Name: Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Öğrenin, sıvı ve katı tümörlerden kanser hücrelerinin protein ekspresyon profillerini kantitatif kütle spektrometrisi ile analiz etme yöntemini. Bu teknik, onkolojide ilaç hedefleri ve biyobelirteç keşfi için güçlü bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar teknik destek için Uwe Plessmann, Monika Raabe ve Silvia Münch'e teşekkür eder.

İnsan doku ya da kan örnekleri üzerinde tüm deneyler etik oylamaya verilen yönergelere göre bir etik komitesi tarafından onaylanmış ve yapılmalıdır. 1. Hücresel Zenginleştirme <ol><li> Sıvı tümörler / floresans ile aktive edilen hücre tasnif. <ol><li> Amonyum klorür kullanılarak eritrosit lizizi gerçekleştirerek veya Ficoll yoğunluk-gradyan santrifüjü ile, kemik iliği veya kan numunesinden mononükleer hücreleri izole edin. <ol><li> Eritrosit liziz için, amonyum klorür çözeltisi 4 ml ile numunenin 1 mL bir araya getirir. 10 dakika - 5 buz üzerinde çözelti inkübe edin. 400 x g&#39;de 5 dakika 4 ° C&#39;de fosfat tamponlu tuz (PBS) +% 2 fetal dana serumu (FCS) ve santrifüj 40 ml ilave edilir. </li><li> Ficoll gradyan santrifüj, katman 2 ayrı katmanları oluşturmak için Ficoll-Hypaque 15 ml üzerindeki numune 10 ml için (katmanları rahatsız etmemek için dikkatli olun). Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj - dikkatli bir şekilde (15 ila 25 ° C) ve mononükleer hasatinterfaz toplamak hücreler. </li><li> Hücreleri aşağı Spin ve PBS +% 2 FCS onları sürebilir. 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj ve 1 ml PBS +% 2 FCS ile kaplar. Negatif kontrol olarak bir kısım ve son leke kullanılan her bir floresan boya için, bir kısım al. </li></ol></li><li> 30 dakika boyunca buz üzerinde, üreticinin talimatlarına uygun olarak seyreltme lösemik hücre popülasyonu izole etmek için yararlı bir floresan-etiketli antikorlar ile inkübe edin. Ayrıca her bir antikor ile tazminat için kullanılan alikotları leke. PBS +% 2 FCS ile iki kez yıkanır. Not: kullanılan antikorlar, CD117-PE (Klon 95C3), CD34-FITC (Klon 8G12) ve CD33-PE (Klon P67.6) karşı fare anti-insan edildi. </li><li> 35 mikron hücre süzgecinden Filtre hücreleri, hücre süzgecinden ile ideal kullanarak tüpler kap entegre. </li><li> (Örneğin, 7-AAD) hücre canlılığı leke ekleyin. Bir hücre sıralayıcı 11 (Şekil 2) kullanarak sıralar hücreleri. Isc&#39;den hücreleri toplamak<html> % 10 FCS içeren Ove&#39;nin Modifiye Dulbecco ortamı (IMDM). </li></ol></li><li> Katı tümörler / Lazer yakalama mikrodiseksiyon. <ol><li> Tarif edilen deneyler için, akciğer kanseri örnekten FFPE örnekleri kullanılmıştır. Bu amaçla, akciğer kanseri dokusu derhal cerrahi rezeksiyon ile yaklaşık 3 x 2 x 1 cm parçaları sonra% 4 tampon formalin içinde sabitlendi için daha fazla analiz için parafin içine gömülmüştür burada. </li><li> Bir mikrotom ile formalinle sabitlenmiş parafine gömülmüş (FFPE) numune 10 um kalınlığı 5 - kesitler halinde kesilmiştir. Film kaplı membran slaytlar ve 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de kuru üzerine monte bölümleri. Deparaffinize ve 1 dakika boyunca, ksilen içinde arka arkaya kuluçkalama, mutlak etanol,% 70 su ve her monte edilmiş bölümleri nemlendirir. </li><li> 20 saniye hematoksilen ile bölümleri Leke ve daha sonra musluk suyu ile durulayın. Bir lazer yakalama mikrodiseksiyon sistemini kullanarak ilgi hücre popülasyonu toplayın (ayrıca 12 bakınız). </li></ol></li></ol>başlığı &quot;&gt; 2. Protein Ekstraksiyonu <ol><li> Sıvı tümörler. <ol><li> 400 xg, 4 dakika 4 ° C&#39;de adım 1.1.5 hücre süspansiyonu Santrifüj ve süpernatant atın. 400 x g&#39;de 5 dakika boyunca, 500 soğuk PBS ul ve santrifüj ile iki kez yıkanır ve 4 ° C&#39;de </li><li> 10 6 hücre başına 40 ul liziz tamponu ilave edin ve (en az hücre sayısı olmalıdır 10 5 hücre (yakl. 10 ug toplam protein)), buz üzerinde 15 dakika inkübe edilir. 14,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de lizat santrifüj ve yeni bir reaksiyon tüpüne süpernatant (temizlenmiş hücre lisatı) aktarın. Pelet atın. </li></ol></li><li> Katı tümörler. <ol><li> Microdissected dokuya, doku liziz tamponunda 60 ul eklenir ve buz üzerinde 15 dakika inkübe edilir, kısa süreli santrfugasyon yoluyla sıvı toplamak ve yeni bir reaksiyon tüpüne süspansiyon aktarın. 3 dakika boyunca buz üzerinde lizat sonikasyon. </li><li> Nihai SDS co ulaşmak bir% 20 sodyum dodesil sülfat (SDS) 15 ul ekle% 4 ncentration. 1 saat için bir ısıtma bloğu içinde 99 ° C &#39;de microdissected doku inkübe ve 600 rpm&#39;de çalkalandı. 16.000 x g&#39;de, 10 dakika süre ile 18 ° C &#39;de lizat santrifüj ve yeni bir tüpe süpernatantı aktarın. </li></ol></li></ol> Bir SILAC Spike-in Ölçülmesi Standardı 3. kurulması (Süper-SILAC Standardı) NOT: ölçüm standardı 4 türetilen bir SILAC-etiketli protein karışımı oluşur - ilgi tümör tipini maç 6 hücre hatları. SILAC etiketli referans proteomu ve tümör türevli proteomu arasındaki maksimum çakışmasını sağlamak için, bir ana bileşen analizi hücre çizgileri ölçüm standardı 14 için seçilen önce yapılması gerekir. <ol><li> Temel bileşenler analizi (PCA). <ol><li> Hücre çizgilerinin protein ekspresyon modellerini belirlemek için, uygun hücre kültürü ortamı içinde yaklaşık olarak on farklı hücre hatları yetiştirmek. Hücreleri, tarif edildiği gibiAdım 2.1. Adım 6.1&#39;de tarif edildiği gibi, kütle spektrometrisi için hücre lizatları hazırlayın. </li><li> Yüksek çözünürlüklü her hücre soyunun, protein sentezleme modelini analiz, sıvı kromatografisi-bağlanmış kütle spektrometresi (nanoLC-MS / MS). </li><li> Ücretsiz eşya MaxQuant kullanarak ortaya çıkan ham veri analiz ve Perseus 16,17 gibi ilişkili yazılım kullanarak bir ana-bileşen analizleri. </li><li> Protein-ifade profilleri arasındaki en büyük çeşitlilik gösterir ve Süper-SILAC başak-standardı oluşturmak için bunları kullanmak 6 hücre hatları - 4 seçin. </li></ol></li><li> SILAC-etiketleme ve etiket kontrolü. <ol><li> Arginin ve lisin, karbon ve azot ile (SILAC ortamı) 4 kararlı izotoplar ile işaretlenmiş olan uygun SILAC hücre kültür ortamı içinde en az beş hücre döngüsü için, seçilmiş hücre soylannın geliştirin. </li><li> Parçalayıcı aşama 6.1&#39;de tarif edildiği gibi aşama 3.1&#39;de tarif edilen ve kütle spektrometresi için hücre lizatları hazırlamak hücreleri.NanoLC-MS / MS ile SILAC etiketleme kuruluş verimliliğini ölçmek. MaxQuant ile sonuçlanan ham MS verileri analiz ve SILAC-etiketleme etkinliğini belirlemek. Bu onların etiketli (ağır) olarak tanımlanan peptidler ve onların endojen formları (ışık) sayıları sayma, ve oranı (ağır) / (ağır + ışık) hesaplanması ile elde edilir. Etiketleme verimliliği% 98 aşmalıdır. </li></ol></li><li> SILAC proteomlarda ve doğrulama kombinasyonu. <ol><li> Yetiştirmek ve uygun SILAC ortamında, üretici talimatlarına göre seçilen hücre hatları genişletmek. Parçalayıcı katı tümörler için, aşama 3.2&#39;de tarif edilen ve her bir hücre lizatı protein konsantrasyonunu belirlemek sıvı tümörler için aşama 2.1&#39;de tanımlanan ya da hücreler. </li><li> Her bir hücre dizisinin eşit molar miktarlarda bir protein karıştırın ve kana karışımı içine ayırmaktadır. Ölçme kadar -80 ° C&#39;de alikotları ve mağaza Yapış-dondurma. Süper SILAC standart 50 ug - bir deney için, 20 gerekir. Stan hazırlamak için özenBir dizi deney sırasında içinde standart değişiyor gibi fazlalık olarak dart kaçınılmalıdır. </li></ol></li></ol> Protein Konsantrasyonu ve Spike-in 4. Ölçümü <ol><li> Sıvı tümörler. <ol><li> Protein kantitasyon deneyi kullanılarak ilgili hücresel lizatları ve Süper-SILAC standart protein konsantrasyonlarını belirlemek. </li><li> Temizlenmiş hücre lisatı ve süper SILAC standart eşit miktarlarda karıştırılır ve daha sonra lityum dodesil sülfat (LDS) tamponu (örnek hacminin% 25) ve indirgeyici bir madde (örnek hacminin% 10) ekleyin. </li><li> 10 dakika boyunca 72 ° C&#39;de bir ısıtma bloğu içinde elde edilen çözelti ısıtılır. İsteğe bağlı olarak, -80 ° C &#39;de elde edilen denatüre edilmiş proteinler saklayın. </li></ol></li><li> Katı tümörler. <ol><li> Bir plaka okuyucusu üzerinde protein konsantrasyonu ölçümü için, (BSA) seyreltme çözeltisi serisi, lizat ve ticari olarak temin edilebilen bir protein, a uygun süper SILAC standart standart sığır serum albümini karıştırın96 oyuklu bir plaka içerisinde ssay ve 1 dakika süre ile çalkalanır, belirtilen süre boyunca inkübe ve üretici tarafından belirtildiği gibi absorbansı ölçülür. Not: lizat yüksek SDS konsantrasyonu ve ditiotreitol (DTT) protein konsantrasyonunu belirlemek için en uygun deneyleri için bir sorundur. </li><li> Açıklık lizat ve 20 ° C&#39;de 30 dakika 14,000 x g&#39;de filtre ünitesi ve santrifüj üre 200 ul Süper SILAC standart eşit miktarda karıştırılır. 50&#39;den fazla açıklık lizatın ul ve Süper-SILAC standardını kullanmayın. Bu üre kristalleşmez, yani 15 ° C altında kaçının. </li></ol></li></ol> 5. Numune Ayırma ve Protein Digest <ol><li> Sıvı tümörler. <ol><li> % 12 gradyan SDS-PAGE jeli - Ayrı 30 - 4 üzerinde çizgi başına 100 ug toplam protein. Coomassie Mavi O / N ile Leke proteinleri. Su ile sonraki iki yıkar aşırı Coomassie leke çıkarın. </li><li> Jelden her sokağın kesin ve bölmekbakılmaksızın jel boyama desen 23 eşit büyüklükte dilimler halinde. 0.6 ml polipropilen şişe içinde, ayrı ayrı her bir jel dilimlerini işleyin. </li><li> Su ve metanol / su (50:50, h / h), 56 ° C&#39;de 30 dakika boyunca inkübe edilerek, 10 mM DTT ile azaltılması ile jel dilimlerini yıkayın. Karanlıkta oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edilerek iyodoasetamid 55 mM (IAA) ile jel dilimlerini alkilat. </li><li> Numune işleme adımları arasında, fazla çözücüyü yok ve reaktif çözeltisi alımını artırmak için bir SpeedVac içinde 15 dakika boyunca, asetonitril ve kuru ile dilimleri yıkayın. </li><li> 37 ° C&#39;de 16 saat süre ile (0.025 M sulu amonyum bikarbonat içinde 12.5 ng / ul), domuz tripsin çözeltisinin minimum miktarda kuru jel dilimlerini rehidrasyon proteaz bölünme yapın. </li><li> Jel dilimi 10 ul su ilave edin ve 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edilir. 80 ul asetonitril ilave edin ve 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edilir. 1 dakika boyunca, 15,800 x g&#39;de santrifüjleyin. Ayrı 0.6 ml süpernatant ve mağaza toplayıntüp. </li><li> % 5 formik asit çözeltisi, girdap 65 ul ilave edin ve 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edilir. 65 ul asetonitril ilave edin ve 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edilir. 1 dakika için 15,800 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatant toplayın ve önceki adımdaki süpernatant ekleyin. Bir vakum yoğunlaştırıcısı kuruyana kadar birleştirilen supernatant buharlaştırın. </li></ol></li><li> Katı tümörler. <ol><li> Doku lizattan SDS&#39;nin uzaklaştırılması için de referans 15 olarak açıklanan aşağıdaki FASP protokolünü kullanır. </li><li> Aşama 5.2.3 tarif edilen birinci santrifüjden sonra 20 ° C&#39;de 20 dakika 14,000 x g&#39;de bir filtre üzerinde, 8 M üre ayrıca 200 ul, ve daha fazla santrifüj ekleyin. Flow-through süzüntü atın. </li><li> 100 ul IAA ilave edilir ve 1 dakika süre ile, 600 rpm&#39;de bir Thermomixer karıştırın. Karanlıkta 20 ° C sıcaklıkta 20 dakika boyunca filtreyi inkübe edin. 20 ° C&#39;de 10 dakika 14,000 x g&#39;de filtre santrifüjleyin. </li><li> Filtre ve cen üre 100 ul ekleyin20 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 14,000 x g&#39;de trifuge. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın. </li><li> 20 ° C&#39;de 10 dakika 14,000 x g&#39;de filtre ve santrifüj NH4 HCO3 100 ul ekle. Iki kez bu adımı tekrarlayın. </li><li> 40 ul NH4 HCO3 + 1 ul (= 0.4 ug) tripsin ilave edin ve 600 rpm&#39;de 1 dakika için 20 ° C &#39;de Thermomixer karıştırın. 37 ° C&#39;de nemli bir bölmede filtre O / N inkübe edin. Yeni toplama tüpleri filtreyi aktarın. </li><li> 20 ° C&#39;de 10 dakika 14,000 x g&#39;de filtre santrifüjleyin. 20 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 14,000 g&#39;de NH4 HCO3 ve santrifüj 50 ul filtre ekleyin. Kütle spektroskopisi ölçümü kadar -20 ° C&#39;de elde edilen peptidler saklayın. </li><li> Peptid konsantrasyonu ölçümü için, bir 96-çukurlu plaka içinde elde edilen akış yoluyla ve düzgün triptofan uygun seyreltilerde bir dizi 50 ul dağıtmak. Triptofan floresan ölçün. Elde edilen konsantrasyon dönüştürmetriptofan, 0.1 ug peptid konsantrasyonuna triptofan, 9 ug proteine ​​karşılık gelir. </li></ol></li></ol> 6. Sıvı Kromatografi ve kütle spektrometrik analiziyle <ol><li> Bir sonikasyon banyosu içinde 5 dakika için 30 ul yükleme tamponu peptidler içinde yeniden çözülür. 1 dakika boyunca 15,800 xg&#39;de santrifüj aşağı Spin ve MS otomatik numune şişenin içine net bir çözüm pipetle. </li><li> NanoLC-MS / MS sistemi otomatik numune alıcı ile analiz başına örnek 5 ul enjekte edilir. C18 ön kolonu (5 um gözenek boyutu C18 malzeme ile 0.15 mm iç çap x 20 mm), bir havalandırılmış kolon kurulum veya Kolon öncesi anahtarlama kurulum ya da monte edilen bir ters faz online konsantre edin ve desalt peptidler. </li><li> Bir ters faz C18 Mikrokolonlu ayrı peptidler (0.075 mm İD x 200 mm kendinden dolu 5&gt;% 35 asetonitril, 90 dakikalık bir gradyan vs kullanılarak, örneğin PicoFrit olarak kendi kendine paket nano-sprey sütun 3 um veya daha küçük bir gözenek boyutu C18 malzeme ile 300 nl de.% 0.1 sulu formik asit /Min. Bir nano-sprey iyon kaynağı ile hibrid bir dört kat / Orbitrap kütle spektrometreye Aktarım yıkama sıvısı. </li><li> Bir top15 veriler bağımlı toplama yöntemi (MS m / z aralığı 350 ile peptidler analiz -. 1600, çözünürlük hedef 70.000 FWHM, AGC hedef 1 x 10 6, maksimum dolum süresi 60 milisaniye MS / MS kütle 100 başlatmak, çözünürlük hedef 17.500 FWHM, AGC ., MS / MS eşiği 3 x 10 4 2 x 10 5, maksimum dolum süresi 60 msn hedef ücret devletlere 2 dahil - 5, Normalize Çarpışma Enerji NCE% 25, dinamik dışlama 15 sn). </li></ol> 7. Veri analizi <ol><li> Veri analizi için serbestçe kullanılabilir MaxQuant 16 yazılımını kullanın. Biyoinformatik veri analizi için ayrıntılı bir protokol 16,17 tarif edilmektedir. Analizi için, tek bir deneyde 17 içine bir SDS-PAGE şeritli tüm dilim ham veri dosyaları birleştirmek. </li></ol>

<ol><li>Walther, T. C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics in cell biology.</a> J Cell Biol. 190 (4), 491-500 (2010).</li>
<li>Lenz, C., Urlaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+methodology+to+improve+proteome+coverage+depth%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Separation methodology to improve proteome coverage depth.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (4), 409-414 (2014).</li>
<li>Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Status+of+large-scale+analysis+of+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Status of large-scale analysis of post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3444-3452 (2013).</li>
<li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture%2C+SILAC%2C+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li>
<li>Jimenez, C. R., Verheul, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%3A+from+cancer+biology+to+protein+biomarkers%2C+drug+targets%2C+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Soc+Clin+Oncol+Educ+Book%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics: from cancer biology to protein biomarkers, drug targets, and clinical applications.</a> Am Soc Clin Oncol Educ Book. , e504-e510 (2014).</li>
<li>Tang, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+cancer+stem+cell+heterogeneity+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Understanding cancer stem cell heterogeneity and plasticity.</a> Cell Res. 22 (3), 457-472 (2012).</li>
<li>Evans, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+iTRAQ%3A+where+do+we+stand+now%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">An insight into iTRAQ: where do we stand now.</a> Anal Bioanal Chem. 404 (4), 1011-1027 (2012).</li>
<li>Ostasiewicz, P., Zielinska, D. F., Mann, M., Wisniewski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome%2C+phosphoproteome%2C+and+N-glycoproteome+are+quantitatively+preserved+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+and+analyzable+by+high-resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 9 (7), 3688-3700 (2010).</li>
<li>Malmström, J., Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+of+targeted+mass+spectrometry+for+protein+biomarker+verification%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Perspectives of targeted mass spectrometry for protein biomarker verification.</a> Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 518-525 (2009).</li>
<li>Gillet, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+data+extraction+of+the+MS%2FMS+spectra+generated+by+data-independent+acquisition%3A+a+new+concept+for+consistent+and+accurate+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. 41, (2010).</li>
<li>Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+mammalian+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of mammalian tissue.</a> J Vis Exp. 8, 309(2007).</li>
<li>Liu, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+pipeline+for+biomarker+discovery+of+laser+capture+microdissected+breast+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Proteomics pipeline for biomarker discovery of laser capture microdissected breast cancer tissue.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 155-164 (2012).</li>
<li>Geiger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+as+a+spike-in+standard+in+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Use of stable isotope labeling by amino acids in cell culture as a spike-in standard in quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 6 (2), 147-157 (2011).</li>
<li>Wisniewski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+sample+preparation+from+formalin+fixed+and+paraffin+embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Sarvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+cancer+stem-like+cells+in+small+cell+lung+cancer+are+highly+tumorigenic+and+chemoresistant+but+sensitive+to+a+novel+neuropeptide+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD133+ cancer stem-like cells in small cell lung cancer are highly tumorigenic and chemoresistant but sensitive to a novel neuropeptide antagonist.</a> Cancer Res. 74 (5), 1554-1565 (2014).</li>
<li>Shlush, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+pre-leukaemic+haematopoietic+stem+cells+in+acute+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of pre-leukaemic haematopoietic stem cells in acute leukaemia.</a> Nature. 506 (7488), 328-333 (2014).</li>
<li>Schaab, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+phosphoproteome+analysis+of+human+bone+marrow+reveals+predictive+phosphorylation+markers+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia+with+quizartinib%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Global phosphoproteome analysis of human bone marrow reveals predictive phosphorylation markers for the treatment of acute myeloid leukemia with quizartinib.</a> Leukemia. 28 (3), 716-719 (2014).</li>
<li>Hüttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Sci Transl Med. 4 (142), 142ra94(2012).</li>
<li>Burgess, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+efficient+quantification+of+low-abundance+proteins+at+very+high+multiplex+via+targeted+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (4), 1137-1149 (2014).</li>
<li>Boja, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+Validation+Considerations+of+Multiplex+Mass+Spectrometry-based+Proteomic+Platforms+for+Measuring+Protein+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Analytical Validation Considerations of Multiplex Mass Spectrometry-based Proteomic Platforms for Measuring Protein Biomarkers.</a> J Proteome Res. , (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa ilgi ya da diğer konularda hiçbir çatışma var.

Hasta kaynaklı kanser hücre proteomların Kitle spektrometrik profil yeni tanı / öngörü biyomarkerların keşfi için gerekli yanı sıra kanser hücre biyolojisi daha iyi bir anlayış vermek için hangi olabilir yeni potansiyel ilaç hedeflerinin belirlenmesine yol açacaktır. Çeşitli ön-analitik konular bir sağlam ve biyolojik ilgili sonuçlar elde etmek ise, çözülmesi gereken Ancak, bu tür kitlesel spektrometrik analizler, özellikle zorlu vardır. Burada tarif edilen deney akışı, sıvı ve katı tümörlerin, hem hücresel alt popülasyonlannda elde proteomların kantitatif proteomik karakterizasyonu için izin verir. ya da FACS-bazlı hücre sortingor mikro-kesim ile tümör hücrelerinin ilk zenginleştirme tümör mikro-hücreleri ile kirlenmesini önlemek için gereklidir. Ayrıca, bu teknikler bir ilgi hücresel subpopülasyonunun izole sağlar. Son hücre biyolojik çalışmalar iblis varBazı hücresel subpopülasyonunun tümör başlatan özelliklere sahip ve dolayısıyla kanser patogenezinde 19,20 için son derece alakalı olduğunu strated. Kütle spektrometresi son yıllarda daha duyarlı hale geldikçe, kantitatif proteomik analizler, birkaç bin hücrelerden elde edilebilir protein küçük miktarlarda mümkün olan mümkün işlevsel ilgili hücre popülasyonlarının odaklanmak için yapım. Burada sunulan set-up FFPE örneklerinde yeni tanı Biyobelirteçleri tanımlamak ve doğrulamak için kullanılabilir. Dolayısıyla, hala birçok kanser türleri için yeterli sayıda ve kalitede moleküler biyolojik belirteçler eksikliği olduğu tarihe kadar, klinik teşhis iyileştirilmesi için yararlı bir araç bea vaat ediyor. Biyomarkırlar eksik olan zor ayırıcı tanı, önemli örnekleri, akciğer metastazları, intrapankreatik kolanjiosellüler karsinom ve pankreas adenokarsinomaya primer akciğer kanseri arasındaki ayrımcılık vardır, yanı sıra farklıoldukça malign periferik sinir kılıfı tümörleri-benign nörofibromlar ayırt edilmesi. Ayrıca, ve diğerleri proteomik imza sayısal aydınlatılması, genel olarak kanser hücresi biyolojisi okuyan ve kanser hastalarında 21 terapötik tepkinin işaretidir biyolojik işaretleri ortaya çıkarılması için yararlı olabileceğini göstermiştir. Burada yer alan yöntem iki akım dezavantajları zengin manuel Örnek işleme gerekliliği ve nanoLC-MS / MS, alma zamanına ilişkin bir talep vardır. Eski örneğin, 96-kuyu formatları örnek hazırlama hareketli ve robotik işleme kullanılarak ele alınabilir iken, ikincisi kitle spektrometrik satın alma stratejisinde bir değişiklik gerektirecektir. Hedef proteinlerin alt-gruplar, örneğin, tümör sınıflandırması ile ilişkili olabilir ki belirlendikten sonra, bir önemli ölçüde azaltılmış ayrılma çaba ile, bu alt-gruplar için nicel okumalarını sağlayabilir hedef kütle spektrometresi yöntemleri tasarım öngörmektedir, veDolayısıyla buna bağlı olarak azalır, alma zamanına sahip. 24&#39;ten azaltılabilir gereken gerekli alma süresi ise - 36 saat (sıvı tümörler) veya 3 saat (katı tümörler) gibi üzere, 1 saat daha sonra kütle spektrometrisi ve peptidlerin bir basit tek-boyutlu bir ayırma, iç verimle sonuçlanır kazanç hedef kullanılarak ölçüm sonuçlarının önemli iyileştirmeler karşılık gelen, incelenmiş ve biyolojik teknik replika anlamlı sayısını arttırmak için kullanılabilir. Hedeflenen kitle spektrometrik yaklaşımları zaten kanser-ilişkili protein biyolojik belirteç-adayların 22 doğrulanması için uygun bir araç olduğu gösterilmiştir ve onlar doğrulama için ya da rutin klinik kullanımda 23 için potansiyel bir araç olarak umut vaat bir noktaya geliştirilmiştir , 24.

Kütle spektrometresi tabanlı proteomik ortaya çıkmıştır ve hücre biyolojisi ve translasyonel biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılan bir disiplin şimdi. Binlerce proteinin tek bir kütle spektrometrik deney 1,2 tespit edilebilir bu alandaki teknik ilerlemeler, hücre hatları ve hayvan modellerinde kompleks hücresel süreçlerin çalışma mümkün kılmıştır. Bu, genellikle bir değişiklik 2,3 her türü için zenginleştirme ve veri analizi için sipariş akışlarını gerektirir, ancak benzer bir ilerleme, fosforilasyon ya da ubikitinasyon gibi birçok dönüşüm sonrası modifikasyonların analizi için yapılmıştır. Ayrıca, SILAC dahil olmak üzere kimyasal ve metabolik etiketleme stratejileri, katılımı, insan kanserinde 4 temel hücresel süreçler, tanı biyolojik belirteçler ve potansiyel ilaç hedefleri keşfi için bu yöntem özellikle çekici hale proteinlerin ve PTMS doğru nispi ölçümü sağlar. Bununla birlikte,birçok karşı primer insan kanserlerinin 5 proteomik analizi ile ilgili aşılması gerekmektedir. Her şeyden önce, insan kanser örnekleri, genellikle bağışıklık sistemi hücreleri, fibroblastlar, tümör mikro-e ait çeşitli hücre tiplerinin varlığı nedeniyle hücresel heterojenlik yüksek derecesini göstermektedir. İkincisi, klonal evrim farklı fonksiyonel özelliklere sahip çeşitli hücresel alt popülasyonlar varlığına sonuçlanan, kendi tümörler içinde genetik çeşitliliğe yol açar. Kanser gelişimi ve ilerlemesi gibi (işlevsel son derece alakalı), hücresel alt popülasyonlar proteomik analizi ardındaki itici güçleri olan birkaç kanser kök hücrelerinin mevcut kavramına göre klinik uygulama için ilgili onkojenik mekanizmaların daha iyi anlaşılması için büyük önem olması bekleniyor 6. Üçüncü olarak, yüksek numune miktarlarının setleri kantitatif protein ekspresyon profilleri, genellikle, güçlü bir klinik BIOMAR tanımlanması için gerekli olankers; dayanarak bu gibi hücre çoğalması 4, -, - aynı şekilde uygulanamaz metabolik etiketleme stratejileri ise, bu, örneğin iTRAQ 7 gibi kimyasal etiketleme başarılamaz. Dördüncü olarak, en uygun bir katı tümör örnekleri formalinle sabitlenmiş, bağlı bir protein çapraz bağlarının 8 oluşumu için kütle spektrometrik analizi proteom zorlaştırmaktadır bulunmaktadır. Son olarak, en mevcut proteomik iş akışları zor klinik araştırmalar için ilgili örnek sayı analizi render örnek işleme ve veri toplama önemli miktarda gerektirir, ve yeni iş akışı çağrısında 9,10 paradigmalar. Bu engelleri gidermek için biz kapsamlı kitle spektrometresi analizi için küresel bir iç standart tanıtmak için bir süper-SILAC 14 strateji ile hücresel zenginleştirme için 11 veya lazer yakalama mikrodiseksiyon 12,13 sıralama ya akım-sitometrik hücre birleştiren bir deney düzeneği geliştirdi. Burada tarif edilen yöntem kullanılarak, sıvı ya da katı kanserler ya da elde edilen tek bir insan tümör örneklerinde 8000 proteine ​​kadar ölçmek mümkündür.

<table><tbody><tr><td>660 nm Kit</td><td>Thermo scientific</td><td>22662</td><td></td></tr><tr><td>Arginin ve lizin içermeyen hücre kültürü ortamı</td><td>Thermo Scientific</td><td>88421</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 boyama solüsyonu</td><td>Bio Rad</td><td>161-0436</td><td></td></tr><tr><td>Diyalize edilmiş fetal buzağı serumu (FCS)</td><td>PAA</td><td>A15-107</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodiseksiyon için difüzör kapakları</td><td>MMI</td><td>50202</td><td></td></tr><tr><td>FACS-sorter</td><td>BD</td><td>FACSAria III</td><td></td></tr><tr><td>İyonik Deterjan Uyumluluk Reaktifi</td><td>Thermo scientific</td><td>22663</td><td></td></tr><tr><td>Lazer yakalama mikrodissektörü</td><td>MMI&nbsp;</td><td>hücre kesimi artı</td><td></td></tr><tr><td>LDS tamponu&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodiseksiyon için membran slaytları</td><td>MMI</td><td>50103</td><td></td></tr><tr><td>Microcon YM-30</td><td>Millipore</td><td>MRCF0R030</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE %4-12 Bis-Tris Mini Jeller</td><td>Life Technologies</td><td>NP0335PK2</td><td></td></tr><tr><td>Picofrit Kendinden Paketli Sütunlar</td><td>Yeni Amaç</td><td>PF360-75-15-N-5</td><td>Kütle Spektrometresi Sütunu/Yayıcı</td></tr><tr><td>İndirgeyici ajan</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Reprosil-Pur LC/MS/MS Kolon sabit faz</td><td>Dr. Maisch</td><td>120 C18-AQ, 3 & m</td><td></td></tr><tr><td>Reprosil-Pur LC/MS/MS Sütun öncesi sabit faz</td><td>Dr. Maisch</td><td>120 C18-AQ, 5 & m</td><td></td></tr><tr><td>SILAC etiketli arginin</td><td>Eurisotop</td><td>CLM-2265-H-0.1</td><td></td></tr><tr><td>SILAC etiketli lizin</td><td>Eurisotop</td><td>DLM-2640-0.25</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin, NB Sıralama Sınıfı</td> Jel <td>içi sindirimler için</td><td>Serva</td><td></td></tr><tr><td>3728301 Tripsin,</td><td>çözelti içi sindirmeler için</td>Sıralama Sınıfı <td>Promega</td><td>V5111</td></tr><tr><td>Tampon ve çözeltiler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre lizis tamponu: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5 mM NaF,&nbsp; %0.5 NP40, %0.1 laurilmaltosid, Roche tam proteaz inhibitörü, 1 mM Na3VO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doku lizis tamponu: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Üre: 0.1 M Tris-HCl'de 8 M üre,</td><td>FASP protokolü için</td>pH 8.5 <td></td><td></td></tr><tr><td>IAA: 0.05 M iyodoasetamid, 8 M üre, 0.1 M Tris-HCl,</td><td>FASP protokolü için</td>pH 8.5 <td></td><td></td></tr><tr><td>0.05 M NH4HCO3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM ditiyotreitol (DTT) jel içi sindirim</td><td></td> için 0.1 M amonyum bikarbonat <td></td><td></td> içinde</tr><tr><td>Jel içi sindirim için 0.1 mM amonyum bikarbonat</td><td></td><td></td><td></td> içinde 55 mM iyodoasetamid (</tr><tr><td>IAA)&nbsp; % 5 sulu formik asit.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sıvı ve katı tümörler kaynaklanan kanser hücre proteomlar kantitatif kitle spektrometrik profil

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Derinlemesine kanser hücresi proteomların analizleri onkojenik patomekanizmaların aydınlatmak için, yanı sıra potansiyel ilaç hedefleri ve teşhis Biyobelirteçleri tanımlamak için gereklidir. Ancak, hasta kaynaklı tümörlerin ve özellikle hücresel alt popülasyonlar kantitatif proteomik karakterizasyonu için yöntemler büyük ölçüde eksiktir. Burada, sıvı ya da katı tümörler ya da elde edilen kanser hücresi alt-popülasyonlarının proteomların analiz edilmesine olanak sağlamıştır deneysel kurulum tarif eder. Bu biyoinformatik veri analizi ve ardından kantitatif Süper SILAC bazlı kütle spektrometresi ile hücresel zenginleştirme stratejileri birleştirerek elde edilir. FACS-sıralayarak ardından sitometri spesifik hücresel alt kümelerini zenginleştirmek için, sıvı tümörler ilk akış tarafından immunophenotyped edilir; katı tümörler için, lazer yakalama mikrodiseksiyon spesifik hücresel alt-popülasyonunu saflaştırmak için kullanılır. İkinci bir aşamada, bir protein, arıtılmış hücrelerinden ekstre edilir ve daha sonra bir tümör-spesifik birlikte,Protein miktarının sağlayan başak-standardı SILAC-etiketli. Elde edilen protein karışımının, jel elektroforezi ya da triptik sindirme ile ve ardından filtre Destekli Numune Hazırlama (FASP) &#39;ye tabi tutulmuştur. Son olarak, triptik peptidler bir melez quadrupole-Orbitrap kütle spektrometresi ile analiz edilir ve elde edilen veriler MaxQuant dahil biyoinformatik yazılım suit ile işlenir. 8000 proteine ​​kadar burada sunulan akışı aracılığı ile tespit edilebilir ve bir hastada elde edilen numunelerde ölçülmüştür ve elde edilen protein ekspresyon profilleri teşhis proteomik imza ya da potansiyel ilaç hedeflerini tanımlamak için hastalar arasında karşılaştırılabilir.

Hastaların sıvı ve katı tümörlerin proteomik profilleme yeni tanı ve öngörü biyomarkerların keşfi için umut verici bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, numune hazırlama işlemi ve kütle spektrometrik analiz numunelerinin karmaşıklığı ve örneklerin büyük setleri doğru protein miktarının ihtiyacı nedeniyle zordur. Yukarıda tarif edilen deney prosedürü, floresans ile aktive edilen hücre sıralama ya da lazer yakalama mikro-kesim ile ya da, ilgi konusu hücrelerin izolasyonu ile başlar. Bu amaçla, bir hastada elde edilen kemik iliği aspiratları veya kan örneklerinden Hücreler, FACS-bazlı sıralama ve hücre lizizi önce ilgili tanımlanan yüzey belirteçleri karşı floresan-etiketli antikorlar ile lekelendi. Doku kesitlerinden hücre alt kümelerine zenginleştirmek için bu birinci lazer yakalama mikro-kesim sağlamak için uygun kaydıraklar üzerinde monte edilmesi gerekir. Bu amaçla, t monteçok uygun bir membran slaytlar üzerinde doku bölümleri ve üreticinin talimatlarına lazer yakalama microdissector göre kullanımı. Alanları ve ilgi hücreleri seçme sağlıklı ve neoplastik doku histomorphology hakkında uygun bilgi gerektirir. Alınan hücreler daha sonra uygun bir toplama tüpüne aktarılır. İlk deneyler, ilgi her yeni doku için yeterli protein miktarlarının (en az 10 ug toplam protein) çıkarılması için gerekli olan doku miktarını tanımlamak üzere yapılmalıdır. Her microdissected numunesi doku liziz tamponu 60 ul ile muamele edilmektedir. Etkin parçalanması için, doku örneklerinden elde edilen hücreler, formalinin neden olduğu protein çapraz bağlar kaldırmak için 1 saat süreyle 99 ° C de bir termomikser içerisinde inkübe edilir ve 3 dakika için ve SDS numune 15 ul ilave edilmesinden sonra sonikasyona tabi gerekir. Santrifüj sonunda temizledi hücresel lizatın toplanmasını kolaylaştırmak olacaktır. I her hastalık içinnterest (sıvı ve katı tümörler) uygun bir Süper-SILAC ölçümü standardı olan 14 tesis edilecek. Uygun bir standart ilgi örneklerde ifade edilen proteinlerin% 90&#39;ından fazlasını temsil etmelidir. Bir miktar standart hazırlanması için, ilgi konusu kanser tipine bağlı hücre hatları ilk önce, protein ekspresyon profillerini belirlemek için kütle spektrometresi ile analiz edilir ve daha sonra, ana bileşen analizi yapılmalıdır. 4 - diferansiyel protein ekspresyonu ile 6 farklı hücre hatları seçilen ve &quot;ağır&quot; arginin ve lizin ile SILAC etiketli olmalıdır. Etiketleme verimliliği nanoLC-MS / MS ile kontrol edilmelidir ve% 98 daha büyük olması gerekmektedir. Daha sonra, hücre çizgileri daha sonra, her bir numune ve SILAC başak standart eşit mol protein miktarlarının karıştırılmalıdır ilgili bir hastada elde edilen örnek ile aynı şekilde lize edilmelidir. O Klinik örneklerin doğru bir protein ölçümü için kritik bir adımf faiz hasta kaynaklı numunelerin ve SILAC başak-in miktar standart ekimolar protein miktarlarının doğru karışımıdır. Kriteri hücrelerinden türetilen lisatların protein konsantrasyonunu belirlemek için, çeşitli protein ölçüm tahlilleri kullanılabilir. Doku türevli hücrelerin hücre lizatları, bir deney lizatı içinde SDS ve DTT konsantrasyonu yüksek olan başa ihtiyaç duyulmaktadır. Hasta türevi örnekleri ve SILAC başak standart protein konsantrasyonları da benzer örneklerin yüzlerce yapımında çok önemli olan doğru karışımı sağlamak amacıyla, ilgili klinik örnekler ile bir araya getirilmeden önce, her zaman ölçülmelidir. Ayrılmış 1D-PAGE 10 dakika boyunca 72 ° C&#39;de bir Thermomixer ısıtıldı LDS ile karıştırılır sıvı tümörler elde edilen ve daha sonra maruz standart ve lizat örnekleri başak ve jel sindirim eşit miktarlarda karışımı sonra tripsin ile protein. Örnekler eldeDoku Wisniewski ve arkadaşları tarafından belirlenmiş olan FASP yaklaşımı kullanarak SDS kurtarılmış ve tripsin ile sindirilir. 15 Elde edilen triptik peptidler filtre salınan Peptid miktarı, ilk filtre üzerine yerleştirilmiştir, protein miktarlarına göre% 15 ve% 75 arasında değişmektedir doku örnekleri için özel ilgi çeken bir triptofan floresan ölçülmesi ile hesaplanabilir. Bu amaçla triptofan floresan ölçer. Triptofan 1.1 ug, yaklaşık 100 ug peptidin tekabül gibi uygun bir triptofan seyreltme serisi ile karşılaştırma, peptitler ölçülmesini sağlar. Gerekirse, FASP işlem özellikle edilen örnekler nanoLC / MS / MS sistemine 18 üzerine yüklenmeden önce, ters faz C18 (RP-C18) malzeme ile dolu, ticari veya ev yapımı aşama uçları ya da önceden saflaştırılabilir. Kitle-spektometrik analiz, yüksek gerçekleştirilir-resolution, yüksek hassasiyet kütle spektrometresi sistemi. Kısacası, peptid numuneleri, tuzdan arındırılmıştır ve bir RP-C18 Kolon öncesi ile yoğunlaştırılmış ve kütle spektrometresi ile doğrudan bağlanmış bir RP-C18 analitik kolonu üzerinde ayrılır. FASP tarafından işlenen katı tümörlerin (3 saat, RP-C18 geçişlerini - analizi, yeterli derinliği elde etmek için, uzun bir 2, 40 dakika RP-C18 (sıvı tümörler) ve gradyanlar veya tek enjeksiyonları ile SDS-PAGE protein prefractionation bir kombinasyonu ya istihdam ). MS spektrumları kromatografik pik profilleri entegrasyonu ile SILAC çiftleri doğru ölçümü sağlamak için, 70,000 FWHM ya da daha iyi bir çözünürlükte elde edilir. Protein belirlenmesi için, bir top15, veri-bağımlı alma yöntemi peptid ve protein belirlenmesi için peptid MS / MS spektrumları, büyük bir sayı üretmek için kullanılır. Elde edilen ham verilerden, protein kimlik ve miktar bir UniProt Knowledgebas karşı MaxQuant yazılım ile arama veritabanı elde edilirE İnsan Tam Proteome veri tabanının 17. MaxQuant yazılım (güncel sürümü 1.5.0.25), peptidler protein dizi veritabanından silico türetilen spektrumları karşı peptid fragmanı eşleştirme tarafından satın MS / MS spektrumları ile tanımlanmıştır. Aynı zamanda, izotopik profilleri iyon ön-madde kromatografik tutma süreleri yaklaşık ekstre edilir ve entegre pik alanları ışık nispi ölçümü için kullanılır: SILAC etiketlenmesi sureti ile oluşturulan yoğun peptit çiftleri. Peptit kimlikler ve nispi yoğunlukları daha sonra gelen protein özellikleri atanır. Kahraman yazılımı (güncel sürümü 1.5.0.15) daha sonra örnek-örnek karşılaştırmalar, PCA ve hiyerarşik kümeleme dahil MaxQuant işleme sonuçlarının daha aşağısında istatistiksel değerlendirme, gerçekleştirmek için kullanılır. Deney düzeneği biz belirledik açıklanan ve az toplam proteinin mikrogram 30 olarak 8,000 proteinlere kadar sayısal kullanmaSıvı tümörlerinden türetilen. Katı tümör örneklerinden kadar 2500 proteinleri tanımlanmış ve nispeten kısa bir süre içinde, klinik örneklerde yüzlerce analize izin verir ancak 2 saat arasında bir LC gradyanı ile bir av tüfeği proteomik yaklaşımla belirlenebilir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52435/52435fig1highres.jpg" /> Şekil 1. Deneysel iş akışı. Hücresel alt kümesi zenginleştirme, protein izolasyonu temel adımlar, başak-in sıvı ve katı tümörler için gösterilen ölçüm standardı ve kitle-spektrometrik analiz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52435/52435fig2highres.jpg" /> Şekil 2. Hücresel zenginleştirme strategies. FACS sıralama ve LCM. (A) Örnek yolluk stratejisi hücre sıralayıcı tarafından elde edilen bir CD117-lekeli lösemik hücre popülasyonu üzerinde yolluk resmeden. Solid tümör dokusu (B) Lazer yakalama mikrodiseksiyon. 5 Doku kesitleri - 10 um kalınlıkta boyama önce film kaplı membran lam üzerine yerleştirilmiştir. Çıkarları Bölge lazer yakalama mikrodiseksiyon elle seçildi. Ilgi bölge ile mikrodiseksiyon sarı ve mikrodiseksiyon sonra işaretli önce bölümler gösterilmiştir. 50 um bir ölçek çubuğu rakam dahil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52435/52435fig3highres.jpg" /> Insan kanser hücre proteomların Şekil 3. Küme analizi. Pr Öğreticisiz küme analiziSıvı ve katı tümörlerin otein sentezleme profilleri hesaplama platformu Kahraman kullanılarak gerçekleştirilmiştir. AC - Adenokarsinom, SCC - Skuamöz hücreli karsinom, SCC-Met - teknik çoğaltmak - baş ve boyun kanseri, R Skuamöz hücreli karsinom metastazı.

Kanser hücresi proteomlarının derinlemesine analizleri, yeni ilaç hedeflerinin ve tanısal biyobelirteçlerin tanımlanmasını kolaylaştırır. Sıvı ve katı tümörlerden türetilen kanser hücresi alt popülasyonlarındaki (fosfo-) proteomların kantitatif analizi için deneysel bir iş akışı açıklıyoruz. Bu, hücresel zenginleştirme stratejilerinin kantitatif Super-SILAC tabanlı kütle spektrometresi ile birleştirilmesiyle elde edilir.

Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Bu prosedürün genel amacı, sıvı ve katı tümörlerin protein ekspresyon profillerini aydınlatmaktır. Bu işlem, öncelikle hastadan alınan kan veya doku örneklerinden kanser hücrelerinin zenginleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, kanser hücrelerinden proteinler izole edilir ve ardından tümöre özgü bir susac kantifikasyon standardı ile karıştırılır.Son adımda, protein karışımı sindirilir. Nihayetinde, sıvı ve katı tümörlerden protein ekspresyon profillerini göstermek için kütle spektrometrisi kullanılır. Bu yöntem, onkoloji ve patoloji alanındaki "ilaç hedefleri ve terapi direnci mekanizmaları nasıl belirlenebilir?" gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu yöntem biyobelirteç keşfine dair içgörüler sağlayabilse de, çeşitli katı ve sıvı kanserlerin incelenmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Prosedürü, Patoloji Enstitüsü'nden Dr. Hannibal Berger ve laboratuvarımdan Dr. Christophe Lanz gerçekleştirecektir. Sıvı tümör hücrelerini akış sitometrisi ile floresan ayrıştırma için hazırlamak amacıyla, negatif kontrol için PBS artı %2 FBS içinde süspanse edilmiş bir mililitre insan mononükleer hücre örneği ve final boyamada kullanılan her bir floresan boya için bir mililitre alıkoyarak başlayın. Ardından, hücreleri lösemik hücre popülasyonunu izole etmek için uygun antikorlar ve kompanzasyon kontrolleri ile buz üzerinde inkübe edin.30 dakika sonra, hücreleri %2 FCS içeren PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, uygun tüplere bir hücre canlılık boyası ekleyin ve hücreleri şemaya göre ayırın. Lazer yakalama mikrodissection yöntemiyle solid tümörleri toplamak için örnekleri %10 FCS içeren IMDM'de toplayın.İlk olarak, formaldehit ile fikse edilmiş parafin gömülü örneklerden mikrotom kullanarak 5 ila 10 mikrometre kalınlığında kesitler alın. Ardından, kesitleri film kaplı membran lamlara monte edin ve örnekleri 37 °C'de bir saat boyunca kurutun. Kesitleri sırasıyla ksilen, absolut etanol, %70 etanol ve su içerisinde birer dakikalık inkübasyonlarla deparafinize edin ve rehidrate edin.Ardından kesitleri 20 saniye boyunca hematin ile boyayın. Musluk suyuyla durulayın ve ayrıştırılmış sıvı tümör hücrelerinden protein özütlemek için lazer yakalama mikrodissection sistemi ile ilgilenilen hücreleri toplayın. Örneği üç kez santrifüjleyin; ikinci ve üçüncü santrifüj işlemleri sırasında hücreleri 500 µL soğuk PBS ile yıkayın.Ardından, hücreleri 1x10⁶ hücre başına 40 µL lizis tamponu içerisinde inkübe edin. 15 dakika sonra, lizatı santrifüjleyin ve mikrodissection ile ayrılmış solid tümör hücrelerinden protein ekstraksiyonu yapmak için süpernatant içeren berrak lizatı yeni bir reaksiyon tüpüne aktarın. Doku örneğini, 72 °C'de 60 µL doku lizis tamponu ile inkübe edin.15 dakika sonra, kısa bir santrifüj ile sıvıyı toplayın ve süpernatantı yeni bir reaksiyon tüpüne aktarın. Ardından lizatı buz üzerinde üç dakika boyunca sonikasyona tabi tutun ve ardından 600 RPM karıştırma hızındaki bir ısıtma bloğunda 99 °C'de %20 sodyum dodesil sülfat içeren 15 µL ile inkübe edin. Bir saat sonra, lizatı çöktürmek için santrifüjleyin ve süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.Ardından, berraklaştırılmış hücresel protein ve super SLAC standartlarının protein konsantrasyonlarını belirleyin ve ardından tümör hücresi parçalarını super SLAC standardı ile eşit miktarlarda karıştırın; bunu lityum disülfat tamponu (%25 örnek hacminde) ve indirgeyici ajan (%10 örnek hacminde) ekleyerek takip edin. Daha sonra, elde edilen çözeltiyi bir ısıtma bloğunda 72 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın.Katı tümör lizatının protein konsantrasyonunu bir plaka okuyucuda ölçmek için, standart bir sığır serum albümin dilüsyon çözeltisi serisini, lizatı ve uygun super SLAC standardını, ticari olarak temin edilebilen bir protein analiz kiti ve 96 kuyucuklu plaka ile karıştırın. Bir dakika boyunca çalkaladıktan sonra, örneği uygun süre boyunca inkübe edin ve üreticinin belirttiği şekilde absorbansı ölçün. Ardından, berraklaştırılmış lizat ve super SLAC standardından eşit miktarları bir filtre ünitesinde 200 microliters üre ile karıştırın ve örnekleri 30 dakika boyunca santrifüjleyin.Tümör hücresi lizatlarını sıvı kromatografisi ve kütle spektrometrik analizi ile analiz etmek için. Öncelikle, ilgili peptitleri 30 µL yükleme tamponu içerisinde beş dakika boyunca sonikasyon banyosunda çözerek başlayın. Ardından proteini çöktürün ve berrak süpernatantı kütle spektrometrik otomatik örnekleyici şişesine aktarın.Ardından, analiz başına beş mikrolitre örneği nano LC-MS/MS sisteminin otomatik örnekleyicisine enjekte edin; peptitleri ters faz C18 ön kolon düzeneğinde çevrimiçi olarak konsantre edin ve tuzdan arındırın. Son olarak, peptitleri kendi kendine hızlanan bir nano sprey kolonu içindeki ters faz C18 mikro kolonda ayırın. 300 nanolitre/dakika hızında, %0,1 sulu formik asite karşı %5'ten %35'e asetonitril gradyanı ile 90 dakikalık bir ayırma işlemi uygulayın, ardından peptitleri transfer etmek ve analiz etmek için bir nano sprey iyon kaynağı kullanın.En iyi 15 veri bağımlı kazanım yöntemi kullanılarak, peptidlerin analizi için farklı kütle spektrometresi türleri kullanılabilir. Hastalardan alınan sıvı ve katı tümörlerin proteomik profillemesi, yeni tanısal ve öngörücü biyobelirteçlerin keşfi için gelecek vaat eden bir yaklaşımdır. Örneğin, bu ilk şekil, sıvı bir tümör örneğinden CD17 pozitif lökemik hücrelerin izole edilmesi için örnek bir kapılama stratejisini göstermektedir.Burada ise, az önce gösterildiği gibi, film kaplı membran lamlar üzerine monte edilmiş beş ila 10 mikrometre kalınlığında bir kesit kullanılmıştır. Gösterildiği üzere, bir ilgi alanı manuel olarak seçilmiş ve lazer yakalama mikrodissection ile kesilmiştir; ardından sıvı ve katı tümör örneklerinin protein ekspresyon profillerinin denetimsiz küme analizi kütle spektrometrisi ile gerçekleştirilebilir ve bu da farklı tümör varlıklarının, belirgin protein ekspresyon profillerine göre net bir şekilde ayrılmasına olanak tanır. Bu veriler nihayetinde klinik olarak ilgili biyobelirteçlerin belirlenmesine katkıda bulunabilir.Fosforilasyon veya UIC ventilasyonu gibi post-translasyonel modifikasyonlar için zenginleştirme stratejilerinin uygulanması, disregüle kinaz paternlerinin gelişimi sonrasında nasıl tanımlanabileceği gibi ek soruları yanıtlamak için de gerçekleştirilebilir. Bu teknik, patoloji ve onkoloji alanındaki araştırmacıların çeşitli kanser türlerindeki spesifik biyobelirteçleri ve sinyal yollarını keşfetmelerine olanak sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, protein ekspresyon paternlerini ve sinyal durumlarını kütle spektrometrisi ile analiz etmek amacıyla, kanserlerden alt popülasyonlar şeklinde proteinlerin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

quantitative-mass-spectrometric-profiling-cancer-cell-proteomes

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Biz doğru bir şekilde sıvı Kromatografi yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometre için arabirim ile proteinler ile izobarik etiketleme, geniş ayırma, Biyoinformatik araçlarını ve kalite kontrol adımları birlikte quantitate için bir protokol mevcut.

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Bu iletişim kuralı ayıklamak ve prostat kanseri hücre hatlarından veya doku phosphoproteome ile kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizi için phosphopeptides zenginleştirmek için bir yordam açıklanır.

Prostat kanserinde Phosphoproteome araştırmak için etiket içermeyen nicel kütle spektrometresi ile birleştiğinde Phosphopeptide zenginleştirme

Entegre hücre manipülasyon platformu, ortam koşullarında bireysel süspansiyon hücrelerinin on-line analizi için tek prob Kütle Spektrometrisi kurulumu ile birlikte kullanılmak üzere geliştirilmiştir.

Entegre hücre manipülasyon platformu tek süspansiyon hücrelerinde Ilaçların ve metabolitlerin Kütle Spektrometrisi analizi için tek prob ile birleştiğinde

El yazması, katı faz mikroekstraksiyonu ile insan beyin tümörlerinin yerinde örneklemesini ve ardından biyobelirteçlerin keşfine yönelik biyokimyasal profillemelerini sunmaktadır.

Metabolomik ve Lipidomik Analizler için Beyin Tümörlerinin Yerinde Örnekleme sivesi ve ekstraksiyonu

Bu yazıda kan toplama, plazma ve buffy kat ayırma, cfDNA ve germline DNA ekstraksiyonu, cfDNA veya germline DNA'nın nicelleştirilmesi ve cfDNA parça zenginleştirme analizi dahil olmak üzere invaziv olmayan sıvı biyopsi tekniği için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Kanser Hastalarının Kan Plazma Örneklerinde Hücresiz DNA Tespiti

Burada, çeşitli hücre tiplerinin hücre yüzeyi proteomunun karakterizasyonu için bir proteomik iş akışını açıklıyoruz. Bu iş akışı, hücre yüzeyi proteini zenginleştirmeyi, müteakip numune hazırlamayı, bir LC-MS/MS platformu kullanarak analizi ve özel yazılımla veri işlemeyi içerir.

Hücre yüzeyi proteomunun etiketsiz miktar tayini için "hücre yüzeyi yakalama" iş akışı

Bu protokol, kanserlerin glikobiyolojisini daha iyi anlamak için gerekli olan karmaşık tümör mikro ortamlarındaki heterojen glikoproteom hakkında kapsamlı bilgiler sunan entegre bir omik teknolojisi olan glikomik kılavuzlu glikoproteomik yöntemini detaylandırır.

Glikomik kılavuzluğunda glikoproteomikler, karmaşık tümör mikro ortamlarında glikoproteomun kapsamlı profilini kolaylaştırır 

Burada, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü doku kesitlerinde izole edilmiş ilgi alanlarını kullanarak kütle spektrometresi tabanlı bir proteomik yöntem oluşturuyoruz. Bu protokol, arşivlenmiş formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü doku kesitlerindeki belirli doku alanlarından proteomu analiz etmek için kullanılır.

Seçilmiş Doku Bölgelerini Kullanan Kütle Spektrometresi Tabanlı Proteomikler için Kolaylaştırılmış Bir Yaklaşım

Bu protokol, çeşitli klinik örneklerden verimli histon çıkarımı ve ardından LC-MS/MS ile translasyonel sonrası modifikasyon analizini sağlar. Önemli histon modifikasyonlarının sağlam tespitini kolaylaştırarak, büyük klinik kohortlarda kapsamlı epigenetik profilleme için değerli bir araç olarak hizmet eder.

Kütle Spektrometrisi ile Epigenetik Profilleme için Klinik Örneklerden Histonların Ekstraksiyonu

Bu protokol, tümör anjiyogenezinin nicel proteomik analizi için lazer-yakama mikrodiseksiyonu kullanarak glioma örneklerinden yeterli yüksek kaliteli neovasküler doku hazırlamış, geleneksel olarak anjiyojenik faktörlere odaklanan çalışmaların sınırlamalarını aşmış ve glioma anjiyogenezinin geniş ölçekli proteomik profilini sağlamıştır.

İnsan Glioma Dokularından Neovasküler Dokuların Tümör Anjiyogenezinin Nicel Proteomik Analizi İçin Hazırlanması

Öğrenin, sıvı ve katı tümörlerden kanser hücrelerinin protein ekspresyon profillerini kantitatif kütle spektrometrisi ile analiz etme yöntemini. Bu teknik, onkolojide ilaç hedefleri ve biyobelirteç keşfi için güçlü bir çerçeve sunar.

Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil

Daha fazla video keşfet