Name: Mast Hücre Salgı granüller incelenmesi; biyosentezi adlı ekzositozu için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 1 s
Description: Öğrenin mast hücrelerinde ekzositoz mekanizmalarını floresan raportör gen kullanarak incelemeyi. Bu yöntem, sekretuar granüllerin gelişimini ve salınımını nicel olarak analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz NPY-MRFP cDNA hediye Dr. U. Ashery teşekkür ederim. Biz Dr teşekkür ederim. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani ve mikroskobu ile paha biçilmez yardım için Y. Zilberstein ve görüntü analizleri. Biz de bu yazının eleştirel okuma Dr Joseph Orly teşekkür ederim. Bu çalışma Bilimler Akademisi İsrail tarafından kurulan İsrail Bilim Vakfı hibe tarafından desteklenmiştir (1139-1112 RS-e için.).

RBL hücre kültür ortamının hazırlanması 1. <ol><li> (Bu durum, örneğin% 1 PEST) yapar (bu% 10 FBS yapar) cenin sığır serumu, 56 ml düşük glikoz Dulbecco modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM), 500 ml karıştırın ve penisilin streptomisin 5.5 mi ekleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de 0.22 mikron gözenek büyüklüğüne ve mağaza ile 500-1000 ml Şişe-Üst Vakum Filtreler kullanarak ortamı Filtre. </li></ol> RBL hücrelerinde 2. Kültür <ol><li> Ya da plakalar veya şişeler içinde, 37 ° C&#39;de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde, RBL hücreleri büyütün. 10 cm plakalar içinde büyüyen RBL hücreleri 10 ml ortam ile takviye edilmiş ve ~ 10 7 hücre / levha konfluent tek tabaka oluşturmak gerekmektedir. </li><li> Hücre tabakası birleştiği yaklaşan zaman, daha düşük bir yoğunlukta kültür Replate. <ol><li> Vakum bağlı steril pastör pipet kullanılarak plaka / şişeden kültür ortamı çıkarın. </li><li> (37 prewarmed hücre tek tabaka durulayınTüm tek tabaka (hacim kültürü plakası / şişenin büyüklüğüne bağlıdır kapsayan ° C),% 0.25 tripsin / EDTA, 10 cm plaka 2 ml) eklenmiştir. Bu hücreleri ayırmak olacaktır. </li><li> Alternatif olarak, fosfat hücre tek tabaka serum fizyolojik (PBS) ilave edilmeden durulama PBS kaldırmak ve / EDTA önceden ısıtılmış (37 ° C), tripsin ekleyin. Bu adım hızlı hücreleri ayırır. </li><li> 37 ° C&#39;de (en fazla 10 dakika) bir kuluçka makinesi içinde tabaka / içine yerleştirilir. </li><li> Onlar müstakil varsa kontrol etmek için optik mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Hücreler 10 dakika sonra ayırmak olmadıysa, yavaşça plaka / balona dokunun. </li><li> Hücrelerin süspansiyonu kültürü plakası / şişeye ortamı ilave edin (ortamının hacmi, en azından bir tripsin çözeltisinin hacmi daha büyük 2 misli olmalıdır). </li><li> 25 ° C&#39;de, 200 g, 3 dakika boyunca santrifüj ile pelet hücreleri. </li><li> Orta hücrelerin tekrar. 01:10 hücreleri sulandırmak ve yeni bir kültür çanak tohum. Onlar reac kadar, 48-72 saat inkübe hücrelerih, yaklaşık% 90 birleşir. </li><li> 3 aya kadar (30 pasajlar) için aynı prosedürü (bölüm 2.2.1-2.2.8) tekrarlayın. </li></ol></li></ol> Transfeksiyon Medya 3. hazırlanması. <ol><li> K-Borular, pH 7, Ca 2 + asetat, 1 mM çözeltisi ve Mg2 + asetat, 100 mM çözelti bir 100 mM çözelti hazırlayın. </li><li> DMEM ortamı kullanılarak 20 mM içine K-Borular, pH 7, 100 mM&#39;lik çözelti ile seyreltilir, 2 arasında nihai bir konsantrasyona kadar 10 uM ve Mg2 + asetat, 100 mM çözeltinin nihai bir konsantrasyona kadar Ca2 + asetat, 1 mM çözeltisi ekleyin mM. </li><li> Potasyum glutamat tartılır ve 128 mM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için çözeltiye eklenir, iyice karıştırılır ve kullanılana kadar 4 ° C&#39;de tutun. -20 ° C&#39;de kalan çözümleri (yani., K-Borular, Ca 2+ asetat, Mg 2+ asetat) tutun. </li></ol> RBL hücrelerinde 4. transfeksiyonu <ol><li> Bir kullanarak plakası / şişesi kültür ortamı çıkarınvakum bağlı steril pastör pipet. </li><li> Tüm tek tabaka kapsamalıdır önceden ısıtılmış (37 ° C) tripsin / EDTA ile hücre mono tabakasının durulayın. 37 ° C&#39;de (en fazla 10 dakika) bir kuluçka makinesi içinde tabaka / içine yerleştirilir. Hücreler, optik mikroskop kullanılarak müstakil varsa kontrol edin. </li><li> Hücrelerin süspansiyonu kültürü plakası / şişeye ortamı ilave edin (ortam hacmi tripsin çözeltisinin hacmine göre en az 2 daha fazla olmalıdır). </li><li> Hemasitometre kullanarak hücre sayısını sayın. </li><li> 25 ° C&#39;de 200 x g&#39;de 3 dakika boyunca santrifüj ile 1.5 x 10 7 hücre Pelet. Süpernatantlar atın ve transfeksiyon orta 280 ul ekleyin. 4 mm&#39;lik küvetin içine Reaksiyon karışımı aktarın. </li><li> Ekle NPY-MRFP plazmid 20 ug ve boş kontrol plasmidi ya da bir test plazmid ya da 30 ug. Reaksiyon karışımı nihai hacim 300 ul olmalıdır. </li><li> Hemen 10 dakika süreyle buz üzerine yerleştirin. Kalıntı su ve p gelen küvet silin9 ms 300 V elektroporasyon roceed. </li><li> Ekzositozu ölçümleri için, 300 ul ortam ihtiva eden 24 oyuklu doku kültür tabaklarında hücrelerin hemen Replate. Her bir reaksiyon karışımı (4 x 10 5 hücre) 8 ul ekleyin. Kontrolü için ek oyuklara 4 x 10 5 olmayan transfekte edilmiş hücrelerin ekleyin. En azından her transfeksiyon için her tedavi için kuyu çoğaltmak olması için yeterli kuyuları hazırlayın. </li><li> Zaman atlamalı mikroskopi için, 80 ul ortamı içeren bir 8-iyi odasının borosilikat coverglass sistemi hemen hücreleri Replate. Her bölme için, reaksiyon karışımı (7.5 x 10 4 hücreleri), 1.5 ul ekleyin. (Coverglass merkezinde odaları görüntü kolay coverglass kenarında odaları kullanmaktan kaçınmak için deneyin). NOT: Önemlisi, tüm hücreleri bir tetikleyici cevabını değildir ve bazen time-lapse mikroskopi sayesinde 8-iyi odasının borosi odak kaybı ve sürüklenme bindiğilicate coverglass sistemi. Bu nedenle, her bir transfeksiyon için her bir işlem için en az 8 bölmeleri hazırlar. </li><li> FcεRI aracılı aktivasyonu için hücrelerin duyarlılaştırılması için, ortam (en az 2 saat süreyle IgE ile hücrelerin inkübe) fare DNP&#39;ye özel monoklonal IgE 1 ug / ml ekleyin. </li><li> 18-24 saat sonra hücreler plazmidler ifade onaylamak için bir floresan mikroskop kullanın. MRFP floresan eksitasyon ve emisyon dalga boyları: λEx 584, λEm 607 nm. NPY-MRFP SG- karşılık veziküler yapılar görünmelidir. İlgi ikinci gen, bir floresan etiketi kaynaşır ise aynı hücreler, her iki plasmidin birlikte-sentezlenmesini teyit etmek üzere bir floresan mikroskop kullanılır. Test edilen gen GFP&#39;ye birleştirilmiş Örneğin, GFP floresan eksitasyon ve emisyon dalga boyları: λEx 488, λEm 507 nm. GFP etiketli protein NPY-MRFP ifade eden aynı hücrelerde görünmelidir. </li><li> Ekzositoz ölçümleri için t devamo adım 5 ve zaman atlamalı mikroskopi için, 6. adıma geçin. </li></ol> 5. NPY-MRFP Ekzositoz Ölçme <ol><li> Tyrode tampon hazırlanması: <ol><li> 54 mM KCI, 20 mM MgCl2, 2.74 M NaCl ve DDW içinde 8 mM NaH 2 PO 4 içinde bir çözeltisi hazırlandı. İyice karıştırın ve 4 ° C&#39;de saklayın. Bu aşama, 20x Tyrode tamponu ile hazırlanır. </li><li> 20 mM Hepes çözeltisi, pH 7, 1.8 mM CaCl2, 1 mg / ml BSA, 5.6 mM glukoz ve DDW içinde Tyrode 20x arasında 1-20 seyreltme hazırlayın ve iyice karıştırın. Bu adım, 1x Tyrode tamponu ile hazırlanır. </li><li> -20 ° C&#39;de 1x Tyrode tamponu ve mağaza alikosu. Tekrarlanan donma ve çözülme kaçının. </li></ol></li><li> 24 plaka kültür ortamının çıkarın ve Tyrode tamponu ile 3 kez yıka. Kontrol kuyularına, 200 ul Tyrode tamponu ilave edilerek uyarılmamış hücreler hazırlayın. </li><li> / Oyuk 20X 10 ul reaktif [(örneğin, 1000 ng / ml DNP-BSA ya da DNP aktive konsantre edildi hazırlanması-HSA (Ag), 200 uM Ca 2 + iyonoforu (örneğin, A23187) ve 20 uM Ca 2 + iyonofor ve 1000 nM 12-O- tetradekanoilforbol-13-asetat (TPA)] bir kombinasyonu. Reaktifler DMSO içinde saklanır ise,% 1 DMSO içeren Tyrode tamponu içinde 20x konsantrasyonu reaktifler sulandırmak. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Bir 96 çukurlu levhaya iyi dikkatle her süpernatantlar kaldır buz üzerine yerleştirin ve ışıktan kaçının. (Yüzer hücrelerinden salıverildi kimerik peptid NPY-MRFP içerir). </li><li> Her kuyuya% 0.5 Triton X-100 ihtiva eden 200 ul Tyrode tamponu ilave edin ve 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. (Bu adım hücrelerinden salınan değildi NPY-MRFP kalan içeren hücre lizatları hazırlanması için önemlidir). Hücre lisatlan toplayın ve bir 96 çukurlu levhaya transfer buz üzerine yerleştirin ve ışıktan kaçının. </li><li> Bir fluoresc kullanılarak hücre süpernatanları ve hücre lizatlarının floresan ölçümüence plaka okuyucu, bir 590-, 20 nm bant genişliği uyarma filtresi ve 635-, 35 nm bant genişliği emisyon filtre kullanarak. </li><li> Serbest NPY-MRFP yüzdesini hesaplayın: NOT: floresan okuyucu önlem keyfi floresan üniteleri (AFU). AFU değerleri makine ve duyarlılık ve transfeksiyon verimliliğine bağlıdır. <ol><li> Boş olarak transfekte RBL hücreleri otofloresans ayarlayın. Toplam floresan her süpernatant AFU (süpernatanlarında ilgili lizatın + AFU ve AFU) bölün ve 100 ile çarpın. </li></ol></li></ol> Ekzositozu 6. Time-lapse Mikroskopi <ol><li> 8-iyi odasının borosilikat coverglass sistemi transfekte hücre / odasının 7.5 × 10 4 Tohum. 18-24 saat sonra, odalar kültür ortamının çıkarın ve Tyrode tamponu ile 3 kez yıkayın </li><li> Her bölmeye Tyrode tamponu 72 ul ekle. 10x konsantrasyon Tyrode tampon içinde aktive edici reaktifler seyreltin. </li> &lt;li&gt; ısıtılmış odasının (37 ° C) ve CO 2 kontrolör (% 4.8) ve 40X veya 63X amacı ile donatılmış bir konfokal floresan mikroskop kullanın. Mikroskop sistemleri açın: cıva lambası, bilgisayar, ve lazerler. Isıtmalı odası deney başlamadan önce doğru sıcaklıkta olduğundan emin olun. </li><li> Isıtmalı odasında odasına yerleştirin ve oda doğru ve istikrarlı yüklü olduğundan emin olun. </li><li> İlgili florofora göre floresan ışığı açın ve transfekte hücreleri görselleştirmek. Söz konusu bir hücreye ağartma ve sitotoksisite en aza indirmek için bu alanda bir kez floresan kapatın. Bu alan 2-3 transfekte edilmiş hücreleri ihtiva etmesi önemlidir. Transfekte hücreler de yayıldı ama birbirlerine dokunmadan değil edilmelidir. </li><li> Gürültü ve doyma gibi toksisite en aza indirmek için (mikroskop bağlı) lazer gücü ayarlayın ve kazanç ayarlamak ve sinyal gürültü oranı değiştirmek için ofset. Hızlı tarama veyader lazer fuar (ortalama 2) süresini en aza indirmek için. </li><li> Bu lazer gücünü azaltarak sağlar, maksimum iğne deliği boyutunu ayarlayın ve uzun bir süre için odaklanmış görüntüleri korumak için. İstenirse Z yığını iki-boyutlu konfokal optik dilim üç boyutlu, gürültü oranı için en iyi sinyal veren 1 havadar ünitesi (AU) iğne deliği boyutunu ayarlamak ve kazanmak ardışık tarama görüntü yeniden için, parametrelerini ayarlamak optik dilim ≤0.7 um z -axes. </li><li> 15-30 sn her edinimi ve 15 dakika toplam satın alma süresi arasındaki süreyi ayarlayın ve görüntüleri elde başlayın. Iktisap 5 dakika sonra zaman serisini duraklatmak. 10x tetikleyici 8 ul ekleyin ve hemen satın devam edin. </li><li> , Resimleri kaydetmek, bir Dekonvolüsyonun yazılımı kullanarak dekonvulasyon gerçekleştirmek ve üç boyutlu görüntüler ve Imaris yazılımını kullanarak bir film yığınları yeniden. </li></ol><ol><li> Imaris yazılımı konfokal floresan mikroskop ile elde edilmiştir açılmış zaman serisi görüntüleri veri alma. Bu yazılım fazla 40 mikroskopi dosyaları okur. Yazılım dosyalarını okuyamaz ise; tif dosyaları ve ithalat dosyalarını dönüştürebilirsiniz. </li><li> Açık veri seti basın düzenlemek sonuna zaman noktaları eklemek için -&gt; set yeni veri Zaman Points ekleyin ve ithalat. </li><li> Yüzey sihirbazı seçeneğini kullanarak MRFP kanalının yüzeyini oluşturun. Varsayılan algoritması seçin. NPY-MRFP kanalını seçin. Gürültüyü azaltmak için düzeltme seçeneği işaretleyin. Küçük detaylar 0.05 um alan ayrıntı düzeyini azaltmak kaybını önlemek için. </li><li> Yoğunluk eşiği ayarlayın. Yeni gri yüzey görüntülenir. &quot;Ayarlar&quot; gidin ve &quot;Merkez noktası&quot; için &quot;Surface&quot; den stili geçiş. </li><li> Seçilen nesnenin özelliklerinde istatistik sekmesine gidin detaylı sekmesini ve özel bir değer suc seçinfloresan yoğunluğu olarak saat, hacim vs. </li><li> Verileri gözden ve değerler görüntüleri ile uyumlu olduğundan emin olun. Örneğin, iki veya daha fazla bitişik tanecikler, bir daha büyük bir granül olarak ölçülebilir. Ortalama granül boyutu ölçülmesi için granül gerçek sayısı, birleştirilmiş granül boyutunu bölün. </li><li> Excel dosyaları istenen veri setlerini İhracat ve verileri analiz. </li></ol> f

<ol><li>Abonia, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+mast+cells+in+eosinophilic+esophagitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis.</a> J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).</li>
<li>Galli, S. J., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+in+allergy+and+infection%3A+versatile+effector+and+regulatory+cells+in+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity.</a> Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).</li>
<li>Ribatti, D., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+controversial+role+of+mast+cells+in+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The controversial role of mast cells in tumor growth.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).</li>
<li>Ribatti, D., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells%2C+angiogenesis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mast cells, angiogenesis and cancer.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).</li>
<li>Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+and+immunoregulation%2Fimmunomodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mast cells and immunoregulation/immunomodulation.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).</li>
<li>Vries, V. C., Noelle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+mediators+in+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cell mediators in tolerance.</a> Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).</li>
<li>Kirshenbaum, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+that+human+mast+cells+arise+from+a+progenitor+cell+population+that+is+CD34%28%2B%29%2C+c-kit%28%2B%29%2C+and+expresses+aminopeptidase+N+%28CD13%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13).</a> Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).</li>
<li>Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mast cells.</a> Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).</li>
<li>Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+biology%3A+introduction+and+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mast cell biology: introduction and overview.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).</li>
<li>Rivera, J., Gilfillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+mast+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of mast cell activation.</a> J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).</li>
<li>Rivera, J., Gilfillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+mast+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of mast cell activation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214(2006).</li>
<li>Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agents+that+release+histamine+from+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Agents that release histamine from mast cells.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).</li>
<li>Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-dependent+down-regulation+of+antigen-specific+immune+responses+by+mosquito+bites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites.</a> J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).</li>
<li>Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+evades+the+extracellular+antimicrobial+activity+of+mast+cells+by+promoting+its+own+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake.</a> J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).</li>
<li>Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+Toll-like+receptor+4+and+mast+cell-dependent+innate+immunity+responses%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses.</a> IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).</li>
<li>Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunoglobulin+E-Toll-like+receptor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunoglobulin E-Toll-like receptor network.</a> Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).</li>
<li>Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+adenosine+receptors+function%3A+a+focus+on+the+a3+adenosine+receptor+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation.</a> Front Immunol. 3, 134(2012).</li>
<li>Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+release+of+mast+cell+mediators+and+the+pathogenesis+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation.</a> Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).</li>
<li>Caughey, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+proteases+as+protective+and+inflammatory+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).</li>
<li>Lundequist, A., Pejler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+implications+of+preformed+mast+cell+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Biological implications of preformed mast cell mediators.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).</li>
<li>Metz, M., Maurer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells--key+effector+cells+in+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cells--key effector cells in immune responses.</a> Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).</li>
<li>Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+as+a+source+of+multifunctional+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">Mast cells as a source of multifunctional cytokines.</a> Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).</li>
<li>Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+regulation+of+mast+cell+exocytosis+by+networks+of+Rab+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases.</a> J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).</li>
<li>Stenmark, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+rab5+GTPase+activity+stimulates+membrane+fusion+in+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis.</a> EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).</li>
<li>Azouz, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab5+is+a+novel+regulator+of+mast+cell+secretory+granules%3A+impact+on+size%2C+cargo%2C+and+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis.</a> J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).</li>
</ol>

Yazarların herhangi bir finansal çıkar çatışması yoktur.

Biz ekzositoz için bir raportör gen kullanılarak canlı hücrelerde SG- zaman-lapsed üç boyutlu görüntüleme ile MCs Ekzositoz ve dört (x, y, z, t) boyut sayımsal kantifikasyonunu birleştiren yenilikçi bir strateji tarif. Bu teknik olarak erken olgunlaşma yoluyla Golgi kendi çıkış, ekzositoz yetkinlik ve degranülasyonun satın olarak başlayan bu tür izleme SG- MC fonksiyonu üzerindeki etkileri için protein aileleri tarama sağlar. Birlikte SG- morfometrik ve kinetik karakterizasyonu ile ekzositoz ölçümleri kombinasyonu test ...

Direk Hücreler (MC), en iyi, artrit, astım, eozinofilik özofajit, kronik dermatit ve koroner arter hastalığı 3,5 ve anafilaktik şok 1,2 yanı sıra diğer patolojiler gibi alerjik ve iltihabik reaksiyonlarda katılımı için bilinen bağışıklık hücreleri Kanser 3,4. Buna ek olarak, MH&#39;si allogreft toleransı 5,6 uyaran örneğin, bakteri ve parazitlere karşı konak savunmasında ve bağışıklık tepkilerinin bastırılması hem doğuştan ve edinilmiş bağışıklık önemli rol oynamaktadır. AN + / CD117 + pluripotent progenitör hücrelerin CD34 7 gelişen, kemik iliğinden köken. Taahhüt kemik iliği MC ataları kana salınan ve bağ doku ve epitel yüzeylere 8 içinde ağırlıklı olarak lokalize periferik dokulara göç vardır. Olgunlaşma ve terminal farklılaşma sonunda etkisi o altında elde edilirÇevredeki ortam 8,9 içinde f sitokinler. AN olan karşılaşma immunglobulin E (IgE) üretimi sonuçlandı antikorlar yazın bir alerjene (antijen, Ag) tarafından aktive edilebilir. Aynı Ag yeniden maruz kaldıktan sonra IgE bağlı hücre çapraz bağlanması, ardından MC&#39;nin FcεRI reseptörlerine IgE bağlanması, FcεRI birikmesi ve hücre degranülasyonu sonuçlanan bir sinyal akışının başlamasında sonuçları [10,11 gözden] . AN da nöropeptidler 5,12 ile, bağımsız olarak IgE, aktive edilmiş 13, bakteriyel ve viral antijenlerin 14,15, toplu olarak, temel salgı bağışıklık hücreleri ve sitokinler 5,13,12,16 olarak adlandırılır, pozitif yüklü bir dizi peptit toksinlerdir , 17. AN ayrıca inflamatuar yanıtı yükseltmek, kendi serbest aracıların, birçok kişi tarafından aktive edilir. AN immuno ihtiva salgı granülleri (SGS) ile paketlenirBu tür kimaz ve triptaz, vasküler endotelyal büyüme faktörü ve çeşitli sitokinler ve kemokinlerin 8,9 gibi histamin ve (kemirgenlerde) serotonin vazoaktif aminler, proteoglikanlar, proteazlar da dahil olmak üzere düzenleyici aracılar. Bu aracılar &quot;gitmeye hazır&quot; ve MH&#39;si uygun bir uyaran ile aktive kez, bu arabulucuların dakika 18,19 saniye bir konuda düzenlenen Ekzositoz (degranülasyona) hücrelerden salınır. Bu ilk etkinlik arakidonik asit metabolitlerinin, çoklu sitokinler ve kemokinlerin 20,21,22 de dahil olmak üzere, biyolojik olarak etkili maddeler, geniş bir dizi de novo sentezi ve serbest izlemektedir. Yeni sentezlenen ürünlerin Yayın bağımsız SG sürümü oluşur. Toplu olarak, bu aracılar, erken ve geç faz enflamatuar ve alerjik cevap başlar. Bu nedenle, MC aktivasyonu ve degranülasyonu muhasebe mekanizmalarının anlaşılması teorik ve klinik imp hemortance. genetik birincil ve kültürlü MCs işlemek için zorluk zayıf çözülmesi kaldı MC degranülasyonu yatan mekanizmaları, aydınlatmak için girişimlerini engellemiştir. Ilgi konusu bir gen ile bu sorunun üstesinden gelmek için, biz eş zamanlı olarak transfekte mukozal mast hücre çizgisi, fare bazofilik lösemi bir raportör göre bir deney geliştirildi (RBL) -2H3 (burada RBL olarak anılacaktır) ya da kemik iliğinden elde edilen AN (BMMC&#39;ler), 30 ve nöropeptid Y (NPY), bir SG muhabir olarak, monomerik RFP (MRFP) erimiş. NPY önce diğer sistemlerde endojen SG belirteçleri davranışını özetlemek gösterilmiştir. MRFP floresan duyarsız pH ifadesi çünkü Ayrıca, NPY-MRFP 96 oyuklu plakalar bir floresan plaka okuyucu kullanarak asidik SG- görselleştirilmesi gibi ekzositozu kantitatif bir değerlendirmesini sağlamaktadır. O NPY-MRFP RBL hücrelerinde ve BMMC&#39;ler asidik SG- teslim olduğunu göstermiştir ve hücreler salınırendojen SG kargo (yani, β-heksosaminidaz ve serotonin) 30, 32 yanında düzenlenmiş moda. Bu protokol kendi fenotipik ve RBL hücrelerinde 32 SG özellikleri ve degranülasyonunun fonksiyonel etkisi ilgi tarama genleri izin veren bir yüksek-çözünürlüklü görüntüleme bazlı bir metodoloji sağlar. Özellikle, bu protokol gerçek zamanlı MC SG- izleme ve kendi alanında veya hacim büyüklüğü, sayısı, montaj kinetik, hücre hücre iskeletinin boyunca onların hareket ve farklı koşullar altında plazma zarı ile nihai füzyon kantifizasyonunu. Örneğin, DNP spesifik IgE ile hücrelerin duyarlılaştırılması farklı düzensizlikler altında bir çok-Ag (DNP konjuge serum albümini) ile hücrelerin tetiklenmesi (yani, ağırlık veya mutant gen ekspresyonuna ya da farmakolojik manipülasyonlara fazla ilgi genlerinin yok etme) ve kontrol hücreleri ile mukayese etmek.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046-500ML</td><td>37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>GE sağlık hizmetleri Yaşam bilimleri</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Selüloz asetat membran, gözenek boyutu 0.22&nbsp; &mu; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning doku kültürü ile muamele edilmiş kültür kapları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA Çözeltisi (TE)</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>R001100</td><td>37 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>BORULAR dipotasyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108321-27-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum asetat</td><td>hidrat Sigma-Aldrich</td><td>114460-21-8</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum asetat tetrahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamik asit potasyum tuzu monohidrat (Potasyum glutamat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>4 mm elektroporasyon küvetleri</td><td>hücre projeleri</td><td>EP-104</td><td></td></tr><tr><td>PULSE KONTROL CIHAZLI GEN PULSER & KAPASITANS</td><td>Bio rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odacıklı kapak camı</td><td>Thermo scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu, düz tabanlı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 kuyulu plakalar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3367 veya CLS390</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka floresan okuyucu - Sonsuz 200</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum iyonofor A23187</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7522</td><td>Doğrudan ışığa maruz kalmaktan kaçının</td></tr><tr><td>12-O-tetradekanoil-13-asetat (TPA)</td> <td>Calbiochem</td><td>P3766</td><td></td></tr><tr><td>anti-DNP monoklonal IgE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8406 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNP-BSA/ DNP-HAS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661</td><td>Doğrudan ışığa maruz kalmaktan kaçının</td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal floresan mikroskop:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 ters çevrilmiş</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris yazılımı</td><td>BITLANE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft exel veya Prism veya diğer analiz yazılımları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diğer reaktifler:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Magnezyum Klorür</td><td>MERK</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>MERK</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>MERK</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>BDH Laboratuvarları</td><td>284515V</td><td></td></tr><tr><td>Monosodyum fosfat&nbsp;</td><td>MERK</td><td>5345</td><td></td></tr><tr><td>Steril su</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mast hücre salgı granüller incelenmesi; biyosentezi adlı ekzositozu için

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Direk Hücreler (MC) oluşan önceden ve yeni sentezlenmiş, alerjik iltihap ve bağışıklık mediatörler salgılayarak kendi fizyolojik ve patolojik fonksiyonlarını yerine bağışıklık sisteminin salgı hücreleri bulunmaktadır. MCnin arabulucular alerjik ve bağışıklık yanıtları sonuçlanan birden dokuları ve organları etkiler. MC aracıların sentezi, depolama ve serbest derece düzenlenir. Önceden oluşturulmuş arabulucular plazma zarı ile kaynaştırmak ve düzenlenmiş ekzositoz kendi içeriğini serbest sitoplazmik salgı granülleri (SG) paketlenir. SGS hedeflenen endojen SG aracıların yanında düzenlenmiş bir şekilde serbest bırakılan bir raportör gen ile ilgi konusu bir genin ortak ifadesine dayalı bir protokol, mevcut. protokol MC SG- analizleri ve tetiklenen ekzositoz için biyogeneze kendi zaman çizelgesini takip yüksek çözünürlüklü dört boyutlu konfokal sağlar. Böylece, inter genleri taranması için bu protokolü kullanarakkendi fenotipik ve fonksiyonel etki için est MC SG- ve biyogenezi ve ekzositoz düzenleyen moleküler mekanizmaları deşifre ve ilgili düzenleyici belirlenmesi sağlar. Böylece, sağlık ve hastalık MCs işlevi hesap hücresel mekanizmaları içine daha fazla anlayışlar sağlanmalıdır.

Çünkü MCs düşük transfeksiyon verimi, genetik manipülasyonlar endojen SGS arabulucular tarafından ölçülen ortalama salgılanması çıktılan üzerinde bir etki bırakmak için olası değildir. Bununla birlikte, özel olarak ilgi konusu geni ifade eden hücre popülasyonu izlenmesinde raportör gen NPY-MRFP tam eş-ifade ve aynı hücre ko-transfekte edilmiş plazmid NPY-MRFP sonuçlarının izlenmesi kurarak. Bu nedenle, geleneksel yöntemler ile karşılaştırıldığında, bu deneyde avantajı seçici Genetik olarak manipüle edilmiş hücreler <str...

Bu protokolün amacı, mast hücresi salgısının fonksiyonel genomik analiz sağlayacak bir yöntem geliştirmektir. Protokol çıkar ve gerçek zamanlı gen ile cotrasfected bir flüoresan raportör geninin salınımının nicel değerlendirilmesine dayanır salgılama granülün en morfolojisinin analiz eder.

Mast Hücre Salgı granüller incelenmesi; biyosentezi adlı ekzositozu için

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Bu prosedürün genel amacı, mast hücresi salgı granülü gelişimini ve sitozu düzenleyen mekanizmaları incelemektir. Bu işlem, öncelikle mast hücrelerinin bir eksositoz raporlayıcı geni ve ilgilenilen gen ile birlikte kotransfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise hücrelerin stimüle edilmesi ve eksositoz sırasında raporlayıcı genin floresan sinyalinin izlenmesi yoluyla, test edilen genin eksositoz üzerindeki etkisinin değerlendirilmesidir.Ardından, test edilen genin mast hücresi sekresyon granülü üretimi ve gelişimi üzerindeki etkisi, sekresyon granüllerine yerleşen raporcu genin konfokal görüntülemesi ile değerlendirilir. Son adım, sekresyon granüllerinin morfometrik analizinin gerçekleştirilmesidir. Nihayetinde, bir raporcu gen kullanılarak mast hücresi sekresyon granüllerinin floresan işaretlenmesi; mast hücrelerindeki, sekresyon granülü gelişimindeki ve bunların ekzositozundaki değişikliği göstermek için kullanılır.Bu tekniğin, endojen mediyatörlerin, beta heksazimin veya histamin salınımının ölçülmesi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, ilgi duyulan genin veya tip mutant ya da S-H-R-N-A'nın bir ekzositoz raporlayıcısı ile birlikte ko-ekspresyonuna dayanmasıdır. Ko-ekspresyon, salınımın yalnızca genetik olarak manipüle edilmiş hücrelerden izlenmesine olanak tanır; böylece mast hücrelerinin düşük transfeksiyon yeteneği nedeniyle endojen mediyatörlerin salınımı ölçüldüğünde ortaya çıkan ve sonuçların yorumlanmasını zorlaştıran yüksek gürültü-sinyal oranı sorunu aşılmış olur. Bu yöntem, kargo seçimi, granüllerin paketlenmesi ve ekzositoz yetenekleri dahil olmak üzere salgı granülleri oluşum sürecini kontrol eden moleküler mekanizmaların belirlenmesi gibi, mast hücrelerinin hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu yöntem ayrıca kinazların, fosfatazların ve diğer protein ailelerinin bu süreçteki rolünü değerlendirerek, hücrelerin düzenlenmiş kitlesel ekzositoz sürecini kontrol eden moleküler mekanizmaların belirlenmesine yardımcı olur. Başlamak için, transfeksiyonu gerçekleştirmek üzere metin protokolünde açıklandığı şekilde sıçan bazofilik lösemi hücrelerini ve medyumu hazırlayın. İlk olarak, vakuma bağlı steril bir pastör pipeti kullanarak plakadaki kültür ortamını uzaklaştırın.Hücre monotabakasını, tüm monotabakayı kaplayacak şekilde önceden ısıtılmış tripsin ile durulayın. Plakayı 37 °C sıcaklıktaki bir inkübatöre en fazla 10 dakika süreyle yerleştirin. Ardından, hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını optik mikroskop kullanarak kontrol edin.Hücreler ayrıldıktan sonra, hücreleri süspanse etmek için kültür plağına, tripsin çözeltisi hacminin en az iki katı kadar besiyeri ekleyin. Hemositometre kullanarak hücre sayımı yaptıktan sonra, 15 milyon hücreyi 200 G'de ve 25 °C'de üç dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün. Süpernatantı atın ve 280 µL transfeksiyon besiyeri ekleyin.Ardından reaksiyon karışımını dört milimetrelik bir tüpe aktarın. Kısa adı N-P-Y-M-R-F-P olarak da bilinen neuropeptide Y-M-R-F-P içeren 20 µg plazmid ile 30 µg kontrol boş plazmid veya test edilen plazmid ekleyin. Reaksiyon karışımının nihai hacmi 300 µL olmalıdır.10 dakika boyunca buz üzerinde beklettikten sonra, vet üzerindeki kalıntı suları silin. Ardından 300 volt gerilimde dokuz milisaniye boyunca elektroporasyona geçin. Ekzositoz ölçümleri için hücreleri, 300 µL besiyeri içeren 24 kuyucuklu doku kültürü plaklarında derhal yeniden şişirin.Her bir kuyucuğa sekiz µL reaksiyon karışımı ekleyin. Ardından, kontrol grubu için ek kuyucuklara transfekte edilmemiş hücreler ekleyin. Her bir işlem için çift kuyucuk olacak şekilde yeterli sayıda kuyucuk hazırlayın; zaman ayarlı mikroskopi için her bir transfeksiyonda hücreleri hemen 80 µL besiyeri içeren, sekiz kuyucuklu bir borosilikat lam sistemi içine aktarın.Hücreleri FC epsilon R bir aracılı aktivasyona duyarlı hale getirmek için her bir hazneye 1,5 µL reaksiyon karışımı ekleyin. Besiyerine mililitre başına bir mikrogram fare DNP spesifik monoklonal IgE ekleyin. Hücreleri IgE ile en az iki saat inkübe edin.18 ila 24 saat sonra, hücrelerin plazmidleri eksprese ettiğini doğrulamak için floresan mikroskobu kullanın. MRFP, 584 nanometre uyarım dalga boyuna ve 607 nanometre emisyon dalga boyuna sahiptir. N-P-Y-M-R-F-P, sekretuar granüllere karşılık gelen veziküler yapılarda görülmelidir.N-P-Y-M-R-F-P ekzositozunu ölçmek için kültür ortamını uzaklaştırın. 24 kuyucuklu plakayı tyro tamponu ile üç kez yıkayın. Kontrol kuyucuklarına 200 µL tyro tamponu ekleyerek uyarılmamış hücreleri hazırlayın.Ardından, 37 °C'de 30 dakika inkübe etmeden önce aktive edici reaktifleri ve seyreltilmiş tyro tamponunu ekleyin. Her kuyucuktaki S süpernatantanlarını dikkatlice 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Plakayı buz üzerine yerleştirin ve ışıktan koruyun.S süpernatantları, hücrelerden salınan kimera peptid N-P-Y-M-R-F-P'yi içerir. Ardından, her bir kuyucuğa %0.5 Triton X 100 içeren 200 µL tyro tamponu ekleyin ve 37 °C'de 10 dakika inkübe edin. Bu adım, hücrelerden salınmayan geri kalan N-P-Y-M-R-F-P'yi içeren hücre lizatlarının hazırlanması için önemlidir.Hücre lizatlarını toplayın ve buz üzerine yerleştirmeden önce 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Işık olmayan bir ortamda, 590 nanometre 20 nanometre bant genişliğinde uyarma filtresi ve 635 nanometre 35 nanometre bant genişliğinde emisyon filtresine sahip bir floresan plaka okuyucu kullanarak hücre süpernatanlarının ve hücre lizatlarının floresansını ölçün. Sekiz bölmeli BO silikat lamel sistemine 1.5 microliters transfekte hücre ekin.Hücreleri, 37 °C'deki bir inkübatörde 18 ila 24 saat boyunca inkübe edin. Kültür ortamını odacıklardan uzaklaştırın ve tyroid tamponu ile üç kez yıkayın. Ardından her bir odacığa 72 µL tyroid tamponu ekleyin.Isıtmalı bir hazne karbondioksit kontrolörü ve 40 x veya 63 x objektif ile donatılmış bir konfokal floresan mikroskop kullanın. Cıva lambası, bilgisayar ve lazerler dahil olmak üzere mikroskop sistemlerini açın. Isıtmalı haznenin doğru sıcaklıkta olduğundan emin olun.Deneye başlamadan önce, sekiz kuyucuklu hazne bor silikat lamel sistemini ısıtılmış hazneye yerleştirin ve haznenin doğru şekilde kurulduğundan ve sabit olduğundan emin olun. İlgili kat dört talimatlarına göre floresan ışığı açın ve transfekte edilmiş hücreleri görüntüleyin; ilgilenilen bir hücre görüş alanına girdiğinde floresan ışığı kapatın. Ağarma ve sitotoksisiteyi en aza indirmek için, bu alanın, hücrelerin iyice yayılmış olduğu ancak birbirine temas etmediği yaklaşık iki ila üç transfekte hücre içermesi gerekir.Bu vakada hücreler, reporter gen N-P-Y-M-R-F-P ve GFP etiketli, konstitütif olarak aktif RAB five mutantı ile birlikte transfekte edilir. Gürültüyü, aşırı doygunluğu ve toksisiteyi minimize etmek için lazer gücünü ayarlayın; sinyal-gürültü oranını düzenlemek için kazanç (gain) ve ofset değerlerini belirleyin. Lazer maruziyet süresini minimize etmek için hızlı tarama yapın.Ardından, görüntüyü üç boyutlu olarak yeniden oluşturmak için Zack parametrelerini ayarlayın. En iyi sinyal-gürültü oranını elde etmek için pinhole boyutunu bir alan birimi olarak ayarlayın ve Z ekseninde, optik kesit kalınlığı 0.7 µm veya daha az olacak şekilde iki boyutlu konfokal optik kesitlerin ardışık taramasını gerçekleştirin. Şimdi, her bir görüntüleme arasındaki aralık süresini 30 saniye, toplam görüntüleme süresini 15 dakika olarak ayarlayın ve görüntüleri beş dakikalık bir bekleme süresinin ardından almaya başlayın.Zaman serisini durdurun, sekiz µL 10 x tetikleyici ekleyin ve görüntüleme işlemini hemen devam ettirin. Son olarak, resimleri kaydedin. Dekonvolüsyon yazılımı kullanarak dekonvolüsyon işlemini gerçekleştirin ve görüntü analizi yapmak için yığınları üç boyutlu görüntülere ve bir filme dönüştürün.Konfokal floresan mikroskobu ile elde edilen dekonvolüsyon uygulanmış zaman serisi görüntüleri, MRS gibi bilimsel görüntü analiz yazılımlarına aktarın. Bu yazılım 40'tan fazla mikroskopi dosya formatını okuyabilmektedir. Açık olan bir veri setinin sonuna zaman noktaları eklemek için düzenle (edit) menüsünden zaman noktaları ekle (add time points) seçeneğini belirleyin ve yeni veri setini içe aktarın.Optimal görüntü görünümünü elde etmek için kontrastı ve renk tonunu ayarlayın. İndirilen dosyalar MRFP kanalının yüzeyini oluşturur. Yüzey sihirbazı seçeneğini kullanın.Varsayılan algoritmayı ve N-P-Y-M-R-F-P kanalını seçin, gürültüyü azaltmak için düzeltme seçeneğini işaretleyin. Küçük detayların kaybını önlemek için, alan detay seviyesini 0.05 ile 0.1 mikron arasına düşürün. Ardından, yoğunluk eşiğini ayarlayın.Yeni bir gri yüzey görüntülenir. Ardından ayarlara gidin ve stili merkez noktasından yüzeye değiştirin. Seçilen nesnenin özelliklerindeki istatistik sekmesine gidin.Ardından ayrıntılı sekmesini ve floresans, yoğunluk veya hacim gibi spesifik değeri seçin. Verileri gözden geçirin ve değerlerin görüntülerle uyumlu olduğunu doğrulayın. Örneğin, ortalama granül boyutunu belirlemek için yan yana bulunan iki veya daha fazla granül, tek bir büyük granül olarak ölçülmüş olabilir.Merch granüllerinin boyutunu, gerçek granül sayısına bölün. Son adım olarak, istenen veri setlerini excel dosyalarına aktarın ve verileri analiz edin. Burada, konstitütif olarak aktif RAB5 ekspresyonu ile oluşan mast hücresi dev sekretuar granüllerinin temsili time-lapse görüntüleri ile ekzositoz kinetiği ve tek bir sekretuar granülün çözünürlüğü gösterilmektedir.Stimülasyon sonrası. Mast hücresi ekzositozu sırasında, sekresyon granülleri plazma membranına doğru hareket eder ve onunla kaynaşır. Granüller, yeşil ile gösterilen konstitütif olarak aktif RAB5 ile kaplıdır.Bu deneyde magenta renginde gösterilen ve N-P-Y-M-R-F-P olan salgılanan kargo, daha sonra hücrelerden hücre dışı boşluğa salınır. Yeşil renkte gösterilen RAB five'ın konstitütif olarak aktif mutantı tarafından füzyona uğratılan granüller, bu deneyde magenta renginde olan kargolarını (N-P-Y-M-R-F-P), hücrelerden hücre dışı boşluğa salarlar.Ekzositoz sırasında N-P-Y-M-R-F-P salınımı, N-P-Y-M-R-F-P floresans yoğunluğunda dramatik bir artışa ve N-P-Y-M-R-F-P içeren salgı granüllerinin küçülmesine, ardından da yok olmalarına neden olur; salgı granüllerinin floresans yoğunlukları, hücrelerin bir kalsiyum iyonoforu ile uyarılmasının ardından farklı zaman noktalarında ekzositoza uğradıklarını göstermektedir. Öte yandan, bir salgı granülü plazma membranı ile kaynaşmamış ve floresans yoğunluğu sabit kalmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, sekretuar granüllere iletilen ve stimüle edilmiş hücreler tarafından salınan floresan bir gen raporlayıcısı kullanarak, mast hücresi sekretuar granüllerinin gelişimini ve ekzositozunu nasıl izleyeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Endojen medyatörlerle birlikte, mast hücresi sekretuar granüllerinin gelişiminin ve ekzositozunun altında yatan mekanizmalar, hücrelerin bir rapor gen ve bir test geni ile ko-transfekte edilip incelenmesiyle bu prosedür kullanılarak tanımlanabilir. Test geninin mast hücresi sekretuar granülleri gelişimi üzerindeki rolü, ilgili gen ile ko-transfekte edilen hücrelerin sekretuar granüllerinin morfometrik analizi, kontrol hücreleri ile karşılaştırılarak değerlendirilebilir.Ek olarak, test edilen genin düzenlenen ekzositoz üzerindeki rolü, raporcu genin salınımı izlenerek belirlenebilir.

investigating-mast-cell-secretory-granules-from-biosynthesis-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, mast hücrelerinin degranülasyon aktivitesini belirlemek için bir kolorimetrik testi göstermektedir. Mast hücreleri tarafından salınan enzim, substratı hidrolize eder ve renkli bir ürün üretir. Mast hücrelerinin degranülasyon aktivitesi, hücredeki toplam enzim içeriği ile normalize edilmiş hücre dışındaki enzimlerin salınım yüzdesi olarak ölçüldü.

Bir hedef kimyasalın etkisini incelemek için mast hücresi degranülasyon testi

Bu video, yetişkin farelerin periton boşluğundan olgun bağ dokusu tipi mast hücrelerini izole etmek için bir periton lavaj yöntemini göstermektedir. Periton boşluğundan primer immün hücrelerin bir karışımı izole edildikten sonra, uygun kültür koşulları altında mast hücrelerinin seçici proliferasyonu gerçekleştirilir.

Primer Mast Hücrelerini Murin Periton Boşluğundan İzole Etme Tekniği

Bu video, floresan raportör protein NPY-mRFP içeren salgı granüllerinin salınımını başlatan bir kalsiyum iyonofor içeren aktive edici bir reaktif tarafından indüklenen mast hücresi ekzositozunu göstermektedir. Daha sonra, bir floresan plaka okuyucu kullanarak salınan NPY-mRFP'yi ölçerek ekzositozu kantitatif olarak değerlendiriyoruz.

Nöropeptit Y Monomerik Kırmızı Floresan Protein Salınımı ile Mast Hücre Ekzositozunun Ölçülmesi

Bu video, mast hücrelerinde ekzositozu görselleştirmek için bir tekniği göstermektedir. Hücreler, asidik pH'ın floresansını söndürdüğü salgı granülleri (SG'ler) içindeki hücreler tarafından alınan bir floresan raportör olan FITC-dekstran ile inkübe edilir. Granül ekzositozunun uyarılması üzerine, ortamın daha yüksek pH'ı, bir floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilen kaynaşmış SG'lerin içinde raportör floresansını indükler.

Mast Hücrelerinde Salgı Granüllerinin Ekzositozunu Görselleştirmek için İn Vitro Bir Teknik

Mast hücre degranülasyonu, alerjik aracıların salınması, alerji, astım ve parazit savunmada önemlidir. Burada degranülasyonunun uyuşturucu ve toksik etkileri değerlendirmek için teknikleri 1 göstermek, yöntem son zamanlarda antibakteriyel madde triklosan 2 güçlü inhibitör etkisi sergilemeye kullandı.

Organik Solvent kullanımı olmadan Triklosan Etkileri: RBL-2H3 Mast Hücre Degranülasyon üzerinde kimyasal etkileri değerlendirmek için bir Mikroplaka Testi

Ozmotik stres ekzositozu ve bu işlem sırasında serbest nörotransmitter miktarını etkiler. Biz nasıl transmisyon elektron mikroskobu ile birlikte elektrokimyasal yöntemleri birleştirerek ekstraselüler ozmotik basınç etkisi ekzositozu etkinlik, vezikül quantal boyut ve serbest nörotransmitter miktarı incelemek için kullanılabileceğini göstermek ekzositozu sırasında.

Ozmotik stres etkisi salgı veziküller ve ekzositozu izleme

Burada, izole ve fare peritoneal mast hücreleri yetiştirmek için bir protokol mevcut. Biz de onların fonksiyonel karakterizasyonu için iki protokol tarif: hücre içi ücretsiz Ca2 + toplama ve degranulation tahlil floresan bir görüntüleme dayalı yayımlanan β-hexosaminidase Renkölçer miktar üzerinde.

Yalıtım Karın zarını kaynaklı Mast hücreleri ve onların fonksiyonel karakterizasyonu ile Ca2 +-görüntüleme ve Degranulation deneyleri

Burada biz ayrıntılı olarak düzenlenmiş ekzositozu canlı hücre görüntüleme için bir yöntem. Bu yöntem lysosome ilgili organelleri içinde birikir, FITC-dextran muhabir olarak kullanır. Bu basit yöntem aynı zamanda genetik olarak işlemek zor olan hücrelerdeki düzenlenmiş ekzositozu farklı modları arasında ayrım sağlar.

Düzenlenmiş ekzositozu için muhabir olarak FITC dextran görüntüleme

Mikro desenli hücrelerde izosomal ekzositozun canlı görüntülemesi bu sürecin mekansal bir niceleifikasyonuna olanak sağlar. Mikro desenler kullanarak morfoloji normalleştirme hücresel süreçlerin mekansal dağılımı hakkında genel kuralları ortaya çıkarmak için olağanüstü bir araçtır.

Mikro Desenli Hücrelerde Hücresel Eksositozun Spatiotemporal Parametrelerinin Ölçülmesi

Bir CD19 özgü kimerik antijen reseptör (SYR) eksprese eden T hücrelerinin ilk-in-insan gen tedavi denemelerinde B-hücreli kanserlerin araştırılan tedavi olarak infüze edilir. Bu kullanılarak T hücre genetik modifikasyonu...

Klinik Uygulama<em&gt; Sleeping Beauty</emGenetiği Periferik ve Göbek Kordon Kanı alınan T hücreleri Değiştir Sunan Hücreler&gt; ve Yapay Antijen

Öğrenin mast hücrelerinde ekzositoz mekanizmalarını floresan raportör gen kullanarak incelemeyi. Bu yöntem, sekretuar granüllerin gelişimini ve salınımını nicel olarak analiz etmenizi sağlar.

Mast Hücre Salgı granüller incelenmesi; biyosentezi adlı ekzositozu için

Daha fazla video keşfet