Name: Makrofaj Kolesterol tükenmesi ve Fagositoz Üzerine Etkisi Cryptococcus neoformans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Öğrenin, Cryptococcus neoformans enfeksiyonlarında makrofaj kolesterol tükenmesinin fagositoz üzerindeki etkisini in vitro incelemek için kullanılan yöntemi. Bu protokol, fungal patogenez ve konak-patojen etkileşimleri alanında önemli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibe MDP için AI56168, AI71142, AI87541 ve AI100631 tarafından desteklenmiştir. Maurizio Del Poeta Enfeksiyon Hastalıkları Burroughs Wellcome Araştırmacı olduğunu.

MβCD ile J774A.1 Hücreleri 1. Kolesterol tükenmesi <ol><li> Steril bir biyo-güvenlik kabini, tohum 10 5 J774A.1 makrofaj-benzeri hücreler, göz başına,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde 200 ul% 1, 96-iyi hücre kültür plakası üzerine penisilin / streptomisin (P / S). 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve% 5 CO2 O / N. </li><li> Hücre mono tabakasının ortamı çıkarın ve süzüldü otoklave edilmiş 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iki kez yıkama hücreleri. </li><li> Bir kontrol olarak, istenen konsantrasyonda (10, PBS içinde mM ya da 30 nM) ya da 1x PBS&#39;den MβCD çözeltisi 200 ul ilave edin ve çalkalanarak 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. Hemen prosedürü izleyerek piyasada mevcut kiti ile kantitatif analiz için oda sıcaklığında yüzer ve rezerv çıkarın. </li><li> 1x PBS veya serum ücretsiz DMEM ile hücreler 2-3 kez yıkayın ve pipetti tarafından enfeksiyon veya lize hücreleri ile devamince tabaka kromatografisi ile ya da bir kit ile analiz için deiyonize H2O ile 2-3 kez ng. NOT: Bir piyasada mevcut kolesterol ölçümü kiti kullanılabilir kolesterol tükenmesi sonrasında. Ayrıntılar için malzeme bölümüne bakın. Yazılı olarak üreticinin talimatlarını izleyin. </li></ol> İnce Tabaka Kromatografisi ile kolesterol içeriğinin 2. Gözlem (TLC), <ol><li> Petrol eter çözeltisi ile, iki kez aseton ile ve bir kez bir TLC tankı yıkayın: dietil eter: asetik asit (65: 30: 1 hacım bazında). (Hacme göre 1 65: 30) solüsyonu ve / N O bırakmak asetik asit: dietil eter: petrol eteri ile tankı Doymuş. Not: Organik çözücü, her zaman Buhar, önlemek için bir davlumbaz altında kullanılmalıdır. Eldiven ve laboratuvar önlüğü her zaman giyilmelidir. Asetik asit güçlü bir asittir ve dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır. </li><li> 6-çukurlu ce üzerinde oyuk başına steril biyo-güvenlik kabini, tohum 10 6 J774A.1 makrofaj benzeri hücre% 10 FBS ve% 1 P / S ilave edilmiş, sıcak DMEM, 5 ml lik bir hacim içinde ll kültür plakası. % 5, 37 ° C&#39;de inkübe CO2 göre O / N. </li><li> 1.4 büyük kuyu boyutu hesaba uygulanan 200 ul için 1 ml ikame - adımları 1.2 izleyerek kolesterol makrofajlar tüketmek. </li><li> Her bir oyuğa Tripsin-EDTA, 500 ul ekle 37 ° C &#39;de 3 dakika süre ile inkübe edilir ve yavaşça bir hücre kazıyıcı ile hücrelerin kazıyın. </li><li> Bir mikrofüj tüpü içine transferi ve% 10 FBS ve% 1 P / S ilave edilmiş, sıcak DMEM ek bir 500 ul ilave edin. </li><li> 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca hücreleri Spin ve süpernatant kaldırmak. </li><li> Hücre pelet% 10 FBS ve% 1 P / S ile takviye sıcak DMEM ek 500 ul ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleme dikkatlice tekrar süspansiyon. </li><li> Hücrelerin 10 ul çıkarın ve bir hemasitometre hücreleri saymak. Her bir örnek hücre konsantrasyonları normalize ve cam tüplere hücrelerin eşit sayısı ekleyin. NOT: Bu aşamada, bir mayısBir daha konsantre son lipid özü elde etmek için aynı tedavi grupları hücreleri birleştirmek için seçin. </li><li> Santrifüj hücreleri ortam oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de çıkarın. </li><li> Metanol ve vorteks 2 ml ekleyin. Daha sonra, kloroform ve girdap 1 ml. Monofazik emin çözüm yapmak için faz durumunu kontrol edin. Not: tüpler 4 ° de CO / N saklanabilir. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1700 x g&#39;de santrifüj ve yeni bir tüpe süpernatantı aktarın </li><li> DH 2 O, 1 ml, ardından kloroform ilave edilmiş, 1 ml ilave edilir Iki kez 30 saniye vorteksleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1700 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Hassas bir denge üzerinde bir cam tüp tartılır ve ağırlığı bilinen cam tüp içine alt faz aktarmak için bir cam Pasteur pipet kullanın. </li><li> Kuru (yaklaşık 2 saat) kadar bir santrifüj buharlaştırıcı içinde lipitleri kurutun. Kurutuldu lipidler ile tüp tartılır ve kuru lipit ağırlığı hesaplamak. Not: Kuru lipid TLC gerçekleştirmek için hazır olana kadar, -20 ° C de muhafaza edilebilir. </li><li> (- 50 ul genelde 20) ve bir silis TLC plakası üzerindeki seyreltilmiş lipid yükü 20 ul lipid konsantrasyonunun normalleştirmek için yeterli kloroform içinde tutularak kurutulmuş lipitlerin seyreltin. Yük 20, bir standart olarak kloroform 20 ul seyreltilmiş kolesterol ug. </li><li> Doymuş TLC tankına kurutulmuş TLC plakası ekleyin ve plaka kenar önce 1 cm kadar göç solvent sağlar. Tanktan TLC plakasını çıkarın ve yaklaşık 5 dakika kurumasını bekleyin. </li><li> Göçü kontrol etmek için bir iyodin buhar tankında yerleştirerek lipit görselleştirmek. Çıkarın ve lekeler yaklaşık 10 solmaya izin - kaputun altında 15 dakika. NOT: İyot bir inhalasyon tehlikesi. Her bir davlumbaz altında kullanın. </li><li> Deiyonize H2O 60 ml, sülfürik asit, 4 ml ve mangan klorür 630 mg 60 ml metanol un birleştirilmesi ile nötral bir lipid boyama için bir çözelti hazırlayın. </li><li> Dikkatle ve yavaş yavaş bir tepsiye nötral lipid boyama çözeltisi içine TLC plakası daldırma ve silis l kapalı sloughing olmadan kaldırmakAyer. Not: nötral lipid boyama çözeltisi bir kaç kez tekrar edilebilir ve bu tepsinin alınabilir ve daha sonraki kullanım için bir şişe içinde geri bırakılır. </li><li> Tüm kabarcıklar kaybolana kadar plaka oda sıcaklığında kaputun altında kurumaya bırakın. Istenilen renkte bir ısıtma bloğu 160 ° C&#39;ye set ve karakter üzerinde TLC plakası ısıtın. NOT: Böyle Vizyon İşleri LS gibi bir dansitometri programı lipit örnekleri karşılaştırmak için kömürleşmiş bantları ölçmek için kullanılabilir. </li></ol> C ile Makrofagların 3. Enfeksiyon neoformans (H99) <ol><li> Steril bir biyo-güvenlik kabininde, DMEM 200 ul, 96 gözlü bir hücre kültürü plakasında tane 10 5 makrofaj-benzeri hücreler,% 10 FBS ve% 1 P / S ile takviye edilmiştir. 37 ° C,% 5 CO2,% 5 CO2 göre O / N inkübe edin. Not: Enfeksiyon cam yapılabilir kolay görüntüleme için konfokal yemekler dipli; Tüm tutarlar aynı kalır. </li><li> C&#39;lik bir kültür büyütün neoformans (H99)Çakılmış plaka elde edilen bir koloni ile YNB 10 ml aşılama ve çalkalanarak 30 ° C&#39;de g / Ç N inkübe edilerek. </li><li> Yıkayın ve C sayısı neoformans (H99) hücreleri. <ol><li> Santrifüj C. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1,700 x g hızında neoformans O / N kültürü. </li><li> Ortamı çıkarın ve atın. 1x PBS, 5 ml hücreleri yıkayın. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1700 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> PBS çıkarın ve süzüldü 1x 5 ml PBS ile yıkayın. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1700 x g&#39;de santrifüjleyin. Bu adımı 2 kez daha tekrarlayın. </li><li> PBS çıkarın ve 1 x PBS, 5 ml olarak yeniden süspanse edin. </li><li> Yıkandı, kültür: 500 oranında seyreltilmiş PBS&#39;de bir seri seyreltme, 1 elde etmek üzere olun. <ol><li> 1:10 seyreltme elde etmek için 1x PBS 900 ul orijinal numune 100 ul ekle. </li><li> 100 seyreltme: 1 elde etmek için 1x PBS 900 ul 1:10 seyreltilmiş numune, 100 ul ekle. </li><li> 500 diluti bir 1: elde etmek için 1x PBS 800 ul seyreltilmiş örnek, 100: 1 200 ul ekleüzerinde </li></ol></li><li> 1 10 ul alın: 500 seyreltme ve hücrelerin sayısını hesaplamak için hemasitometre saymak. </li></ol></li><li> C makrofajlar aktive ve opsonizasyon için çalışma çözeltisi hazırlayın neoformans. <ol><li> 990 ul 10 ul ekleyerek stok çözümleri LPS ve IFNy 100x seyreltin. Not: LPS IFNy fagositik alımını güçlendirmek üzere kullanılır ancak fagositosis için gerekli değildir. Makrofaj fungisit aktivite, bir ilgi ise, enfeksiyondan önce çalkalama ile 37 ° C&#39;de etkinleştirme O / N gerçekleştirin. </li><li> Numune başına seyreltilmiş LPS 7.5 ul, seyreltilmiş IFNy 1.25 ul, GXM antikor 1.25 ul ve C hacmini birleştirmek 1.25 x 10 5 hücre verir neoformans kültürü. % 10 FBS ve% 1 P / S ile desteklenmiş DMEM ile numune sayısı ile çarpılır 250 ul kadar hacmi getirin. </li><li> Vorteks ve çalkalanarak 37 ° C&#39;de 20 dakika boyunca çözelti inkübe edin. NOT:Opsonizasyon adım ile eş zamanlı olarak yapılabilir - Kolesterol tükenmesi (1.4 1.2 adımları). Opsonize edilmiş hücreler optimum adım 3.4.3 inkübasyon aşağıdaki 20 dakika daha uzun kullanılması gerektiğini gibi, çalışma çözümü birleştirerek önce makrofajlar tedavi emin olun. </li></ol></li><li> Makrofajları enfekte <ol><li> Yıkama makrofajlar iki kez serum serbest DMEM ile ve opsonize C 200 ul ekleyin neoformans her iyi çözüm çalışıyor. </li><li> 37 ° C&#39;de 2 saat süreyle inkübe edin. </li></ol></li><li> Düzeltme ve Leke Hücreler <ol><li> Ortamı çıkarın ve DMEM ile hücreler 2 kez yıkayın. </li><li> Hava, 10 dakika boyunca, hücre tekli tabakası kuru ve hücreleri düzeltmek için buz gibi soğuk metanol 200 ul ilave edin. </li><li> 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin ve kalan metanolü uzaklaştırmak. </li><li> 10x Giemsa 200 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. </li><li> Kapalı kapaklı iyonu giderilmiş su ve kuru O / N ile 3 kez 2 - yıkayın. NOT: Görüntüleme haftada followi ertesi gün yapılması veya yukarı olabilirng boyama. </li></ol></li><li> Görselleştirmek ve Kont <ol><li> Bir mikroskop (oyuk başına 150 sayısı, aynı tedavi 2 varsa) veri alanına 300 hücrelerin sayısı ve saran, Cryptococcus hücrelerinin enfekte olmuş makrofaj sayısı ve sayısı not edin. NOT: durumun başına veri noktası kullanım başına 2 tabak örnekleme bile emin plaka başına 3 örtüşmeyen alanları seçmek ve alan başına 50 hücreleri saymak için. </li><li> C ortalama sayısına göre enfekte makrofajlar yüzdesini çarpılarak fagositik indeksi hesaplamak makrofaj başına neoformans. 1x PBS yüzde kontrolünü ele gibi değerleri ifade ederek fagositik indeksi Normale. Birkaç denemeden sonra ortalama değeri ve fagositik indeksi eğilimleri belirlemek için ortalama standart sapmayı hesaplamak. Önemini belirlemek için Student t-testi kullanın. </li><li> 1,000X veya 400X büyütmede hücrelerin mikrograflanm alın. </li></ol></li></ol> 4. Tripan Mavisi Deneyi <ol><li> Steril bir biyo-güvenlik kabini, tohum 10 6, makrofaj-benzeri hücreler, göz başına bir hacimde bir 6-yuvalı hücre kültürü plakasının üzerindeki 5% 10 fetal büyükbaş hayvan serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco minimal esas ortamı (DMEM) içinde mi . % 5, 37 ° C&#39;de inkübe CO2 göre O / N. </li><li> Daha büyük kuyu boyutu hesaba uygulanan 200 ul için 2 ml ikame 1.4 - 1.2 adımları takip ederek kolesterol makrofajlar tüketmek. NOT: 1x PBS yanı sıra herhangi bir tedavi öncesinde kazınarak bir kumanda ile tedavi edilen bir kontrolü de emin olun. </li><li> Iyi her 1x PBS 500 ul ekleyin ve hafifçe bir hücre kazıyıcı ile hücreler kazıyın. Bir mikrofuge&#39;de tüp içine aktarın ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri askıya. </li><li> % 4 Tripan mavi 1 ul hücre ve leke, 10 ul çıkarın. </li><li> Bir hemasitometre hücre sayımı ve aşağıdaki denklem kullanılarak sağ kalabilirliğinin hesaplanması:% canlılığı = [1 - (Mavi hücre / toplam hücre)]Tedavi edilmeyen oldu kontrolü x 100 Normale değerleri. Birkaç denemeden sonra ortalama değeri ve canlılığı eğilimleri belirlemek için standart sapmayı hesaplar. Önemini belirlemek için Student t-testi kullanın. </li></ol>

<ol><li>Sarantis, H., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+phagocytosis+for+pathogen+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Subversion of phagocytosis for pathogen survival.</a> Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).</li>
<li>Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Membrane+Structures+During+Phagocytosis+And+Chemotaxis+Of+Macrophages%3A+Role+And+Regulation+Of+The+Actin+Cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).</li>
<li>Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+Of+Cryptococcal+Meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis.</a> Virulence. 3, 173(2012).</li>
<li>Abadi, J., Pirofski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Antibodies+Reactive+With+The+Cryptococcal+Capsular+Polysaccharide+Glucuronoxylomannan+Are+Present+In+Sera+From+Children+With+And+Without+Human+Immunodeficiency+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection.</a> The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).</li>
<li>Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+Of+Alveolar+Macrophages+Decreases+The+Dissemination+Of+A+Glucosylceramide-Deficient+Mutant+Of+Cryptococcus+Neoformans+In+Immunodeficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+And+Immunity%22%5BJournal%5D)">Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice.</a> Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).</li>
<li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococci+At+The+Brain+Gate%3A+Break+And+Enter+Or+Use+A+Trojan+Horse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse.</a> The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).</li>
<li>Chrétien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+Of+Cerebral+Cryptococcus+Neoformans+Infection+After+Fungemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia.</a> The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).</li>
<li>Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+Of+App1+As+A+Regulator+Of+Phagocytosis+And+Virulence+Of+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans.</a> The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).</li>
<li>Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+Roles+Of+Alveolar+Macrophages+In+The+Host+Response+To+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Infection+And+Chemotherapy%3A+Official+Journal+Of+The+Japan+Society+Of+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans.</a> Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>García-Rodas, R., Zaragoza, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+Me+If+You+Can%3A+Phagocytosis+And+Killing+Avoidance+By+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+And+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans.</a> FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).</li>
<li>Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intracellular+Life+Of+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Of+Pathology.+9%22%5BJournal%5D)">The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans.</a> Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).</li>
<li>Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+Of+Cellular+Cholesterol+Interferes+With+Intracellular+Trafficking+Of+Liposome-Encapsulated+Ovalbumin%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+And+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin.</a> Immunology And Cell Biology. 81, Doi. 415-423 (2003).</li>
<li>Sein, K. K., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prime+Role+Of+Plasma+Membrane+Cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22In+The+Pathogenesis+Of+Immune+Evasion+And+Clinical+Manifestations+Of+Falciparum+Malaria.+Medical+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol.</a> In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).</li>
<li>Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Is+Required+For+Leishmania+Donovani+Infection%3A+Implications+In+Leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+And+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis.</a> Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).</li>
<li>Tagliari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Microdomain+Components+Of+Histoplasma+Capsulatum+Yeast+Forms%2C+And+Their+Role+In%5BTitle%5D)+AND+%22Alveolar+Macrophage+Infectivity.+Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In.</a> Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).</li>
<li>Crane, J. M., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+Of+Cholesterol+In+The+Formation+And+Nature+Of+Lipid+Rafts+In+Planar+And+Spherical+Model+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes.</a> Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).</li>
<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+Of+Lipid+Rafts+In+Biological+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Of+Cell+And+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes.</a> Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).</li>
<li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Rafts+And+Signal+Transduction+Nature+Reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).</li>
<li>Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+Of+Cholesterol+Depletion+By+Cyclodextrin+On+The+Sphingolipid+Microdomains+Of+The+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane.</a> The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+Method+Of+Total+Lipid+Extraction+And+Purification%29%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+Of+Biochemistry+And+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification).</a> Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
<li>Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+To+Cryptococcus+Neoformans+Glucuronoxylomannan+Enhance+Antifungal+Activity+Of+Murine+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages.</a> Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).</li>
<li>Deshaw, M., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+To+The+Cryptococcus+Neoformans+Capsular+Glucuronoxylomannan+Are+Ubiquitous%5BTitle%5D)+AND+%22In+Serum+From+HIV%2B+And+HIV-+Individuals.+Clinical+And+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous.</a> In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).</li>
<li>Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea+Treatment+Inhibits+Proliferation+Of+Cryptococcus+Neoformans+In+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice.</a> Frontiers In Microbiology. 3, 187(2012).</li>
<li>Chaka, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+Of+Phagocytosis+And+Killing+Of+Cryptococcus+Neoformans+By+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+By+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokol ile çalışırken bu C memeli hücreleri kaplama ve opsonizasyon zaman doğru hücre sayılarını elde etmek önemlidir neoformans hücreleri. Bu çalışmalar arasındaki varyasyon en aza indirir ve doğru 1 sağlar: çalışma boyunca efektör oranı 1 hedef. Ayrıca prosedürler arasında oda sıcaklığında istirahat opsonize maya hücreleri ya da muamele edilmiş makrofaj hücreleri önlemek için kolesterol azaltımı ve enfeksiyon zamanlamasını koordine edecek tarzda önemlidir. Enfeksiyon başlamadan önce uzun bekleme...

Fagositoz hücre dışı kişiler konakçı hücreler tarafından olan bir süreçtir. Bu patojenlere karşı savunmak için bağışıklık sisteminin cephanelik önemli bir silahtır, ama süreç genellikle içselleştirme ve vücutta 1 yayılan sağlamak için patojenler tarafından yıkılabilir olabilir. Fagositoz konukçu hücrenin hücre iskeletinin yeniden düzenlemeler yoluyla bağlanması ve yutulma neden olan bazı sinyal olayları aracılık eder. &quot;Profesyonel&quot; fagositler bağlanması ve patojen yutmak ve phagosome 2 oluşturan lamellipodia oluşması için sinyal istilacı patojenin yüzeyinde opsonins ayırt eden ve bağlanan edebiliyoruz. Sözde &#39;profesyonel&#39; fagositler arasında makrofajlar. Makrofajlar çoğu, arayan ve hastalığa neden olan ajanlar ortadan kaldırarak, hasarlı dokuların onarımı ve inflamasyon aracılık dahil koruyucu fonksiyonlarını yürütmek son derece uzmanlaşmış hücrelerdirfagositoz 1,2 sürecinde bu. Cryptococcus neoformans cryptococcosis olarak bilinen ciddi bir hastalığa neden patojenik maya türüdür. Cryptococcus sporlar ev sahibi tarafından inhale ve genellikle asemptomatik bir akciğer enfeksiyonu neden vardır. Bu poz son derece yaygın olduğu düşünülmektedir; Ankete tüm bu kriptokok polisakkarit glucuronoxylomannan ve diğer çalışmalara antikor olduğunu Kliniği Bronx-Lübnan Hastanesi Merkezi&#39;nde bulunan Çocuk Enfeksiyon Hastalıkları 61 çocuklu bir örnek, hem insan immün yetmezlik virüsü (HIV) enfekte olmayan ve enfekte yetişkinlerin 3 prevalansı göstermiştir 4. Alveoler makrofajlar başarıyla net patojen akciğer enfeksiyonuna ve çoğu durumda yanıtın ilk satırı vardır. Ancak, bağışıklığı baskılanmış kişilerde (örneğin, HIV ve AIDS hastaları) maya makrofajlar içinde hayatta yapabiliyor. Bunlardadavalar, makrofajlar patojenin çoğalması için bir niş olarak hizmet verebilir ve hastalık ölümcül hale 5 santral sinir sistemi (MSS) onun yayılmasını kolaylaştırabilir - 8. 11 - Bu makrofajlar hatta &quot;Truva atı&quot; modeli 3,9 yoluyla kan beyin bariyerini geçmeye maya yardımcı meninkslerde doğrudan maya teslim düşünülmektedir. Böylece, bu fagositoz sürecini ve özellikle kriptokoksik enfeksiyonlarda, bunu etkileyen faktörleri anlamak önemlidir. 15 - Diğer patojen sistemlerinde Önceki çalışma fagositozu 12 oynamak için önemli bir role sahip olduğu kolesterol oluşturduğu kolesterol ve lipid sallar işaret. Kolesterol, memeli hücrelerde en fazla lipit türdür ve 25 ihtiva eder - memeli hücre zarı 16, 50%. Bu BIOP modüle bir rol oynadığı tespit edilmiştirrijiditelerini 17 değiştirerek zarların hysical özellikleri. Kolesterol ve sfingolipitler birlikte lipid sallarının olarak bilinen membran lipit mikro bölgelerini oluştururlar. 18 - lipid sallarının kaveolanın oluşumu, hem de 16 sinyal belirli tipleri için, izole edilmiş bir etki sağlayan ilgili olduğu tespit edilmiştir. Nedeniyle, küçük boyutları nedeniyle, in vivo olarak, lipid sallar çalışmak zordur. Lipid sallar rolünü incelemek için yararlı bir yolu, onların bileşenleri değiştirmek için. Metil-β-siklodekstrin (MβCD) memeli zarlarda kolesterol tüketen bulunmuştur ve yaygın olarak lipid sallarının 18 rolünü araştırmak için kullanılan bir bileşimdir. Bu protokol, konakçı hücre zarlarından kolesterol tüketen ve C fagosite konakçı hücrelerin yeteneği üzerindeki tükenmesi etkisinin belirlenmesi için bir yöntem sunmak in vitro neoformans. Bu prosedür, hücre kültürü techniq kullanırenfeksiyonu için bir model olarak hücre hattı (J774A.1) gibi ölümsüzleştirilmiş makrofaj üzerinde daah. Kolesterol tükenmesi sterol büyüklüğüne özel bir hidrofobik bir çekirdeğe sahiptir ve kolesterol zar 19 dışarı çekmek için bir havza olarak etki edebilir MβCD, maruz bırakılarak gerçekleştirilmiştir. Kolesterol tükenmesi kantitatif olarak ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılarak ve niteliksel olarak ince tabaka kromatografisi (TLC), daha sonra da 20 modifiye edilmiş bir Bligh-Dyer lipid ekstraksiyonu kullanılarak ölçülmüştür. . 23 - fagositoz makrofajları aktive edilmesi için, interferon-γ ve lipopolisakkarit bir kokteyl ile karıştırılır opsonize bir maya kültürünün hücre hattı enfekte ölçülmüştür Cryptococcus bir glucuronoxylomannan (GXM) antikor ya 21 ile opsonize edilmiştir. Boyama ve mikroskopi deneyleri fagositoz derecesini değerlendirmek için hücrelerin görselleştirme ve fagositik endeksinin hesaplanmasında izin verdi. Bu protokol d birlikte ele alındığındafizyolojik bir süreç ile, lipid bileşimin değiştirilmesini entegre temel bir metodu escribes.

<table><tbody><tr><td>Sınıf II tip A2 Biyogüvenlik Kabini</td><td>Labconco</td><td>3460009</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Donmuş Olarak Gelir. Kültür için ATCC talimatlarına bakın.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>4 &°C'de Mağaza; C ve 37 ° C'ye kadar sıcak; Kullanmadan önce C</td></tr><tr><td>HI Fetal Fetal Sığır Serumu Performance Plus</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td> -<td>20 ° C'de donmuş halde tutun; DMEM</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin'e (10.000 U/ml)</td> eklemeden önce C ve çözdürün: <td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>Isotemp Hücre kültürü inkübatörünü</td> desteklemek için kullanılır <td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3530</td></tr><tr><td>96 Kuyulu kültür kabı</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>10x Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Fisher Scientific BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Kullanmadan önce 1x'e seyreltin ve süzün veya otoklavlayın.</td></tr><tr><td>Metil-&beta;-siklodekstrin</td><td>Sigma Life Science</td><td>C4555-10G</td><td>10 mM ve 30 mM konsantrasyonlarında çözeltiler yapmak için 1x PBS'de çözün</td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı</td><td>Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex Kırmızı Kolesterol Testi Kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri Moleküler Problar</td><td>A12216</td><td>Kolesterol Testi için tüm reaktifler kitin içinde bulunur. Üretici talimatlarını izleyin.</td></tr><tr><td>96 Kuyulu Siyah Tahlil plakası</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>FilterMax mikroplaka okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>Model F5</td></tr><tr><td>TLC odası</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z126195-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498-4L</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-2L-R</td><td></td></tr><tr><td>TLC Kağıt</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>TLC tankı için gereken boyuta kadar kesin</td></tr><tr><td>Çeker ocak</td><td></td><td></td><td>AIHA/ANSI Standartlarına uygun herhangi bir çeker ocak</td></tr><tr><td>6 Kuyulu plaka</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sıyırıcı</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Model Alegra x-30R</td></tr><tr><td>Votex karıştırıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Denge</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Model # MS104S 0.1 mg'a kadar</td></tr> ölçüm <tr><td>Cam Pastör pipeti</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac yoğunlaştırıcı</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Model # SPD2010</td></tr><tr><td>Petrol eter</td><td>Fisher Scientific</td><td>E139-1</td><td></td></tr><tr><td>Dietil eter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>TLC Silika Jel 60, konsantrasyon bölgesi ile</td><td>Analitik Kromatografi Millipore</td><td>1.11845.0001</td><td></td></tr><tr><td>İyot cipsleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>376558-50G</td><td></td></tr><tr><td>Sülfürik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>Manganez klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>UVP EC3 Görüntüleme Sistemi</td><td>Ultra-Violet Products Ltd.</td><td></td><td>Dansitometri analizi için Vision Works LS yazılımını kullanın</td></tr><tr><td>Cam tabanlı konfokal çanak</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>www.glassbottomdishes.com</td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans (H99)Duke</td><td></td><td></td> <td>Üniversitesi Tıp Merkezi'nden alındı</td></tr><tr><td>YNB</td><td>BD</td><td>239210</td><td>Hazırlama talimatları için üreticiye bakın. 20 g / L'lik bir glikoz konsantrasyonu kullanın.</td></tr><tr><td>Lipopolisakkarit</td><td>Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>1 mg / ml stok yapmak için 1x PBS'de çözün. -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>İnterferon gama</td><td>Sigma</td><td>I4777</td><td>0.1 mg / ml stok çözeltisi yapmak için 1x PBS'de çözün</td></tr><tr><td>Glukuronoksilomannan antikoru (anti-GXM)</td><td></td><td></td> <td>Arturo Casadevall'ın Laboratuvarından hediye Konsantrasyon 1.98 mg / ml'dir</td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>MP Biyomedikal</td><td>194591</td><td>0.8 g Giemsa'yı 25 ml gliserol içinde çözün ve 60 °C'ye ısıtın; 1 saat boyunca C. Çözeltiye 25 ml metanol ekleyin ve en az 1 ay oda sıcaklığında yaşlanmaya bırakın.</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Observer.D1 görüntü almak için AxioCam MRm özellikli mikroskop</td></tr></tbody></table>

makrofaj kolesterol tükenmesi ve fagositoz Üzerine etkisi<em&gt; cryptococcus neoformans</em

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Kriptokokkozis cinsi, Cryptococcus patojenik mantarların neden olduğu bir yaşamı tehdit edici hastalıktır. Enfeksiyon akciğerin derinlerine içinde replike olan sporların, teneffüs sırasında görülür. Makrofajlar tarafından Cryptococcus fagositozu hastalığı, ölümcül meningoensefalit neden merkezi sinir sistemi içine yayabilen yollarından biridir. Bu nedenle, Cryptococcus ve makrofajlar arasındaki ilişkinin incelenmesi enfeksiyonun ilerlemesinin anlamak önemlidir. Bu çalışmada C. makrofaj enfektivitesini incelemek için bir adım-adım protokolü açıklanır in vitro neoformans. Bu protokolü kullanarak, konak-patojen etkileşimleri ev sahibi steroller rolü incelenmiştir. Metil farklı konsantrasyonları - siklodekstrin (MCD), sıçangil sarkomu retikulum makrofaj benzeri hücre hattı J774A.1 kolesterol tüketmek için kullanılmıştır. Kolesterol tükenmesi doğrulandı ve ticari availabl kullanarak hem kantifıyeE kolesterol ölçümü kiti ve ince tabaka kromatografisi. Kolesterol tükenmiş hücreleri lipopolisakkarittir (LPS) ve interferon gamma (IFNy) ile aktive edilir ve 1 arasında bir efektör-hedef oranında antikor opsonize Cryptococcus neoformans, vahşi tip H99 hücreleri ile enfekte edilmiştir: 1 arasındadır. Enfekte hücreler, C ile inkübasyon 2 saat sonra izlenmiştir neoformans ve fagositik indeksi hesaplandı. Kolesterol tükenmesi fagositik indeksinde önemli bir azalma ile sonuçlandı. sunulan protokoller laboratuar ortamında enfeksiyon sürecinin başlatılmasını taklit ve enfekte ev sahibi lipit kompozisyonu rolünü incelemek için uygun bir yöntem sunuyoruz.

Kolesterol tükenmesi 1x PBS kontrol ile karşılaştırıldığında Amplex Red Kolesterol Test kitinde, üretici talimatlarına göre protokol aşama 1.3 ayrılmış yüzer analizi MβCD ile muamele edilen numune kolesterolün yüksek bir konsantrasyonu elde edilir. Hücre tipine ve MβCD konsantrasyonu, kullanılan kolesterol azaltımı bağlı olarak değişebilir. 10 mM MβCD ile muamele J774 için, yaklaşık% 50 oranında bir azalması görülmektedir. Boşaltma 1.4 adım (Şekil 1) toplanan süpernatan ve hücr...

Bu makalede, makrofajların Cryptococcus neoformans ile enfeksiyonu için bir protokol anlatılmaktadır. Ayrıca, makrofajlardan sterol tükenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokoller, mantar enfeksiyonlarını in vitro olarak incelemek ve bu tür enfeksiyonlarda sterollerin rolünü incelemek için bir rehber sağlar.

Makrofaj Kolesterol tükenmesi ve Fagositoz Üzerine Etkisi<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Bu prosedürün genel amacı, makrofajlar tarafından cryptococcus neoformans alımında kolesterolün rolünü aydınlatmaktır. Bu işlem, öncelikle bir fare makrofaj hücre hattından metil beta siklodekstrin kullanılarak kolesterolün tüketilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, kolesterol tüketimi ince tabaka kromatografisi ve ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılarak doğrulanır ve miktarı belirlenir.Ardından, Cryptococcus neoformans hücreleri; glukuronik asit, ksilo-manoz veya GXMA kapsül bileşenlerine özgü antikorlarla opsonize edilir. Son olarak, kolesterolü azaltılmış makrofajlar opsonize edilmiş Cryptococcus neoformans ile enfekte edilir. Nihayetinde, enfekte hücreleri görselleştirmek ve fagositoz derecesinin hesaplanmasını sağlamak için floresan ve ışık mikroskobu kullanılır.Bu tekniğin temel avantajları, nispeten kısa bir sürede temel laboratuvar ekipmanlarıyla gerçekleştirilebilmesi ve buna rağmen kantitatif sonuçlar verebilmesidir. Bu yöntem, fungal patogenez alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, konak lipid aşılarının fungal patojenlerin optiğindeki rolü nedir?Mikrofajların içine giriş, kritik süreçlerin başlatılması için belirleyici bir adım olduğundan, bu tekniğin etkileri okus enfeksiyonlarının tedavisine veya zararlarına kadar uzanmaktadır. Bu yöntemler fungal patojenlerin enfeksiyonalitesi hakkında bilgi sağlayabilmesinin yanı sıra, zorunlu hücre içi patojenler gibi diğer organizmalara da uygulanabilir. Steril bir biyogüvenlik kabininde, 96 kuyucuklu bir kültür plağının her kuyucuğuna 10⁵ J 7 74 A 0.1 makrofaj benzeri hücre ekleyin. %10 FBS ve %1 penisilin streptomisin (PS) ile desteklenmiş 200 µL DMEM içerisinde, 37 °C'de ve %5 CO2'de gece boyunca inkübe edin ve işlemi ertesi gün gerçekleştirin.Besiyerini hücre monokatmanından uzaklaştırın ve hücreleri iki kez yıkamak için filtrelenmiş veya otoklavlanmış PBS kullanın. İstenen konsantrasyonda 200 µL metil beta siklodekstrin veya embeta CD çözeltisi veya kontrol olarak bir miktar XPBS ekleyin ve 37 °C'de, çalkalayarak 30 dakika boyunca inkübe edin. Süpernatanı uzaklaştırın ve ticari olarak mevcut bir kit ile kantitatif analiz yapmak üzere oda sıcaklığında saklayın.PBS veya serumsuz DMEM ile yapılan bu prosedürü takiben, kolesterol miktar tayini yapmadan veya enfeksiyona geçmeden önce hücreleri iki ila üç kez yıkayın. Kolesterolü tüketilmiş makrofajları enfekte etmek için steril bir biyogüvenlik kabinine geçin. Kuyucuk başına 10⁵ makrofaj benzeri hücre ekimi yapın.96 kuyucuklu bir plakada, aynı anda 37 °C'de ve %5 CO2'de gece boyunca inkübe edin. Çizgili bir plakadan tek bir koloni izole edip 10 mL YNB'ye inoküle ederek bir C. neoformans H99 kültürü büyütün; gece boyunca 30 °C'de çalkalayarak inkübe edin ve ertesi güne geçin. C. neoformans kültürünü 1.700 ×g'de ve 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı uzaklaştırın ve tekrar santrifüjlemeden önce beş mililitre 1X PBS ekleyin. Ardından, hücreleri beş mililitre 1X PBS içinde yeniden süspanse etmeden önce, hücreleri yıkamak için filtrelemiş 1X PBS kullanarak üç kez daha yıkama yapın. Daha sonra, yıkanmış kültürün seri dilüsyonunu hazırlamak için, orijinal örnekten 100 mikrolitreyi 900 mikrolitre 1X PBS'ye ekleyin.1/10'luk bir seyreltme elde etmek için, 1/10 seyreltilmiş örnekten 100 µL'yi 900 µL 1X PBS'ye ekleyerek 1/100'lük bir seyreltme hazırlayın. Son olarak, 1/100 seyreltilmiş örnekten 200 µL'yi 800 µL 1X PBS'ye ekleyin. 1/500'lük bir seyreltme elde etmek için, nihai seyreltmeden 10 µL'yi bir hemositometreye ekleyin ve makrofajları aktive etmek ve C. neoformans'ı opsone etmek için kullanılacak çalışma çözeltisini hazırlamak üzere hücre sayısını hesaplamak için sayım yapın. Stok çözeltilerdeki LPS ve interferon gama'yı, her bir bileşiğin 10 µL'sini 990 µL PBS içinde seyrelterek 100 kat seyreltin. Her bir örnek için 7,5 µL LPS, 1,25 µL interferon gama, 1,25 µL GXM antikoru ve 1,25 × 10⁵'i birleştirin.Neoforman hücrelerini görün, ardından FBS ve Ps ile desteklenmiş DMEM kullanarak hacmi örnek başına 250 µL'ye tamamlayın. Çözeltiyi vorteksleyin ve makrofajları enfekte etmeden önce 37 °C'de sallayarak 20 dakika inkübe edin; kolesterol tükenmesi, kolesterol tükenmesi işleminden sonra gerçekleştirilebilir. Her birine 200 µL opsonize C. neoformans çalışma çözeltisi eklemeden önce, onları yıkamak için iki kez serumsuz DMEM kullanın.37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Ardından hücreleri tespit edin ve boyayın. DMEM kullanarak hücreleri iki kez yıkadıktan ve hücre monokatmanını 10 dakika boyunca havada kuruttuktan sonra, 200 µL buz gibi soğuk metanol ekleyip oda sıcaklığında 15 dakika boyunca tespit edin ve ardından kalan metanolü uzaklaştırın.Ardından, 200 µL 10 x giza ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra deiyonize su kullanarak iki veya üç kez yıkayın, kapağı açık bırakın ve bir gece boyunca kurutun; ertesi gün veya bir hafta sonrasına kadar mikroskop altında bekletin. Veri noktası başına 300 hücreyi sayın ve enfekte makrofaj sayısını ve yutulmuş cryptococcus hücre sayısını not edin.Enfekte makrofajların yüzdesini, makrofaj başına düşen ortalama C neoformans sayısı ile çarparak PHA asidik indeksini hesaplayın. Değerleri, XPBS ile işlem görmüş kontrol grubunun bir yüzdesi olarak ifade ederek F asidik indeksini normalize edin. Birkaç denemeden sonra, F asidik indeksindeki eğilimleri belirlemek için ortalama değeri ve ortalamanın standart sapmasını hesaplayın.Burada gösterildiği gibi, anlamlılığı belirlemek için öğrenci T-testini kullanın. M beta CD ile işlem görmüş hücrelerden ayrılan süpernatantın analizi, PBS kontrol hücrelerinden izole edilen süpernatanta kıyasla yüksek kolesterol seviyeleri ortaya çıkarmıştır; bu durum M beta CD ile işlem görmüş hücrelerde daha yüksek düzeyde kolesterol tüketimi olduğunu göstermektedir. Kolesterol tüketim sonuçlarını desteklemek için, burada örneklendiği üzere süpernatant ve hücre lizatından elde edilen kolesterol değerleri kullanılarak tüketim miktarı hesaplanabilir.TLC kullanılarak analiz edilen hücre lizatı, artan M beta CD konsantrasyonları ile işlem görmüş hücrelerde kolesterol boyanmasında belirgin bir azalma olduğunu göstermektedir. TLC analizi, enfeksiyon sonrası yapılan kantitatif analizle benzer bir eğilim sergilemektedir; hücreler yapışık ve sağlam kalmış olup, C. neoformans ile enfekte edilmiş hücrelerde hücre morfolojisi, işlem görmemiş kontrol hücrelerine kıyasla değişmeden kalmıştır. Optimal şekilde enfekte edilmiş hücrelerin mikrografları, C. neoformans'ın memeli hücreler tarafından yutulduğunu açıkça göstermektedir.Bu grafik, tedavi grubu başına 300 makrofaj hücre üzerinden hesaplandığında, kolesterolü tüketilmiş hücrelerde F asidik indeksinde bir azalma tespit edildiğini göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik yaklaşık beş saatte gerçekleştirilebilir. Buna, prosedürü takip eden ve gece boyunca yapılması gereken inkübasyon süreleri dahil değildir. Gelişimini takiben, kolesterol tüketiminin konak lipid raftlarını etkileyerek Cryptococcus'un optiğini azaltıp azaltmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için makrofajlardan deterjana dirençli membranların ekstraksiyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu teknikler, membran biyolojisi ve immünoloji alanındaki araştırmacıların, patojenik funguslardaki patojen etkileşimleri yoluyla makrofajların fagositoz mekanizmalarını anlamalarına yönelik yollar açmaktadır. Patojenlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

macrophage-cholesterol-depletion-its-effect-on-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Makrofajlar homeostasis merkezi bir rol oynar ve birçok dokularda patoloji. Burada sunulan protokol makrofajlar tüketen için kullanılan yöntemleri...

Farelerde Makrofajlar tükenmesi ve Sulandırma

Bu videoda, patojenik bir mantar olan Cryptococcus neoformans'ın makrofajlardaki enfeksiyonunu değerlendirmek için bir sitotoksisite testi gösteriyoruz. Sitotoksisite, Cryptococcus neoformans enfeksiyonunun neden olduğu makrofaj lizizine bağlı olarak sitoplazmik laktat dehidrojenaz enziminin salınmasıyla belirlenir.

Makrofajlarda Cryptococcus neoformans Enfeksiyonunu Tespit Etmek için Bir Laktat Dehidrojenaz Serbest Bırakma Testi

Bu videoda, aspirin ve ibuprofen'in minimum inhibitör konsantrasyonlarında, pH'a duyarlı floresan boya lekeli mantar hücreleri kullanılarak makrofaj fagositozu üzerindeki etkisini değerlendirmek için bir yöntem gösterilmektedir. İlaçlar, pH'a duyarlı boyanın floresan ölçümlerinde gözlemlendiği gibi, siklooksijenaz-2'yi inhibe eder, prostaglandin oluşumunu azaltır ve makrofaj fagositozunu artırır.

Aspirin ve İbuprofen'in Makrofajların Fagositik Yeteneği Üzerine Etkisi

Biz canlı hücre Video mikroskopi yöntemleri...

Fungal Patojen Fagositoz Canlı hücre video Mikroskopi

Konfokal mikroskopi tarafından fagosite Aspergillus sporlarının büyümesini kontrol için izole edilmiş fare alveolar makrofaj yeteneğini değerlendirmek için bir yöntem.

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

Biz makrofaj C görselleştirmek için nasıl açıklar neoformans (Cn) dijital ışık mikroskobu kullanılarak litik olmayan ekzositoz sürecine özel vurgu ile gerçek zamanlı etkileşim,. Ayrı ayrı enfekte makrofajlar bu tekniği kullanarak bu olayın çeşitli yönlerini belirlemek için ele alınabilir.

Sigara litik Ekzositoz görselleştirme Cryptococcus neoformans Dijital Işık mikroskopi ile Makrofagların gelen

Burada, florometrik bir yöntem kullanarak yapışık makrofaj hücre hattı ile floresan parçacıkların fagositozunu ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, partikül içselleştirmesinin yanı sıra ortaya çıkan aktin polimerizasyonunun yüksek verimli bir miktar tayinini kolaylaştırır.

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

Makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) farklılaşmış insan monosit türevi makrofajların hücre kültürü için bir protokol sunulmuştur. Protokol, monositlerin makrofajlara toplu farklılaşması ile birlikte dondurularak saklanmasını kullanır. Daha sonra hasat edilen makrofajlar daha sonra deneyler yapmak için gerekli hücre yoğunluklarında kültür kuyularına ekilebilir.

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) tip 1 ile veya bu virüs olmadan enfekte olmuş canlı hücrelerde hücre merkezine doğru hareket eden fagozomların hızını, floresan enfekte hücreleri tanımlamak için eğirme disk konfokal floresan mikroskobu ve fagozomları tespit etmek için parlak alan mikroskobu kullanarak ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz.

HIV-1 ile infekte Canlı İlköğretim İnsan Makrofagların Ölçülen fagosom Göç ve Hız

Lipidler hücresel fonksiyonlarda önemli rol oynadıkları bilinmektedir. Burada, nötrofil hücre dışı tuzak oluşumunun altında yatan mekanizmaların daha iyi anlaşılması için HPTLC ve HPLC birlikte kullanarak, kolesterol seviyesi üzerinde durularak, nötrofillerin lipit bileşimini belirlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Yöntemler lipid Nötrofiller değişiklikler ve Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar sonraki oluşumunu incelemek

Burada sunulan, pH'a duyarlı bir floresan moleküle konjuge edilen opsonize olmayan maya (zymosan) parçacıklarının makrofaj (MΦ) fagositozunun mezenkimal kök hücre (MSC) aracılı regülasyonunun dinamik görüntülerini ölçmek ve üretmek için bir protokol sunulmaktadır.

Makrofaj Fagositozun Mezenkimal Kök Hücre Regülasyonu; Nicellik ve Görüntüleme

Öğrenin, Cryptococcus neoformans enfeksiyonlarında makrofaj kolesterol tükenmesinin fagositoz üzerindeki etkisini in vitro incelemek için kullanılan yöntemi. Bu protokol, fungal patogenez ve konak-patojen etkileşimleri alanında önemli bilgiler sunar.

Makrofaj Kolesterol tükenmesi ve Fagositoz Üzerine Etkisi

Daha fazla video keşfet