Name: Nanobody ve Antikor Temelli Doğrulama İn Vivo Tümör Xenograftlarında NIRF-görüntüleme Deneyler kullanma Ex vivo Sitometrisi ve Mikroskopi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Öğrenin, farelerdeki tümör ksenogreftlerinde yakın kızılötesi floresan görüntüleme deneylerinin ekso validasyonunu nanobody ve antikor kullanarak yapmayı. Bu yöntem, akış sitometrisi ve floresan mikroskopi ile görüntüleme sonuçlarını doğrulamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft İşbirlikçi Araştırma Merkezi 877 (Friedrich Koch-Nolte) tarafından okuldan mezun &#39;Enflamasyon ve rejenerasyon&#39; Deutsche Forschungsgemeinschaft İşbirlikçi Araştırma Merkezi 841 (Alexander Lenz, Valentin KUNICK, William Fumey) olarak, tarafından desteklenen Wilhelm Sander Vakfı tarafından Werner Otto Vakfı (Peter bannas), (Peter bannas, Friedrich Koch-Nolte), tarafından ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (Martin Trepel Çağlar&#39;la, Friedrich Haag ve Friedrich Koch-Nolte) tarafından. Biz Vivo Optik Görüntüleme Çekirdek Tesisi ve personel Uke de istişare ve yüksek kaliteli hizmet Üniversite Kanser Merkezi Hamburg (UCCH) teşekkür ederim. Çekirdek Tesisi Deutsche Krebshilfe (Alman Kanser Yardım) hibe tarafından kısmen desteklenmiştir.

NOT: Deneyler hayvanların etik kullanımı ile ilgili uluslararası kurallar çerçevesinde yapıldı ve Üniversite Tıp Merkezi, Hamburg yerel hayvan refahı komisyonu tarafından kabul edildi. Tümör hücreleri, Fareler ve antikor yapılan hazırlanması 1. <ol><li> Lenfoma Hücreleri hazırlanması ve Bodrum Matrix aliquoting (Matrigel). <ol><li> Tümör hücrelerinin enjeksiyonundan bir gün önce steril bir ucu kutusu (1.000 ul ipuçları) ve -20 ° C derin dondurucuda uygun pipet koydu. </li><li> 4 ° C buzdolabı O / N buz üzerinde bodrum matrisi ile şişeyi çözülme. </li><li> Enjeksiyon gününde bir buz kovası doldurmak ve pipet, ipuçları ile birlikte bodrum matris yerleştirin ve buz üzerinde 30 G iğne ile 1 ml şırınga. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde, RPMI ortamı, 100 ul lik bir hacim içinde kısım lenfoma hücreleri ve bazal matris 100 ul ile iyice karıştırın. Önceden soğutulmuş içine çizinşırıngalar ve enjeksiyon kadar buz koymak. NOT: İyi steril tekniği kullanın ve buz üzerinde bodrum matris tıkanmasını önlemek için bütün zaman çalışmak. </li></ol></li><li> Fareler Hazırlık <ol><li> 8-10 haftalık atimik çıplak farelere (NMRI- Foxn1 n u) kullanın. </li><li> Bağırsak otofloresansı önce in vivo görüntüleme 1 hafta için bir yonca-serbest diyet fareler tutmak azaltmak için. </li><li> Lenfoma enjeksiyon için hücreler bir indüksiyon odasında 2% izofluran ile etkilemek için fareler uyutmak. Bir izofloran manifoldu kullanılarak prosedür süresince% 1-2 izofluran koruyun. </li><li> Omuz yanları içine deri lenfoma hücrelerini enjekte edilir. Doğrudan içi bireysel karşılaştırma için sırasıyla, sağ ve sol tarafta antijen-pozitif ve negatif antijen-hücreleri enjekte. <ol><li> Fare cilt çimdik ve fare vücuttan uzak çekmek için bir başparmak ve işaret parmağı kullanın. Yavaş yavaş ve eşit enjektederinin altında hücrelerin tek bir küme oluşturarak parmakları tarafından oluşturulan kese. temel matris yerine enjekte hücreleri kalmasına yardımcı olur. </li></ol></li></ol></li><li> Antikor Yapıların Hazırlanması <ol><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir floresan boya AlexaFluor-680 (AF680) (eksitasyon dalga boyu = 679 nm, emisyon dalga boyu = 702 nm), bir ticari olarak temin edilebilen bir protein etiketleme kiti ile monoklonal antikorlar ve tek alanlı nanoantikorlar etiketleyin. 15.720 mol -1 cm -1 ve 203.000 mol -1 cm -1, sırasıyla molar tükenme katsayıları kullanılarak nanobody ve geleneksel antikor başına boyaların sayısını hesaplayın. SDS-PAGE boyutu fraksiyonlaşması ve Coomassie parlak mavi boya ile antikor yapıları saflığını değerlendirin. </li><li> Gerçek görüntüleme çalışmalarında önce in vitro bir dizi deney yapılarak etiketli konjugelerin özgünlüğünü olun. Etiketli An özgünlüğünü testtibody bloke çalışmaları ile, in vitro olarak oluşturur ve spesifik olmayan izotip 8,20 kontrol eder. NOT: adımda antijen-negatif ve antijen-pozitif hücreler (veya farklı hücreler hatları) için 1.2.4 hücre sayıları farklı büyüme oranlarına göre adapte edilmesi gerekebilir. Bu deneyler için, 0.5x10 6 DC27.10 ARTC2 negatif ve 1.5x10 6 DC27.10 ARTC2 pozitif hücreler, benzer büyüklükteki tümörlerin elde edilmesi için kullanılmıştır. Aşama 1.3.1 fluorophores antikor probları etiketleme ve etiketleme etkinliğinin yöntemde, kullanılan etiketleme kiti göre farklı olabilir. </li></ol></li></ol> 2. In vivo görüntüleme <ol><li> 50 ug 2 boyalar / molekülü tümörlerin çapı ~ 8 mm &#39;ye ulaşmak zaman 7-9 gün sonra, AlexaFluor680 50 ug intravenöz fare kuyruk damarından (mAb AF680, 200 ul serum fizyolojik bir hacimde olan antikor yapılarını etiketli enjekte ≈ ~ 4 ^ 14 fluorokromun ≈ -0.8 ug fluorokromun; Nanobody-AF680: 50 μ0.3 boyalarla g / molekül ≈ ~ 5.6 ^ 14 fluorokromun ≈ ~ 1.1 ug fluorokromun). </li><li> Görüntüleme sistemi başlatmak ve% 3 izofluran önce görüntüleme indüksiyon odasında bir XGI-8 anestezi sistemi kullanarak etkilemek için fareler uyutmak. Görüntüleme odacık izofluran manifoldu kullanılarak görüntüleme işlemi süresince% 1-2 izofluran koruyun. <ol><li> Kameraya yönelik tümörü olan ısıtılmış görüntüleme sahnede Pozisyon fareler. Ayak veya hayvanın kuyruk kısma doğru anesthetization Monitör; hayvanın her hangi bir reaksiyon anestezi çok açık olduğunu göstermektedir. </li><li> Solunum hızını izlemek; anestezi solunum hızı artar eğer çok hafif ve çok derin solunum hızı azalmış ise, derin ya da düzensiz olduğunu. Anestezi altında iken kuruluğu önlemek için göz merhemi ile hayvanın kornealar koruyun. </li></ol></li><li> Uyarılması için 615-665 nm, emissio için 695-770 nm floresan filtre kümesi seçn ve 51 2x 512 piksel matris boyutu ile arka plan çıkarma için 580-610 nm uyarma. Orta otomatik pozlama süresini, piksel binning ayarlayın ve F / 2 durdurun. NOT: Daha kısa pozlama süreleri daha hızlı çerçeve oranları sağlar; uzun pozlama süreleri daha hassasiyet sağlar. Binning CCD kamera piksel boyutunu kontrol eder. Binning Artan piksel boyutu, duyarlılık ve kare hızını artırır, ancak uzaysal çözünürlüğü azaltır. F / Stop kamera diyafram boyutunu ayarlar. delik boyutu tespit ışık miktarını ayarlar ve cihaz ve deney seti yukarı görüntüleme farklılık olabilir field.Note derinliğini kontrol eder. En iyi sonuçlar için üreticinin kılavuzuna başvurun. <ol><li> Görüntüleme yazılımı optimize pozlama süresi ise, F / durdurma ve piksel binning hücre hattının ifade seviyesine göre. Kantitatif sonuç etkilemeden bir deney sırasında herhangi bir zamanda bu ayarları değiştirin. Alternatif olarak, Görüntü Sihirbazı yazılımı otomatik olarak belirlemesine izinparametreler. </li></ol></li><li> Görüntü enjeksiyondan önce fareler ve antikor yapıları enjeksiyonundan sonra 6 saat. NOT: etiketleme etkinlik optimum görüntüleme sonuçları için gereken tüm dozunu etkileyebilir. Uygun görüntüleme sonuçlar için gerekli antikor yapısının Bu nedenle bir miktar ampirik olarak belirlenmelidir. Bu etiketleme etkinliği ve boyut yapısının yanı sıra, tümör modeli ve hedef antijen ekspresyonuna bağlı olarak değişebilir. </li></ol> 3. Hasat ve Tümörleri Hazırlanması <ol><li> Bir buz kovası doldurun ve% 4 paraformaldehit (PFA), fosfat tamponlu salin (PBS) / proteaz inhibitörü (AEBSF), ve buz üzerinde, PBS /% 0.2 sığır serum albümini (BSA) yerleştirin. </li><li> Görüntüleme oturumu bittikten sonra,% 4 izofluran konsantrasyonu artırır. Hayvan nefes durur sonra, görüntüleme aşamasında çıkarın ve servikal dislokasyon gerçekleştirin. </li><li> Dağı bir Strafor blok üzerinde fare ve% 70 etanol ile sprey. </li><li> Kullanım makass ve forseps dış derisini kesip tümörleri ortaya çıkarmak için dikkatlice geri çekin. Tümör dokusu bozulmadan kalmasını sağlamak için neşter ile tümörlerin çıkarın. </li><li> Bir neşter kullanılarak yarısında Kes tümörler. PBS / FACS için AEBSF&#39;in analizleri ve immünohistokimya için% 4 PFA ile 50 ml tüp içinde diğer yarısı ile bir toplama tüpüne bir buçuk yerleştirin. </li><li> Immünohistokimya için hazırlık <ol><li> 24 saat süre ile 4 ° C&#39;de bir buzdolabı içerisinde% 4 PFA içinde tümör tutun. PBS /% 30 sakaroz ile bir tübe tümörleri aktarın ve tüpün alt tümör lavabolar kadar 4 ° C sıcaklıkta buzdolabında saklayın. </li><li> Cryomolds için uygun parçalar halinde tümörler kesilir. Cryomolds tümörleri koyun ve tümörler kaplıdır böylece Ekim bileşiği ile doldurun. </li><li> Kuru buz kalıpları koymak ve bileşik tamamen donmuş kadar bekleyin. Dondurulmuş tümörler -80 ° C dondurucu transfer ve immünohistokimya için saklayın. </li><li> Kesme bir mikrotom ile 8 um bölümler tümörleri donduruldu. Standart immunhisto kullanınkimya protokol çekirdekleri görselleştirmek için kan damarlarını ve diamidino-fenilindol (DAPI) görselleştirmek için CD31-AF488 karşı antikor ile leke. NOT: zaten floresan işaretli antikorlar içerdiğinden Tümör bölümleri ışığa çok duyarlı. Mümkün olduğunca ışık maruziyeti en aza indirmek. </li></ol></li><li> FACS analizi için hazırlanması <ol><li> Buz üzerinde petri yerleştirin ve 2.0 ml şırınga pistonu çıkartın. Hücre süzgecinden tümörü koyun ve bir neşter kullanılarak 3-4 parçaya hafifçe kesti. Petri ilk PBS dökün ve hücre süzgecinden içinde tümör püre için piston düz ucunu kullanın. </li><li> 10 ml pipet ile tüm hücreleri yıkayın için ilk PBS ile hücre süzgeç yıkayın. 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de yeni bir tüp ve spin hücre süspansiyonu aktarın. Süpernatant atılır ve 10 ml PBS /% 0.2 BSA içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Hücreleri saymak. </li><li> 5 ml&#39;lik bir FACS tüpü içinde Kısım 1-5 x 10 6 lenfoma hücreleri. Yine Spin hücreleri (500xg), 100 ul PBS /% 0.2 BSA içinde supernatant ve tekrar süspansiyon atın. </li><li> İsteğe bağlı olarak, kullanarak bloğu FcR, bir anti-CD16 / 10 dakika süreyle buz üzerinde FcyR bağlanan CD32 mAb (FcgR3 / 2). Bir kez PBS ile yıkayın hücreleri /% 0.2 BSA. </li><li> Diğer hücrelerden gelen lökositler ayırt anti-CD45-mAb ekleyin. PBS /% 0.2 BSA ile iki yıkama ve ardından karanlıkta buz üzerinde 20 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Sağ propidyum iyodürle FACS analizi leke önce buz üzerinde 15 dakika düz PBS ile iki kez yıkanmasından sonra, ölü hücreleri ayırt etmek için. FACS analizi için, 150 ul içinde süspanse. NOT: adım 3.7.4 ve 3.7.5 adım diğer antikorlar tümör varlık bağlı kullanılabilir. </li></ol></li></ol> 4. FACS analizi <ol><li> CD45 pozitif hücreler için yolluk ve antijen-pozitif hücreler için yolluk, geniş dağılım, çiftli ayrımcılık, ölü hücrelerin dışlanma şeklinde kapısına ilgi nüfusu yolluk araçları bir dizi kullanın. <ol><li> İlk başta, kapı dışarı hücreiki parametre arsa kullanarak yan saçılım (SSC-A) karşı bir ileri dağılım (FSC-A) enkaz. Sonraki ıskarta hücre çiftlerin. Son olarak, kapı dışarı olmayan (CD45), CD45-antijen-pozitif ve ölü / hücreleri ölüyor (LD - canlı / ölü-leke). </li></ol></li><li> Tüm deneyler için aynı şablonu kullanarak Tutanak örnekleri. NOT: donanım ve analitik yazılım kullanımı ile ilgili teknik danışmanlık için üreticinin protokolüne bakın. </li></ol> 5. mikroskobik analizi <ol><li> Bir yağ daldırma lens (40X objektif) bir konfokal mikroskop kullanılarak lekeli tümör cryosections analiz. AF680 Bir O-Neon 633 nm lazer uyarma, AF488 için bir Argon Lazer ve DAPI için 405-Diyot kullanın. </li><li> Mikroskop ile uyumlu bir yazılım kullanılarak ham görüntü verileri işlemek. Background-düzeltme ve gürültü gerekirse filtreleme gerçekleştirin. Böyle, kesit kırpma yanı sıra parlaklık ve kontrast ayarlamaları gibi ek görüntü ayarlamaları yapın. <ol><li> Sonunda geTüm algılama kanalları tek bir kompozit görüntü bindirme nerate. Bireysel katmanların parlaklığını ve kontrastını ayarlayın. kompozit görüntüler hücreleri (yeşil AF488-leke) (DAPI-leke, mavi), etiketli antikor yapıları (kırmızı AF680-leke) ve kan damarlarının dağılımı lokalizasyonu gösterecektir. </li></ol></li></ol> İn vivo Analizi 6. <ol><li> Görüntüleme yazılımı açın görüntü dosyaları ve floresan görüntü verileri ile fotoğraf görüntü verileri birleştirerek bir bindirme görüntü oluşturmak. Belirli floresan sinyalin doku otofloresans arka plan sinyali kaldırarak görüntü ekranı optimize. Bu izleyici için özel ayarlanmış filtre ile elde edilen görüntüden ayarlanmış bir arka plan filtresi ile elde edilen görüntüyü çıkarılarak yapılabilir. </li><li> Antijen-pozitif tümör ve antijen-negatif tümör çevresinde ilgi (ROI) aynı dairesel ölçüm bölgeleri çizin. Arka sinyal yoğunluğunu belirlemek için, dairesel bir yatırım getirisi yerleştirinfloresans sinyali (örneğin, bacak hind) düşük olması beklenmektedir, hayvanın bir bölgede. <ol><li> Tüm zaman noktalarında tüm hayvanlar için aynı ROI kullanın. Konumlandırma için, tümör marjları tanımlamak için fotoğraf siyah-beyaz ve-resimler kullanın. </li></ol></li><li> Bir ölçüm tablosunda Ekran ROI verileri. Ileri istatistiksel analizler için floresan sinyalleri daha nicel karşılaştırma sağlayan ortalama radyant verimlilik verilerini kullanın. <ol><li> Ekran ve mutlak sinyal şiddetleri gibi verileri karşılaştırmak ya da hedeflenen doku ve arka plan dokusu ölçülen yatırım getirisi verilerini kullanarak sinyal-arka oranını hesaplamak. Arka bacak belirlenen plan değeri ile tümör alım değeri bölerek tümör-zemin oranı hesaplayın. </li><li> Kontroller olarak, aynı zamanda in vivo olarak sinyallerin özelliğinin değerlendirilmesi için etiketli izotip kontrolleri enjekte antijen negatif ve antijen pozitif aynı hayvanlarda tümörlerin yanı sıra hayvanların analiz eder. </li></ol></li&gt; </ol>

<ol><li>Koch-Nolte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+domain+antibodies+from+llama+effectively+and+specifically+block+T+cell+ecto-ADP-ribosyltransferase+ART2.2+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Single domain antibodies from llama effectively and specifically block T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 in vivo.</a> FASEB J. 21, 3490-3498 (2007).</li>
<li>Koch-Nolte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+monoclonal+antibody+detects+a+developmentally+regulated+mouse+ecto-ADP-ribosyltransferase+on+T+cells%3A+subset+distribution%2C+inbred+strain+variation%2C+and+modulation+upon+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new monoclonal antibody detects a developmentally regulated mouse ecto-ADP-ribosyltransferase on T cells: subset distribution, inbred strain variation, and modulation upon T cell activation.</a> J Immunol. 163, 6014-6022 (1999).</li>
<li>Koch-Nolte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+genetic+immunization+to+raise+antibodies+recognizing+toxin-related+cell+surface+ADP-ribosyltransferases+in+native+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of genetic immunization to raise antibodies recognizing toxin-related cell surface ADP-ribosyltransferases in native conformation.</a> Cell Immunol. 236, 66-71 (2005).</li>
<li>Bannas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+and+specificity+of+toxin-related+mouse+T+cell+ecto-ADP-ribosyltransferase+ART2.2+depends+on+its+association+with+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Activity and specificity of toxin-related mouse T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 depends on its association with lipid rafts.</a> Blood. 105, 3663-3670 (2005).</li>
<li>Bannas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+magnetic+resonance+imaging+of+enzyme+activity+on+the+cell+surface%3A+in+vitro+and+in+vivo+monitoring+of+ADP-ribosyltransferase+2+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Quantitative magnetic resonance imaging of enzyme activity on the cell surface: in vitro and in vivo monitoring of ADP-ribosyltransferase 2 on T cells.</a> Mol Imaging. 9, 211-222 (2010).</li>
<li>Bannas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+overexpression+of+toxin-related+ecto-ADP-ribosyltransferase+ART2.2+sensitizes+T+cells+but+not+B+cells+to+NAD-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transgenic overexpression of toxin-related ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 sensitizes T cells but not B cells to NAD-induced cell death.</a> Mol Immunol. 48, 1762-1770 (2011).</li>
<li>Hottiger, M. O., Hassa, P. O., Luscher, B., Schuler, H., Koch-Nolte, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+unified+nomenclature+for+mammalian+ADP-ribosyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Toward a unified nomenclature for mammalian ADP-ribosyltransferases.</a> Trends Biochem Sci. 35, 208-219 (2010).</li>
<li>Bannas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+near-infrared+fluorescence+targeting+of+T+cells%3A+comparison+of+nanobodies+and+conventional+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">In vivo near-infrared fluorescence targeting of T cells: comparison of nanobodies and conventional monoclonal antibodies.</a> Contrast Media Mol Imaging. 9, 135-142 (2014).</li>
<li>Scheuplein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAD%2B+and+ATP+released+from+injured+cells+induce+P2X7-dependent+shedding+of+CD62L+and+externalization+of+phosphatidylserine+by+murine+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">NAD+ and ATP released from injured cells induce P2X7-dependent shedding of CD62L and externalization of phosphatidylserine by murine T cells.</a> J Immunol. 182, 2898-2908 (2009).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li>
<li>Wesolowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+domain+antibodies%3A+promising+experimental+and+therapeutic+tools+in+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity.</a> Med Microbiol Immunol. 198, 157-174 (2009).</li>
<li>Vaneycken, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+screening+of+anti-HER2+nanobodies+for+molecular+imaging+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Preclinical screening of anti-HER2 nanobodies for molecular imaging of breast cancer.</a> FASEB J. 25, 2433-2446 (2011).</li>
<li>Xavier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+preclinical+validation%2C+dosimetry%2C+and+toxicity+of+68Ga-NOTA-anti-HER2+Nanobodies+for+iPET+imaging+of+HER2+receptor+expression+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Synthesis, preclinical validation, dosimetry, and toxicity of 68Ga-NOTA-anti-HER2 Nanobodies for iPET imaging of HER2 receptor expression in cancer.</a> J Nucl Med. 54, 776-784 (2013).</li>
<li>Tchouate Gainkam, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+Between+Epidermal+Growth+Factor+Receptor-Specific+Nanobody+Uptake+and+Tumor+Burden%3A+A+Tool+for+Noninvasive+Monitoring+of+Tumor+Response+to+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlation Between Epidermal Growth Factor Receptor-Specific Nanobody Uptake and Tumor Burden: A Tool for Noninvasive Monitoring of Tumor Response to Therapy.</a> Mol Imaging Biol. 13 (5), 940-948 (2011).</li>
<li>Vosjan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+labelling+of+an+anti-epidermal+growth+factor+receptor+Nanobody+with+68Ga+via+a+novel+bifunctional+desferal+chelate+for+immuno-PET%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Facile labelling of an anti-epidermal growth factor receptor Nanobody with 68Ga via a novel bifunctional desferal chelate for immuno-PET.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 38, 753-763 (2011).</li>
<li>Oliveira, S., Heukers, R., Sornkom, J., Kok, R. J., van Bergen En Henegouwen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumors+with+nanobodies+for+cancer+imaging+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Targeting tumors with nanobodies for cancer imaging and therapy.</a> Journal Of Controlled Release. 172 (3), 607-617 (2013).</li>
<li>Kijanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+optical+imaging+of+human+breast+tumour+xenografts+using+anti-HER2+VHHs+site-directly+conjugated+to+IRDye+800CW+for+image-guided+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Rapid optical imaging of human breast tumour xenografts using anti-HER2 VHHs site-directly conjugated to IRDye 800CW for image-guided surgery.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40, 1718-1729 (2013).</li>
<li>Zaman, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibody+bioconjugated+near-IR+quantum+dots+for+targeted+cellular+imaging+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanosci+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibody bioconjugated near-IR quantum dots for targeted cellular imaging of pancreatic cancer.</a> J Nanosci Nanotechnol. 11, 3757-3763 (2011).</li>
<li>Oliveira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+visualization+of+human+tumor+xenografts+through+optical+imaging+with+a+near-infrared+fluorescent+anti-epidermal+growth+factor+receptor+nanobody%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Rapid visualization of human tumor xenografts through optical imaging with a near-infrared fluorescent anti-epidermal growth factor receptor nanobody.</a> Mol Imaging. 11, 33-46 (2012).</li>
<li>Gainkam, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+biodistribution+and+tumor+targeting+of+two+99mTc-labeled+anti-EGFR+nanobodies+in+mice%2C+using+pinhole+SPECT%2Fmicro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of the biodistribution and tumor targeting of two 99mTc-labeled anti-EGFR nanobodies in mice, using pinhole SPECT/micro-CT.</a> J Nucl Med. 49, 788-795 (2008).</li>
<li>Chakravarty, R., Goel, S., Cai, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody%3A+the+%27magic+bullet%27+for+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Nanobody: the 'magic bullet' for molecular imaging.</a> Theranostics. 4, 386-398 (2014).</li>
<li>Siontorou, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies+as+novel+agents+for+disease+diagnosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Nanobodies as novel agents for disease diagnosis and therapy.</a> International journal of nanomedicine. 8, 4215-4227 (2013).</li>
<li>Kaur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+trends+in+antibody-based+oncologic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Recent trends in antibody-based oncologic imaging.</a> Cancer Lett. 315, 97-111 (2012).</li>
<li>Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+targeting+to+tumors%3A+principles%2C+pitfalls+and+%28pre-%29+clinical+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Drug targeting to tumors: principles, pitfalls and (pre-) clinical progress.</a> Journal Of Controlled Release. 161, 175-187 (2012).</li>
<li>Jain, R. K., Stylianopoulos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+nanomedicine+to+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Delivering nanomedicine to solid tumors.</a> Nature reviews. Clinical Oncology. 7, 653-664 (2010).</li>
<li>Lisy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging+of+carcinoembryonic+antigen-expressing+tumor+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">In vivo near-infrared fluorescence imaging of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in mice.</a> Radiology. 247, 779-787 (2008).</li>
<li>Herzog, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cancer+heterogeneity+with+multispectral+optoacoustic+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cancer heterogeneity with multispectral optoacoustic tomography.</a> Radiology. 263, 461-468 (2012).</li>
</ol>

Friedrich Koch-Nolte ve Friedrich Haag, Hamburg-Eppendorf Üniversitesi Tıp Merkezi'nin yüzde yüz iştiraki olan MediGate GmbH aracılığıyla antikor ve protein satışlarından pay alıyor.

Bu, in vivo ve ex vivo analizler çok yönlü bir karşılaştırma için limfoma hücreleri üzerinde aynı hedefe karşı yakın kızılötesi flüorofor etiketli nanoantikorlar ve konvansiyonel monoklonal antikorlar kullanılır. Biz nanoantikorlar de lenfomaların hızlı ve spesifik in vivo tespiti için tanı araçları olarak uygun olduğunu göstermiştir. İn vivo olarak, + 16a 680 ARTC2 pozitif ksenograftlarının hızlı ve daha özel saptanmasına olanak s. Apart in vivo iyi tümör görselleştirme için farklı kinetik, Nika102 680 büyük dezavantajı ARTC2-negatif tümörler ve spesifik olmayan arka plan sinyalleri yüksek nonspesifik sinyal oldu. Kesilmiş tümör enjekte AF680-konjugatlarının ARTC2 negatif lenfoma hücrelerine herhangi bir spesifik olmayan bağlanma gösterdi gelen ex vivo akış sitometrik dağılmış hücrelerin analiz eder. Ex vivo floresan hemen hemen homojen güçlü ortaya çıktı venanobody 6 saat sonra tümör içinde hatta uzaktan bölgelere ulaşmak mümkün olduğunu teyit nanobody s + 16a durumunda ART2C-pozitif tümör bölümlerinde hücrelerin lı boyama. Bunun tersine, tek klonlu antikor, 6 saat sonra ARTC2-pozitif tümörlerde hücre artmış ve homojen olmayan bir lekelenme göstermiştir. Geleneksel antikor ile daha iyi görüntüleme sonuçları 24 saat ya da 48 saat sonra elde edilebilir (veri gösterilmemiştir). Iki farklı boyutlu yapıların tam bir karşılaştırma yapmak için, farklı zaman noktalarında (seri görüntüleme) ile görüntüleme, her bir yapı için en uygun görüntü zaman noktasını tanımlamak üzere gerçekleştirilebilir zorundadır. Önceki diğer çalışmalarda olduğu gibi, burada bildirilen sonuçlar in vivo etiketli nanoantikorlar moleküler görüntüleme yüksek tümör-zemin oranları 12-15,17-19 ile hızlı ve spesifik aynı gün tümör görüntüleme sağlar vurgulamak. Tersine, geleneksel antikorlar düşük tümör-to-arka oranları ve anti-gelen nonspesifik sinyallerine nedennedeniyle vücuttan onların yavaş açıklık erken enjeksiyondan sonra jeneratör negatif tümörler. Konvansiyonel antikorlarla uygun görüntüleme sonuçları elde etmek için, bir görüntüleme süresi 24 saat ya da enjeksiyon çok ihtiyaç duyulan sonra da 48 saat işaret eder. Bu bulgular, kanıtlanmış terapötik bir fayda ile, geleneksel antikorlar moleküler görüntüleme 17,19,26 kullanıma sınırlı olduğunu ileri sürmüşlerdir önceki çalışmalar ile uyum içindedir. Nanoantikorlar bağlı dolaşımından hızlı bir temizlenme için görüntüleme amaçları için oldukça uygundur iken Bu nedenle, geleneksel antikorlar nedeniyle uzun plazma yarı-ömrü için terapötik amaçlar için oldukça uygun olabilir. Bu farklılıklar, daha büyük, konvansiyonel antikorlarla (150 kDa), fazla dolaşımdan tutulmaya devam edildiği halde daha küçük nanoantikorlar (15-17 kDa) herhangi bir aşırı hızlı bir şekilde renal eliminasyon yoluyla temizlenir olmasından kaynaklanmaktadır. Yani moleküler görüntüleme için nanoantikorlar büyük avantajı erken görüntüleme zaman noktalarında düşük arka plan sinyali regardlenjekte edilen dozun ess. Aynı gün görüntüleme sağlar ve klinik bir ortam. Tersine çevrilebilir olabilir, geleneksel antikorlar tam olarak hedef dokuya (yayınlanmamış veriler) yeterli belirli bir sinyal korurken spesifik olmayan arka plan sinyalleri en aza indirmek için titre edilmelidir. In vivo NIRF-görüntüleme tekniği sınırlamalardan biri, genel değil ortotopik tümör modellerinin deri altı tek görüntüleme izin veren düşük penetrasyon derinliği. Ancak, bu sınırlama fareler 27 yaşam tüm vücut görüntüleme izin son zamanlarda geliştirilen tomografik fotoğraf-akustik teknikler ile deneysel bir ortamda üstesinden olabilir. Radyonüklid-aracılı görüntüleme ile karşılaştırıldığında NIRF-görüntüleme tekniği başka sınırlama doku doz değerlendirilmesidir. Ancak, nanoantikorlar ksenogref modelleri ve tam kantitatif değerlendirme pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntüleme için radyo-etiketli olabilirizleyici biyodağılımı. Gerçekten de, NIRF görüntüleme sonuçları nanoantikorlar PET görüntülemesi için geleneksel antikor göre yeni bir çalışma ile uygun olarak sunulmuştur. Yazarlar ayrıca nanoantikorlar yüksek tümör-zemin oranları 15 ile aynı gün görüntüleme izin sonuca geldi. Ancak, yakın-kızılötesi floresan boya AF680 ile antikor yapılarının yalnızca etiketleme in vivo, in vitro bize kapsamlı izin ve ex vivo yakın kızılötesi floresan görüntüleme karşılaştırma, akım sitometri floresan mikroskopi ve NIRF-görüntüleme kullanarak. O, radyoaktif olmayan ucuz, son derece hassas ve nispeten kolay üretmek hedeflenen problar kullanır, çünkü bu nedenle, ve biz preklinik moleküler görüntülemede yeni antikor yapılarının değerlendirilmesi için NIRF-görüntüleme tekniği kullanımını savunmaktadırlar.

Bu yazıda, ex vivo disseke ksenograft tümörlerinin flow sitometri ve floresan mikroskop kullanılarak in vivo ksenogref görüntüleme deneyleri onaylanması için yakın-kızılötesi fluorofor etiketli prob uygulanmasını açıklar. Tek bir etki nanobody (s + 16a, 17 kDa), 1 ve in vivo olarak belirli aynı hedef antijene karşı yönlendirilen tek klonlu bir antikoru (Nika102, 150 kDa), 2,3 karşılaştırın yakın kızıl ötesi bir lenfoma ksenogreft modelinde floresan görüntüleme. Hedef antijeni ADP-riboziltransferaz ARTC2.2 lenfoma hücreleri 4-9 tarafından bir GPI-ankorlu hücre yüzeyi ekto-enzim olarak ifade edilir. Camelid türetilen nanoantikorlar ağır zincir sadece antikorlar en küçük antijen bağlanma fragmanları, 10,11 vardır. Sadece ~ 15 kDa, bu küçük antikor fragmanları, çözünür, çok stabil olan ve böbrek yoluyla dolaşım 8,10 temizlenir. These özellikleri, in vivo 12-20 tümör antijenlerinin spesifik ve etkin bir hedefleme için özellikle uygun hale gelir. Mevcut nanoantikorlar ortak antijen hedefleri (EGFR1 veya HER-1), insan epidermal büyüme faktörü tip 2 (HER-2 veya CD340), karsinoembriyonik antijen (CEA) ve vasküler hücre yapışma molekülü-1 (VCAM-1, epidermal büyüme faktörü reseptörünün ) 21. Nanobody birleşikleri enflamatuar hastalıklar 22 kanseri immünoterapisi ve tedavisi için gelecek vaat eden araçlar. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, daha yüksek tümör-zemin (T / B) &#39;de in vivo moleküler görüntüleme uygulamalarında 8,17,19 geleneksel antikorlara göre -ratios nanoantikorlar izin göstermiştir. Bu hedefli olmayan dokularda 23 geleneksel antikorlar dolaşımdan yavaş açıklık ve uzun tutma nispeten zayıf ve yavaş doku penetrasyonu ile ağırlıklı olarak açıklanmıştır. Ayrıca, geleneksel antikor fazla spesifik olmayan birikimi i açarGelişmiş geçirgenlik ve tutma (EPR) neden n hedef antijen-negatif tümörler 24,25 etkilemektedir. Bu durum, bilinen antikor yüksek dozlarda bu şekilde elde edilebilen maksimum tümör-zemin oranını daha da azaltmak, belirli sinyallerini değil, aynı zamanda non-spesifik sinyaller sadece artış anlamına gelir. Bunun aksine, nanoantikorlar dozunun artırılması, normal dokuda değil veya antijen negatif tümör (yayınlanmamış veriler) antijen pozitif tümörlerinin sinyalleri arttırır. Nanoantikorlar ve konvansiyonel antikorlarla karşılaştırılması ötesinde, bağlı EPR etkisi, spesifik ve spesifik olmayan sinyallerin doğrudan bir karşılaştırma için, aynı farelerde antijen pozitif ve negatif ksenograftlarının bir bireyin kendi içindeki değerlendirme özetlemektedir. yakın kızılötesi fluorofor konjuge sondalar bize, yakın kızıl ötesi floresan görüntüleme kullanılarak yapılan in vivo ve ex vivo tek bir prob yararlanma akış sitometrisi, ve floresan mikroskobu bırakıldı. Bizim protokolleri uygulamak dışı için izin verirBu tür spesifik tümör hedefleme için yeni antikor yapıları değerlendirilmesi gibi in vivo moleküler görüntüleme deneyler, radyoaktif, son derece hassas ve ucuz bir optimizasyonu. Bu öğretici çalışmanın amacı klinik öncesi moleküler görüntülemede yeni antikor yapılarının değerlendirilmesi için NIRF-görüntüleme kullanımını vurgulamak için. Bu protokol, tüm deneyler, bir küçük hayvan NIRF-görüntüleme sistemi ile yapıldı, bir floresan aktive hücre ayırıcı (FACS) akış sitometresi ve konfokal mikroskop.

<table><tbody><tr><td>AF680 protein etiketleme kiti</td><td>Invitrogen</td><td>A20172</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16 / CD32 antikoru</td><td>BioXCell</td><td>BE0008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31-antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1506</td>, <td>AF488</td></tr><tr><td>Anti-CD45-antikoru V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560501</td><td></td></tr><tr><td>AxioVision LE yazılımı</td> ile ikincil antikor ile etiketlenmiştir <td>Zeiss</td><td>www.zeiss.com</td><td></td></tr><tr><td>Bodrum membran matrisi</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Alternatif ürün kullanılabilir</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci 70 & m</td><td>Corning</td><td>431751</td><td>Alternatif ürün</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>Leica SP5'i aşağıdaki lazerlerle www.leica-microsystems.com: AF680 için He-Neon, AF488 için Argon Lazer ve</td></tr><tr><td>DAPI DAPI</td><td>Moleküler Problar</td><td>için 405 Diyot D1306</td><td></td></tr><tr><td>DC27.10 hücreleri&nbsp;</td><td>laboratuvara özel</td><td></td><td>Farklı yüzey hedeflerine sahip diğer hücreler kullanılabilir</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>www.bdbiosciences.com</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mirkoskopu</td><td>Zeiss</td><td>www.zeiss.com</td><td>Zeiss Axiovert 200, AF680 için Filtre Seti #32: 000000-1031-354</td></tr><tr><td>ImageJ yazılımı</td><td>NIH</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>IVIS 200</td><td>Perkin Elmer</td><td>www.perkinelmer.com</td><td>Alternatif in vivo görüntüleme sistemi</td></tr> kullanılabilir <tr><td>Leica LAS yazılımı</td><td>Leica</td><td>www.leica-microsystems.com</td><td>Kullanılan mikroskoba özel yazılım</td></tr><tr><td>Living Image yazılımı</td><td>Perkin Elmer</td><td>www.perkinelmer.com</td><td>Kullanılan görüntüleme sistemine özel yazılım</td></tr><tr><td>İğneler 30 G</td><td>BD Biosciences</td><td>305128</td><td>Alternatif ürün kullanılabilir</td></tr><tr><td>Nika102-antikor AF680</td><td>laboratuvara özel</td><td></td><td>Farklı yüzey hedeflerine karşı diğer antikorlar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Potansiyel tehlikeler: kanserojendir, gözleri ve cildi tahriş edebilir, temas cildin kurumasına ve/veya alerjik dermatite neden olabilir</td></tr><tr><td>S+16A-nanobody AF680</td><td>laboratuvarı spesifik</td><td></td><td>Farklı yüzey hedeflerine karşı başka antikorlar da kullanılabilir</td></tr><tr><td>Şırıngalar 1 ml</td><td>Braun</td><td>916 1406 V</td><td>Alternatif ürün kullanılabilir</td></tr></tbody></table>

nanobody ve antikor temelli doğrulama<em&gt; İn vivo</emfarelerde&gt; tümör xenograftlarında nirf-görüntüleme deneyler kullanma<em&gt; ex vivo</em&gt; sitometrisi ve mikroskopi

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

Bu protokol, florofor etiketli nanokorlar ve konvansiyonel antikorlar kullanan farelerde in vivo yakın kızılötesi floresan (NIRF) ksenogreft görüntüleme deneylerinin ex vivo doğrulamasını gerçekleştirmek için gereken adımları ana hatlarıyla belirtir.
İlk olarak, birey içi karşılaştırma için aynı farelerde negatif kontroller olarak antijen-negatif hücre dizileri ve pozitif kontroller olarak antijen-pozitif hücreler kullanarak farelerde deri altı tümörlerin nasıl oluşturulacağını açıklıyoruz. İntravenöz yakın kızılötesi florofor etiketli (AlexaFluor680) antijene özgü nanokorların ve geleneksel antikorların nasıl uygulanacağını ana hatlarıyla açıklıyoruz. İn vivo görüntüleme, küçük hayvan NIRF-Görüntüleme sistemi ile gerçekleştirildi. İn vivo görüntüleme deneylerinden sonra fareler sakrifiye edildi. Daha sonra, in vivo görüntüleme sonuçlarını doğrulamak için tümörlerin akış sitometrisi ve floresan mikroskobu ile paralel ex vivo analizler için nasıl hazırlanacağını açıklıyoruz.
Yakın kızılötesi florofor etiketli nanocisimlerin kullanılması, in vivo olarak non-invaziv aynı gün görüntülemeye izin verir. Protokollerimiz, akış sitometrisi ile tümör hücrelerinin spesifik etiketleme etkinliğinin ex vivo olarak ölçülmesini ve floresan mikroskobu ile tümörler içindeki antikor yapılarının dağılımının analizini tanımlar. Yakın kızılötesi florofor etiketli probların kullanılması, akış sitometrisi ve floresan mikroskobu kullanan ex vivo doğrulama deneyleri için daha fazla ikincil etiketleme olmadan aynı probundan yararlanma konusunda benzersiz bir yetenekle invaziv olmayan, ekonomik in vivo görüntülemeye izin verir.

Floresan etiketli prob farklı NIRF-görüntüleme teknikleri (Şekil 1A) birleştirilmesine olanak sağlar. Bu in vivo görüntüleme (Şekil 1B) yer alan spesifik için floresan etiketli nanoantikorlar ve monoklonal antikorları karşılaştırmak amacıyla in vivo NIRF-görüntüleme gerçekleştirmek akış sitometrisi, ve floresan mikroskobu sekans amaçlanmıştır. Fareler in vivo görüntüleme için floresan işaretli yapıların özgüllüğünün değerlendirilmesi nanobody ve monoklonal antikor 50 ug enjekte edilmiştir. Sonuçlar, enjeksiyondan sonra 6 saat (Şekil 2) nanobody ve monoklonal antikor hem de antijen pozitif tümörlerinin belirli etiketleme göstermiştir. İB monoklonal antikor için ~ 6&#39;ya göre nanobody için çok daha yüksek bir T / B oranı ~ 12 gösterdi antijen pozitif tümörlerinin analiz eder. Ayrıca, nanobody ise antijen negatif tümör herhangi bir spesifik olmayan sinyal gösterdimonoklonal antikor, antijen negatif tümör spesifik olmayan karıştırıcı sinyalleri göstermiştir. Negatif tümörlerin spesifik olmayan sinyal yanında, monoklonal antikor, aynı zamanda tüm hayvanda spesifik olmayan arka plan sinyalleri endüklemişlerdir. Bu, böbrek yoluyla atılır kadar büyük olan aşırı serbest dolaşan antikorlar için olasıdır. Tersine, nanoantikorlar enjekte hayvanlar sadece küçük nanoantikorlar renal eliminasyonu nedeniyle böbreklerde nonspesifik sinyalleri gösterdi. Sitometrisi tümör hücre süspansiyonları analiz akış enjeksiyonundan sonra AF680-konjugatları 6 saat, her iki antijen pozitif tümör hücrelerinin spesifik etiketleme göstermiştir. monoklonal antikor etiketlenir hücrelere kıyasla nanobody işaretli hücrelerin güçlü bir floresan sinyali, in vivo NIRF görüntüleme sonuçlarını yansıtmaktadır. Önemli olarak, akış sitometrik analizi iki ya da antijen negatif hücrelerin herhangi bir spesifik olmayan etiketleme olduğunu ortaya koymaktadıryapıları (Şekil 3). Tümör cryosections floresans mikroskopisi enjeksiyonundan sonra nanobody 6 saat antijen pozitif hücrelerin güçlü ve hemen hemen homojen bir etiketleme göstermiştir. Tersine, monoklonal antikor, daha zayıf ve daha çok homojen olmayan bir boyama (Şekil 4A) göstermiştir. Antijen negatif tümör ara boşluk (Şekil 4B), geleneksel antikor göstermek spesifik olmayan dağılmış boyama enjekte ise antijen negatif tümör nanobody enjeksiyonundan sonra boyanma 6 saat göstermektedir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52462/52462fig1highres.jpg" /> Şekil 1: floresan görüntüleme ve antikor yapıları. Akış sitometrisi ve floresan mikroskobu ardından in vivo NIRF-görüntüleme: AF680-konjugatlarının değerlendirilmesi için, (A) Görüntüleme düzeneği. (B </strong&gt;) AlexaFluor680 şematik nanobody s + 16a (kırmızı) ve monoklonal antikor Nika102 (mavi) etiketli. Turuncu yıldızlı AlexaFluor680 fluorochromes göstermektedir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52462/52462fig2highres.jpg" /> Şekil 2: in vivo NIRF görüntüleme floresans sinyali görüntüleri antijen pozitif (+) ve antijen negatif (-) nanobody s + 16a (A) ve monoklonal antikor Nika102 (B) enjekte edilmiş farelerde tümörler. . in vivo görüntüleme (0 saat) ve enjeksiyondan sonra 6 saat önce yapıldı. Sinyal yoğunluk radyant verimi (s / s / cm2 / sr) / (uW / cm2) olarak gösterilir. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52462/52462fig3highres.jpg" /> Şekil 3:FACS için ex vivo, FACS analizi, tümör hücre süspansiyonları, hücre bağlı antikor yapıları (A). Ayırıcı strateji, tümör hücrelerinin analiz eder. (B) Histogramlar, özellikle in vivo olarak tümör hücrelerine bağlı, damar içinden enjekte AF680-konjüge nanobody s + 16a ve antikor Nika102 miktarını gösterir. Antijen-negatif tümörleri doldurulmayan histogramlar ve antijen pozitif tümörler olarak gösterildi dolu hıstogramlar olarak gösterilir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52462/52462fig4highres.jpg" /> Şekil 4:. 6 saat s + 16a 680 veya Nika102 680 enjeksiyonundan sonra tüm antijen pozitif tümör cryosections ex vivo floresan mikroskobu (A) Genel floresan mikroskobu. In vivo olarak, intravenöz olarak sinyal yoğunluklarıherhangi bir ikincil-etiketleme ajanlar olmadan maruz kalanlar AF680-Konjügatlar kırmızı görüntülenir. ex vivo zıt çekirdekler yeşil, mavi ve damarlarda görüntülenir. Noktalı çizgiler tüm tümörlerin dış kenar boşluklarını göstermektedir. (B) antijen pozitif ve negatif antijen-tümörlerin Close-up floresan mikroskobu.

Bu protokol, florofor etiketli nanokorlar ve geleneksel antikorlar kullanan farelerde in vivo yakın kızılötesi floresan ksenogreft görüntüleme deneylerinin ex vivo doğrulamasını gerçekleştirmek için gereken adımları ana hatlarıyla belirtir.

Nanobody ve Antikor Temelli Doğrulama<em&gt; İn Vivo</emFarelerde&gt; Tümör Xenograftlarında NIRF-görüntüleme Deneyler kullanma<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sitometrisi ve Mikroskopi

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

Bu prosedürün genel amacı, Fluor four ile işaretlenmiş nanogövdeler veya konvansiyonel antikorlar kullanarak farelerdeki in vivo yakın kızılötesi floresan xenograft görüntüleme deneylerinin ex vivo doğrulamasını gerçekleştirmektir. Bu işlem, önce hem antijen pozitif hem de negatif xenograft taşıyan farelere yakın kızılötesi fluoro dört ile işaretlenmiş antijene özgü antikorların ve konvansiyonel antikorların uygulanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise in vivo görüntülemenin yapılmasıdır.Görüntüleme sonrası, ksenogreftlerin çıkarılması için fareler sakrifiye edilir ve bu dokular ex vivo analizler için işleme alınır. Nihai olarak, in vivo görüntüleme sonuçlarını doğrulamak için ex vivo akış sitometrisi ve floresan mikroskobu kullanılır. Bu yöntemin nükleer görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre avantajı, yakın kızılötesi floresan boya kullanımının; akış sitometrisi, floresan mikroskobu ve yakın kızılötesi floresan görüntüleme için tek bir prob ile kapsamlı bir in vitro, in vivo ve ex vivo multimodalite görüntüleme karşılaştırmasına olanak tanımasıdır.Bu yöntem, cerrahi sırasında metastazların yerini belirlemek ve anti-tümör tedavilerinin etkinliğini izlemek gibi tümör görüntüleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Antikorların floroforlarla işaretlenmesi, hücreye bağlanan antikorların ex vivo olarak kesin şekilde miktarının belirlenmesini sağlar. Bu sayede, in vivo olarak gözlemlediğimiz spesifik sinyallerin hücre yüzeyi antijenlerine bağlanan antikorlardan mı kaynaklandığını, yoksa sözde artmış geçirgenlik ve tutulum etkisi nedeniyle spesifik olmayan sinyaller mi olduğunu ayırt edebiliriz.Tümör hücreleri enjekte edildikten yedi ila dokuz gün sonra, tümörlerin çapı yaklaşık sekiz milimetreye ulaştığında; önce fareleri görüntülemeye hazırlanın, oftalmik pomad uygulayın ve görüntüleme sistemini başlatın. Ardından, anestezi altındaki fareleri, tümörleri kameraya bakacak şekilde ısıtmalı platform üzerine yerleştirin.Görüntüleme odasında bulunan isof florun manifoldunu kullanarak, görüntüleme prosedürü boyunca %1 ila %2 oranında ISO florun seviyesini koruyun. Solunum hızlarını izleyin. Eğer solunum hızı çok yüksekse anestezi çok hafiftir; eğer yavaş veya düzensizse anestezi çok derindir.Ardından, bazal görüntüleme yapıldıktan sonra fareleri görüntüleyin. Farelerin kuyruk venine 200 µL serum fizyolojik hacminde 50 µg LOR six 80 etiketli antikor konstrüktü enjekte edin.Görüntüleme işleminden sonra fareyi ötanize edin, bir strafor bloğa sabitleyin ve %70 etanol ile temizleyin. Ardından, tümörleri açığa çıkarmak için deriyi kesin. Tümörleri bir bistüri ile çıkarın ve tümörlerin bütünlüğünü koruyun.Tümörler çıkarıldıktan sonra ikiye bölün; yarılarını fiksasyon analizi için BUZ üzerinde P-B-S-A-E-B-S-F çözeltisi içeren bir kaba, diğer yarılarını ise immünohistokimya için soğuk %4 PFA içeren hacimlerinin iki katı miktardaki çözeltiye aktarın. Dört santigrat derecede, fiksatif içerisinde 24 saat beklettikten sonra tümörleri %30 sükroz içeren PBS'ye aktarın ve çözeltinin içine tamamen çökene kadar dört santigrat derecede muhafaza edin. Ardından tümörleri, kriyomoldlara sığacak boyutlarda parçalara bölün.Kalıpları OCT bileşiği ile doldurun ve tümör parçalarını kalıplara aktarın. Dokular tamamen OCT içine daldırılmalıdır. Ardından kriyokalıpları kuru buza aktarın ve tamamen donduklarında, işleme alınana kadar minus 80 degrees Celsius'ta saklayın.Hücreleri hazırlamak için tümörün yarısını bir hücre süzgecine aktarın. Tümörü üç veya dört parçaya bölün, ardından 2 mL'lik bir şırınganın pistonunu çıkarın ve dokuyu süzgece karşı ezmek için bu pistonu kullanın. Süzgeçten süzülen çözeltiyi toplayın; dokular ezildikten sonra süzgeci PBS ile yıkayın.Ardından toplanan süspansiyonu yeni bir tüpe aktarın ve 500 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre peletini 0.2%BSA içeren 10 mililitre PBS içinde süspanse ederiz. Daha sonra hücreleri sayın, beş mililitrelik bir faks tüpüne 1 ila 5 milyon lenfoma hücresi olacak şekilde alikotlayın, tüpü 500 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın.Ardından hücreleri 0,2%BSA içeren 100 µL PBS içerisinde süspande edin. Bu aşamada, FC gamma R'ye bağlanacak bir antikor kullanarak FCR'yi bloke etmek mümkündür. 10 dakika bekleyin ve hücreleri 0,2%BSA içeren PBS ile bir kez yıkayın. Şimdi lökositleri tanımlamak için bir anti CD 45 monoklonal antikor ekleyin.Hücreleri bu antikorla karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin ve ardından faks analizi hemen öncesinde antikoru uzaklaştırmak için iki kez yıkayın. Ölü hücreleri belirlemek için hücreleri buz üzerinde 15 dakika boyunca propidyum iyodür ile boyayın. Daha sonra hücreleri sadece PBS ile temiz bir şekilde yıkayın.Bunu, hücreleri 150 µL PBS içinde süspanse ederek takip edin ve işlemlere devam edin. Floresan işaretli yapıların özgüllüğünü değerlendirmek için farelere 50 µg nanobody ve monoklonal antikor enjekte edildi. In vivo görüntüleme için.Tüm görüntülemeler, enjeksiyon akışından altı saat sonra gerçekleştirilmiştir. Tümör hücresi süspansiyonlarının sitometrik analizi, antijen pozitif tümör hücrelerinin her iki AF altı 80 konjugatı ile spesifik olarak işaretlendiğini göstermiştir. Her iki yapı ile de antijen negatif hücrelerde spesifik olmayan bir işaretleme gözlenmemiştir.Tümör. Kriyoseksiyonlar, nano beden ile antijen pozitif hücrelerin güçlü ve neredeyse homojen bir şekilde işaretlendiğini göstermiştir. Ancak, monoklonal antikor, beklenen antijenle çok daha zayıf ve heterojen bir boyama vermiştir.Negatif tümörlerde antikor boyanması gözlenmemiştir; antijen negatif tümörlerde ise konvansiyonel antikor enjeksiyonu sonrası interstisyel alanda spesifik olmayan dağınık boyanmalar görülmüştür. Bu durum, konvansiyonel antikor enjeksiyonu sonrası antijen pozitif tümörlerdeki boyanma görünümüyle oldukça benzerlik göstermiştir.Bu teknolojinin görüntüleme kısmı, bu prosedürün ardından tek bir günde gerçekleştirilebilir. Enjekte edilen konjugatların farklı dokulara biyodağılımını veya diğer soruları araştırmak için nanovücutların radyolojik etiketlenmesi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, fluoro four etiketli bir prob ile in vivo, yakın kızılötesi floresan görüntüleme deneyiminizin multimodality ex vivo doğrulamasını nasıl yapacağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Böylece, preklinik moleküler görüntüleme için yeni antikor konstrüktlarının değerlendirilmesine yönelik bir teknik sunulmuş olur.

validation-nanobody-antibody-based-vivo-tumor-xenograft-nirf-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Biz bir kuş embriyo modeli dinamik, gerçek zamanlı intravital görüntüleme kullanarak insan xenografted tümörlerin vasküler nanoparçacık yerelleştirme ölçmek için yeni bir yaklaşım sunuyoruz.

Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

Bitki viral nanopartiküller (VNPs) biyomedikal uygulamalar için platformlar umut vericidir. Burada, biz bitki VNP yayılımı, saflaştırma, karakterizasyon ve bioconjugation ilişkin prosedürler anlatılmaktadır. Son olarak, biz bir fare ksenogreft model ve floresan görüntüleme kullanılarak tümör homing ve görüntüleme için VNPs uygulama göstermektedir.

Viral Nanopartiküller<em&gt; In vivo</em&gt; Tümör Görüntüleme

Video, bir fare tümörü ksenogreft modelinde in vivo antikor lokalizasyonu için bir floresan görüntüleme yöntemini göstermektedir. Deri altında katı ksenogreftler oluşturmak için bir fareye tümör hücrelerinin enjeksiyonunu içerir. Floresan antikorların müteakip enjeksiyonu, tümör ksenogrefti içindeki gelişmiş floresan sinyalleri yoluyla spesifik lokalizasyonu doğrular.

Bir fare tümörü ksenogreft modelinde antikorları lokalize etmek için in vivo floresan görüntüleme

Nanoilaçların in vivo performansının zayıf anlaşılması, klinik translasyonlarını engellemektedir. Tümör taşıyan immünokompetan farelerde kanser nanoilaçlarının sistemik, doku, tek hücreli ve subselüler düzeylerde in vivo davranışını değerlendirme prosedürleri burada açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, araştırmacıların klinik çeviri için umut verici kanser nanoilaçlarını tanımlamalarına yardımcı olabilir.

Kapsamlı Usulü değerlendirin<em&gt; İn Vivo</em&gt; Kanser Nanomedicines performans

Biz kanseri metastaz preklinik vivo içinde takibi için bir iletişim kuralı tanımlamak. Non-invaziv [18F] tetrafluoroborate-evde beslenen hayvan ve aerodinamik ex vivo onay floresan bir protein tarafından algılanan sodyum iyodür simporter birleştiren bir radyonüklid Floresans muhabir dayanmaktadır. Preklinik in vivo hücre tümör biyolojisi izleme için uygun bir yöntemdir.

Kemirgen tümör modelleri ilerlemesinde tümör izlemek için Imaging radyonüklid Floresans muhabir gen

Burada kollarındaki kullandığımız, x-ışını nasıl inhibe mTOR etkinlik çalışmaya ve pozitron emisyon tomografi/bilgisayarlı tomografi Imaging etkileri myeloma kemik iliği engrafted tümörler bir xenograft modeli. Bu myeloma kemik iliği engrafted tümör vivo içindehedefleme terapiler Anti-miyelom etkisini fizyolojik ilgili, non-invaziv ve multimodal analizleri için sağlar.

Multipl Miyelom kemik iliği Xenografts NOG farelerde Multimodal kollarındaki ve pozitronik emisyon tomografi/Hesaplamalı tomografi görüntüleme

In vivo immünfloresans lokalizasyonu (IVIL) yöntemi, in vivo tümör hedeflemesi ve ekzo immünboyama kombinasyonu nu kullanarak canlı organizmalarda onkolojik amaçlarla antikor ve antikor konjugatörlerinin in vivo biyodağılımını incelemek için kullanılabilir. Yöntemler.

Kanser Araştırmalarında Terapötik ve Tanısal Antikor Biyodağılımının Değerlendirilmesi için In Vivo Immunofluoresence Lokalizasyonu

Burada fare tümörü ksenogreft modellerinde antikorların in vivo lokalizasyonunu incelemek için bir protokol sayılmaktadır.

Hedef Antijen Spesifik Terapötik Antikor tümör ve doku dağılımının analizi

Bu yazıda, uzun bozunma yayan numunelerin makroskopik fotolüminesans ömür boyu görüntülenmesi için yeni, hızlı bir optik görüntüleyicinin kullanımı açıklanmaktadır. Entegrasyon, görüntü toplama ve analiz prosedürleri, görüntüleme için sensör malzemelerinin hazırlanması ve karakterizasyonu ve görüntüleyicinin biyolojik numunelerin incelenmesinde uygulanması ile birlikte açıklanmaktadır.

Biyomedikal Uygulamalar için Floresan Ömür Boyu Makro Görüntüleyici

Burada, onkojenik nükleik asitlerin terapötik susturulması için klinik olarak uygulanabilir bir yaklaşım sağlayarak, RNA oligomerlerini taşıyan manyetik demir oksit nanopartiküllerinin hayvan modellerinde metastatik meme kanserine in vivo olarak verilmesi için protokolü açıklıyoruz.

Murin Meme Kanseri Metastazlarında Nanoilaç Birikiminin İzlenmesi

Kan-beyin bariyeri, tedavisi olmayan bir hastalık olan glioblastoma için tedavilerin uygulanmasında önemli bir engeldir. Burada, boyut nedeniyle bu fizyolojik bariyeri atlayabilen ve tümör içinde birikebilen in vivo görüntü kılavuzluğunda demir oksit terapötik nano bir platform sunuyoruz.

Bir Glioblastoma Multiforme Hayvan Modelinde Bir Oligonükleotid Yükünün Nanopartikül Teslimi

Öğrenin, farelerdeki tümör ksenogreftlerinde yakın kızılötesi floresan görüntüleme deneylerinin ekso validasyonunu nanobody ve antikor kullanarak yapmayı. Bu yöntem, akış sitometrisi ve floresan mikroskopi ile görüntüleme sonuçlarını doğrulamanıza yardımcı olur.

Nanobody ve Antikor Temelli Doğrulama İn Vivo Tümör Xenograftlarında NIRF-görüntüleme Deneyler kullanma Ex vivo Sitometrisi ve Mikroskopi (Video) | JoVE Journal

Nanobody ve Antikor Temelli Doğrulama

Daha fazla video keşfet