Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil

Bu prosedürün genel amacı, sıvı ve katı tümörlerin protein ekspresyon profillerini aydınlatmaktır. Bu, ilk olarak hastadan elde edilen kan veya doku örneklerinden kanser hücrelerinin zenginleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, proteinler kanser hücrelerinden izole edilir ve daha sonra tümöre özgü bir susac miktar tayini standardı ile karıştırılır.

Son adımda, protein karışımı sindirilir. Sonuç olarak, sıvı ve katı tümörlerden protein ekspresyon profillerini göstermek için kütle spektrometresi kullanılır. Bu yöntem, onkoloji ve patoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin ilaç hedefleri ve tedavi direnci mekanizmaları nasıl belirlenebilir?

Bu yöntem biyobelirteç keşfi hakkında fikir verebilse de, çeşitli, katı ve sıvı kanserlerin araştırılması gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Prosedürü gösterecek olan Dr.Hannibal Berger Patoloji Enstitüsü ve laboratuvarımdan Dr.Christophe Lanz olacak Akış sitometrisi ile floresan sıralama için sıvı tümör hücrelerini hazırlamak için, Ali'nin PBS'de süspanse edilmiş insan mononükleer hücre örneğinden bir mililitre artı negatif kontrol için %2 FBS ve son lekede kullanılan her floresan boya için bir mililitre alıntı yaparak başlayın. Daha sonra, lösemik hücre popülasyonunu izole etmek ve buz üzerindeki kompanzasyon kontrolleri için hücreleri uygun antikorlarla inkübe edin.

30 dakika sonra, hücreleri PBS ve% 2 FCS ile iki kez yıkayın. Daha sonra uygun tüplere bir hücre canlılığı boyası ekleyin ve hücreleri şemaya göre sıralayın. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu ile katı tümörleri toplamak için örneklerin IMDM artı% 10 FCS'de toplanması.

İlk olarak, formin sabit parafin gömülü numunelerden beş ila 10 mikrometre kalınlığında kesitler kesmek için bir mikrotom kullanın. Daha sonra, bölümleri film kaplı membran slaytlara monte edin ve numuneleri bir saat sonra 37 santigrat derecede kurutun. Ksilen mutlak etanol,% 70 etanol ve su içinde ardışık bir dakikalık inkübasyonlarla bölümleri ayırın ve rehidre edin.

Ardından bölümleri 20 saniye boyunca hematin ile boyayın. Bunları musluk suyuyla durulayın ve sıralanmış sıvı tümör hücrelerinden proteini çıkarmak için lazer yakalama mikrodiseksiyon sistemi ile ilgilenilen hücreleri toplayın. Numuneyi üç kez döndürün, ikinci iki santrifüjleme sırasında hücreleri 500 mikrolitre soğuk PBS'de yıkayın.

Daha sonra, hücreleri bir kez 10 ila altı hücreye bir kez 40 mikrolitre lizis tamponunda inkübe edin. 15 dakika sonra, lizatı santrifüjleyin ve mikro diseke katı tümör hücrelerinden proteini çıkarmak için berrak lizat içeren süpernatanı yeni bir reaksiyon tüpüne aktarın. Doku örneğini 72 santigrat derecede 60 mikrolitre doku lizis tamponu ile inkübe edin.

15 dakika sonra, sıvıyı kısa bir santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı yeni bir reaksiyon tüpüne aktarın. Daha sonra lizatı buz üzerinde üç dakika boyunca sonikleştirin, ardından 600 RPM ajitasyonlu bir ısıtma bloğunda 99 santigrat derecede% 20 sodyum ESAL sülfat içeren 15 mikrolitre ile bir inkübasyon yapın. Bir saat sonra, lizatı aşağı doğru döndürün ve S natin'i yeni bir tüpe aktarın.

Daha sonra, temizlenmiş hücresel ve süper SLAC standardının protein konsantrasyonlarını belirleyin ve ardından eşit miktarda tümör hücresi parçalarını süper SLAC standardı ile karıştırın, ardından lityum ile karıştırın. Numune hacminin %25'inde desal sülfat tamponu ve numune hacminin %10'unda indirgeyici ajan yapın. Daha sonra elde edilen çözeltiyi bir ısıtma bloğunda 72 santigrat derecede 10 dakika ısıtın.

Katı tümör lizatının protein konsantrasyonunu bir plaka okuyucu üzerinde ölçmek için, standart bir sığır serum albümin seyreltme çözeltisi serisini, lizatı ve uygun süper SLAC standardını ticari olarak temin edilebilen bir protein tahlili ve 96 oyuklu bir plaka ile karıştırın. Bir dakika çalkaladıktan sonra, numuneyi uygun süre boyunca inkübe edin ve emiciliği üretici tarafından belirtildiği gibi ölçün. Daha sonra eşit miktarda arıtılmış lizat ve süper SLAC standardını bir filtre ünitesinde 200 mikrolitre üre ile karıştırın ve numuneleri 30 dakika santrifüjleyin.

Tümör hücresi lizatlarını sıvı kromatografisi ve kütle spektrometrik analizi ile analiz etmek. İlgilenilen peptitleri bir sonikasyon banyosunda beş dakika boyunca 30 mikrolitre yükleme tamponunda çözerek başlayın. Daha sonra proteini aşağı doğru döndürün ve berrak süpernatanı bir kütle spektrometrik otomatik örnekleyici şişesine aktarın.

Daha sonra, nano lc, ms MS sistem otomobillerine, örnekleyiciye analiz başına beş mikrolitre numune enjekte edin ve peptitleri ters faz C 18 preco monte edilmiş ve havalandırmalı kolon kurulumunda çevrimiçi olarak konsantre edin ve tuzdan arındırın. Son olarak, peptitleri, kendi hızınızda bir nanos püskürtme sütununda ters faz C 18 mikro sütununda ayırın. Dakikada 300 nanolitrede %0.1 sulu formik aside karşı %5 ila %35 asetil nitril arasında 90 dakikalık bir gradyan kullanarak, peptitleri aktarmak ve analiz etmek için bir nano sprey iyon kaynağı kullanın.

En iyi 15 veriye bağlı toplama yöntemi kullanılarak, peptitleri analiz etmek için farklı tipte kütle spektrometreleri kullanılabilir. Hastalardan alınan sıvı ve katı tümörlerin proteomik profillemesi, yeni tanısal ve prediktif biyobelirteçlerin keşfi için umut verici bir yaklaşımdır. Örneğin, bu ilk şekil, bir sıvı tümör örneğinden CD bir 17 boyası, lösemik hücreleri izole etmek için örnek bir geçit stratejisini göstermektedir.

Oysa burada, az önce gösterildiği gibi film kaplı membran kayarlarına monte edilmiş beş ila 10 mikrometre kalınlığında bir bölüm. Gösterildiği gibi, ilgilenilen bir bölge daha sonra manuel olarak seçildi ve lazer yakalama mikro diseksiyonu ile eksize edildi, sıvı ve katı tümör örneklerinin protein ekspresyon profillerinin denetimsiz küme analizi daha sonra kütle spektrometresi ile gerçekleştirilebilir ve farklı tümör varlıklarının farklı protein ekspresyon profillerine göre net bir şekilde ayrılmasına izin verilir. Bu veriler daha sonra klinik olarak ilgili biyobelirteçlerin oluşturulmasına katkıda bulunabilir.

Fosforilasyon veya UIC ventilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonlar için zenginleştirme stratejilerinin uygulanması, aşağıdaki gibi ek soruları yanıtlamak için de gerçekleştirilebilir: Düzensiz kinaz paternleri geliştirildikten sonra nasıl tanımlanabilir? Bu teknik, patoloji ve onkoloji alanındaki araştırmacıların çeşitli kanser oluşumlarında spesifik biyobelirteçleri ve sinyal yollarını keşfetmelerinin yolunu açmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, protein ekspresyon modellerini ve kütle spektrometresi ile sinyal durumlarını analiz etmek için proteinlerin kanserlerden alt popülasyonlar olarak nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.