Enterik Sinir Sistemi Yerinde Ca 2+ Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, floresan kalsiyum indikatör boyaları kullanarak bağırsağın canlı tüm montaj preparatlarında enterik nöronların ve glia'nın aktivitesini görüntülemektir. Bu, önce bağırsağın bir kısmının hayvandan çıkarılması ve önceden ısıtılmış bir ortama yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bağırsağı mezenterik sınır boyunca açmak ve mukozal bir yüzey yukarı bakacak şekilde hafif gerilim altında düz bir şekilde sabitlemektir.

Myenteric pleksusun tüm montaj preparatları mikrodiseksiyon ile hazırlanır ve görüntüleme kaplarına yerleştirilir. Daha sonra, tüm montaj preparatları bir inkübatörde bir floresan indikatör boya grip oh dört ile yüklenir. Son adımlarda, yüklenen preparatlar, temel aktiviteyi kaydetmek için görüntü toplama ve analiz yazılımı tarafından kontrol edilen yüksek çözünürlüklü bir kamera ile donatılmış bir floresan görüntüleme mikroskobu kullanılarak görüntülenir.

Daha sonra incelenen ilaçlar eklenir ve nöronlardaki ve gliadaki kalsiyum geçişleri kaydedilir. Sonuçta yerinde. Enterik sinir sisteminin kalsiyum görüntülemesi, nöronlardaki ve gliadaki hücresel aktivitenin, bağırsak patofizyolojisinde fizyolojik bağırsak fonksiyonlarının düzenlenmesine ve enterik sinir sistemi disfonksiyonuna nasıl katkıda bulunduğunu incelemek için kullanılır.

Bu tekniğin çıkarımları, nöronlar ve enterik glia arasındaki karmaşık etkileşimi incelemek için basit ve sağlam bir yöntem kullanarak, fonksiyonel bağırsak bozukluklarının ve inflamatuar bağırsak hastalığının fizyolojisi ve patofizyolojisi hakkında bir anlayış oluşturmaya doğru uzanır. Laboratuvar hayvanlarından alınan dokuları içeren aşağıdaki prosedürler, 2013 Hayvanların ötenazisi için A VMA yönergeleri ile tutarlıdır ve Michigan Eyalet Üniversitesi I-A-C-U-C tarafından önceden onaylanmıştır. Hayvanı onaylanmış prosedürlere göre ötenazi yaptıktan sonra, hayvanı sırtüstü pozisyona getirin ve cildi karın üzerinde% 70 etanol ile temizleyin. Karın derisini orta hatta sıkıştırmak için forseps kullanın ve ardından iç sindirim organlarını ortaya çıkarmak için lineer dirsek boyunca altı santimetrelik bir medial kesi yapmak için cerrahi makas kullanın.

Ardından, peritonun içindeki kolonu bulmak ve ortaya çıkarmak için künt forseps kullanın. İleal kolon mezenterini makasla kesin ve bağırsağı çözmeye başlayın. Bağırsağın uzunluğu yeterince çözüldükten sonra, bu videoda gösterilecek olan kalın bağırsak hazırlığı için kolonu çekumun distalinde ve rektumun proksimalinde kesin.

Daha sonra bağırsak segmentini hızlı bir şekilde çıkarın ve buz üzerinde üç mikromolar nikardipin hidroklorür ve bir mikromolar S skopolamin hidroklorür ile desteklenmiş DM EMF 12 Besiyeri içeren bir behere yerleştirin. Bu inhibitörlerin eklenmesi, bağırsak düz kasını felç ederek mikrodiseksiyonu ve müteakip görüntülemeyi kolaylaştırır. İstenen bağırsak segmentinin dört ila altı santimetrelik küçük bir segmentini çıkarın ve soğutulmuş takviye edilmiş ortamla doldurulmuş bir sil koruyucu kaplı Petri kabına yerleştirin.

Daha sonra bağırsak segmentinin proksimal ve distal uçlarını böcek pimleri ile sabitleyin ve mezenterik sınır boyunca uzunlamasına düz bir kesim yaparak bağırsak tüpünü açın. Şimdi dokuyu mukoza tarafı yukarı bakacak şekilde hafif gerilim altında düz bir şekilde sabitleyin ve mukozayı beş numaralı ince forseps ile kaldırarak ve çok ince yaylı makasla alttan keserek mukozal tabakayı dikkatlice inceleyin. Dokuyu yaklaşık 0,5 santimetre karelik daha küçük preparatlar halinde kesin ve her bir parçayı takviye edilmiş ortamla dolu bir görüntüleme kabına yerleştirin ve buzun üzerine yerleştirin.

Her hazırlığı, dairesel bir kas tabakası yukarı bakacak şekilde dört köşeye sabitleyin. Dairesel kası ince cımbızla ayırarak dikkatlice inceleyin. Myenterik pleksusu açığa çıkarmak için aşırı gerilmeden kaçının, görüntüleme kaplarını tekrar buzun üzerine yerleştirin ve her tabaktaki çözeltiyi taze takviye edilmiş ortamla değiştirin.

Daha sonra, bulaşıkları buzdan çıkarın ve her yemeğe iki mililitre enzim karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında% 5 karbondioksit ve% 95 hava ile 15 dakika inkübe edin. Son olarak, 1.5 mililitre takviye edilmiş ortamda ve 1.2 mikrolitre 250 milimolar probit stokunda fotoağartmayı önlemek için doku preparatlarını üç kez ortamla yıkayın ve köşeleri dizginleyin, yaklaşık 1.5 milimol Fluro dört stokunda 1.5 mikrolitrelik Eloqua'ya dört milimol dört stok görüntüleme kaplarına dört yükleme çözeltisi ve 37 santigrat derecede karanlık bir inkübatörde 45 dakika boyunca inkübe edin tutanak. Bulaşıkları inkübatörden çıkardıktan sonra, preparatları üç kez ortamla yıkayın.

Daha sonra nöral nöronal etiketlemeyi geliştirmek için 200 mikromolar prop asit içeren taze ortam ekleyin ve daha önce olduğu gibi 15 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, protokolün yazılı bölümündeki talimatlara göre modifiye edilmiş bir Krebs tamponu yapın ve kas kasılmalarını engellemek için üç mikromolar nikardipin ve bir mikromolar skopolamin ekleyin. Kalsiyum iki artı görüntüleme ve tüm montaj diseksiyonları sırasında, kayıt odasını floresan mikroskobu altında ve birden fazla ısıtılmış şırınga rezervuarına sahip bir yerçekimi akışı perfüzyon sistemi kullanarak konumlandırın.

37 santigrat derece Krebs tamponunun dakikada iki ila üç mililitre sürekli bir perfüzyon hızı oluşturun. Bir vakum kapanına bağlı hem girişte hem de emiş hattında hava kabarcığı oluşumunu önlediğinizden emin olun. İstenilen pleksusu parlak alan aydınlatması altında odağa getirin.

Foto ağartmaya yol açabilecek dokuyu aşırı maruz bırakmaktan kaçının. Ganglionlar içindeki grip oh dört yüklemeyi inceleyin ve görüntüleme için sağlıklı gangliyonları seçin. Sağlıksız hasarlı ganglionlar otofloresan veya punktat morfoloji sergileyecektir ve görüntüleme için kullanılmamalıdır.

Bir ganglion seçildikten sonra, ışık yolunu kameraya yönlendirin ve canlı bir görüntü elde edin. Görüntü elde etme yazılımıyla, ganglionun odakta olduğundan emin olun ve görüntü elde etme oranını ve pozlama sürelerini ayarlayın Görüntü elde etme oranları ve süreleri, araştırmacıların kaydetmek istediği olaylara bağlı olarak değişecektir. Çoğu deney için, görüntüler geleneksel olarak glial hücreler için 0,5 ila bir hertz ve iki ila 10 hertz'e kadar elde edilir.

Nöronlar için, glial kalsiyum geçici nöronlar kadar hızlı olmadığından, Kaydı başlatın ve 30 saniye boyunca deneysel uyaranların yokluğunda seçilen ganglionun temel fizyolojik aktivitesini oluşturun. Ardından, ilacınız için optimize edilmiş bir protokole göre dakikada iki ila üç mililitre oranında yerçekimi akış perfüzyon sistemini kullanarak reseptör agonistleri ve antagonistler gibi ilgilenilen ön ısıtma ilaçlarını uygulayın. Kaydı durdurun ve deneyin zaman atlamalı filmini izleyin.

Uygun görüntü analiz yazılımını kullanarak ilgi alanlarını veya yatırım getirilerini dikkatlice seçin. Son olarak, ilgilenilen bölgelerin floresan yoğunluğunu normalleştirmek ve başlangıçtaki taban çizgisiyle karşılaştırmak için uygun görüntüleme yazılımı kullanın Normalleştirilmiş floresandaki değer değişiklikleri, kalsiyumdaki değişikliklerle doğru orantılıdır. Aşağıdaki üç görüntü, Gine domuzundaki enterik glia'nın yerinde bir TP'ye yanıt verdiğini göstermektedir.

Bazal koşullar altında, kesikli çizgi ile belirtildiği gibi düşük seviyeli bir floro dört floresan görülebilir. Oklar, litre A TP glial hücreleri başına 100 mikro mo ile stimülasyon üzerine kalın ganglionik lif yollarına işaret eder, ancak nöronlar değil, kalsiyumda bir artışa işaret eden floro dört floresansı hızla artırmaz. Yanıt veren hücrelerin küçük olduğunu ve yıldızla işaretlenmiş karanlık boşluklarla gösterilen çok daha büyük nöronları çevrelediğini unutmayın.

Bu histogram, enterik glia'nın bir TP'ye doza bağımlı bir şekilde litre başına bir mili mol ile yanıt verdiğini ve maksimum yanıtları ortaya çıkardığını göstermektedir. Bu video, fare distal kolonundan bir mienterik gangliyonu göstermektedir, kalsiyum iki artı indikatör boya gribi, oh dört. Glial hücre agonisti a DP, belirtildiğinde banyoya eklenir.

Bir DP, grip oh dört floresansındaki geçici yükselme ile gözlemlendiği gibi, hücre içi kalsiyum ikide artı enterik glia'da bir artışa neden olur. Bu videoyu izledikten sonra, nöronlar arasındaki karmaşık etkileşimi doğru bir şekilde nasıl inceleyeceğinizi ve kalsiyum görüntülemeyi ampirik olarak nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Tüm montaj preparatlarındaki kalsiyum yanıtlarının mekanizmalarını ve potansiyel fonksiyonel sonuçlarını karakterize etmek, ideal görüntüleme kalitesi için hassas diseksiyonlar gerektirir.

Bu mikroskopi tabanlı teknikte floresan etiketleme ve farmakolojik uyaranların kullanılması, bu hücrelerin doğal çok hücreli ortamlarında daha iyi değerlendirilmesini sağlar.