Name: Enterik Sinir Sistemi Yerinde Ca 2+ Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Öğrenin, enterik sinir sistemi aktivitesini canlı bağırsak preparatlarında floresan kalsiyum göstergeleriyle görüntülemeyi. Bu yöntem nöron-glia etkileşimlerini ve bağırsak fizyolojisini incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Amerika İlaç Araştırma ve Üreticileri Birliği (PhRMA) Vakfı (B. Gulbransen'e), Ulusal Sağlık Enstitüleri (Kadın Sağlığında Disiplinlerarası Araştırma Kariyerleri Oluşturma), K12 HD065879 hibesi (B. Gulbransen) ve Michigan Eyalet Üniversitesi'nden (B. Gulbransen) başlangıç fonları ile desteklenmiştir.

NOT: Laboratuvar hayvanlarında doku içeren aşağıdaki prosedürler Hayvanlar 2013 Ötenazi için AVMA Rehberi ile tutarlı ve Michigan State Üniversitesi IACUC tarafından önceden kabul edildi. 1. Doku Hazırlanması <ol><li> Oksijen ya da bir fiziksel bariyer izofluran ile doğrudan temas hayvanları engeller sağlanması, bölmenin tabanında bir emici malzemenin üzerine sıvı izofluran 3-5 ml yerleştirerek% 2.5 izofluran içeren bir hücre araştırma hayvan anestezisi. Kapkaççı sıkıştırarak anestezi derinliği için test. NOT: arka bacak hiçbir geri çekilme refleksi olduğunda anestezi derinliği uygun görülmüştür. Uygun anestezi sonra, servikal dislokasyon ile fare euthanize </li><li> Bir yatar pozisyonda hayvan yerleştirin ve% 70 etanol ile karın cildi temizleyin. Orta hatta karın cildi çimdik forseps kullanın ve 6 cm ortamı yapmak için cerrahi makas kullanınlinea alba boyunca l kesi iç sindirim organları ortaya çıkarmak. </li><li> Bulmak ve periton içine ileum maruz künt forseps kullanın. Makasla İleal / kolon mezentere kesin ve bağırsak çözülüyor başlar. </li><li> Bağırsak uzunluğu yeterli sökülmüş sonra, bir ileum hazırlanması için çekum mide ve proksimal barsak distalinden kesti. Büyük bir bağırsak hazırlığı için, rektum çekum ve proksimal kolon distaline kesti. </li><li> Hızlı bir şekilde bağırsak segmenti çıkarın ve 3 uM nikardipin hidroklorür ve 1 uM skopolamin hidroklorür ile desteklenmiş DMEM / F12 ortamı ile bir çanak içinde yerleştirmek buz üzerinde (bundan sonra &quot;ortam&quot; olarak adlandırılacaktır). Bu inhibitörlerinin eklenmesi bağırsak düz kas felç mikrodiseksiyon ve sonraki görüntüleme kolaylaştırır. </li><li> Kurulan anatomik belirteçler dayalı faiz Kes segmenti (örneğin, jejunum, ileum, uzak veya yakın kolon). Tipik haliyle utilizDistal ileum veya distal kolonda e dokusu. Ancak, tüm bağırsak bölgelerinde, yük ve görüntü myenterik nöronlar ve glia izole etmek için aynı temel yordamı kullanın. </li><li> Soğutulmuş medya ile dolu bir Sylgard kaplı petri istenen bağırsak segmenti ve yerin küçük bir bölümünü (4-6 cm) sökün. </li><li> Proksimal ve böcek pimleri ile barsak segmentinin distal uçlarını Güvenli ve düz yaparak bağırsak tüp açın, uzunlamasına mezenterik sınırı boyunca kesilir. </li><li> Ince forseps (# 5 ve # en 5/45 çalışma) ve çok ince yaylı makas kullanılarak mukozal tabaka uzak teşrih yukarı ve dikkatle mukoza tarafı ile hafif gerilim altında düz pin dokusu. NOT: eğer düzgün yapılmazsa mukoza çıkarılması ENS için oldukça travmatik olabilir. Kaliteli hazırlıkları için, soyulma veya kazıyarak mukozasında ani kaldırılmasını sınırlamak için özen gösterin. En iyi uygulama mukozayı kaldırın ve ince makas ile altında kesmektir. </li><li> Daha küçük preparat haline doku kesips görüntüleme yemekleri içine (yaklaşık 0.5 cm 2) ve pin taze medya ile buz üzerinde yerleştirilen (dairesel kas tabakası yukarı bakacak şekilde 4 köşe). </li><li> Dikkatle myenterik pleksusu maruz ince cımbız ile ayrı alay dairesel kas uzak teşrih. Aşırı germe kaçının. </li><li> Taze medya ile buz ve değişim çözeltisi geri görüntüleme çanak yerleştirin. </li><li> Tabağı başına enzim karışımı 2 ml hazırlanması [Dispase 1 U / ml (4.48 mg / 8 mi), kollajenaz tip II, 150 U / ml (5.45 mg / 8 mi) ortam içinde]. </li><li> Buz yemekleri çıkarın ve adım 1.13 enzim karışımı ekleyin. </li><li> % 5 CO 2/95% hava ile 15 dakika boyunca oda sıcaklığında yemekler inkübe edin. </li><li> Medya 3 kez ve yeniden-pin köşeleri ile yıkayın doku preparatları. </li></ol> 2. Yükleme Fluo-4 Boya NOT: Gösterge boya ile yüklenen floresan boyalar ve doku tutarken sınırlı ışık ile çalışarak photobleaching kaçının. <ol><li> 4 mcM Fluo-4 yükleme çözeltisi hazırlayın. <ol><li> 4 mM Fluo-4 stokunun 1.5 ul kana 1.5 ml medya ve 250 mM probenesid stokunun 1.2 ul ekleyin. Flu-4, GM 50 ug (% 0.25 kremafor-EL ile takviye edilmiş DMSO içinde% 20), 4 mM Fluo-4 hazır pluronik F-127, 11.4 ul ilave edilerek hazırlanır. </li></ol></li><li> 37 ° C de karanlık bir kuluçka makinesi içinde, 45 dakika boyunca Fluo-4 yükleme çözeltisi içinde preparatlarıyla inkübe edin. </li><li> Inkübatör çıkarın ve medya ile 3 kez hazırlıkları yıkayın. </li><li> Medya, 200 mcM probenesit içeren ve görüntüleme önce 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe Exchange ortamı. Not: Probenesid nöronlarda çoklu ilaç direnci taşıyıcıları önleyen bir ilaçtır. Bu ilaç eklenmesi boyalar ekstrüde etmek nöronların yetisini baskılayan ve nöronal etiketleme artırır. Probenesid yokluğunda Ca 2 + göstergesi boyaların Toplu yükleme ağırlıklı glial hücre yükleme üretir. probenesid eklenmesi nöronal ve glial tepkilerin görselleştirme sağlar. </li><li> Hazırlayın Kre Modifiyebs tampon. <ol><li> Yap bileşenlerin (mM olarak) son konsantrasyonlar olarak takip olduğu tadil edilmiş bir Krebs tamponu,: 121 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl2, 1.2 MgCl2, 1.2 NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21.2 NaHCO 3, 1 piruvik asit ve (NaOH ile 7.4&#39;e ayarlanmış, pH) 8 glikoz ihtiva eder. Ca sırasında 2+ görüntüleme kas kasılmaları inhibe 3 mcM nikardipini ve 1 mcM skopolamin ekleyin ve diseksiyonu tüm montaj. </li></ol></li></ol> 3. Görüntüleme ve Analiz NOT: Bir floresan ışık kaynağı, mikroskop, kaliteli bir CCD kamera ve uygun satın alma yazılımı ile en az bir temel görüntüleme teçhizat kullanın. Işık kaynağı ve özel uygulamaya bağlı olarak diğer bileşenlerin ilave edilmesini değişir. Bir filtre tekerleği ve deklanşör geleneksel xenon ark ışık kaynağı ile kullanılması gerekir. Ancak, LED ışık kaynakları ve aydınlatma sistemleri bu bileşenleri gerekmez. <ol><li> Rec yerleştirinmikroskop altında bölmeyi ording ve birden fazla ısıtılmış şırınga rezervuarlı bir yerçekimi akışlı perfüzyon sistemi kullanılarak 37 ° C Krebs tampon 2-3 ml / dak sürekli perfüzyon oranı oluşturmaktadır. Bir vakum tuzak bağlı her iki giriş ve emme hattında hava kabarcığı oluşumunu önlemek için emin olun. </li><li> Parlak bir alan aydınlatma altında odak noktası haline istenen pleksusunu getirin. Fotoğraf beyazlatma yol açabilir doku, ışığa maruz kalmaması. </li><li> Ganglionlar içinde Fluo-4 yükleme inceleyin ve görüntüleme için sağlıklı ganglionlar seçin. Sağlıksız / hasarlı ganglion otofloresan veya noktalı morfolojisi sergiler ve görüntüleme için kullanılmamalıdır. </li><li> Ganglion seçildikten sonra, kameraya ışık yolu yönlendirmek ve görüntü elde etme yazılımı ile canlı görüntü elde. Bu ganglion odak ve set görüntü alma hızı ve pozlama süreleri olduğundan emin olun. NOT: Görüntü elde etme oranları ve süreleri araştırmacılar kaydetmek istediğiniz olaylara bağlı olarak değişecektir. En deneyleri, görüntüler içinglial Ca 2+ cevapları Ca nöronlarda 2+ transientler gibi hızlı değildir çünkü geleneksel nöronlar için 2-10 Hz glial hücreler için 0.5-1 Hz ve yukarı elde edilir. </li><li> Denemeyi başlayın ve 30 saniye için temel aktivite kurmak. </li><li> Örneğin 2-3 ml / dakika bir oranda yerçekimi akışlı perfüzyon sistemi kullanılarak reseptör agonistleri ve antagonistleri olarak yararlı önceden ısıtılmış ilaçlar uygulanır. Normal tampon bir perfüzyon dönerek agonistleri / antagonistleri uygulanmasını takip ve en az 10 dakikalık bir yıkama / iyileşme süresi sağlar. NOT: İlaç uygulama süreleri bireysel bileşik ve deneysel tasarım bağlı olarak değişecektir. Genel olarak, agonist bir 20-30 saniye uygulama nöron ve glial hücrelerdeki G-proteinine bağlı reseptörlerin aktive etmek için yeterlidir. Bununla birlikte, (örneğin, nikotinik asetilkolin reseptörleri gibi) ligand-kapılı iyon kanallarının en fazla 5-10 saniye uygulama süresi gerektirirler. Daha fazla süre maruz kalma ligand kapılı iyon kanalları hızla dese neden olurnsitize. Antagonistler reseptör yollarının tam blokajını sağlamak için yaklaşık 3-15 dakika boyunca uygulanır. Ancak, bu bir brüt genellemedir ve araştırmacılar her zaman kendi özel paradigmada herhangi bir deneysel ilaç optimize edilmelidir. </li><li> Deney kayıt ve görünümü time-lapse film durdurun. Uygun görüntü analiz yazılımı kullanarak ilgi dikkatlice seçin bölgeleri (ROI). </li><li> Normalleştirmek ve ilk başlangıç ​​floresan değeri karşı ROI floresan yoğunluğu karşılaştırmak için yazılımı kullanın. Normalize floresanstaki değişimler, [Ca + 2] &#39;de değişiklikler ile doğrudan orantılıdır. <ol><li> YG - kadar taşınmış / K = (F 0) / K 0 (F 1) - kullanılarak daha önce 26 tarif edilen bir yöntemin değiştirilmesine kullanarak ((F 1 - K 0) / F 0) F1 floresan herhangi bir olan arka plan noktası ve F0 değerlendirme doğruluğunu geliştirmek için, temel floresan olduğunu. Bu değişiklik, yardımcı maddelermyenterik pleksusu yatan kas tabakasının hareketi sergileyen doku hazırlıkları floresan değişiklikleri gürültü azaltılmasında. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+of+neurons+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Autonomic+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Types of neurons in the enteric nervous system.</a> Journal of the Autonomic Nervous System. 81 (1-3), 87-96 (2000).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+the+autonomic+nervous+system%3A+peripheral+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The organization of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Neuroscience. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li>
<li>Pham, T. D., Gershon, M. D., Rothman, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+of+origin+of+neurons+in+the+murine+enteric+nervous+system%3A+sequence+in+relation+to+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Time of origin of neurons in the murine enteric nervous system: sequence in relation to phenotype.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 789-798 (1991).</li>
<li>Nasser, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+enteric+glia+in+intestinal+physiology%3A+effects+of+the+gliotoxin+fluorocitrate+on+motor+and+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of enteric glia in intestinal physiology: effects of the gliotoxin fluorocitrate on motor and secretory function.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291, G912-927 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterology+%26+Motility%22%5BJournal%5D)">Glial cells in the gut.</a> Neurogastroenterology & Motility. 17 (6), 777-790 (2005).</li>
<li>Broadhead, M. J., Bayguinov, P. O., Okamoto, T., Heredia, D. J., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+transients+in+myenteric+glial+cells+during+the+colonic+migrating+motor+complex+in+the+isolated+murine+large+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ transients in myenteric glial cells during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine.</a> J. Physiol. 590, 335-350 (2012).</li>
<li>Gulbransen, B. D., Bains, J. S., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glia+are+targets+of+the+sympathetic+innervation+of+the+myenteric+plexus+in+the+guinea+pig+distal+colon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enteric glia are targets of the sympathetic innervation of the myenteric plexus in the guinea pig distal colon.</a> J. Neurosci. 30, 6801-6809 (2010).</li>
<li>McClain, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+Responses+in+Enteric+Glia+Are+Mediated+by+Connexin-43+Hemichannels+and+Modulate+Colonic+Transit+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Ca2+ Responses in Enteric Glia Are Mediated by Connexin-43 Hemichannels and Modulate Colonic Transit in Mice.</a> Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).</li>
<li>Chandrasekharan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+motor+dysfunction+in+human+diabetes+is+associated+with+enteric+neuronal+loss+and+increased+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterology+%26+Motility%22%5BJournal%5D)">Colonic motor dysfunction in human diabetes is associated with enteric neuronal loss and increased oxidative stress.</a> Neurogastroenterology & Motility. 23 (2), e131-e126 (2011).</li>
<li>Abdo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells+protect+neurons+from+oxidative+stress+in+part+via+reduced+glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione.</a> FASEB J. 24, 1082-1092 (2010).</li>
<li>Aube, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+enteric+neurone+phenotype+and+intestinal+functions+in+a+transgenic+mouse+model+of+enteric+glia+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption.</a> Gut. 55, 630-637 (2006).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nature Reviews Molecular cell biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Gulbransen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+neuronal+P2X7+receptor-pannexin-1+mediates+death+of+enteric+neurons+during+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of neuronal P2X7 receptor-pannexin-1 mediates death of enteric neurons during colitis.</a> Nat Med. 18, 600-604 (2012).</li>
<li>Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+activity+in+different+classes+of+myenteric+neurons+underlying+the+migrating+motor+complex+in+the+murine+colon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium activity in different classes of myenteric neurons underlying the migrating motor complex in the murine colon.</a> J Physiol. 588, 399-421 (2010).</li>
<li>Okamoto, T., Bayguinov, P. O., Broadhead, M. J., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+transients+in+submucous+neurons+during+the+colonic+migrating+motor+complex+in+the+isolated+murine+large+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) transients in submucous neurons during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine.</a> Neurogastroenterol Motil. 24 (8), 769-778 (2012).</li>
<li>Kunze, W. A., Clerc, N., Furness, J. B., Gola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soma+and+neurites+of+primary+afferent+neurons+in+the+guinea-pig+intestine+respond+differentially+to+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The soma and neurites of primary afferent neurons in the guinea-pig intestine respond differentially to deformation.</a> J Physiol. 526, 375-385 (2000).</li>
<li>Schemann, M., Michel, K., Peters, S., Bischoff, S. C., Neunlist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+the+gastrointestinal+tract%3A+mapping+the+human+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Imaging and the gastrointestinal tract: mapping the human enteric nervous system.</a> Am J Physiol. 282, G919-G925 (2002).</li>
<li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+spread+of+pacemaker+activity+in+through+ICC+in+guinea-pig+antrum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastro+Motil%22%5BJournal%5D)">Visualization of spread of pacemaker activity in through ICC in guinea-pig antrum.</a> Neurogastro Motil. 14, 575(2001).</li>
<li>Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+organization+of+Ca2%2B+waves+by+enteric+neural+reflexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction and organization of Ca2+ waves by enteric neural reflexes.</a> Nature. 399, 62-66 (1999).</li>
<li>Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+and+neural+regulation+of+calcium+waves+in+longitudinal+and+circular+muscle+layers+of+guinea-pig+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Propagation and neural regulation of calcium waves in longitudinal and circular muscle layers of guinea-pig small intestine.</a> Gastroenterology. 118, 982-984 (2000).</li>
<li>Jessen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-like+glia+in+the+peripheral+nervous+system%3A+an+immunohistochemical+study+of+enteric+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-like glia in the peripheral nervous system: an immunohistochemical study of enteric glia.</a> Journal of Neuroscience. 3 (11), 2206-2218 (1983).</li>
<li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+functional+roles+for+enteric+glia+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 625-632 (2012).</li>
<li>Gomes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+paracrine+communication+between+enteric+neurons+and+glia+in+a+primary+cell+culture+derived+from+embryonic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterology+%26+Motility%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent paracrine communication between enteric neurons and glia in a primary cell culture derived from embryonic mice.</a> Neurogastroenterology & Motility. 21 (8), e870-e862 (2009).</li>
<li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+neuron-to-glia+signaling+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Purinergic neuron-to-glia signaling in the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 136, 1349-1358 (2009).</li>
<li>Ren, J., Bertrand, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptors+and+synaptic+transmission+in+enteric+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signal%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptors and synaptic transmission in enteric neurons.</a> Purinergic Signal. 4, 255-266 (2008).</li>
<li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiol Rev. 79, 1089-1125 (1999).</li>
<li>Dongcheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+regionalisation+for+enteric+nervous+system+formation%3A+implications+for+Hirschsprung%27s+disease+and+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest regionalisation for enteric nervous system formation: implications for Hirschsprung's disease and stem cell therapy.</a> Developmental Biology. 339 (2), 280-294 (2010).</li>
<li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behind+an+enteric+neuron+there+may+lie+a+glial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Behind an enteric neuron there may lie a glial cell.</a> J Clin Invest. 121, 3386-3389 (2011).</li>
<li>Boesmans, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuron-glia+interactions+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging neuron-glia interactions in the enteric nervous system.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu yazıda açıklanan metodolojiler, ENS'deki nöronları ve enterik glia'yı etkili bir şekilde incelemek için tutarlı bir yaklaşım sağlar. Kültürde nöronların ve enterik gliaların görüntülenmesi, tek tek hücrelerin işlevi hakkında zengin bir fikir vermiş olsa da, bu hücreleri doğal, çok hücreli ortamlarında incelemek, fizyolojilerini ve patofizyolojilerini anlamamız için çok önemlidir. Floresan mikroskobu, ENS'deki hücrelerin çok yönlü etkileşimlerini değerlendirmek için çok önemli bir tekniktir. ENS hücrelerinin seçici floresan işaretleyicilerle yüklenmesi ve yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile görüntü elde edilmesi, ENS'deki hücresel aktivitenin nicel gözlemlerine izin verir. ENS'nin canlı doku örneklerinin görüntülenmesi nispeten hızlı bir şekilde gerçekleştirilir ve büyük miktarda derinlemesine fonksiyonel ve mekansal veri üretir. Bu deneylerde kullanılan fare myenterik ve submukozal pleksus preparatları, moleküler ve genetik manipülasyon yaklaşımlarına izin verir. Tam montajlı preparatlardaCa2+ görüntüleme, nöron-glia etkileşimlerinin değerlendirilmesi için yararlı bir araç sağlar.
Gelişmiş deneysel paradigmalarda, hücreler içindeki farklı olaylar hakkında bilgi elde etmek için birkaç prob birleştirilebilir. Floresan mikroskobu, uygun bir floresan etiket kullanılırsa, belirli moleküllerin gelişmiş kontrastına sahip görüntüleri kaydedebilir. Fluo-4, geniş bir dinamik aralığa sahip olduğu için seçildi. boyalarını ENS'de kullanırken yeterli inkübasyon süresi hayati önem taşır. En iyi sonuçları elde etmek için boya konsantrasyonunun ve yükleme yönteminin ayarlanması gerekebilir. İdeal müstahzarlar, floresandaki değişiklikleri görselleştirmek için yeterli boya ile yüklenmelidir, ancak boyanın hedef iyonları şelatlaması ve hücre içi sinyalleşmeye müdahale etmesi için çok fazla olmamalıdır. Hücrelerde fototoksisiteyi ve boyaların ışıkla ağartılmasını önlemek için floresan ışığa maruz kalma sınırlandırılmalıdır. 
Araştırmacılar, özellikle çözelti ve doku hazırlığı olmak üzere bu deneyin birkaç adımına dikkat etmelidir. Hücresel fonksiyonları sürdürmek için ENS dokusunun işlenmesi ve diseksiyonu sırasında özel dikkat gösterilmelidir. GI yolu, bu tam montajlı preparatlarda diseksiyon ve görüntüleme kalitesi için zorluklar oluşturan birkaç katman ve doku çeşidi içerir 27. Ayrıca, MP'nin birbirine bağlanan fiber yolları daha geniştir ve ganglionlar SMP 2'ninkinden daha büyüktür. Myenterik pleksusun nöronal yoğunluğu, submukozal pleksus 28'inkine kıyasla daha yüksektir. Yavaş ve kesin olmayan diseksiyonlar, pleksus preparatlarının kalitesi ve dolayısıyla deneylerin genel başarısı üzerinde zararlı etkilere sahip olacaktır. Bu nedenle, temiz/hasarsız aletler, pratik ve el becerisi bu prosedür için kritik öneme sahiptir.
Tam montajlı doku preparatlarında, istenen hücre tipinin floresan yoğunluğunda gözlemlenen değişikliğin kinetiğini ve derecesini doğru bir şekilde değerlendirmek için ilgilenilen bölgeler (ROI) çizilirken dikkatli olunmalıdır. Ganglionlar kasılma kas tabakası üzerinde yer aldığından, bağırsak hareketliliğinin neden olduğu hareket artefaktları in situ görüntüleme sırasında birincil endişe kaynağıdır. Bu nedenle, enzimlerle inkübasyondan sonra doku preparatlarının yeniden sabitlenmesi ve tamponlara farmakolojik inhibisyonun (nikardipin/skopolamin) eklenmesi yoluyla bu hareket bozukluklarının bastırılması, net ve güvenilir görüntü elde edilmesini sağlar. Doku hareketini önlemek için farmakoloji ve mekanik yaklaşımların yanı sıra, son çalışmalar, kayıtlardaki rezidüel doku hareketini düzeltmek ve analizin doğruluğunu artırmak için gelişmiş yazılım metodolojilerinin ve hücre tipi yanıt özelliklerinin uygulanmasını göstermektedir 29. Bu teknik engeller dışında, bu yöntem, ENS'deki nöronların ve enterik glia'nın morfolojik ve kantitatif özelliklerini değerlendirmek için fizyolojik olarak ilgili koşulları sağlar.

enterik sinir sistemi (ENS) sindirim yolu 1 duvarında gömülü iki ganglionated pleksuslar halinde düzenlenmiştir. Bu kas sinir devreleri, myenterik pleksus (MP) ve submukozal pleksus (SMP), nöronlar ve glia enterik (Şekil 1) 2 oluşur. MP ve SMP gibi bağırsak motilite ve epitel emilimi ve sekresyon, sırasıyla 3 gastrointestinal (Gİ) fonksiyonlarını düzenler. Enterik glia ganglionlar içinde nöronlar ama enterik glia nüfusa yakın bulunan, aynı zamanda lif yolları ve bağırsak duvarının 3,4 ekstra-ganglion bölümlerini birbirine içinde var. Enterik glia başlangıçta nöronların sadece besleyici destek sağlamak için inanılırdı. Ancak son çalışmalar kuvvetle ENS 5,6 fonksiyonları için nöron-glia etkileşimleri önemli olduğunu göstermektedir. Örneğin, veri enterik glia nöronal aktivitenin 7 &quot;dinlemek&quot; olduğunu gösteriyorve nöronal devreler 6,8 modüle oksidatif stres 9 enterik nöronların korunması ve yaralanma 10,11 tepki olarak yeni enterik nöronların üretme yeteneğine sahiptir. Bu teknik inceleme sunulan protokol yerinde hücre içi Ca 2 + görüntüleme kullanarak nöronlar ve glia enterik arasındaki karmaşık etkileşimi incelemek için basit ve sağlam bir yöntem sağlar. Ca2 + uyarılabilir hücrelerde her yerde bulunan bir sinyal molekülü olan ve sinir sistemi 12 sinaptik sinyal olaylarını önemli bir rol oynar. Nöronlar veya enterik glia Uyarma ya akını ile Ca 2 + geçirgen kanallar veya Ca ile hücre içi kalsiyum depolarından 2+ salınımını sitoplazmik Ca 2 + konsantrasyonunda bir yükselme ortaya çıkarmaktadır. Görüntüleme Ca floresan boyalar ile nöron ve glia içinde 2+ transientler bir kurulan ve işlevsel organizasyonunu ve dinamiklerini incelemek için yaygın olarak kullanılan tekniktirENS 13-17. Ca 2+ görüntüleme ICC kalp pili ağları 18 ve bağırsak düz kas 19,20 ile uyarılma yayılmasını aydınlatmak için sağlam GI doku bölümleri okuyan önemli bir araç olduğu gösterilmiştir. Bu fizyolojik parametrelerin geniş bir yelpazede soruşturma araştırmacıların sağlayan ve onların uzaysal dağılımı ve zamansal dinamikleri hem de hakkında bilgi sağlar. Hücreler verimli zar-geçirgen floresan göstergeler ve optimize boyama protokolleri 21 ile minimal invaziv bir şekilde lekeli olabilir. Bu, in vivo 23, hem de işlevsel olarak korunmuş preparasyonlar 14-16,22 bir nöron çok sayıda ve enterik glia izlemek için bir fırsat sunmaktadır. Tüm monte doku preparatlar, Ca 2 + bağlandığmda da floresan artar Fluo-4 gibi yüksek afiniteli bir Ca2 + gösterge boyası yüklendi ağırlığa sahiptir. Floresan değişiklikler bir CCD kamera ve Ana tarafından kaydedilirdijital 6 lize. Ca2 + gelişi çeşitli uyaranlara nöron ve glial hücre etkileşimlerini, yanıt izleme olanağı ve gerçek zamanlı olarak mide-bağırsak işlemlerinde, bu hücre tiplerinin katılımını sağladı. İn situ Ca 2+ görüntüleme enterik nöronların ve glia sinyal mekanizmaları büyük fikir vermiştir ve hücre kültürü modelleri 6,24 üzerinde birkaç farklı avantajlara sahiptir. İlk olarak, yerinde hazırlıkları nöronlar ve glia yerli matris ortamını korumak ve sağlam dokuyu hedef bağlantılarının toplu bırakın. İkincisi, genetik ve kültürlü enterik glia morfolojisi önemli ölçüde in vivo 6,24 oranla değişmiş. Üçüncü olarak, birçok heterotipik etkileşimleri birincil hücre kültüründe kaybetti ve hücre-hücre etkileşimleri değerlendiren bu sınırlar vardır. Kültürlü hücreler de temel özelliklerinin incelenmesi, onların usefulne için uygundur rağmenenterik glia ve nöronlar arasındaki karmaşık etkileşimlerin eğitim için ss sınırlıdır. Sinaptik yollar 25 bozulmadan kalır gibi bir yerinde bir yaklaşım kullanarak incelenmesi nöron glia etkileşim daha fizyolojik ilgili olduğunu. Hücre kültürü yaklaşımlar karşılaştırıldığında, in situ yaklaşım bir sistematik nöronlar ve glia enterik arasındaki karmaşık etkileşimlerin anlaşılması için geliştirilmiş koşullar sunmaktadır. Ayrıca, tüm montaj hazırlıkları içinde ganglionated pleksus düzlemsel organizasyonu hücre içi Ca 2 + geçici floresan görüntüleme için idealdir ve bu teknik ENS nöron-glia aktivitesini değerlendirmek için basit bir yaklaşım sağlar.

<table><tbody><tr><td>BubbleStop Şırınga Isıtıcı&nbsp;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>10-4-35-G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz, Tip II, toz</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42613-33-2</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon araçları</td><td>Roboz&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Sabit kademeli mikroskop</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 boya</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Böcek pimleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>Minutien Pins</td><td></td></tr><tr><td>iQ Canlı Hücre Görüntüleme Yazılımı</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Neo sCMOS kamera</td><td>Andor</td><td>Neo 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nikardipin</td><td>Sigma</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon odası</td><td>Özel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>Harvard Aparatı</td><td>Modeli 720</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Moleküler Problar</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>Skopolamin</td><td>Sigma</td><td>S1013 ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td>DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık Kontrol Cihazı</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr></tbody></table>

enterik sinir sistemi yerinde ca 2+ görüntüleme

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Bağırsağın refleks davranışları enterik sinir sistemi (ENS) tarafından kontrol edilir. ENS, bağırsak duvarında bulunan iki ganglionlu pleksustaki bütünleştirici bir nöron ve glia ağıdır. Enterik nöronlar ve enterik glia, enterik gangliyonlar içindeki tek hücre tipleridir. Enterik nöronların ve glia'nın aktivitesi, bağırsak fonksiyonlarını koordine etmekten sorumludur. Bu protokol, floresan indikatör boyalarla hücre içi kalsiyum (Ca2+) geçici akımlarını görüntüleyerek bozulmamış ENS içindeki nöronların ve gliaların aktivitesini gözlemleme yöntemlerini açıklar. Teknik tartışmamız, kemirgen bağırsağından myenterik pleksusun tam montaj preparatlarında Ca2+ görüntüleme yöntemlerine odaklanmaktadır. Fluo-4 gibi yüksek afiniteli bir Ca2+ göstergesi ile ENS tam montajlarının toplu olarak yüklenmesi, tek tek nöronlarda veya glial hücrelerde Ca2+ yanıtlarının ölçümlerine izin verir. Bu yanıtlar tekrar tekrar ve güvenilir bir şekilde uyandırılabilir, bu da farmakolojik araçlar kullanılarak kantitatif çalışmalara izin verir. ENS hücrelerindeki Ca2+ yanıtları, soğutulmuş bir şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamera ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanılarak kaydedilir. Tam montajlı preparatlarda Ca2 + görüntüleme kullanılarak elde edilen floresan ölçümleri, enterik nöronlarda ve glial hücrelerde Ca2 + yanıtlarının mekanizmalarını ve potansiyel fonksiyonel sonuçlarını karakterize etmek için basit bir yol sunar.

Bu tekniğin doğru kullanımı doku hazırlıklarını-montaj, tüm araştırmacılar doğru hücre içi Ca 2+ [Ca 2 +] i enterik nöronların transienti ve glia ölçmek için sağlar. Fare kolon bir myenterik ganglion glia hücresi içinde, bir agonist ile uyandırılmış Ca2 + tepkilerinin bir temsili bir örneği, Video 1 &#39;de gösterilmiştir. Aşağıdaki sonuçlar, bu yöntem kullanılarak elde edilen bazı temsili sonuçlar anlatmak içindir. İlk olarak, Şekil 2, enterik glial ölçen bir deney sonuçlarını göstermektedir [Ca2 +] i kobay kolon uzunlamasına miyenterik pleksus kas (LMMP) preparasyonlar içinde ATP tarafından uyarılmaya yanıt olarak değişir. Özellikle, bu rakam analiz myenterik ganglion ve enterik nöronların yerini gösteren yıldız anahat dahil olmak üzere yukarıda sıralanan deney protokolünde uygun analiz yöntemini gösterir. Ayrıca bu sonuçlar i[Ca 2 +] i kobay olarak myenterik glia seferberlik yüz mikromolar ATP optimal doz llustrate. Bu yanıt enterik glial uyarımı kalibre ve uyaranlara test yanıtları normalleştirmek için kullanılabilir. Sonraki, Şekil 3 düzgün ilgi (ROI) glial hücreler çevredeki bölgeleri seçmek için nasıl elucidates, sarı daireler ülkelerle birlikte gösterilir. Bu sonuçlar aynı zamanda bazal koşullar altında ve farmakolojik uyarıcıya tepki olarak istenen floresan değişimini göstermektedir. Son olarak, Şekil 4, tüm montaj preparasyonlarda [Ca2 +] i yanıtlar için enterik glia ve nöronlar seçmek için uzamsal hususlar gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> ENS Şekil 1. Organizasyon. ENS iki büyük ganglionated plexuslar içerir. miyenterik pleksus l arasında yer almaktadırongitudinal ve dairesel kas katmanları. submukozal pleksus mukoza ve dairesel kas tabakası arasında yer almaktadır. ENS sadece nöronlar ve glia enterik oluşur. Sinir lifi yolları ganglionlar bağlamak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> Kobay kolon myenterik pleksus cevap Şekil 2. Enterik glia yerinde ATP. (A) myenterik ganglion Fluo-4 floresan bazal koşullar altında (kesikli çizgi ile belirtilen). Oklar 100 mmol / L ATP, glial hücreler ile stimülasyon üzerine (B). Kalın interganglionic lif yollarının işaret, ancak nöronlar, hızla artış Fluo-4 [Ca 2+] bir artış gösteren floresan <sub&gt; i. Yanıt hücreler küçük olduğunu unutmayın ve (yıldız ile işaretlenmiş karanlık alanlarda) çok daha büyük nöronlar çevreleyen. (C) Enterik glia 1 mg / L maksimum yanıtları 24 eliciting ile doza bağımlı bir şekilde ATP cevap. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">Bir görüntülemek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük versiyonu.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> Yerinde ATP kolon myenterik pleksus cevap Şekil 3. Murin S-100-GFP + hücreler. (A) S-100-GFP + fare kolon myenterik ganglion glial hücreler (yeşil) (kesikli çizgi ile belirtilen). Çevrede (ROI) ganglionlar içinde glial hücreler çevredeki Altı bölgeleri sarı daireler olarak gösterilmiştir. Oklar ganglion giden kalın lif yolları gösterir. Yıldızlarla d2 enterik nöronların eNote konumu. (B), bazal koşullar altında Rhod-2 floresans aynı gangliyon. (C), 100 umol / L ATP ile stimülasyondan sonra, gliyal hücreler, [Ca2 +] i artmış Rhod- gösterildiği artış ile cevap 2 floresan. (D) A-C&#39;de gösterilen her ROI karşılık gelen izler. (E) D 24 de gösterilen 6 İB&#39;nin yanıtı (SEM ortalama ±) Ortalamalı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> Enterik nöron-to-glia iletişim yerinde görüntülemede Şekil 4.. Ca 2 + görüntüleme deney (A) Temsilcisi görüntüleri (yalancı) nerede tüm montajmyenterik pleksus hazırlanması nöronal P2X7 reseptör agonisti BzATP (100 uM, 30 sn) ile meydan. Nöronal agonisti çevreleyen enterik glial hücreler (A &quot;) önce nöron, (A &#39;)&#39; de Fluo4 floresansta bir artışa neden olduğunu not edin. (B) glia (mavi) ve nöronların zaman boyunca flöresandaki değişim analizi (kırmızı ) normal tampon (katı çizgiler BzATP nöronal agonist BzATP. (C), nöronal veya glial tepkilerinin uygulamasından sonra) ve tampon içinde nöronal P2X7 reseptörleri 13 güçlendirmek için düşük Ca + 2 ve Mg + 2 (kesikli çizgiler) ihtiva etmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">edin Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> Enterik glia Video 1. Agonist-uyarılmış Ca 2+ yanıtıYerinde. Bu video Ca 2+ gösterge boya, Flu-4 ile yüklü fare distal kolonda bir myenterik ganglion gösterir. belirtildiği zaman glial hücre agonisti, ADP, banyoya ilave edilir. ADP Fluo-4 floresan geçici yükselme ile gözlemlediği gibi enterik glia hücre içi Ca artışı 2+ ortaya çıkarır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Enterik sinir sistemi (ENS), bağırsak duvarında bulunan ve bağırsak reflekslerini kontrol eden bir nöron ve glia ağıdır. Bu protokol, Ca2+ görüntüleme kullanılarak ENS'nin canlı preparatlarında enterik nöronların ve glia'nın aktivitesini kaydetme yöntemlerini açıklar.

Enterik Sinir Sistemi Yerinde Ca 2+ Görüntüleme

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Bu prosedürün genel amacı, floresan kalsiyum indikatör boyalar kullanarak, bağırsağın canlı bütün montaj preparatlarında enterik nöronların ve gliaların aktivitesini görüntülemektir. Bu işlem, öncelikle hayvandan bir bağırsak bölümünün çıkarılması ve önceden ısıtılmış bir ortama yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bağırsağın mezenterik sınır boyunca açılması ve mukozal yüzey yukarı bakacak şekilde hafif bir gerginlikle düz bir şekilde iğnelenmesidir.Miyenterik pleksusun bütün montaj (whole mount) preparatları mikrodissection yöntemiyle hazırlanır ve görüntüleme kaplarına yerleştirilir. Ardından, bütün montaj preparatları bir inkübatörde floresan indikatör boya flu oh four ile yüklenir. Son aşamalarda, yüklü preparatlar, bazal aktiviteyi kaydetmek amacıyla görüntüleme ve analiz yazılımı tarafından kontrol edilen yüksek çözünürlüklü bir kameraya sahip floresan görüntüleme mikroskobu kullanılarak görüntülenir.Ardından incelenen ilaçlar eklenir ve nöronlar ile gliyalardaki kalsiyum geçişleri kaydedilir. Nihayetinde, enterik sinir sisteminin in situ kalsiyum görüntülemesi, nöron ve gliyalardaki hücresel aktivitenin fizyolojik bağırsak fonksiyonlarının düzenlenmesine ve bağırsak patofizyolojisindeki enterik sinir sistemi disfonksiyonuna nasıl katkıda bulunduğunu incelemek için kullanılır.Bu tekniğin etkileri, nöronlar ve enterik glia arasındaki karmaşık etkileşimi incelemek için basit ve sağlam bir yöntem olan NC iki kalsiyum görüntülemesinin kullanımı aracılığıyla, fonksiyonel bağırsak bozukluklarının ve inflamatuar bağırsak hastalığının fizyolojisi ve patofizyolojisine dair bir anlayış geliştirilmesine yöneliktir; bu prosedür laboratuvarımdaki iki bilim insanı tarafından uygulamalı olarak gösterilecektir. Laboratuvar hayvanlarından alınan dokuları içeren aşağıdaki prosedürler, 2013 tarihli AVMA hayvan ötanazisi kılavuzlarıyla uyumludur ve önceden Michigan State University I-A-C-U-C tarafından onaylanmıştır. Hayvanı onaylanmış prosedürlere göre ötanize ettikten sonra, hayvanı sırtüstü pozisyona getirin ve karın üzerindeki cildi %70 etanol ile temizleyin. Karın derisini orta hat boyunca tutmak için penset kullanın ve ardından iç sindirim organlarını açığa çıkarmak için lineer hattı boyunca altı santimetrelik bir medial insizyon yapmak üzere cerrahi makas kullanın.Ardından, periton içindeki kolonu bulmak ve açığa çıkarmak için küt uçlu pens kullanın. İleal kolon mezenterini makasla kesin ve bağırsağı çözmeye başlayın. Bağırsağın uzunluğu yeterince çözüldüğünde, bu videoda gösterilecek olan kalın bağırsak hazırlığı için kolonu, sekumun distalinden ve rektumun proksimalinden kesin.Ardından bağırsak segmentini hızla çıkarın ve buz üzerinde, üç mikromolar nikardipin hidroklorür ve bir mikromolar S skopolamin hidroklorür ile takviye edilmiş DM EMF 12 Medyum içeren bir behere yerleştirin. Bu inhibitörlerin eklenmesi, bağırsak düz kaslarını felç ederek mikrodiseksiyonu ve ardından gelen görüntülemeyi kolaylaştırır. İstenen bağırsak segmentinden dört ila altı santimetrelik küçük bir parça kesin ve soğutulmuş takviyeli medyumla doldurulmuş syl guard kaplı bir Petri kabına yerleştirin.Ardından, bağırsak segmentinin proksimal ve distal uçlarını böcek iğneleriyle sabitleyin ve mezenterik sınır boyunca düzlemesine bir kesi yaparak bağırsak tüpünü açın. Şimdi dokuyu, mukoza tarafı yukarı bakacak şekilde hafif bir gerginlikle düz bir biçimde iğneleyin ve beş numara ince pensle mukozayı kaldırıp altından çok ince yaylı makasla keserek mukoza tabakasını dikkatlice ayırın. Dokuyu yaklaşık 0,5 santimetrekarelik daha küçük preparatlara bölün, her bir parçayı takviyeli besiyeri ile doldurulmuş bir görüntüleme kabına yerleştirin ve buz üzerine koyun.Her bir preparatı, sirküler kas tabakası yukarı bakacak şekilde dört köşesinden iğneleyin. Sirküler kası ince cımbızlarla ayırarak dikkatlice disseke edin. Miyenterik pleksusu açığa çıkarmak için aşırı gerilmeden kaçının, görüntüleme kaplarını tekrar buz üzerine yerleştirin ve her kaptaki solüsyonu taze takviyeli besiyeri ile değiştirin.Ardından, kapları buzdan çıkarın ve her bir kaba iki mililitre enzim karışımı ekleyip %5 karbon dioksit ve %95 hava içeren oda sıcaklığındaki ortamda 15 dakika inkübe edin. Son olarak, fotobeyazlamayı önlemek için sınırlı ışık koşulları altında çalışarak, doku preparatlarını üç kez medyum ile yıkayın ve köşeleri tekrar doldururken 1,5 mililitre takviyeli medyum ve 1,2 mikrolitre 250 milimolar probit stok ile 1,5 mikrolitre Eloqua'nın dört milimolar Fluro four stoğunu ekleyin; ardından görüntüleme kaplarına yaklaşık 1,5 mililitre flu oh four yükleme çözeltisi ekleyip 37 °C'de karanlık bir inkübatörde 45 dakika inkübe edin. Kapları inkübatörden çıkardıktan sonra preparatları üç kez medyum ile yıkayın.Ardından, nöronal işaretlemeyi artırmak için 200 micromolar prop asit içeren taze besiyeri ekleyin ve daha önce olduğu gibi 15 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sırasında, protokolün yazılı bölümündeki talimatlara göre modifiye bir Krebs tamponu hazırlayın ve kas kasılmalarını önlemek için üç micromolar nikardipin ve bir micromolar skopolamin ekleyin. Kalsiyum two plus görüntüleme ve tüm mount diseksiyonları sırasında, kayıt odasını floresan mikroskobunun altına yerleştirin ve çoklu ısıtmalı şırınga rezervuarlarına sahip bir yerçekimi akışlı perfüzyon sistemi kullanın.37 °C Krebs tamponu ile dakikada iki ila üç mililitre sürekli bir perfüzyon hızı oluşturun. Hem giriş hattında hem de vakum tuzağına bağlı emiş hattında hava kabarcığı oluşumunu önlediğinizden emin olun. İstenen pleksusu parlak alan aydınlatması altında odaklayın.Fotobeyazlamaya yol açabileceği için dokunun aşırı maruziyetinden kaçının. Ganglionlar içindeki flu oh four yüklemesini inceleyin ve görüntüleme için sağlıklı ganglionları seçin. Sağlıksız, hasarlı ganglionlar otofloresans veya noktasal morfoloji sergileyecektir ve görüntüleme için kullanılmamalıdır.Bir ganglion seçildikten sonra, ışık yolunu kameraya yönlendirin ve canlı bir görüntü elde edin. Görüntüleme yazılımı ile ganglionun odakta olduğundan emin olun; görüntü alma hızını ve pozlama sürelerini ayarlayın. Görüntü alma hızları ve süreleri, araştırmacıların kaydetmek istediği olaylara bağlı olarak değişiklik gösterecektir. Çoğu deneyde görüntüler geleneksel olarak glia hücreleri için 0,5 ile 1 hertz arasında ve iki ila 10 hertz'e kadar olan hızlarda alınır.Glial kalsiyum geçişleri nöronlardaki kalsiyum geçişleri kadar hızlı olmadığı için, nöronlar için kaydı başlatın ve deneysel stimülasyonlar olmadan seçilen ganglionun bazal fizyolojik aktivitesini 30 saniye boyunca belirleyin. Ardından, ilacınız için optimize edilmiş bir protokole uygun olarak, reseptör agonistleri ve antagonistleri gibi ilgili ön ısıtılmış ilaçları yerçekimi akışlı perfüzyon sistemini kullanarak dakikada iki ila üç mililitre hızında uygulayın. Kaydı durdurun ve deneyin zaman atlamalı videosunu izleyin.Uygun görüntü analiz yazılımını kullanarak ilgi bölgelerini (ROI) dikkatle seçin. Son olarak, ilgi bölgelerinin floresan yoğunluğunu başlangıç temel değerine göre normalize etmek ve karşılaştırmak için uygun görüntüleme yazılımını kullanın. Normalize edilmiş floresanstaki değişimler, kalsiyumdaki değişimlerle doğrudan orantılıdır. Aşağıdaki üç görüntü, Guinea piglerdeki enterik gliaların in situ bir TP'ye yanıt verdiğini göstermektedir.Bazal koşullar altında, kesikli çizgiyle belirtilen düşük seviyeli bir fluoro four floresansı görülmektedir. Oklar, 100 µM ATP stimülasyonu üzerine kalın interganglionik fiber traktlarına işaret etmektedir; nöronlar değil, glial hücreler fluoro four floresansını hızla artırarak kalsiyum artışına işaret eder. Yanıt veren hücrelerin küçük olduğunu ve asteriskle işaretlenen koyu boşluklarla belirtilen çok daha büyük nöronları çevrelediğini not edin.Bu histogram, enterik glial hücrelerin bir TP'ye doz bağımlı olarak yanıt verdiğini ve litre başına bir milimolün maksimal yanıtları tetiklediğini göstermektedir. Bu video, kalsiyum iki artı indikatör boyası flu oh dört ile yüklenmiş fare distal kolonundan bir miyenterik gangliyonu göstermektedir. Belirtilen zamanda banyoya glial hücre agonisti a DP eklenir.Bir DP, flu oh dört floresanındaki geçici artışla gözlemlendiği üzere, enterik gliada hücre içi kalsiyum iki artı seviyesinde bir artışa neden olur. Bu videoyu izledikten sonra, kalsiyum görüntüleme kullanarak nöronlar ve enterik glia arasındaki karmaşık etkileşimi nasıl doğru bir şekilde inceleyebileceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Tüm mount preparatlarda kalsiyum yanıtlarının mekanizmalarını ve potansiyel fonksiyonel sonuçlarını karakterize etmek, ideal görüntüleme kalitesi için hassas diseksiyonlar gerektirir.Bu mikroskobi tabanlı teknik kapsamında floresan işaretlemenin ve farmakolojik stimülasyonların kullanılması, bu hücrelerin doğal çok hücreli ortamlarındaki değerlendirmesinin iyileştirilmesini sağlar.

in-situ-ca2-imaging-of-the-enteric-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, boyalar, ayarlanabilir bir çözünürlüğe sahip, sağlam sinir ağları gibi kobay enterik sinir sistemi plexuses gibi optik kayıt sağlayan elektriksel aktivitenin ne kadar voltaj duyarlı göstermektedir ki, tek hücrelerden çok ganglion devre arasında değişmektedir.

Gerilim duyarlı Boyalar kullanarak Gine domuzu Enterik Ağları Elektrik Faaliyet Optik Kayıt

Bu videoda, fare bağırsağının submukoza ve lamina propriasından enterik glial hücrelerin izole edilmesi için bir yöntem gösterilmektedir. Submukoza ve lamina propria dokusunun çıkarılması, enterik glial hücrelerin bunlardan izole edilmesi ve bir enterik glial hücre kültürü oluşturmak için hücrelerin kaplanmış bir kuyu plakası üzerinde kültürlenmesi ile ilgili adımları ana hatlarıyla belirtir.

Bir farenin submukoza ve lamina propriasından enterik glial hücrelerin izole edilmesi

Bu video, immünofloresan ve konfokal mikroskopi kullanarak nöronal popülasyon dağılımını görselleştirmek ve analiz etmek için embriyonik murin gastrointestinal sisteminin immün boyamayı göstermektedir.

Embriyonik Murin Gastrointestinal Sistemindeki Nöronal Popülasyonların İmmünofloresan Boyanması

Kaynak: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In Situ Ca2+ Enterik sinir sisteminin görüntülenmesi. J. Vis. Uzm.  (2015)Bu video kalsiyumu göstermektedir fare Kolonik Myenterik pleksus preparatlarında enterik nöronların ve glia'nın aktivitesini görselleştirmek ve analiz etmek için görüntüleme.

Bir Fare Kolonik Myenterik Pleksusunda Enterik Nöron ve Glia Aktivitelerinin Kalsiyum Görüntülemesi

Kaynak: Doser, R., et al. Nöronal Kalsiyum İşleminin In Vivo Hücre Altı Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2023)Bu video, transgenik Caenorhabditis elegans suşlarının ventral sinir kordonu nöronlarındaki hücre altı kalsiyum akışının in vivo görüntülemesini göstermektedir. İki farklı kalsiyum indikatörü kullanılır: bir suşta bir sitoplazmik indikatör ve diğerinde bir mitokondriyal indikatör kullanılır. Nöronlar, nöronal sitoplazma ve mitokondri içindeki floresan yoğunluğundaki gerçek zamanlı...

Caenorhabditis elegans Nöronlarında Hücre Altı Kalsiyum Dinamiğinin Görüntülenmesi

Bu enterik sinir sisteminin nöronal ve glial bileşenlerin doğrudan çalışma için bir hücre kültür protokolü göstermektedir. Lamelleri bir nöron / glia karışık kültür, immünohistokimyasal elektrofizyoloji, bireysel nöron ve glia fonksiyonu incelemek için yeteneği sağlayan yetişkin fare myenterik pleksustan...

Bir<em&gt; In-vitro</emYetişkin Mouse myenterik Pleksus izole edilen enterik Nöronlar ve Glia bir&gt; hazırlanması

Enterik sinir sistemi, bağırsağı çoğaltan, göç eden ve kolonize eden nöral krest hücreleri tarafından oluşturulur. Nöral krest hücreleri, nörotransmitter fenotiplerine özgü belirteçlerle nöronlara farklılaşır. Bu protokol, enterik sinir sistemi nörotransmitter ekspresyonunu görselleştirmek için murin embriyonik gastrointestinal sistemin diseksiyonu, sabitlenmesi ve immün boyanması için bir tekniği tanımlar.

Fare Enterik Sinir Sistemi Geliştirme gözünüzde canlandırın için immün

Bu makale, yetişkin farelerde kolonik motilitenin nöral regülasyonundaki değişiklikleri tanımlamak için bir video görüntüleme tekniği ve yüksek çözünürlüklü uzay-zamansal haritalamayı açıklamaktadır. Gastrointestinal (GI) fonksiyon üzerindeki ince etkiler, GI hastalığı hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için izole doku preparatlarında bu yaklaşım kullanılarak tespit edilebilir.

Video Görüntüleme ve Spatiotemporal Haritalar Fare Gastrointestinal Motilite Analiz

Mezenterik afferent sinirler, normal homeostaz ve patofizyoloji ile ilgili bilgileri gastrointestinal sistemden beyne doğru iletir. Gastrointestinal afferent sinir aktivitesi, bağlı afferent sinirlere sahip izole bağırsak segmentlerinin bir organ banyosuna monte edilmesi, sinirin izole edilmesi ve bazal ve uyarılmış aktivitenin değerlendirilmesi ile değerlendirilebilir.

Fare jejunal ve Kolon Segmentlerde Mezenterik Afferent Sinir Faaliyet Vitro kaydedilmesi

Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskopisi, biyomoleküllerin spesifik kimyasal bağların içsel titreşimine dayanarak etiketsiz görüntülenmesini sağlar. Bu protokolde, canlı farelerin omuriliğindeki hücresel yapıları görselleştirmek için entegre bir SRS ve iki fotonlu floresan mikroskobun enstrümantal kurulumu açıklanmaktadır.

İn vivo Kombine İki Foton Floresan ve Stimüle Raman Saçılma Mikroskobu ile Biyolojik Dokuların Görüntülenmesi

Bu protokol, dorsal kök ganglionunun (DRG) cerrahi maruziyetini ve ardından GCaMP3'ü (genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergesi; Yeşil Floresan Protein-Kalmodulin-M13 Protein 3) İpsilateral arka pençeye çeşitli uyaranlar uygularken Pirt-GCaMP3 fareleri kullanılarak nöronal toplulukların Ca2+ görüntülenmesi.

İn Vivo Bozulmamış Dorsal Kök Ganglialarında Primer Duyusal Nöronların Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülenmesi

Öğrenin, enterik sinir sistemi aktivitesini canlı bağırsak preparatlarında floresan kalsiyum göstergeleriyle görüntülemeyi. Bu yöntem nöron-glia etkileşimlerini ve bağırsak fizyolojisini incelemeye olanak tanır.

Enterik Sinir Sistemi Yerinde Ca ²⁺ Görüntüleme

Daha fazla video keşfet