Matrix Modifikasyon Bağlı Hücresel Yapışma ve De-yapışma Real-time Değişiklikleri Tedbir Hücre-substrat Empedans ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücre substrat empedansı ve canlı hücre görüntüleme kullanarak gerçek zamanlı olarak matris modifiye edici ajanlara maruz kalan endotel hücrelerinde hücre matrisi yapışmasındaki hızlı değişiklikleri ölçmektir. Bu deneyde, hem enzimi myelo peroksidaz, patofizyolojik olarak ilgili bir matris modifiye edici ajan olarak kullanılmıştır. Bu, yapışkan bir matris substratı sağlamak için önce yüzeylerin fibronektin ile kaplanmasıyla elde edilir.

Myo peroksidaz veya MPO'nun daha sonra fibronektine bağlanmasına izin verilir. Daha sonra askıda kalan endotel hücreleri yüzeylere oturtulur ve maksimum hücre bağlanmasını sağlamak ve fibronektin üzerine yayılmak için inkübe edilir. Daha sonra hücreler, NPO aracılı fibronektin oksidasyonunu başlatmak için hidrojen peroksite maruz bırakılır.

Hücre matrisi yapışmasındaki müteakip hızlı değişiklikler daha sonra hücre substrat empedansı ve canlı hücre görüntüleme analizi kullanılarak gerçek zamanlı olarak ölçülür. Sonuçlar, NPO aracılı fibronektin oksidasyonu tarafından tetiklenen endotel hücre matriksi adezyonundaki hızlı kayıpların, hücre substrat empedansı ve canlı hücre görüntüleme ile yüksek zamansal çözünürlükle ve etiketsiz bir şekilde gerçek zamanlı olarak ölçülebileceğini göstermektedir. Bu tekniklerin avantajı, hücre matrisi yapışmasındaki değişiklikleri yüksek zamansal çözünürlükle sürekli olarak ölçebilmeleridir ve bu, matris modifikasyonlarının hücre morfolojisinde ve yapışmaya bağlı sinyalleme süreçlerinde aşağı akış değişikliklerini nasıl yönlendirdiğine dair önemli yeni bilgiler sağlayabilecekleri anlamına gelir.

Protokoller, MPO'nun matris gibi diğer matris modifiye edici ajanlar için geçit, proteazlar veya epitel hücreleri gibi endotel hücreleri dışındaki yapışık hücre tipleri kullanılarak kolayca uyarlanabilmesi açısından daha geniş bir öneme sahiptir. Başlamak için, hücre substrat empedansı ölçümleri için 96 kuyu altın mikro elektrot dizisini kaplamak için fibronektin kuyusu başına 80 mikrolitre ekleyin veya canlı hücre görüntüleme analizi için cam alt hücre kültürü kaplarına iki mililitre fibronektin ekleyin. Dizileri ve/veya kültür kaplarını 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin.

Daha sonra yüzeyleri bloke etmek için% 0.2 BSA ekleyin ve iki saat daha 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, saflaştırılmış insan peroksidazımı HBSS'ye ekleyin ve 30 dakika inkübe edin. Ardından, bağlanmamış MPO'yu çıkarmak için yüzeyleri iki kez yıkamak için HBSS'yi kullanın.

Daha sonra, metin protokolüne göre hazırlanan mililitre başına 250.000 hücreye bakın 96 kuyulu hücre substrat empedansı mikro elektrot dizileri üzerine doğal veya MPO taşıyan fibronektin kaplı yüzeyler. 35 milimetre cam tabanlı hücre kültürü kapları için, mililitre başına iki mililitre 500.000 hücre ekleyin. Tohumlamadan hemen sonra, hücreler mikro elektrot dizi plakalarını 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte hücre substratı empedans inkübatör portuna monte edin.

Ve hücre indeksi verilerinin sürekli alımını başlatmak için boş okumalar yapın. 35 milimetrelik cam tabanlı hücre kültürü kaplarını 35 santigrat derece %5'lik bir karbondioksit inkübatörüne aktarın. Maksimum hücre bağlanmasına ve yayılmasına izin vermek için iki saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, hücre indeksi okumalarını duraklatın ve mikroelektrot dizi plakasını kısaca çıkarın veya cam alt tabağı inkübatörden çıkarın, snat'ı aspire edin ve inhibitörlerin, MPO modülatörlerinin, katalize reaksiyonların veya hücre sinyal inhibitörlerinin etkilerini incelemek için ısıtılmış HBSS ekleyin. Onları kültürlere ekleyin. Bu noktada, dizi plakasını hemen inkübatör portuna veya cam alt tabağı inkübatöre geri yerleştirin ve hücrelerin 30 dakika boyunca dengelenmesine izin verin.

Hücre empedansı çalışmaları için NPO katalizli hipokloröz aside bağlı fibronektin oksidasyonunu ve de yapışmayı başlatmak için, mikroelektrot dizi plakasını inkübatörden çıkarın ve hücre indeksi ölçümlerini duraklatın. HBSS'ye hidrojen peroksit ekleyin ve tekrarlanan pipetleme ile hafifçe karıştırın, hemen mikroelektrot dizisine inkübatör portuna geri monte edin ve 35 milimetre cam tabanlı kaplar kullanarak canlı hücre görüntüleme çalışmaları için hücre indeksi okumalarını yeniden başlatın. Çanağı inkübatörden çıkardıktan sonra, 63 x su objektif lensi ile donatılmış, ters çevrilmiş bir konfokal mikroskobun 37 santigrat derece ısıtılmış bir aşamasına monte edin.

Ve DIC optiği Canlı hücre filmlerini kaydetmek için hücrelere odaklanın ve DIC optiklerini burada atıfta bulunulan yönergelere göre optimize edin. DIC filmini başlatın ve bir dakika boyunca işlenmemiş hücrelerin temel okumalarını kaydedin, ardından hidrojen peroksit ekleyin ve tekrarlanan pipetleme ile hafifçe karıştırın, mikroskobu yeniden odaklayın ve gereken süre boyunca tedavi edilen hücrelerin DIC filmlerini kaydetmeye devam edin. Hücre substrat empedansı verilerini analiz etmek için, verileri hücre d yapışması için bir elektronik tabloya aktararak başlayın.

Çalışmalar, NPO aracılı fibronektin oksidasyonunun başlamasından hemen önce kaydedilen değerleri, canlı hücre görüntüleme verilerini analiz etmek için zamana karşı normalleştirilmiş hücre indeksi grafikleri olarak mevcut bir veriye ayarlayarak verileri normalleştirir. En az iki ayrı DIC filminde Görüntü J gibi bir görüntü analiz programında MPO aracılı fibronektin oksidasyonunun başlamasından hemen önce ve sonra kaydedilen DIC canlı hücre görüntüleme filmlerini açın, rastgele birden fazla hücre seçin ve membran kenarlarını manuel olarak izleyerek ve kapalı piksellerin sayısını ölçerek öngörülen alanlarını sıralı çerçevelerde ölçün. Son olarak, verileri, endotel hücre süspansiyonlarının fibronektin veya MPO taşıyan fibronektin üzerine oturtulması, hücre substratındaki hücre indeksi değerlerinin bir platosu ile değerlendirildiği gibi, maksimum hücre bağlanması ve iki saat içinde yayılma ile sonuçlanır, normalleştirilmiş hücre alanının bir grafiği olarak sunun.

Empedans ölçümleri, doğal veya NPO taşıyan fibronektin üzerinde maksimum hücre yapışması sağlandıktan sonra, NPO katalizli hipokloröz asidin aracılık ettiği ve NPO'ların substrat Hidrojen peroksit ilavesiyle başlatılan hedeflenen fibronektin oksidasyonu, hücre substrat empedansı ve burada gösterildiği gibi canlı hücre görüntüleme ile ölçülen hücre matrisi temasının yüzey alanında hızlı bir azalmaya neden olur, Hidrojen peroksit tedavisine yanıt olarak NPO taşıyan fibronektine bağlı endotel hücrelerinde görülen hızlı hücresel de yapışması, tek başına hidrojen peroksit ile muamele edilen hücrelerde yoktur. Miyozin iki motor fonksiyonunun BLE'ler statin ile inhibisyonu, hücre substrat empedansı ile ölçülen endotel hücre de yapışma hızını inhibe eder ve canlı hücre görüntüleme ile MPO'ya yanıt olarak hücresel de yapışma ve kasılmanın hücre altı matris oksidasyonunu katalize ettiğini belirler, ACTO miyozin gerilme kuvvetleri tarafından yönlendirilir. Bu yöntemler, hücre adezyonundaki çok hızlı değişiklikleri doğru bir şekilde ölçebildiğinden, adezyon değişiklikleri ile SARK fosforilasyonu veya fokal adezyon sinyalizasyonu gibi adezyona bağlı sinyalleme süreçlerindeki aşağı akış değişiklikleri arasındaki nedensel ilişkiler hakkında kritik bilgiler verebilir ve bunlar zaman içinde Western blotlama kullanılarak paralel deneylerde kolayca ölçülebilir.