolitre substrat, iki ila 10 mililitre çözelti iki ekleyerek ve iyice karıştırarak çalışma çözeltisi ikisini hazırlayın. Halihazırda 100 mikrolitre çalışma çözeltisi içeren 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna iki adet 100 mikrolitre çalışma çözeltisi ekleyin. 10 dakika bekleyin ve ardından renal el lusiferaz aktivitesini ölçün.

Daha sonra, ateşböceği lusiferazından renal lusiferaza lüminesans oranı hesaplanır. Yeşil ile gösterilen beta üç tübülin için immünokimya boyaması ve mavi ile gösterilen kancalı çekirdek karşı boyaması için immünokimya boyaması sonrasında 3D iskeleler üzerinde H NSCS'nin temsili mikro fotoğrafları elde edildi, akson işlemlerinin ölçümü görüntü analiz yazılımı yardımıyla gerçekleştirildi. 3D iskelelerle ve geleneksel düz yüzeyli veya 2D kültürlerle yetiştirilen H nsc'ler arasındaki akson proses büyümesinin karşılaştırılması, bir hafta veya üç hafta içinde 3D farklılaşmış HSC'lerin daha fazla akson proses büyümesi sergilediğini göstermektedir.

Hedef tahmini için hesaplamalı analiz, burada sunulan bilgiler, tahmin edilen mikroRNA'ların bir listesi, hedef genler ve hassasiyet, skor ve toplam değerlerle sonuçlandı. SOX beş ve NR dört A üç varsayılan hedef genler olarak tanımlandı. Burada gösterildiği gibi mikroRNA'ların hedeflerini doğrulamak için bir çift lusiferaz raportör testi kullanıldı.

SOX beş ve NR dört A üç geninin insan üç asal UTR raportöründen elde edilen nispi lusiferaz aktivitesi, belirtilen mikroRNA'ların varlığında önemli ölçüde azaldı. Bu videoyu izledikten sonra, onu nöral kök hücrelerde nasıl ayırt edeceğinizi ve mikro RNA ekspresyonunu ve hedef Messenger.RNA'nın doğrulamasını nasıl araştıracağınızı iyi anlamış olmalısınız.