Name: Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae'de protein parçalanmasının genetik gereksinimlerini belirlemek için büyüme tabanlı bir analiz yöntemi. Bu teknik, hücre biyolojisi ve biyokimya araştırmalarında protein stabilitesini hızlıca değerlendirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bir destekleyici ve coşkulu bir araştırma ortamı sağlamak için Rubenstein laboratuar mevcut ve eski üyeleri teşekkür ederiz. Biz protokol optimizasyonu konusunda yardım almak için Ryan T. Gibson teşekkür ederim. Biz maya suşları ve plazmidler Mark Hochstrasser (Yale Üniversitesi) ve Dieter Kurt (Universität Stuttgart) teşekkür ederim. Biz bu yazının netlik ve programı geliştirmeye yardım ettikleri için anonim yorumcular teşekkür ederiz. Bu çalışma SGW&#39;den Sigma Xi Ball State Üniversitesi bölümünden bir araştırma ödülü tarafından desteklenen, Ball State Üniversitesi Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri (R15 GM111713) EMR için, EMR bir Ball State Üniversitesi aspire araştırma ödülü ve fonlar Provost Ofisi ve Biyoloji Bölümü.

Protein Bozulması Arızalı Aday Mutantlarına tanımak 1. Maya Büyüme Deneyi <ol><li> Bir raportör metabolik enzim, çerçeve içinde, erimiş kararsız bir proteini kodlayan bir plasmid ile vahşi tip ve mutant maya hücreleri dönüştürmek. </li><li> Plazmid moleküllerini taşıyan hücreler için seçici olan sentetik tanımlı (SD) minimal ortam 5 ml transformantların inoküle. Döner, 30 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. </li><li> Her bir gece boyunca kültür, 600 nm&#39;de (OD600) &#39;deki optik yoğunluk ölçülür. NOT: Bir gece inkübe edildikten sonra, kültür içindeki hücreler, ya logaritmik veya sabit gelişme fazında olabilir, fakat en az bir OD 0.2 600 ulaşmış olmalıdır. Ampirik bir şekilde tespit gibi çok yavaş büyüyen maya cinsleri, hücrelerin daha fazla sayıda inkübasyon süresi daha uzun bir gece veya aşılama gerektirebilir. </li><li> Bir seyreltilmiş hücreleri ile başlayan, bir steril 96 oyuklu bir plaka içerisinde dönüştürülen maya hücrelerinin altı kat seri dilüsyonları hazırlanmasın, OD 0.2 600. 96 gözlü plaka içindeki farklı üst üste denenecek her biri maya transformant yerleştirin. <ol><li> Her bir transformant için, 200 ul nihai hacim içinde 0.2 OD 600 hücreleri sulandırmak için gerekli olan bir gece boyunca kültür hacmi hesaplamak. 200 ul hacmi getirmek için steril su içinde uygun miktarda Sütun 1&#39;de de karşılık gelen, gece boyunca bu kültür hacim. </li><li> Maya her satır için, Sütun 2, 3 ve 4 kuyulara steril su, 125 ul ilave edin. Not: ayrı paketlenmiş steril 96-yuvalı plakalar, steril kapaklar ile paketlenebilir. Kapaklar bu adımda dağıtılır, steril su için rezervuar olarak kullanılabilmektedir. Bu çok kanallı bir pipet ile belirli bir sütunda tüm oyuklara steril su eşzamanlı transferi sağlar. </li><li> Yukarı pipetleme ve bir çok kanallı pipet aşağı ilk sütuna (OD 0.2 600 seyreltilmiş maya) içeriğini karıştırın. </li><li> TransfBir çok kanallı pipet kullanarak sütun 2 Sütun 1 maya 25 ul, er. Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. Aktarım Sütun 3 Sütun 2 25 ul ve sütun 3 den Sütun 4 25 ul (her adımda iyi karıştırma). </li></ol></li><li> Bir çok kanallı pipet ile her bir örnek karıştırın. En seyreltilmiş hareketle en uygun seçici ortamı içeren iki plakalar üzerine maya, pipet, her numunenin 4 ul sütunları sulandırmak için. Plazmid seçimi (bu plaka maya lekelenme ve büyüme kontrolü olarak hizmet vermektedir) korur ortamı ile bir tabak kullanın. Raportör enzime bağlı kararsız protein plazmid muhafaza ve ekspresyonu için seçim ortamı ile bir ikinci plaka kullanın. Maya hızla yerleşmek için, düzenli aralıklarla yukarı pipetleme ve aşağı hücreleri karıştırın. Not: Kurutucu plakalar daha kolay bir şekilde taze hazırlanmış plakalar daha sıvı absorbe edecek ve bu nedenle, bu deneyler için tavsiye edilir. Nemli plakalar lo oda sıcaklığında kuluçkalama ile kurutulabilirbir laminar akış başlığı içinde 2 gün ya da daha kısa bir inkubasyon - 1 ağırlık nem. Laminar hava akımı tezgah paralel ise Tabaklar dengesiz kuruyabilir. Bir şablonun kullanımı kolay düzenli mesafelerde maya hücreleri görmenizi sağlar. İki örnek şablonlar, Şekil 1 &#39;de verilmiştir. Bu, baskılı üzerinden kesilir ve bir Petri kabı, kapağın iç tarafında olabilir. </li><li> Plakalar tezgah üstünde kurumaya bırakın. </li><li> 6 gün - 2, 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, her plaka fotoğraf. </li></ol><img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" /> 100 mm agar plakaları üzerine maya hücreleri tespit için Şekil 1 şablonlar. Bu şablonlar, çok kanallı bir pipet ile düzenli aralıklarda maya tespit kolaylaştırmak için kullanılabilir. Şablonlar, baskılı kesip, ve bir Petri kabı kapağının içine yapıştırılmış olabilir. Büyüme ile Petri kabı yerleştirinşablon orta kapağının iç kısmına yapıştırılmıştır. Şablonlar yönünü izlemek için bir çentik ile işaretlenmiştir. Bu büyüme deneylerinde kullanılan plakalar Benzer yönünü izlemek için bir çentik ile işaretlenmiş olması tavsiye edilir. Dört (A) veya beş (B) maya hücrelerinin seri seyreltme sağlanır tespit için şablonlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52428/150126 Fig 1.pdf" target="_blank">100 mm şablonları ile bu rakamın bir yazdırılabilir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Maya Büyüme Testi 2. Biyokimyasal Onayı <ol><li> Maya Hücreleri ve Post-Alkali Protein Ekstraksiyon Büyüme (31 değiştirilmiş) <ol><li> Kararsız bir proteini kodlayan bir plasmid ile vahşi tip ve mutant maya hücreleri dönüştürmek. </li><li> Plazmid moleküllerini taşıyan hücreler için seçici olan SD ortamı 5 ml transformantların inoküle. Döner, 30 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. </li><li> Her gecede cu OD 600 ölçünlture. NOT: Bir gece inkübe edildikten sonra hücreler, ya logaritmik veya sabit gelişme fazında olabilir, fakat 0.2 10 ml taze seçici ortam (aşama 2.1.4) OD 600 seyreltme izin verecek bir OD 600 ulaşmış olmalıdır. Ampirik bir şekilde tespit gibi çok yavaş büyüyen maya cinsleri, hücrelerin daha fazla sayıda inkübasyon süresi daha uzun bir gece veya aşılama gerektirebilir. </li><li> 0.2 10 ml taze seçici ortam içinde, bir OD 600 maya hücreleri seyreltin. </li><li> Kültürler (orta-logaritmik büyüme olan yani) 0.8 ve 1.2 arasında bir OD 600 ulaşıncaya kadar, döner veya çalkalama, 30 ° C&#39;de kuluçkalayın devam edin. Not: İlgili kararsız proteini, bir düzenlenebilir promoterin kontrolü altında ise, protein ifadesi ve hücre hasat indüksiyonu için en uygun zamanlama önceki çalışmalarda ya da deneysel gözlemlere göre değişebilir. </li><li> 15-ml&#39;lik konik kültür 2.5 OD 600 birimleri toplayınOda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5000 x g&#39;de santrifüj ile ark tüpü. Pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı. Not: 600 birim 1.0 OD 600 kültürün 1 ml maya mevcut miktarı olarak tanımlanır bir OD. V = 2.5 OD 600 birim / Ölçülen OD 600: 2.5 OD 600 birim (V) hasat için gereklidir (ml) kültür hacmi, aşağıdaki denklem kullanılarak belirlenebilir </li><li> 1 ml tekrar süspansiyon hücreleri distile su. Bir mikrosantrifüj tüp askıya hücreleri aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 6500 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. Pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı. </li><li> 100 ul süspanse hücreleri aşağı veya yukarı vorteksleme pipetleme tarafından damıtılmış su ve 100 ul 0.2 M NaOH ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 18.000 x santrifüj (henüz proteinleri serbest ve hala canlı olan değil çoğu) Pelet hücreleri5 dakika boyunca örn. Pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı. </li><li> Yukarı ve aşağı pipetleme veya vorteks ile, hücreleri lize olacak 100 ul 1x Laemmli numune tamponu, - 50 süspanse pelet. Not: santrifüj ve Laemmli numune tampon maddesi içinde hücrelerin daha sonra yeniden süspansiyonu aşağıdaki alkali yüzer uzaklaştırılması bir Tris-glisin çalışan tamponu sistemi ve Batı lekeleme ile sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile uyumlu bir pH&#39;da proteinleri ayıklar. </li><li> Tam proteinleri denatüre etmek için 5 dakika boyunca 95 ° C &#39;de lizatları inkübe edin. Not: 95 ° C de inkübe toplama eğilimli proteinler (çok sayıda zar-ötesi bölümler ile, örneğin proteinler) çözünmez hale gelebilir. Bu nedenle, Lizatlar daha düşük sıcaklıklarda inkübe edilmelidir (örneğin, 37 ° C - 70 ° C), 10 - 30 dakika sonra gibi ampirik proteinlerin analizi için, tespit edilmiştir. </li><li> 5 dakika buz üzerine koyarak serin lizatları. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 18,000 x g&#39;de santrifüjleyin lizatları çözünmeyen malzeme peletlendi. Önce, sonra Western blot analizi (kısım 2.2) SDS-PAGE ile süpernatant (çözünmüş ekstre protein), ayırın. Alternatif olarak, -20 ° C&#39;de mağaza lizatları. </li></ol></li><li> Örnek Western Blot Protokolü <ol><li> Bir SDS-PAGE jeli içinde lizatlarının ampirik bir biçimde tespit hacmi yükleyin. </li><li> Boya ön kadar 200 V jel çalıştırın jel alt ulaşmıştır. </li><li> 4 ° C&#39;de 90 dakika - 60 20 V ıslak transferi poliviniliden florür (PVDF) membrana jel proteinleri aktarın. </li><li> 4 ° C &#39;de bir gece boyunca, oda sıcaklığında 1 saat süre ile, sallanan ya Tris-tamponlu Tuzlu su (TBS) içinde% 5 yağsız süt içinde inkübe edilerek blok membran. </li><li> Çözüm engelleme Durusu. </li><li> Oda sıcaklığına 1 saat süre ile% 0.1 Tween-20 (TBS / T) ile TBS içinde% 1 yağsız süt içinde (ya da bunların epitop) başta ilgi konusu olan proteini için spesifik bir antikor ile membran inkübemperature, sallanan. </li><li> Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın. </li><li> Sallanan, oda sıcaklığında 1 saat süre ile TBS / T içinde% 1 yağsız süt uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor ile membran inkübe edin. Not: flüoroforlar ışığa duyarlı olduğu için, florofor konjuge antikor seyreltileri karanlıkta hazırlanmalıdır. Buna ek olarak, florofor-konjuge antikor varlığında membran inkübasyon ışık geçirmeyen kaplarda gerçekleşmelidir. Bu alüminyum folyo ile inkübasyon tepsiler sarılarak yapılabilir. </li><li> Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın. </li><li> Üretici tavsiyelerine göre, Li-Cor Odyssey CLX kullanarak membran ve Görüntü Studio yazılımı (veya benzer görüntüleme cihazları ve yazılım) görüntü elde. </li><li> Membran görüntüleme sonra, bir yük için spesifik bir primer antikor ile membran inkübesallanan, oda sıcaklığında 1 saat süre ile TBS / T içinde% 1 yağsız süt kontrol proteini ing. </li><li> Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın. </li><li> Sallanan, oda sıcaklığında 1 saat süre ile TBS / T içinde% 1 yağsız süt uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor ile membran inkübe edin. </li><li> Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın. </li><li> Üretici tavsiyelerine göre, Li-Cor Odyssey CLX kullanarak membran ve Görüntü Studio yazılımı (veya benzer görüntüleme cihazları ve yazılım) görüntü elde. </li></ol></li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada yer alan yöntem hızlı bir şekilde belirlenmesi ve maya hücrelerinde protein yıkımı genetik gereklerine biyokimyasal onay sağlar. Bu deneyler () (örn 41-44, taşıma, depolama ve maya hücreleri manipüle etmek için protokollerin maya biyoloji birkaç mükemmel değerlendirmeleri ve derlemeler organizmaya yeni müfettişler için mevcuttur) programı ve güç maya modeli ökaryotik organizma olarak vurgulayın. teknikler kolayca protein sınıflarının birçok degradasyonunu ve bolluk araştırmak için uygulanabili...

Seçici protein yıkımı ökaryotik yaşam için gerekli olduğunu ve değiştirilmiş protein yıkımı, çeşitli kanser tipleri, nörodejeneratif hastalıklar, kardiyovasküler hastalıklar ve sistik fibrozis 1-5 dahil olmak üzere tıbbi koşullar, bir dizi katkıda bulunur. seçici protein degradasyonunu katalize ubikitin-proteazom sistemi (UPS), bu koşullar 6-10 için gelişmekte olan bir tedavi edici hedeftir. Ubikitin ligaz kovalent proteinler 11 76-amino asit ubikitinin polimerleri takın. Poliübikütin zincirleri ile işaretlenmiş proteinler tanınan ve ~ 2.5 megadalton 26S ile 12 proteazom proteolizlenmiş edilir. Model ökaryotik organizma Saccharomyces cerevisiae (çiçek mayası) başlatılan çalışmalar ökaryotik hücrelerde protein yıkımı mekanizmaların açıklanması, temel olmuştur. UPS ilk gösterdi fizyolojik substrat MATα2 13 maya transkripsiyon represörü oldu, UPS 14 ve çok sayıda yüksek derecede korunmuş bileşenler ilk olarak tespit edilmiştir ya da (örneğin, 15-26), maya ile karakterize edilir. Bu çok yönlü ve genetik uysal model organizma yapılan Keşifler ubikuitin-aracılı bozulması korunmuş mekanizmaları önemli açılımlar sağlamaya devam etmesi muhtemeldir. Çoğu UPS yüzeylerde tanınması ve yıkımı birden proteinlerin uyumlu eylem gerektirir. Bu nedenle, belirli bir kararsız proteinin düzenlenmiş bozulmasını karakterize önemli bir gol proteoliz genetik gereksinimlerini belirlemektir. Memeli ya da maya hücrelerinde protein degradasyonunu izlenmesi için klasik yaklaşımları (örneğin, darbe kovalayıcı ve sikloheksimid kovalayıcı deneyler, 27), zahmetli ve zaman alıcı bir iştir. Yöntem bu tür protein degradasyonunu tespit etmek için çok hassas bir araç temin ederken, protein parçalanması ya da büyük ölçekli bir screeni hızlı analizi için uygun değildirProtein bozulmasını önlemek mutasyonlar için ng. Burada, kararsız proteinlerin bozunması için genetik gereklerine hızlı tespit edilmesi için bir maya gelişimi bazlı analiz sunulmuştur. Protein degradasyonunu, ilgi (ya da bozulma sinyali) kararsız bir protein analiz etmek için maya gelişimi dayalı yöntemde, belirli koşullar altında maya büyümesi için gerekli olan bir proteine, çerçeve içinde, birleştirilir. Sonuç ilgi kararsız proteinin protein yıkımı genetik gereksinimlerini belirlemek için güçlü bir araç olarak hizmet edebilir yapay substrat. Uygun bir şekilde, en sık kullanılan laboratuar maya cinsleri, özellikle amino asitler ya da azotlu bazların (örneğin, 20,28-30) biyosentezinde yer alan metabolik enzimleri kodlayan genlerdeki mutasyonların bir panel barındırır. Bu enzimler, sentez enzimleri katılmak dışsal olarak sağlanan metabolitlerin yokluğunda hücre proliferasyonu için gereklidir. Böylekararsız proteinlerin bozunması için büyüme bazlı muhabir bağlı oldukları bağlı oldukları gibi metabolik enzimler ve böylece işlev görebilir. proteolizini engellemek mutasyonlar bozunma raportör barındıran hücreleri seçilen şartlar altında büyümeye izin verir çünkü protein yıkımı için genetik olarak gerekli gördükleri kolaylıkla açıklanacaktır edilebilir. Bir büyüme avantajı, belirli bir mutasyon ve ilgilenilen protein bolluğu arttırır dolaylı bir göstergesidir. Ancak, doğrudan biyokimyasal analiz mutasyon oldukça dolaylı ya da suni nedenler yoluyla daha artmış protein düzeyleri ile büyümeyi izin onaylamak için gereklidir. Protein miktarı hakkında bir mutasyonun etkisi yapabilecek ve özellikle mutasyonu olmayan hücrelerde kararlı durum proteini düzeylerinin Western blot analizleri ile teyit edilebilir. Uygun bir biçimde maya proteinleri hızlı ve etkili bir ekstraksiyon (sodyum hidroksit ve numune tampon maddesi ile maya hücrelerinin sıralı inkübasyonu) için bir yöntem olupwestern blotting ile analiz için de 31 gösterilmektedir. Birlikte, bu deneyler, protein yıkımı aday düzenleyicilerinin hızlı belirlenmesini kolaylaştırmaktadır.

<table><tbody><tr><td>İstenen maya suşları, plazmitler, standart ortam ve tampon bileşenleri</td><td></td><td></td><td>İstenilen mutasyonlara sahip maya suşları araştırmacının laboratuvarında oluşturulabilir. Yabani tip maya ve çeşitli mutantlar da ticari olarak temin edilebilir (örneğin GE Healthcare'den). Füzyon proteinlerini kodlayan plazmitler, araştırmacının laboratuvarında üretilebilir.</td></tr><tr><td>3-amino-1 H -1,2,4-triazol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC264571000</td><td>His3 enziminin rekabetçi inhibitörü. His3 raportör yapılarını kullanarak büyüme testinin sıkılığını artırmak için ortama dahil edilebilir.</td></tr><tr><td>Endoglikosidaz H (Streptomyces plicatus)</td> <td>Roche</td><td>11088726001</td><td>proteinlerin N-glikosilasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir; 1x Laemmli numune tamponunda bulunan SDS ve beta-merkaptoetanol konsantrasyonları ile uyumludur.</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık borosilikat cam tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Çeşitli üreticilerden temin edilebilir</td></tr><tr><td>Sıcaklık ayarlı inkübatör (örn. Heratherm İnkübatör Modeli IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Çeşitli üreticilerden temin edilebilir</td></tr><tr><td>New Brunswick 18 mm tüpler için değiştirilebilir tambur (tüp silindiri)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>Maya hücrelerinin gece boyunca maya başlatıcı kültürlerini süspansiyonda tutmak için tüp silindiri önerilir. Daha büyük kültürleri süspansiyonda tutmak için bir platform çalkalayıcı veya tüp silindiri kullanılabilir.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Makaralı Tambur 120V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>Tüp silindiri ile kullanım için</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spektrofotometre</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Çeşitli üreticilerden temin edilebilir</td></tr><tr><td>Steril 96 oyuklu düz tabanlı mikrotest plakaları, ayrı ayrı sarılmış kapaklı</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td>Çeşitli üreticilerden temin edilebilir</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 & mu; l</td><td>Gilson</td><td>F14401</td><td>Çeşitli üreticilerden temin edilebilir &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &mu; l</td><td>Gilson</td><td>F14403</td><td>Tek kanallı ve çok kanallı pipetleyiciler protokolün çeşitli aşamalarında kullanılır. Çok kanallı pipetleyiciler pipetleme yükünü birkaç adımda azaltırken, tek kanallı pipetleyiciler tüm protokol boyunca kullanılabilir. Çeşitli üreticilerden temin edilebilir.</td></tr><tr><td>Santrifüj 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216</td><td>Ünite ile birlikte satılan rotor, 1.5 ve 2.0 ml mikrosantrifüj tüplerini tutar. Rotor, 15 ml ve 50 ml konik tüpleri tutan bir rotorla değiştirilebilir.</td></tr><tr><td>Plaka görüntüleme sistemi (örn. Jel Doc XR+ Sistemi)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8195</td><td>Plakaları görüntülemek için gelişmiş görüntüleme sistemleri, bilgisayar tarayıcıları ve kameralı telefonlar dahil olmak üzere çeşitli sistemler kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Sabit Açılı Rotor F-35-6-30, Santrifüj için Kapaklı ve Adaptörlü Model 5430/R, 15/50 ml Konik Tüpler, 6'lı</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15 ml serigrafi baskılı vidalı kapaklı tüp 17 x 20 mm konik, polipropilen</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Çeşitli üreticilerden temin edilebilir</td></tr><tr><td>1,5 ml esnek tüp, PCR temiz, Doğal mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Çeşitli üreticiler</td></tr><tr><td>Analog Dri-Banyo Isıtıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>Sıcak plakalı kaynar su banyosu, proteinleri denatüre etmek için de kullanılabilir</td></tr><tr><td>SDS-PAGE çalıştırma ve aktarma aparatları, güç kaynakları ve görüntüleme ekipmanları veya SDS-PAGE için karanlık odalar ve membrana</td><td></td><td></td> aktarım <td>Laboratuvara ve uygulamaya</td></tr> <tr><td>göre değişecektirWestern blot görüntüleme sistemi (örn Li-Cor Odyssey CLx tarayıcı ve Image Studio Yazılımı)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Laboratuvara ve uygulamaya göre değişir</td></tr><tr><td>EMD Millipore İmmobilon PVDF Transfer Membranları</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Laboratuvara ve uygulamaya göre değişir</td></tr><tr><td>Birincil antikorlar (örn. Fosfogliserat Kinaz (Pgk1) Monoklonal antikor, fare (klon 22C5D8))</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>459250</td><td>Laboratuvara ve uygulamaya göre değişir</td></tr><tr><td>İkincil antikorlar (örn. Alexa-Fluor 680 Tavşan Anti-Fare IgG (H+L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Laboratuvara ve uygulamaya göre değişiklik gösterir</td></tr></tbody></table>

büyüme-tabanlı belirlenmesi ve protein parçalanabilirliklerinin genetik talepler biyokimyasal onay<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Düzenlenmiş protein yıkımı hemen hemen her hücresel fonksiyon için çok önemlidir. Moleküler mekanizmaları ve ökaryotik protein yıkımı için genetik gereksinimleri hakkında bildiklerimizin çoğu başlangıçta Saccharomyces cerevisiae kurulmuştur. Protein yıkımı Klasik analizleri biyokimyasal darbe-kovalamaca ve sikloheksimid-kovalamaca metodolojileri yararlanmıştır. Bu teknikler, protein degradasyonunu gözlemlemek için duyarlı araçlar sağlarken, zahmetli, zaman alıcı ve düşük verimlilik bulunmaktadır. Bu yaklaşımlar, protein bozulmasını önlemek mutasyonlar için hızlı veya büyük ölçekli tarama için uygun değildir. Burada, protein parçalanması için genetik gereksinimleri kolay tanımlama için bir maya gelişimi tabanlı deney tarif edilecektir. Bu testte, özgül seçici koşullar altında büyüme için gerekli bir raportör enzim kararsız bir proteine ​​kaynaştırılır. Hücreler, endojen raportör enzim eksik olan fakat füzyon proteini sele altında büyüyebilir ifadeFüzyon proteini stabilize yalnızca ktif koşulları (örneğin, protein yıkımı uyuşmazlık olduğunda). Burada tarif edilen büyüme deneyinde, vahşi tipten ve bir füzyon proteinini kodlayan bir plazmid mutant maya hücreleri seri seyreltme seçici ve seçici olmayan ortam üzerine tespit edilir. Seçici koşullar altında büyüme, belirli bir mutasyon ile bozunma bozukluğu ile tutarlıdır. Artan protein bolluğu biyokimyasal teyit edilmelidir. Elektroforez ve Western blot için müsait bir biçimde maya proteinleri hızlı bir şekilde çıkarılması için bir yöntem olup, aynı zamanda gösterilmiştir. Biyokimyasal analizi için protein çıkarılması için basit bir protokol ile birlikte protein istikrarı için bir büyüme temelli okuma, protein parçalanması için genetik gereksinimleri hızlı belirlenmesini kolaylaştırır. Bu teknikler, kısa ömürlü bir çok protein degradasyonunu izlemek için adapte edilebilir. Verilen örnekte, histidin biyosentezi için gerekli olan His3 enzim kaynaştırıldıbu anormal endoplazmik retikulum translokon yürütmektedir sonra Deg1 için -Sec62. Deg1 -Sec62 bozulması için hedeflenmiştir. Deg1 -Sec62-HIS3 barındıran hücreler proteini kararlı hale geldiğinde, seçici koşullar altında büyüyebilir mümkün.

Bu yöntem göstermek için, His3 enzim modeli endoplazmik retikulum (ER) enzimi yüksek yoğunluklu lipoproteinlerde bozulması karboksi-terminaline kaynaştırılmış olduğu (ERAD) alt-tabaka, Deg1 -Sec62 (Şekil 2A) Deg1 -Sec62-HIS3 oluşturmak için (Şekil 3) . Deg1 -Sec62 translokon ile kalıcı, anormal bir ilişki aşağıdaki hedeflenen ERAD alt tabakalar yeni bir sınıfının kurucu elemanını temsil ER zar 32-34 arasında proteinlerin taşınması için esas olarak s...

Bu makale, protein bozunması için genetik gereksinimlerin belirlenmesi için maya büyümesine dayalı bir testi açıklamaktadır. Ayrıca, bozunma gereksinimlerini biyokimyasal olarak doğrulamak için batı lekelemeye uygun maya proteinlerinin hızlı bir şekilde ekstraksiyonu için bir yöntem gösterir. Bu teknikler, çeşitli proteinlerin bozunmasını izlemek için uyarlanabilir.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, Croce Visier'de kararsız bir proteinin bozunması için genetik gereksinimleri hızlı bir şekilde belirlemektir. Bu, belirli seçici koşullar altında büyüme için gerekli olan bir raportör enzimin, ilgilenilen kararsız bir proteine kaynaştırılmasıyla elde edilir. Daha sonra, her ikisi de füzyon proteinini eksprese eden vahşi tip veya mutant hücreler, seçici orta agar plakaları üzerinde kültürlenir.Kaplama testi, protein bolluğundaki farklılıkları biyokimyasal olarak doğrulamak için maya hücresi büyümesi temelinde protein stabilizasyonunun uygun bir göstergesini sağlarken, füzyon proteinini barındıran mutant hücrelerdeki tip, Western blot analizi için hızlı, verimsiz bir protein ekstraksiyon yöntemi ile parçalanır. Sonuçlar, bozunma için gerekli olan bir gende mutasyona sahip hücrelerde kararsız bir proteinin bolluğunun arttığını göstermektedir. Bunun tersi, bozunmaya yetkin vahşi tip suşlar için geçerlidir.Bu tekniğin nabız takibi ve Cycl heide kovalama analizleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, daha az emek yoğun ve zaman alıcı olması ve protein bozunması için genetik gereksinimlerin hızlı ve yüksek verimli bir şekilde belirlenmesine izin vermesidir. Bu yöntem, bir dizi kararsız protein için bozunma gereksinimleri hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca, transkripsiyon ve translasyon gibi gen ifadelerinin diğer yönlerinin düzenleyicilerini tanımlamak için de kullanılabilir.Prosedürleri göstermek Sheldon Watts ve Justin Crowder olacak. Laboratuvarımdaki öğrenciler: Tahlilden önce, kararsız bir protein ve metabolik raportör bir enzimden oluşan bir füzyon proteinini kodlayan bir plazmiti mutant bir maya suşuna dönüştürürler. Bir kontrol olarak protein bozunmasının düzenlenmesi ile ilgili genetik kusurlara sahip olduğundan şüphelenilen aynı plazmit, aynı zamanda vahşi tip bir maya suşuna dönüştürür.Transformatörleri, plazmit moleküllerini barındıran, hücreleri seçen beş mililitre minimal ortama aşılayın. Test tüpünü eğimli bir döndürücüye yerleştirin ve ertesi gün gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Gece boyunca kültürlerin optik yoğunluğunu ölçün, daha sonra her kültürü taze ortam ve steril ayrı 1.5 mililitre santrifüj tüpleri ile 0.2'lik bir OD 600'e seyrelterek tüm hücreler için hücre konsantrasyonunu eşitleyin.Ana tahlile başlamak için, önce 0.2'lik bir OD 600'den başlayarak, sonraki seyreltmelere hazırlık olarak steril 96 oyuklu bir plakanın ilk sütunundaki belirlenmiş kuyucuklara başlayarak, önceden seyreltilmiş her bir suşun 200 mikrolitresini aktararak altı katlı bir seyreltme serisi matrisi oluşturun, ikinci sütundaki boş kuyucuklara 125 mikrolitre steril su eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın, üç ve dört. Daha sonra, 25 mikrolitre mayayı birinci sütundan ikinci sütuna aktarın, hücreleri eşit şekilde karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve 25 mikrolitre hücreyi ikinci sütundan üçüncü sütuna aktarmaya devam edin. Dördüncü sütundaki oyuklar, hücre lekelenmesi için görsel bir yardımcı olarak iyice karışana kadar seri seyreltme adımlarını tekrarlayın.Bir ızgara şablonu yazdırın ve seri seyreltme matrisindeki en az konsantre sütundan başlayarak bir Petri kabı kapağının içine bantlayın. Her sütundan dört mikrolitre hücre aktarın. 96 oyuklu plaka üzerinde, hücre içi plazmit bakımını seçen bir kontrol minimal orta agar plakası üzerine, her sütundan dört mikrolitre hücre daha yerleştirin, her iki hücre içi plazmidi seçen ayrı, minimal orta agar plakasına yerleştirin.Kararsız füzyon proteininin bakımı ve ekspresyonu. Her iki plakanın da tezgahta beş ila 10 dakika kurumasına izin verin. Dehidrasyonu önlemek için kapakları param ile kapatın ve hücreleri iki ila altı gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.En hızlı büyüyen kültürden elde edilen koloniler, belirli bir plaka üzerindeki en seyreltik noktada ilk kez görünür hale geldiğinde, plakayı inkübatörden çıkarın ve büyümenin derecesini belgeleyin. Fotoğraf çekerek, farklı günlerde farklı plakaların veya aynı plakanın birden fazla günde fotoğrafını çekmek gerekebilir. Çok çeşitli büyüme oranları sergileyen farklı maya suşları söz konusu olduğunda, büyüme tahlilinde tanımlanan bir genin protein bolluğunu düzenlediği biyokimyasal olarak doğrulanmıştır, yabani tip ve mutant maya suşlarını yukarıda belirtilen füzyon proteinini kodlayan bir plazmit ile dönüştürerek başlar, dönüştürücüleri hücre içi plazmit bakımı için seçen beş mililitre minimal ortamda aşılayın ve tüpleri gece boyunca 30 santigrat derece eğimli bir döndürücüde inkübe edin.Ertesi gün, optik yoğunluğu her gece boyunca 600'de ölçün. Tüm suşlar 0.4 veya daha yüksek bir OD 600'e ulaştığında, tüm kültürleri, her bir suş için nihai hacim 10 mililitre olacak şekilde taze ortamla 0.2'ye kadar seyreltin. Hücreleri, tüm kültürler 0.8 ile 1.2 arasında bir orta log faz büyümesi OD 600'e ulaşana kadar 30 santigrat derecelik bir platform çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.Toplam 2,5 OD birimi hücreyi 15 mililitrelik taze bir konik tüpe aktararak bir hücreyi hasat edin. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleyin ve S süpernatantını çıkarın. Ardından, damağı yeniden süspanse etmek için bir mililitre damıtılmış su girdabı veya pipet ekleyin ve hücre süspansiyonunu 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.Hücreleri ikinci santrifüjleme ile 30 saniye boyunca izole edin Oda sıcaklığında, snat'ı çıkarın ve hücreleri 100 mikrolitre damıtılmış suda tekrar süspanse edin. Hücre süspansiyonuna 100 mikrolitre 0.2 molar sodyum hidroksit ekleyin, erken hücresel parçalanmayı önlemek için numuneleri karıştırmak ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe etmek için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücreleri girdap haline getirmeyin.Hücreleri 30 saniye boyunca üçüncü bir santrifüjleme ile tekrar izole edin. Oda sıcaklığında, süpernatanları hücrelerden çıkarın ve peleti 50 ila 100 mikrolitre bir x lamby numune tamponunda tekrar askıya alarak hücreleri lys eder, süspansiyonu 95 santigrat derecede beş dakika inkübe ederek tüm proteinleri denatüre eder ve ardından tüm hücre lizatını buz üzerinde beş dakika soğutun. Birkaç transmembran segmentli proteinler gibi agregasyona eğilimli proteinlerin bolluğunu test etmek için, beş dakika boyunca 95 santigrat derece yerine 10 dakika boyunca 70 santigrat dereceden başlayarak optimal denatüre inkübasyonunu, sıcaklığı ve süreyi ampirik olarak belirler.Son olarak, lizatı oda sıcaklığında bir dakika santrifüjleyerek çözünür fraksiyonu izole edin, snat taze bir tüpe aktarın ve çözünmeyen pelet fraksiyonunu atın. Çözünür fraksiyon artık doğrudan bir SDS sayfasına, jele yüklenebilir veya maya büyümesine dayalı bir protein bozunma testi oluşturmak için negatif 20 santigrat derecede saklanabilir. Kararsız bir üçlü füzyon proteini, aynı metabolik genden yoksun maya suşu arka planını tamamlayan ek bir metabolik enzim ile kaynaştırılır.Füzyon proteini mayada eksprese edildiğinde, endoplazmik retikulum zarında çorak bir translokasyon olayına eğilimlidir. Bu anormal translokasyon, metabolik enzim de dahil olmak üzere tüm proteinin ubikuitin aracılı bozunmasını tetikler ve böylece hücre çoğalmasını önler. Bununla birlikte, ubikitin ligazdan yoksun maya suşlarında, füzyon proteini, hücrelerin çoğalmasına izin veren ortalama translokasyonda bile bozulmaya karşı korunur.Bu nedenle, ubikitin ligaz varlığında, hücrelerin içinde meydana gelen protein yıkımı ile maya hücrelerinin metabolit tükenmiş agar plakaları üzerinde çoğalmaması arasında bir yazışma vardır. Öte yandan, kusurlu veya eksik bir ubikitin ligaz hücresi proliferasyonu bağlamında, füzyon proteininin, arka plan veya sahte büyümeyi azaltmak ve bu testin sıkılığını artırmak için bozunmadan korunduğunu gösterir. Metabolik enzimin rekabetçi inhibitörleri, maya büyüme testinde gözlenen sonuçları doğrulamak için büyüme ortamına eklenebilir.Füzyon proteini bozulmasının doğrudan kanıtı, bir western blot ile de tespit edilebilir. Ubikitin ligazın varlığında veya yokluğunda, füzyon proteini sırasıyla bozulacak veya yıkımdan korunacaktır. Bu prosedürlerin, ilgilenilen proteinin kararlı durum bolluğu hakkında en doğrudan rapor verdiğini hatırlamak önemlidir.Bu prosedürler gerçekleştirildikten sonra, protein bozunma kinetiğini ve çalışma durumu protein seviyelerini arttırdığı tespit edilen mutasyonların varlığını doğrudan analiz etmek için nabız veya sikloheksimid takip analizleri yapılabilir.

growth-based-determination-biochemical-confirmation-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Gen silme ve protein aşırı ekspresyonu proteinlerin işlevleri çalışmak için sık kullanılan yöntemlerdir. Bu makalede, bir nüfus protein konsantrasyonu fonksiyonu ve tek hücreli düzeylerde fenotip gelişimi analiz için bir...

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Bu makalede, araştırmak için bir ateş böceği lusiferaz-GFP füzyon proteini tanımının kullanımını tarif...

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Burada, ubikitin-proteazom sistemi tarafından nispi proteoliz oranını ölçmek için sağlam bir biyolojik testi açıklıyoruz. Tahlil okuması, temel bir metabolik belirteçle kaynaşmış bir bozunma sinyali içeren bir raportör proteinin hücresel seviyelerine bağlı olan sıvı kültürdeki maya büyüme hızıdır.

Protein Parçalanabilirliklerinin Sistematik Analizi muhabiri tabanlı Büyüme Deneyi

Burada, tomurcuklanan mayadaki kimyasal-genetik etkileşimleri tanımlamak için uygun maliyetli bir yöntem sunuyoruz. Yaklaşım, maya moleküler biyolojisindeki temel teknikler üzerine inşa edilmiştir ve küçük ila orta ölçekli kimyasal koleksiyonlarının ve diğer ortam ortamlarının mekanik sorgulaması için çok uygundur.

Kimyasal Genetik Etkileşimleri Hızlı Kimlik<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae'de yönlendirilmiş evrim kampanyaları için mutant kütüphaneler oluşturmak ve taramak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Protein bolluğu hem protein sentezi hem de protein yıkım oranlarını yansıtır. Bu makale, tek hücreli ökaryot, Saccharomyces cerevisiae (tomurcuklanan maya) modelinde protein bozulmasını analiz etmek için sikloheksimid kovalamacasının ve ardından western blotlamanın kullanımını açıklamaktadır.

Protein Bozulması ve Siklohekzimid Chase Analizi<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Bu iletişim kuralı işlevsel olarak protein bazlı miras S. cerevisiaeiçin ekran için bir yüksek-den geçerek metodoloji açıklar.

S. cerevisiae Protein bazlı miras için yüksek üretilen iş tarama

Bu çalışma, Schizosaccharomyces pombe'de çok kopyalı baskılayıcı genetik ekran için bir protokolü açıklamaktadır. Bu ekran, bir sorgu mutant suşu ile ilişkili bir fonksiyon kaybı fenotipinin baskılayıcı klonlarını tanımlamak için genom çapında bir plazmid kütüphanesi kullanır. Bu ekran kullanılarak ell1 null mutantının yeni genetik baskılayıcıları tanımlandı.

Şizosakkaromices pombe'de Multicopy Suppressorların Tanımlanması için Genetik Ekran

Fisyon mayası burada, polimerizasyonlarını görselleştirmek için GFP ile translasyonel füzyon proteinleri olarak FtsZ ve MreB gibi bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini eksprese etmek için heterolog bir konakçı olarak kullanılır. Ayrıca, polimerizasyonu etkileyen bileşikler, bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntüleme ile tanımlanır.

Bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini hedef alan antibakteriyel ilaç taramaları için bir platform olarak fisyon mayası

Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae'de protein parçalanmasının genetik gereksinimlerini belirlemek için büyüme tabanlı bir analiz yöntemi. Bu teknik, hücre biyolojisi ve biyokimya araştırmalarında protein stabilitesini hızlıca değerlendirmeyi sağlar.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay

Daha fazla video keşfet