Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay Saccharomyces cerevisiae

Aşağıdaki deneyin genel amacı, Croce Visier'de kararsız bir proteinin bozunması için genetik gereksinimleri hızlı bir şekilde belirlemektir. Bu, belirli seçici koşullar altında büyüme için gerekli olan bir raportör enzimin, ilgilenilen kararsız bir proteine kaynaştırılmasıyla elde edilir. Daha sonra, her ikisi de füzyon proteinini eksprese eden vahşi tip veya mutant hücreler, seçici orta agar plakaları üzerinde kültürlenir.

Kaplama testi, protein bolluğundaki farklılıkları biyokimyasal olarak doğrulamak için maya hücresi büyümesi temelinde protein stabilizasyonunun uygun bir göstergesini sağlarken, füzyon proteinini barındıran mutant hücrelerdeki tip, Western blot analizi için hızlı, verimsiz bir protein ekstraksiyon yöntemi ile parçalanır. Sonuçlar, bozunma için gerekli olan bir gende mutasyona sahip hücrelerde kararsız bir proteinin bolluğunun arttığını göstermektedir. Bunun tersi, bozunmaya yetkin vahşi tip suşlar için geçerlidir.

Bu tekniğin nabız takibi ve Cycl heide kovalama analizleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, daha az emek yoğun ve zaman alıcı olması ve protein bozunması için genetik gereksinimlerin hızlı ve yüksek verimli bir şekilde belirlenmesine izin vermesidir. Bu yöntem, bir dizi kararsız protein için bozunma gereksinimleri hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca, transkripsiyon ve translasyon gibi gen ifadelerinin diğer yönlerinin düzenleyicilerini tanımlamak için de kullanılabilir.

Prosedürleri göstermek Sheldon Watts ve Justin Crowder olacak. Laboratuvarımdaki öğrenciler: Tahlilden önce, kararsız bir protein ve metabolik raportör bir enzimden oluşan bir füzyon proteinini kodlayan bir plazmiti mutant bir maya suşuna dönüştürürler. Bir kontrol olarak protein bozunmasının düzenlenmesi ile ilgili genetik kusurlara sahip olduğundan şüphelenilen aynı plazmit, aynı zamanda vahşi tip bir maya suşuna dönüştürür.

Transformatörleri, plazmit moleküllerini barındıran, hücreleri seçen beş mililitre minimal ortama aşılayın. Test tüpünü eğimli bir döndürücüye yerleştirin ve ertesi gün gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Gece boyunca kültürlerin optik yoğunluğunu ölçün, daha sonra her kültürü taze ortam ve steril ayrı 1.5 mililitre santrifüj tüpleri ile 0.2'lik bir OD 600'e seyrelterek tüm hücreler için hücre konsantrasyonunu eşitleyin.

Ana tahlile başlamak için, önce 0.2'lik bir OD 600'den başlayarak, sonraki seyreltmelere hazırlık olarak steril 96 oyuklu bir plakanın ilk sütunundaki belirlenmiş kuyucuklara başlayarak, önceden seyreltilmiş her bir suşun 200 mikrolitresini aktararak altı katlı bir seyreltme serisi matrisi oluşturun, ikinci sütundaki boş kuyucuklara 125 mikrolitre steril su eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın, üç ve dört. Daha sonra, 25 mikrolitre mayayı birinci sütundan ikinci sütuna aktarın, hücreleri eşit şekilde karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve 25 mikrolitre hücreyi ikinci sütundan üçüncü sütuna aktarmaya devam edin. Dördüncü sütundaki oyuklar, hücre lekelenmesi için görsel bir yardımcı olarak iyice karışana kadar seri seyreltme adımlarını tekrarlayın.

Bir ızgara şablonu yazdırın ve seri seyreltme matrisindeki en az konsantre sütundan başlayarak bir Petri kabı kapağının içine bantlayın. Her sütundan dört mikrolitre hücre aktarın. 96 oyuklu plaka üzerinde, hücre içi plazmit bakımını seçen bir kontrol minimal orta agar plakası üzerine, her sütundan dört mikrolitre hücre daha yerleştirin, her iki hücre içi plazmidi seçen ayrı, minimal orta agar plakasına yerleştirin.

Kararsız füzyon proteininin bakımı ve ekspresyonu. Her iki plakanın da tezgahta beş ila 10 dakika kurumasına izin verin. Dehidrasyonu önlemek için kapakları param ile kapatın ve hücreleri iki ila altı gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.

En hızlı büyüyen kültürden elde edilen koloniler, belirli bir plaka üzerindeki en seyreltik noktada ilk kez görünür hale geldiğinde, plakayı inkübatörden çıkarın ve büyümenin derecesini belgeleyin. Fotoğraf çekerek, farklı günlerde farklı plakaların veya aynı plakanın birden fazla günde fotoğrafını çekmek gerekebilir. Çok çeşitli büyüme oranları sergileyen farklı maya suşları söz konusu olduğunda, büyüme tahlilinde tanımlanan bir genin protein bolluğunu düzenlediği biyokimyasal olarak doğrulanmıştır, yabani tip ve mutant maya suşlarını yukarıda belirtilen füzyon proteinini kodlayan bir plazmit ile dönüştürerek başlar, dönüştürücüleri hücre içi plazmit bakımı için seçen beş mililitre minimal ortamda aşılayın ve tüpleri gece boyunca 30 santigrat derece eğimli bir döndürücüde inkübe edin.

Ertesi gün, optik yoğunluğu her gece boyunca 600'de ölçün. Tüm suşlar 0.4 veya daha yüksek bir OD 600'e ulaştığında, tüm kültürleri, her bir suş için nihai hacim 10 mililitre olacak şekilde taze ortamla 0.2'ye kadar seyreltin. Hücreleri, tüm kültürler 0.8 ile 1.2 arasında bir orta log faz büyümesi OD 600'e ulaşana kadar 30 santigrat derecelik bir platform çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.

Toplam 2,5 OD birimi hücreyi 15 mililitrelik taze bir konik tüpe aktararak bir hücreyi hasat edin. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleyin ve S süpernatantını çıkarın. Ardından, damağı yeniden süspanse etmek için bir mililitre damıtılmış su girdabı veya pipet ekleyin ve hücre süspansiyonunu 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.

Hücreleri ikinci santrifüjleme ile 30 saniye boyunca izole edin Oda sıcaklığında, snat'ı çıkarın ve hücreleri 100 mikrolitre damıtılmış suda tekrar süspanse edin. Hücre süspansiyonuna 100 mikrolitre 0.2 molar sodyum hidroksit ekleyin, erken hücresel parçalanmayı önlemek için numuneleri karıştırmak ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe etmek için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücreleri girdap haline getirmeyin.

Hücreleri 30 saniye boyunca üçüncü bir santrifüjleme ile tekrar izole edin. Oda sıcaklığında, süpernatanları hücrelerden çıkarın ve peleti 50 ila 100 mikrolitre bir x lamby numune tamponunda tekrar askıya alarak hücreleri lys eder, süspansiyonu 95 santigrat derecede beş dakika inkübe ederek tüm proteinleri denatüre eder ve ardından tüm hücre lizatını buz üzerinde beş dakika soğutun. Birkaç transmembran segmentli proteinler gibi agregasyona eğilimli proteinlerin bolluğunu test etmek için, beş dakika boyunca 95 santigrat derece yerine 10 dakika boyunca 70 santigrat dereceden başlayarak optimal denatüre inkübasyonunu, sıcaklığı ve süreyi ampirik olarak belirler.

Son olarak, lizatı oda sıcaklığında bir dakika santrifüjleyerek çözünür fraksiyonu izole edin, snat taze bir tüpe aktarın ve çözünmeyen pelet fraksiyonunu atın. Çözünür fraksiyon artık doğrudan bir SDS sayfasına, jele yüklenebilir veya maya büyümesine dayalı bir protein bozunma testi oluşturmak için negatif 20 santigrat derecede saklanabilir. Kararsız bir üçlü füzyon proteini, aynı metabolik genden yoksun maya suşu arka planını tamamlayan ek bir metabolik enzim ile kaynaştırılır.

Füzyon proteini mayada eksprese edildiğinde, endoplazmik retikulum zarında çorak bir translokasyon olayına eğilimlidir. Bu anormal translokasyon, metabolik enzim de dahil olmak üzere tüm proteinin ubikuitin aracılı bozunmasını tetikler ve böylece hücre çoğalmasını önler. Bununla birlikte, ubikitin ligazdan yoksun maya suşlarında, füzyon proteini, hücrelerin çoğalmasına izin veren ortalama translokasyonda bile bozulmaya karşı korunur.

Bu nedenle, ubikitin ligaz varlığında, hücrelerin içinde meydana gelen protein yıkımı ile maya hücrelerinin metabolit tükenmiş agar plakaları üzerinde çoğalmaması arasında bir yazışma vardır. Öte yandan, kusurlu veya eksik bir ubikitin ligaz hücresi proliferasyonu bağlamında, füzyon proteininin, arka plan veya sahte büyümeyi azaltmak ve bu testin sıkılığını artırmak için bozunmadan korunduğunu gösterir. Metabolik enzimin rekabetçi inhibitörleri, maya büyüme testinde gözlenen sonuçları doğrulamak için büyüme ortamına eklenebilir.

Füzyon proteini bozulmasının doğrudan kanıtı, bir western blot ile de tespit edilebilir. Ubikitin ligazın varlığında veya yokluğunda, füzyon proteini sırasıyla bozulacak veya yıkımdan korunacaktır. Bu prosedürlerin, ilgilenilen proteinin kararlı durum bolluğu hakkında en doğrudan rapor verdiğini hatırlamak önemlidir.

Bu prosedürler gerçekleştirildikten sonra, protein bozunma kinetiğini ve çalışma durumu protein seviyelerini arttırdığı tespit edilen mutasyonların varlığını doğrudan analiz etmek için nabız veya sikloheksimid takip analizleri yapılabilir.