Name: Ovo Piliç Chorioallantoic Membran (CAM) Deneyi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Öğrenin, hepatoselüler karsinom için güvenilir bir CAM ksenogreft modeli geliştirmeyi. Bu yöntem, üç boyutlu damarlı tümörlerin büyütülmesini ve embriyonik sağkalım oranlarının %93'e kadar artırılmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.S. kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH), Ulusal Diş ve Kraniyofasiyal Araştırma Enstitüsü (5R03DE021741-02) ve Ulusal Kanser Enstitüsü (1K08CA154963-01A1) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir. 
Howard Hughes Tıp Enstitüsü, HHMI Tıbbi Araştırma Görevlileri Programı aracılığıyla ML için fon sağladı.

1. Yumurta Kuluçka <ol><li> 8 günlük spesifik patojenden serbest embriyolu yumurtaların elde edilir. </li><li> Yumurta tepsisi, yukarı bakacak damgalı biter dönen yumurta yerleştirin ve bir yumurta kuluçka içine döner tepsiye yerleştirin. 36 ° C de 48 saat ve% 50 nem yumurta inkübe edin. </li></ol> 2. CAM Damlama ve Yumurta Açılış <ol><li> Inkübatör yumurta toplamak. Yumurta rafa yerleştirin yumurta, yukarı tarafında damgalı ve laminer akış kaputu getirmek. </li><li> Oda ve kaput ışıkları kapatın. </li><li> CAM damarsal yanı sıra hava kesesi maruz yumurta Candler hafifçe yumurta damgalı ucunu tutun. NOT: Yumurta Candler gelişen embriyo ve ilişkili hava kesesi ve damarsal görselleştirmek için kullanılan bir ışık kaynağıdır. </li><li> Iki büyük kan damarları arasında bir kalem işareti koyun. </li><li> Işıkları açın ve pe hava kesesi (damgalı sonu) Yukarıdaki yumurta ucu ve bir delik, bir delik açmak için steril bir itme pimi kullanınncil işareti. Itme pimini tüm yol boyunca itmeyin; 3 mm çapında bir delik derin genellikle yeterli olacaktır. </li><li> Işıkları kapat. Hava kesesi üzerindeki deliğin karşı sıkıca açık ucu basarak, emniyet ampul sıkın. CAM kalem işareti de uzak kabuk düşmesine neden kalem işaretine deliğe hava çekmek için emme uygulayın. </li><li> Hava kesesi Candler kullanarak kalem işaretli deliğe yumurta damgalı ucundan geçti olmadığını kontrol edin. Değil varsa, emniyet ampul kullanarak emiş yeniden uygulamak ardından iki delik biraz daha derin yapmak ve itme pimi kullanın. </li><li> Işıkları aç. Bağlı bir 15/16 inç cut-off tekerleği ile dremel döner aracı açmak ve kabuk kesmek için sadece yeterince derin iki enine kesimler yapmak ama yeterince derin değil depresif aşağı tüm yol kesmek için, bir yandan yumurta Holding CAM. Birbirinden uzunluğu 2 cm ve 1 cm çapında kesim yapın. 1 cm çapında bir silikon halka geçebilir ve böylece yeterince geniş kesim yapmakStandart seloteyip genişliğinden daha ama daha ince. </li><li> Sonraki hafifçe kabuk kesme tekerleği dokunarak arasında iki enine kesik uçlarında 1 uzunlamasına kesim yapmak. </li><li> Kabuk kabuk parçasının ve paralel altında steril forseps kaydırın. Forseps ile kabuk parçasını alın ve temiz tüm parça kaldırmak. </li><li> Kaldırma kolaylığı için kendi üzerine bir ucunu üzerine kat için emin olun, yeni açılan pencere üzerinde seloteyip yerleştirin. </li><li> Geri inkübatör (NOT dönen yumurta rafları) yumurta tepsisine aşılama zamanına kadar yerleştirin yumurta. </li></ol> 3. Aşılama <ol><li> Örneğin matrigel olarak, bazal membran proteini karışımı tutun buz üzerinde kaputu (polimerizasyonu önlemek için) ve yer. </li><li> 5 dakika boyunca doku kültürü inkübatör - (T75 şişeye başına 5 ml 4) ve yer matara hücreleri ayırmak için 2 mM EDTA kullanın. </li><li> Medyada müstakil hücreleri tekrar süspansiyon ve hemasitometre ve tripan mavisi kullanarak sayın. 500.000 t arası kullanın, CAM üzerine aşılama hücre hattı bağlı için 2.000.000 hücreleri o. Ön deneylerde doğru numarayı optimize edin. </li><li> 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de uygun hücre sayısı ve santrifüj için gerekli Tedbir hacmi. </li><li> Süpernatantı atın ve sonra PBS 40 μ l ++ ve bazal membran karışımı 20 μ l hücre pelletini. Not: Hücre / bazal membran karışımı süspansiyon haline resuspending deneyler için gerektiği gibi, bu noktada, hücreler ilaçlar ya da diğer test maddeleri ile muamele edilebilir. Alternatif olarak, ajanlar aşılama sonrası hücre / bazal membran karışımı süspansiyonu pipetle edilebilir. </li><li> Laminer akış kaputu kuvöz ve yerden yumurta yumurta raf al. </li><li> Peel bant pencerenin kapalı, steril forseps kullanarak bir kriyojenik flakon kapaktan 1 mm silikon halka almak ve pencereden halka bırakın. </li><li> Pipet PBS 60 μ l hücre çözümü ++ ve bazal membran Karışımındoğrudan CAM üzerine oturan silikon halkanın ortasına e. </li><li> Yeniden bant pencere ve inkübatör geri yumurta rafı hareket ettirin. Kolayca yerinden hale gelebilir halka ve hücre süspansiyonu olarak yumurta taşırken bu noktada, dikkatli olun. </li><li> Tümörlerin, 5 ila 7 gün boyunca büyümeye izin verin. </li></ol> 4. Hasat Tümörleri <ol><li> Kaputu altında-pad yerleştirin. Histoloji için gerektiği gibi 35 x 10 mm tabak ve paraformaldehit kapları hazırlayın. Her bir 35 x 10 mm levha 1 ml PBS ++ koyun. </li><li> Kaputu biohazard torbası koyun. Steril diseksiyon makas alın ve damgalı sonuna yakın delik yumurtanın içine sivri ucunu. </li><li> Uzunlamasına tüm yumurta etrafında kesin. NOT: halka ile CAM ve tümör penceresi ile kabuk üst yarısında ayrılmamak gerekir. </li><li> Diseksiyon makas ve forseps kullanarak, uzak CAM tümörü incelemek ve 35 x 10 mm plakasındaki tümörü yerleştirin. Tedbir ve tümörler tartın. Paraformaldehy Sabit tümörlerde ve daha sonra Histoloji ve immünohistokimya deneylerinde kullanılmak üzere bunları parafin gömmek. </li></ol> 5. (İsteğe bağlı): Tümör Hücre Ayrılma <ol><li> 35 x 10 mm tabak içinde tümör kıymaya diseksiyon makas kullanın. 15 ml santrifüj tüpüne kıyılmış tümör dökün ve pipetlerle mümkün olduğunca ++ kadar PBS kaldırmak. </li><li> (PBS içinde 1 mg / ml ++) kolajenaz 2 ml ilave edilir, birkaç kez fazla tüp edecek ve (birkaç saate kadar), en az 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de tüp inkübe edin. </li><li> Her tüpe 5 ml medya ekleyin ve aşağı yukarı 20 pipetleme iyice tekrar süspansiyon - 40x. Kapsamlı pipet tam hücre ayrışma için kritik öneme sahiptir. </li><li> Sediment yerleşmek için izin verin ve yeni bir tüp süpernatant aktarın. 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüjleyin. Ayrışmış hücre pelet geride bırakarak, süpernatantı. NOT: Bu noktada, hücre topakları Çeşitli deneyler için kullanılabilir (akış sitometrisi, Western blotting, RNA izolasyonu, vs kullanım için lizis). Toplam tümör hücresi sayısı da bir hemositometre ve tripan mavi boya kullanılarak elde edilebilir. Daha küçük, oval şekilli hücreler tavuk hücreleri CAM ve tümör hücreleri gibi sayılmamalıdır unutmayın. Tümör dikkatlice CAM uzağa disseke ise non-tümör (CAM) hücreleri kirlenmesine neden asgari sayıda olmalıdır. </li></ol>

<ol><li>Sangiovanni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+survival+of+cirrhotic+patients+with+a+hepatocellular+carcinoma+detected+during+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance.</a> Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).</li>
<li>Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review%3A+evidence-based+management+of+hepatocellular+carcinoma--an+updated+analysis+of+randomized+controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Aliment+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma--an updated analysis of randomized controlled trials.</a> Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).</li>
<li>Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma.</a> Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+evidence+that+tumors+are+angiogenesis+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent.</a> J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+key+steps+of+human+tumor+progression+in+vivo+by+using+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).</li>
<li>Dumartin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrin-1+mediates+early+events+in+pancreatic+adenocarcinoma+progression%2C+acting+on+tumor+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells.</a> Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).</li>
<li>Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK%28MAPK%29+activity+as+a+determinant+of+tumor+growth+and+dormancy%3B+regulation+by+p38%28SAPK%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK).</a> Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).</li>
<li>Baroni, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonomic+and+short+hairpin+RNA+gene+silencing+methods+to+explore+functional+gene+programs+associated+with+tumor+growth+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest.</a> Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).</li>
<li>Lopez-Rivera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+nitric+oxide+synthase+drives+mTOR+pathway+activation+and+proliferation+of+human+melanoma+by+reversible+nitrosylation+of+TSC2%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2.</a> Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).</li>
<li>Balke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short-term+in+vivo+model+for+giant+cell+tumor+of+bone%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone.</a> BMC Cancer. 11, 241(2011).</li>
<li>Balke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+characterization+of+osteosarcoma+growth+on+the+chick+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane.</a> BMC Res Notes. 3, 58(2010).</li>
<li>Sys, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+ovo+CAM-assay+as+a+xenograft+model+for+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma.</a> J Vis Exp. (77), e50522(2013).</li>
<li>Dohle, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay%3A+how+it+really+works%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works.</a> J Vis Exp. (33), (2009).</li>
<li>Ossowski, L., Reich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+model+for+quantitative+study+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental model for quantitative study of metastasis.</a> Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).</li>
<li>Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+do+not+arise+from+tumor-initiating+cells+in+human+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma.</a> BMC Cancer. 13, 485(2013).</li>
<li>Ho, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+novel+immunomodulating+agent%2C+FTY720%2C+on+tumor+growth+and+angiogenesis+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma.</a> Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+coordinates+interaction+of+pericytes+and+endothelial+cells+during+vasculogenesis+and+experimental+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis.</a> Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).</li>
</ol>

A.S., araştırmacı tarafından başlatılan bir klinik araştırmayı desteklemek için Advaxis Pharmaceutical şirketinden fon alıyor.

Bu protokol Çeşitli önemli adımlar büyük olasılıkla gelişmiş embriyonik hayatta yanı sıra tümör büyümesi artan güvenilirlik oluşturmaktadır. Hava kesesi için emme uygulayarak uzak kabuk CAM Damlama (yumurta, künt diseksiyon, vb albümin kaldırmak için bir iğne kullanarak) diğer mevcut yöntemlere göre daha az invaziv. Bu yöntem için gerekli olan iki küçük delik oluşturmak için steril bir itme pimi kullanılarak protokolünün en zor kısmıdır. Çok fazla güç kullanarak raptiye ile aşırı penetrasyon yoluyla CAM ve damarsal hasa...

Hepatosellüler karsinom (HCC) Dünyada 1 kanser ölümlerinin 3. önde gelen nedenidir. Şu anda HCC hastalarının sadece% 30 potansiyel küratif cerrahi tedavi 2 için uygundur, ve sistemik kemoterapi 3 etkili değildir. Bu nedenle yeni tedavilere HCC için acil bir karşılanmamış bir klinik ihtiyaç ve yeni maddelerin etkin bir test için uygun bir model sistemlerinde gelişme vardır. Tavuk koriallantoik zar (CAM) tahlili in vivo potansiyel anti-tümör ilaç test üretilebilir, uygun maliyetli ve hızlı, orta hacimli bir yöntem sağlar. CAM tahlil anjiyogenez 4 incelemek için yaygın olarak kullanılır olmuştur. Ayrıca, başarılı bir şekilde glioblastoma 5, pankreas kanseri 6, melanoma 7-9 ve osteosarkom dahil olmak üzere 10-11, kanser, bir tümör ksenograft modeli geliştirilmiştir. Hem ovo 12 ve ex ovo içinde13 teknikleri protokol protokole değişen ayrıntıları literatürde kullanılmıştır. Yüzde 50 11-14 - CAM ksenograft modeli bir büyük zorluk 25 arasında değişen yayınlanan civciv embriyo ölüm oranları ile, yumurta manipülasyonu sonrası embriyonik ölüm nispeten yüksek insidansı. Bu yazıda, güvenilir histolojik farklılaşmamış HCC benzer üç boyutlu, vaskülarize tümörlerin büyümesini üreten HCC ksenograft modelinde ovo bir in gelişimini açıklar. Biz ilk Ossowski ve ark. 14 tarafından açıklanan protokol adapte var ve son derece yüksek tümör engraftment ile% 93&#39;e varan civciv embriyonik sağkalım oranları elde ettik.

<table><tbody><tr><td>Premium kuluçkalık yumurtalar</td><td>Charles River N</td><td>/A</td><td>http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx</td></tr><tr><td>Yumurta kuluçka makineleri</td><td>GQF</td><td>Hova-Bator 2362N</td><td></td></tr><tr><td>Döner yumurta tepsileri</td><td>GQF</td><td>1611 Otomatik Yumurta Çevirici</td><td></td></tr><tr><td>Yumurta mumcusu</td><td>Lyon</td><td>Hi-Power 950-070</td><td></td></tr><tr><td>Dremel 100 15/16 kesme diskli döner alet</td><td>Dremel</td><td>100-N/7</td><td></td></tr><tr><td>Steril forseps, itme pimi, diseksiyon makası, Scotch bant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Kriyojenik şişeler, silikon rondelalı dış dişli</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C9891'den</td><td></td> kollajenaz</tr></tbody></table>

<em&gt; ovo</emhepatosellüler karsinom verimli xenograftlarında modeli olarak&gt; piliç chorioallantoic membran (cam) deneyi

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

Civciv koriyoallantoik membran (CAM) CAM tümör implantasyonu için ideal bir sistem haline doğal bağışık yetmezliği ve çok kanlanan bir gübreleme gün sonra 7 gelişmeye başlar ve 12. gün olgunlaşır. Bundan başka, CAM tümör istilasını ve metastazını, çalışma için çekici bir model verme gibi, fibronektin, laminin, kolajen, integrin alfa (v) beta3 ve MMP-2 gibi hücre dışı matris proteinleri içerir. Bilim adamları uzun zamandır anjiyogenez bir model olarak kullanarak CAM fizyolojisi avantajlarından almış. Daha yakın zamanlarda, CAM assay&#39;dir bazik in vitro çalışma ve daha karmaşık bir hayvan kanser modellerinde arasında bir köprü, muhtelif kanserler bakımından bir in vivo model sisteminde ksenograft olarak çalışmak için modifiye edilmiştir. CAM deneyi maliyet ve zaman etkin bir biçimde kullanılabilir biyolojik ilgili sisteminde tümör büyümesi, anti-tümör terapisi, ve pro-tümör molekül yollarının çalışması için izin verir. Burada, CAM xen gelişimini açıklarkadar% 93 embriyonik sağkalım oranları ve güvenilir tümör hepatosellüler karsinom (HCC) ve ograft modeli üç boyutlu, vaskülarize tümörlerin büyümesine yol açan take.

Protokolde önemli adımlar Temsilcisi resimler burada gösterilmektedir. Şekil 1A gelişen embriyo, hava kesesi ve CAM damarsal görselleştirmek için Candler kullanımını gösterir. Şekil 1B-1C yaparak CAM bırakarak sürecini göstermek iki delik ve ardından güvenlik ampul kullanarak negatif basınç uygulayarak ve Şekil 1D bir başarıyla kalem işaretli delik altında büyük hava kabarcığı ile CAM düştü gösterir. Şekil 1E ve Şekil 1F gerekli hale ge...

Civciv koryoallantoik membran (CAM) immün yetmezliklidir ve oldukça vaskülarizedir, bu da onu doğal bir in vivo tümör büyümesi ve anjiyogenez modeli yapar. Bu protokolde, CAM testi kullanılarak üç boyutlu, vaskülarize hepatosellüler karsinom (HCC) tümörlerinin büyütülmesi için güvenilir bir yöntem tanımlanmıştır.

<em&gt; Ovo</emHepatosellüler karsinom Verimli Xenograftlarında Modeli olarak&gt; Piliç Chorioallantoic Membran (CAM) Deneyi

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Bu deneyin genel amacı, hepatosellüler karsinom için güvenilir bir cam xenograft modeli geliştirmektir. Bu, öncelikle yumurtaların inokülasyona hazırlanması için inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, yumurtanın koryallant membran veya cam tabakası düşürülür ve yumurta kabuğuna bir pencere açılır.Ardından, tümör büyümesini sağlamak amacıyla yumurta, kabuk penceresi aracılığıyla insan hepatoselüler karsinom hücreleri ile inoküle edilir. Sonuçlar, insan hepatoselüler karsinom hücre hatları kullanılarak üç boyutlu vaskülarize tümörlerin başarıyla büyütüldüğünü göstermektedir. Bu protokol kullanılarak %93'e varan embriyonik sağkalım oranları elde edilmiştir.CAM deneyi'nin fare tümör modelleri gibi diğer in vivo tekniklere göre temel avantajları, kısa deneysel analiz süresi, deneyin düşük toplam maliyeti ve hazır tekrarlanabilirliğidir. CAM deneyleri; anjiyogenez, tümör hücre invazyonu ve metastaz çalışmalarında kullanılabilir. Ayrıca, küçük moleküllerin ve ilaçların tümörlerin büyüme ve gelişimi üzerindeki etkilerini belirlemek için de kullanılabilirler.Bu prosedürün görsel demonstrasyonu önemlidir; çünkü yumurtanın hazırlanmasında kullanılan farklı adımlar, bunlar arasında ışıkla muayene (candling), damar yapısının belirlenmesi, hava kesesinin yakınına ve yumurtanın üst kısmına içeriği boşaltmadan küçük delikler açılması yer almaktadır. Yumurta kabuğunu çatlatmadan pencereleri açmak ve tüm süreçler boyunca embriyonun sağlam kaldığından emin olmak yeni kullanıcılar için zorlayıcı olabilir. Başlamak için yerleştirin.Sekiz günlük, spesifik patojenle karşı karşıya gelmemiş yerli tavuk yumurtalarını, damgalı uçları yukarı bakacak şekilde döner bir yumurta tepsisine yerleştirin. Döner tepsiyi 36 °C sıcaklıkta ve %50 nem oranına sahip bir yumurta inkübatörüne yerleştirin ve yumurtaları 48 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, yumurtaları damgalı uçları yukarı gelecek şekilde bir yumurta rafına yerleştirin ve bunları laminer akışlı kabine alın.Oda ve çeker ocak ışıklarını kapatın, yumurtanın damgalı ucunu yumurta ışığına (candler) hafifçe tutarak civcivin cam (koryoallantoik membran) olarak bilinen damar yapısını ve hava kesesini açığa çıkarın. İki ana kan damarı arasına kurşun kalemle bir işaret koyun. Ardından, yumurtanın damgalı ucundaki hava kesesinin hemen üzerindeki tepe noktasına bir delik ve kalemle işaretlediğiniz yere ikinci bir delik açın.Steril bir raptiye kullanarak, yaklaşık üç milimetre derinliğinde bir delik açılmalıdır. Bir emiş pompasıyla havayı boşaltın ve pompanın açık ucunu hava kesesinin üzerindeki deliğe sıkıca bastırın. Kalemle işaretlenen noktadaki delikten içeri hava çekilerek kamın kabuktan ayrılmasını sağlamak için pompayı yavaşça serbest bırakın.Kandleme cihazı kullanarak hava kesesinin yumurtanın damgalı ucundan kalemle işaretlenmiş deliğe taşındığını doğrulayın. Eğer taşınmamışsa, her iki deliği de biraz daha derinleştirin ve emme ampulü ile vakumu yeniden uygulayın. Ardından, 1/16 inç kesme diski takılı olan döner aletle yumurtayı bir elinizde tutun.Kama kısmına dokunmadan, kabuk üzerinden iki adet transvers kesi yapın. Kesiler iki santimetre uzunluğunda olmalı ve aralarında bir santimetre mesafe bulunmalıdır. Ardından, kesme diskini kabuğa hafifçe değdirerek iki transvers kesinin uçlarından boylamsal kesiler yapın.Kabuğu çıkarmak için steril penseti kabuk parçasının altına, paralel olacak şekilde yerleştirin. Parçayı pensetle kavrayın ve temiz bir şekilde çıkarın. Bir parça bandın bir ucunu kendi üzerine katlayın ve ardından bandı yumurtadaki açıklığın üzerine yerleştirin.Yumurtayı bir yumurta tepsisine yerleştirin ve inokülasyondan önce en fazla iki ila üç saat boyunca rotasyon yapmadan tepsiyi inkübatöre koyun. İnokülasyona hazırlanmak için, polimerizasyonu önlemek amacıyla matrigel gibi bir bazal membran protein karışımını buz üzerine yerleştirin. Ardından, tümör hücrelerini ayırmak için her balon için 2 mM'lık EDTA çözeltisinden dört ila beş mililitre kullanın ve balonu doku kültürü inkübatöründe beş dakika bekletin.Ayrılan hücreleri besiyerinde süspande edin ve hücre sayısını belirleyin. Hücre hattına bağlı olarak, CAM üzerine greftleme için 500.000 ile 2 milyon arasında hücre kullanın. Ardından, uygun hücre sayısını elde etmek için gerekli hacmi yeni bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca santrifüjleyin.500 xg'de santrifüjleyip süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini yeniden süspande edin. Bunun için PBS++ olarak bilinen kalsiyum ve magnezyum içeren 40 µL PBS ve 20 µL bazal membran karışımı kullanın. Bu aşamada, hücre süspansiyonuna ilaçlar veya diğer test ajanları eklenebilir.Ardından, yumurta tepsisini laminer akışlı kabine yerleştirin. Yumurtanın üzerindeki bandı soyun ve kriyojenik bir tüpten steril bir milimetre boyutundaki silikon halkayı açıklıktan geçerek kam borusunun üzerine bırakın. Hücreler, PBS++ ve bazal membran karışımından oluşan 60 µL çözeltiyi silikon halkanın merkezine ekleyin, pencereyi tekrar bantlayın ve yumurta tepsisini dikkatlice inkübatöre geri taşıyın.Tümörlerin beş ila yedi gün boyunca büyümesine izin verin. Tümörleri hasat etmek için, steril kabine bir alt ped ve bir biyotehlike torbası yerleştirin.Histoloji için gerekli miktarda paraformaldehit kapları ve 1 ml PBS++ içeren 35 milimetreye 10 milimrelik plakalar hazırlayın. Steril diseksiyon makasının sivri ucunu, yumurtanın damgalı ucuna yakın kısmındaki delikten içeri yerleştirin ve yumurtanın tüm uzunluğu boyunca kesin. Kamera ve halkayla birlikte tümör, kabuğun açılış tarafındaki üst yarısına yapışık kalmalıdır.Diseksiyon, makas ve penset kullanarak tümörü camdan çıkarın ve tümörü 35 milimetreye 10 milimetrelik bir plakaya yerleştirin. Tümörü ölçün ve tartın. Tümörü, histoloji ve immünohistokimya deneylerinde kullanmak üzere paraformaldehit ile fikse edin ve parafine gömün.Tümör hasat edildikten sonra, tümörü bir plak içinde diseksiyon makasıyla ince parçalara ayırın. Ardından, parçalanmış tümörü 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve PBS++'yı pipetleme yoluyla uzaklaştırın. PBS++ içinde çözünmüş 1 mg/mL konsantrasyonunda 2 mililitre kollagenaz çözeltisi ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın.Tüpü 37 °C'de en az 30 dakika ve birkaç saate kadar inkübe edin. Ardından, tüpe beş mililitre ortam ekleyin ve 20 ila 40 kez pipetleyerek iyice karıştırın. Hücrelerin tamamen ayrıştırılması için bu adım kritiktir.Çökelti çöktükten sonra, snatı yeni bir tüpe aktarın, tüpü 500 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj edin ve ayrışmış hücre peletini geride bırakarak süpernatantı atın. CAM, HUH seven tümör hücreleri ile yerleştirildiğinde, halkanın içinde vaskülarize bir tümör görüldü. Beş günlük büyümenin ardından, CAM analizinden elde edilen HUH seven tümörünün histolojisi, tümör hücrelerinin diferansiye olmamış hepatoselüler karsinoma hücrelerine benzediğini gösterdi.Bu yöntemle çalışırken, farklı hücreler veya farklı ilaçlar söz konusu olduğunda belirli optimizasyonların gerekebileceğini hatırlamak önemlidir. Örneğin, bazı hücre hatlarının üç boyutlu tümörler oluşturmak için daha yüksek veya daha düşük yoğunluklara ihtiyaç duyabileceği göz önünde bulundurulmalıdır.

the-ovo-chick-chorioallantoic-membrane-cam-assay-as-an-efficient

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Civciv chorioallantoic membran (CAM), anjiyogenez ve tümörogenez çalışmak için eşsiz bir doğal bağışık yetmezliği olan, destekleyici bir kültür ortamı. Bu video makale piliç farklı adımları gösteriyor.

Civciv Ex ovo Kültür ve Ex ovo CAM Testi: Gerçekten Nasıl Çalışır?

Bu videoda, bir in ovo model oluşturmak için kanser hücrelerinin bir tavuk koryoallantoik zarına implantasyonunu açıklıyoruz. Model, jinekolojik kanserin ilerlemesini incelemek için yumurtalık kanseri hücrelerini başarıyla aşılar.

Tavuk Korioallantoik Membran Tabanlı Kanser Modellemesi: Kanser Hücresi Tümörigenezi ve Metastazı Çalışmak İçin Bir In Ovo Model

Bu videoda, perinöral invazyonu incelemek için civciv koryoallantoik membran veya CAM üzerinde dorsal kök gangliyonları ve kanser hücrelerini birlikte kültürleme yöntemini açıklıyoruz.

Civciv Korioallantoik Membran veya CAM Tümör Modeli: Tümör Hücrelerinin Perinöral İnvazyonunu Simüle Etmek İçin Bir In Ovo Yöntemi

Bu video, tümör taşıyan koryoallantoik membranın tavuk embriyosundan izolasyonunu göstermektedir. Hasat edilen CAM, daha sonraki sonraki uygulamalar için kullanılabilir.

Civciv Korioallantoik Membran Hasadı: Tavuk Yumurtasından Tümör Grefti Taşıyan Korioallantoik Membranı İzole Etmek İçin Bir Yöntem

<em&gt; Ovo</emSarkoma için bir Xenograftmodel olarak&gt; CAM-testi

Perinevral invazyonu baş ve boyun skuanöz hücre karsinomları ve diğer tümörlerde agresif bir fenotiptir. Piliç chorioallantoik membran modeli anjiyogenez, kanser istilası ve metastif eğitimi için kullanılmıştır. Burada bu modelin perineval invazyonu in vivo olarak değerlendirmek için nasıl kullanılabilirler olduğunu gösteriyoruz.

Kafa ve boyun kanseri Perinevral Invazyonu değerlendirmek için Chick Chorioallantoik membran In vivo model

Metastatik berrak hücreli renal hücreli karsinom kapsamlı bir klinik öncesi araştırma için kapsamlı bir hayvan modeli olmayan bir hastalıktır. Bu protokol hastalık için iki yeni hayvan modelini göstermektedir: ortonik olarak implante edilmiş fare modeli ve tavuk koryoallantoik membran modeli, her ikisi de klinik olgulara benzeyen akciğer metastazı göstermektedir.

Fare Böbreği ve Tavuk Koryoallantoik Membranda Kurulan Metastatik Berrak Hücreli Renal Hücreli Karsinom Modelinin Karşılaştırılması

Tavuk koryoallantoik membran modelini jinekolojik ve ürolojik kanser hücre hatlarının ve hasta kaynaklı tümörlerin engraftment için alternatif, nakledilebilir, in vivo modeli olarak sıyoruz.

Jinekolojik ve Ürolojik Kanserleri Incelemek Için Vivo Modelinde Tavuk Chorioallantoic Membran Kullanma

Bu protokol, kontrastlı ultrason görüntüleme ve mikrokabarcık aracılı ilaç dağıtımını incelemek için 5 ila 8 günlük tavuk embriyolarının ve bunların koryoallantoik membranının (CAM) in vivo bir model olarak nasıl elde edileceği ve kullanılacağına dair üç yöntemi açıklamaktadır.

Kontrastlı Ultrason Görüntüleme ve Mikrokabarcık Aracılı İlaç Dağıtım Çalışmaları için Tavuk Ex Ovo Embriyolarının ve Korioallantoik Membran Damarlarının In Vivo Model Olarak Hazırlanması

Burada, insan yumurtalık dokusu için bir civciv koryoallantoik membran (CAM) ksenogreftleme modeli geliştirmek için bir protokol açıklıyoruz ve tekniğin etkinliğini, greft revaskülarizasyon zaman çerçevesini ve 6 günlük bir greftleme süresi boyunca doku canlılığını gösteriyoruz.

Yumurtalık Dokusu Transplantasyonunu İncelemek İçin Bir Araç Olarak Civciv Korioallantoik Membran (CAM) Modeli

Öğrenin, hepatoselüler karsinom için güvenilir bir CAM ksenogreft modeli geliştirmeyi. Bu yöntem, üç boyutlu damarlı tümörlerin büyütülmesini ve embriyonik sağkalım oranlarının %93'e kadar artırılmasını sağlar.

Daha fazla video keşfet