Transfeksiyon, Seçim ve İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Colony-toplama AAVS1 Safe Harbor içine GFP geninin ile TALEN-hedefli

Bu prosedürün genel amacı, GFP'yi eksprese eden bir güvenli liman, hedeflenmiş indüklenebilir pluripotent kök hücre veya IPSC klonlarına karşı izole bir AA oluşturmaktır. Bu, önce bir AAV'nin bir pençesi ve bir A VS bir C-A-G-E-G-F-P donör plazmitlerinin çekirdek sevgisi ile IPC'lere verimli bir şekilde verilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, fare embriyonik besleyici hücrelerinde A a ve bir hedeflenen hücreler pur misin ile seçilir.

Daha sonra, A'YA KARŞI hedeflenen klonları ifade eden bireysel GFP, matrigel kaplı 96 oyuklu bir plakaya alınır. Son adımda, A A VS bir G-F-P-I-P-S-C klonları, E sekiz orta ve standart IPSC kültür teknikleri ile genişletilir. Sonuç olarak, immünofloresan mikroskobu ve akış sitometrisi, AA VS bir hedefli insan IPSC klonlarında GFP'nin düzgün ve sağlam ekspresyonunu göstermek için kullanılır.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü koloni toplama adımları, yan yana talimat sırasında öğrenilmesi zor olan bir mikroskop altında özel koloni toplama araçları kullanılarak hedeflenen klonların mikro diseksiyonunu içerir. IPSC kültürlerini PBS ile her biri bir kez yıkayarak başlayın. Daha sonra, her bir oyuğa bir mililitre 37 santigrat derece yumuşak hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve hücrelerin% 50'sinden fazlası kültür kabından ayrıldığında hücreleri yaklaşık beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Kalan hücre kümelerini veya bağlı hücreleri mekanik olarak parçalamak için bir P 1000 pipeti kullanın. Daha sonra her bir oyuğa iki mililitre E sekiz ortam ekleyin ve kültürleri tek hücreli süspansiyonlara ayırmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Şimdi hasat edilen hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın ve döndürün.

Saymak için peleti minimum miktarda E sekiz ortamında yeniden askıya alın. Daha sonra, kültürlerin trian mavisi dışlama ile canlılığını ve yeterli ayrışmalarını doğruladıktan sonra, santrifüjleme hücreleri elektroporasyon sistemini insan embriyonik kök hücre hattı H dokuz için hücre tipine özgü programa ayarlarken, iki adet 15 mililitrelik konik tüpün her birine 3 milyon hücre transfer edildi. Daha sonra, kontrol numunesi için bir pelete tek başına 10 mikrogram homolog rekombinasyon donörü ve deney numunesi için her bir pençe plazmidinden beş mikrogram ile birlikte 10 mikrogram homolog rekombinasyon donör plazmidi ekleyin.

Daha sonra, kontrol ve deneysel peletlerin her birine 100 mikrolitre oda sıcaklığında tam P üç birincil hücre transfeksiyon çözeltisi ekleyin ve hücreleri yeniden süspanse edin. Numuneleri ayrı küvetlere aktarın ve ardından transfeksiyondan hemen sonra numuneleri yedim. Her bir Q vet'e 500 mikrolitre oda sıcaklığında E sekiz orta ekleyin ve ardından transfekte edilmiş IPSC örneklerini DR dört fare embriyonik fibroblastı içeren ayrı 10 santimetrelik kaplara damla damla aktarın Kolonileri toplamadan önce, 96 oyuklu bir plakayı 50 mikrolitre bazal membran matris çözeltisi ile birlikte öğretin ve ardından plakayı ertesi sabah gece boyunca dört santigrat derecede saklayın.

Plaka oda sıcaklığına ulaştığında, fazla çözeltiyi aspire edin ve her bir kuyucuğu 10 mikromolar Y 2 7 6 3 2 ile desteklenmiş 100 mikrolitre E sekiz ortamı ile doldurun. Daha sonra, ters çevrilmiş bir mikroskobu biyolojik güvenlik kabinine yerleştirin ve %70 etanol içeren hafif bir sprey ile sterilize edin. Ardından, %70 etanol ile sterilizasyondan sonra ucunda küçük bir kanca bulunan bir koloni toplama aleti oluşturmak için bir bunsen brülörünün üzerine bir cam mera pipeti yerleştirin.

Kancayı kuruması için davlumbazın içine yerleştirin ve ardından klonları toplamak için IPSE kültürünü mikroskop aşamasına yerleştirin. Düşük büyütme altında uygun bir koloniyi bulun ve onu izlemek ve dörde bölmek için koloni toplama aracını kullanın. Daha sonra, dörde bölünmüş koloniyi kültür kabından nazikçe kazıyın ve serbestçe yüzen IPC'leri toplamak için yaklaşık 30 mikrolitreye ayarlanmış bir P 200 pipet kullanın ve hücreleri doğrudan bazal membran matrisi üzerine kaplayın.

Hasat edildiklerinde, IPC'ler kaplamadan sonraki iki ila dört saat içinde bağlanmalıdır. Son olarak, toplanan kolonileri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve ertesi sabah hücreleri tam E sekiz besiyeri ile yenileyin. Deney boyunca yalnızca yüksek kaliteli I PSC'leri transfekte etmek önemlidir.

IPSC kültürleri, burada görülen hücreler ve farklılaşmış hücreler kültürün %10'undan fazla olmaması gerektiğinden, parke taşı benzeri bir morfoloji taşıyan esas olarak farklı koloniler içermelidir, IPC'lerin transfekt yeteneği, küçük PAX GFP vektörü kullanılarak değerlendirilebilir ve optimize edilebilir, çünkü PAX GFP ile transfeksiyon tipik olarak küçük boyutu nedeniyle elde edilebilecek maksimum verimliliği temsil eder. Bir A VS bir C-A-G-E-G-F-P intel ve transfekte edilmiş IPC'lerin geçici ifadesi, transfeksiyondan 48 ila 72 saat sonra zirve yapar ve bu, transfekte edilmiş hücrelerin küçük bir kısmı ile akış sitometrisi ile doğrulanabilir. Transfeksiyon verimliliği büyük ölçüde değişebilir.

A ile yapılan deneylerde bile, GFP pozitif fraksiyonu sadece %10'dur: Tek tip bir floresan gösteren bireysel klonlar, saf misin seçiminden sonra koloni toplama için yeterince büyük olmalıdır. Ayrıca, 96'da bir kez, genişletilmiş hedeflenen IPSC klonlarının iyi biçimlendirilmesi, GFP'nin kararlı ve tek tip bir ifadesini sergilemelidir. Bu videoyu izledikten sonra, I PSC'leri nükleer sevgiyle verimli bir şekilde nasıl geçireceğinizi ve AV'yi güvenli bir limanda nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Koloni toplama araçlarını kullanarak hedeflenen IPSE klonları.