Name: Görüntüleme Yerel Ca 2+ Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Öğrenin, memeli hücrelerinde IP3 aracılığıyla lokal kalsiyum sinyallerinin floresan mikroskopi ile görüntülenmesini ve otomatik analiz algoritması kullanımını. Bu yöntem, kalsiyum salınım dinamiklerini yüksek verimlilikle incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından GM 100201'nin IFS'ye ve GM 048071 ve GM 065830'un IP'ye hibeleri tarafından desteklenmiştir.

Biz insan nöroblastom SH-SY5Y hücrelerinde yerel Ca 2 + olayları görüntüleme ayrıntılı prosedürler sunuyoruz. Bu prosedürler, çoğu hücre tipinde 8-10 görüntü hücre içi Ca + 2 sinyallere uyarlanabilir. Hücreler 1. Hazırlık <ol><li> Kültür hücreleri tedarikçinin Web sitesinde listelenen talimatlara göre yansıması için. </li><li> Görüntü vermeden önce birkaç gün, hasat hücreleri, 1 ml 0.25% tripsin / EDTA (2-3 dakika) kullanılarak bir doku kültürü şişesi içinde büyütülür. Dekolmanı ardından, tripsin inaktive kültür ortamı eşit hacimde ekleyin. </li><li> Tabağı başına 3-7 x 10 4 hücre yoğunluğunda cam alt görüntüleme kapları içine bir hemasitometre ve tohum hücreleri kullanılarak bir hücre sayımı yapın. Görüntüleme deneyleri için hücreleri seçin onlar% 60 izdiham (2-3 gün) ulaştığınızda. </li></ol> Çözümler ve Reaktifler 2. Hazırlık <ol><li> Tamponlu Ca 2+ çözülebilmekle HEPES hazırlayın(mM) oluşan tuz çözeltisi (Ca 2 + -HBSS): 135 NaCl, CaCI2, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukoz 5.4 KCI, 2; pH = 7.4 NaOH ile oda sıcaklığında (RT). 4 ° C &#39;de glikoz ve mağaza eklenmeden Ca 2 + -HBSS hazırlanması; kullanımdan hemen önce solüsyona glikoz ekleyin. </li><li> Floresan Ca2 + göstergesi Cal-520 (1 mM) zara nüfuz edici formları çözünür, Cı-IP 3 (200 uM) ve EGTA% 20 Pluronic F-127 içeren bir dimetil sülfoksit (100 mM), (DMSO). -20 ° C de, nem ve ışıktan korunan Eppendorf tüpleri ve mağaza içine, bu reaktif maddeleri bir kısım. </li></ol> 3. Yükleme Hücreler Membran-geçirgen, Cal-520 ci-IP 3 ve EGTA <ol><li> Ca + 2 -HBSS sırasıyla 5 uM ve 1 uM nihai bir konsantrasyona kadar zara nüfuz edici Cal-520 ve CI-IP 3 stok çözelti seyreltilerek &quot;yükleme tamponu&quot; hazırlayın. </li><li> Aspire culture medya ve Ca 2+ -HBSS üç kez medya değiştirerek hücreleri durulayın. </li><li> Ca2 + çıkarın -HBSS ve karanlıkta, oda sıcaklığında 60 dakika süre ile yükleme tampon maddesi içinde hücrelerin inkübe edin. </li><li> Yükleme tamponu çıkarın ve Ca 2+ -HBSS üç kez medya değiştirerek hücreleri durulayın. <ol><li> Arzu edildiği takdirde, bu aşamada, daha sonra yük Ca 2 + -HBSS 5 mM&#39;lik bir son konsantrasyona kadar stok çözelti seyreltilerek EGTA / AM ile hücreler ve karanlıkta, oda sıcaklığında, 30-60 dakika boyunca kuluçkalayın. Bu inkübasyonun ardından, 3.5 adıma devam etmeden önce, hücreler Ca + 2 -HBSS ile üç kez yıkayın. </li></ol></li><li> Yüklenen reaktifler de-esterifikasyonu için izin vermek için 30 dakika süre ile Ca + 2 -HBSS hücreleri inkübe edin. </li><li> Görüntüleme hemen önce, son inkübasyon sırasında banyoya sızan olabilecek boya kaldırmak için &quot;taze&quot; Ca 2 + -HBSS Ca 2+ -HBSS değiştirin. </li></ol> 4. Ca 2+ </sup&gt; Image Acquisition <ol><li> 100X APO TIRF objektif üzerine daldırma yağ küçük bir damla (NA 1.49) yerleştirin. </li><li> Ters mikroskop sahnede görüntüleme çanak monte ve iletilen ışık kullanarak odak noktası haline getirmek hücreleri. Bu kayıt sırasında hareket etmesini önlemek için görüntüleme çanak sabitlemek için önemlidir. </li><li> Yüksek hızlı EMCCD kamera kullanılarak yayılan floresan (λ&gt; 510 nm) Cal-520 heyecanlandırmak ve toplamak için bir 488 nm lazer ile hücreleri aydınlatın. NOT: mikroskop faaliyet yazılım paketi kullanıcı lazer ışını ya (&quot;WF&quot; uyarma için) daha merkezi ya da (TIRF uyarma için) objektif arka diyafram aşırı kenarında tanıtılacak sağlayan bir odaklama lens çevirmek için izin verir. </li><li> EMCCD yazılımı kullanarak, yerel Ca 2 + olayları yakalamak için gerekli zamansal çözünürlükte veri toplamak için tam 512 x 512 piksel görüntüleme alanını azaltır. NOT: Örneğin, orta dörtlü256 x 256 piksel edinimi 66 fps&#39;ye satın alma oranını hızlandırır. Bundan başka, bir izole edilmiş Bitki Mod fonksiyonu kullanılarak 500 fps EMCCD kameranın kare hızını arttırmak için de mümkündür. </li><li> Otomatik, bazal aktivite birkaç saniye kayıt hücrelere UV flaş teslim ve başka 10-30 saniye kayıt devam etmek yazılım yapılandırın. NOT: UV flaş mikroskop arka limanında dikroik ayna yansıtan bir UV ile tanıtıldı Xenon ark ışık kaynağı kullanılarak teslim edilir. UV flaş süresi ve yoğunluğu yerel Ca 2 + olayların İstenen frekansı uyandırmak için ampirik ayarlanır. </li><li> Görüntü off-line analiz için yığılırken dosyaları kaydedin. </li></ol> 5. Otomatik Ca 2+ Görüntü Analizi NOT: Bu görüntülemek, süreç ve birçok ticari yazılım paketleri kullanılarak yakalanan verileri analiz etmek mümkündür. Ancak, hızla tanımlanması bir otomatikleştirmek için bir algoritma geliştirdikYerel Ca 2 + sinyalleri d analizi. Bu algoritma, mekansal ve zamansal filtre ayrıntılı bir tarifi, mesafe kadar taşınmış / F 0 ve kimlik / analiz rutinleri üretimi 11 bulunabilir. Bu algoritma, açık kaynak kodlu bir yazılım platformu Python üzerinde çalıştırmak için geliştirilmiştir, tarafından, birlikte örnek deneysel verilere ve detaylı kullanıcı talimatları ile elde edilebilir, e-posta gelen yazar (ismith@uci.edu). <ol><li> Dosyalarını dönüştürme çoklu uçağın .tiff dosya formatına özel yazılmış algoritma ithal edilecek. </li><li> Analiz algoritması içeren klasörü bulun ve çift tıklayın RUN.EXE. </li><li> .tiff Dosyayı seçin analiz edilecek. </li><li> Açık iletişim kutusunda analiz parametrelerini seçin. Örnek verileri için varsayılan parametreleri Şekil 2A bakın. </li><li> Siyah seviyesini belirlemek ya n yapar görüş alanının bir kısmına imleci hareket ettirerek görüntü yığını ofset edilecekot hücreyi içerirler (Şekil 2B bakınız) veya elle &#39;Set Siyah Seviye&#39; istemini kullanarak siyah seviyesi girerek. </li><li> Yazılım (Şekil 2C-F) tarafından analiz aşağıdaki ekranda dört pencere gözlemleyin. C hücrelerinden floresan istirahat bir tek renkli görüntü analiz ediliyor. Bu resmin üzerine bindirilmiş Beyaz kareler olaylara takılı iki boyutlu Gauss fonksiyonları sentroid pozisyonları olarak belirlenen etkinlik konumları vardır. </li><li> Her olay yere tıklayın ya da olaylar arasında dolaşmak için imleç tuşlarına basın. Bunu yaparken üzerine arka plan çıkarılır, Gauss penceresi D. bu siteler güncelleme her floresan oranı değişiklikleri (mesafe kadar taşınmış / F 0) düzeltti NOT: Kırmızı olayları komşu sitelere lokalize faaliyetten &#39;sızdırma-through&#39; o belirli sitesinden kaynaklanan ve kararlı olduklarını vurguladı. Seçilen yerinde floresan sinyal algılama aştı nerede alt mavi iz gösterirSiyah çizgi söz konusu sitesinden kaynaklanan olayları tanımlar ise eşik, (kırmızı karşılık gelen olayları vurgulanan). </li><li> Bir kırmızı tıklayın olayın zamansal evrimi görüntüler pencere E, ve birlikte takılan Gauss fonksiyonu mekansal profili ile, olayın mekansal profil zamanı boyunca ortalama görüntüler pencere F güncellemek için olay vurgulanır. </li><li> El eserler analiz reddedilmesi, böylece tespit edilmiştir olaylarını. Sağ kırmızı tıklayarak tür olayları silmek olayları vurgulanır. NOT: Bizim ellerde, Ca tek bir IP 3 R kanallardan 2+ akı kadar taşınmış / F 0 yaklaşık 0.11 ile sinyalleri çağrıştırıyor, bu nedenle bu ölçüde daha küçük herhangi bir tespit &#39;etkinlikleri&#39; yanlış pozitif olması muhtemeldir. </li><li> Kaydet CellR ilgi hücrenin etrafında çizim ve &#39;seçerek hücre bazında bir veri veya ihracat&#39; Excel kaydet &#39;seçerek İhracat verileri17 ;. NOT: Veriler, orijinal görüntü yığınıyla aynı klasöre kaydedilir. </li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549(2011).</li>
<li>Hagenston, A. M., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+synapse-to-nucleus+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564(2011).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+and+global+aspects+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elementary and global aspects of calcium signalling.</a> J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).</li>
<li>Lipp, P., Niggli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchical+concept+of+cellular+and+subcellular+calcium+signalling%29%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling).</a> Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).</li>
<li>Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics+of+calcium+liberation+induced+in+Xenopus+oocytes+by+photoreleased+inositol+trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate.</a> Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).</li>
<li>Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+cytosolic+calcium+based+on+rhodamine+and+fluorescein+chromophores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores.</a> J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).</li>
<li>Demuro, A., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+activity+and+localization+of+single+voltage-gated+Ca%282%2B%29+channels+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).</li>
<li>Smith, I. F., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+quantal+substructure+of+single+inositol+trisphosphate+receptor+channel+activity+during+calcium+puffs+in+intact+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).</li>
<li>Reissner, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+postsynaptic+mechanism+for+heterosynaptic+sharing+of+short-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity.</a> J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).</li>
<li>Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+algorithm+for+automated+detection%2C+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li>
<li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane%3A+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li>
<li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels%3A+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Biz burada açıklamak floresan Ca 2 + göstergeleri kullanarak kültürlü memeli hücrelerinde yerel Ca 2 + olayları görüntüleme için protokolleri. Ayrıca, kimlik ve elde edilen verilerin analizi otomatik bir sezgisel kullanıcı arayüzü ile bir algoritma tanımlamaktadır. Burada tarif edilen prosedür floresan Ca 2 + göstergesi Cal-520 kullanmak, ancak Flu-3, Flu-4, Flu-8 ve Oregon Yeşil BAPTA-1 gibi diğer birçok Ca 2 + duyarlı boyalar görüntü Ca yeterince iyi performans 2+...

Kalsiyum iyonları (Ca 2+) yayg gen ifadesi, sekresyon ve sinaptik plastisite 1 uzun ömürlü değişiklikler dahil olmak üzere biyolojik süreçlerin, çeşitli bir yelpazede düzenler. Ca 2 + Böyle farklı bir şekilde hareket hangi aracılığıyla bir yolu Ca 2+ farklı mekansal ve zamansal desenleri ile bir hücre oluşturabilir sinyalleri. Sitozolik örnek küresel yükselme düz kas dokusu 2 ise daha küçük [Ca 2+] tetik daralma, lokalize geçici yükselmeler (yerel Ca 2 + mikro bölgeler) için öğrenme ve bellek 3 için gerekli gen ifadesini teşvik. Ücretsiz sitozolik [Ca 2 +] ~ 100 nM dinlenme tutulur, fakat hızla Ca ile sitozolüne Ca 2+ akını aşağıdaki birkaç mikro-molar plazma zarı ve yanında bulunan 2 + -geçirgen iyon kanallarını çıkabilir hücre içi s Ca 2+ kurtuluştores. Bizim laboratuvar endoplazmik retikulum (ER) zarında bulunan Ca 2 + bırakma kanalı oluşturan inositol 1,4,5-trifosfat alıcısı (IP 3 R), odaklanır. Reseptör siteleri aktive sitozolik hem IP 3 ve Ca 2+ bağlanması üzerine, IP 3 R kanalı Ca 2 + ER lümeninde tecrit kurtarmak açılır. Ca 2+ salınımı uzamsal (Ca 2 + puf 4) 2+ Ca yerel sitozolik mikro oluşturmak için IP 3 Rs küçük bir küme sınırlı kalabilir veya IP 3 Rs komşu kümelerinin yakınlığı bağlı olabilir Ca 2+ indüklediği Ca 2 + -salınımı (YÜÇAM) 5,6 süreciyle birden puf siteleri işe bir hücre boyunca yaymak. Gelişmiş mikroskobu IMAGI ile birleştiğinde Tsien 7 Roger tarafından geliştirilen floresan küçük moleküllü Ca 2+ gösterge boyaların tanıtımı,teknikleri ng, Ca 2+ sinyalizasyon anlayışımızı büyük katkı sağlamaktadır. Mikroskopi için kullanılan kameralar son gelişmeler şimdi böyle görülmemiş mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip ponponları gibi geçici yerel Ca 2 + olayları görüntüleme için izin verir. Şu anda mevcut EMCCD kameralar&gt; 500 kare saniye -1 (fps) ve tamamlayıcı metal oksit yarı iletken yeni nesil 128 x 128 piksel ile görüntüleme sağlayan (CMOS) kameralar biraz daha yüksek pahasına yüksek piksel çözünürlük, ve hatta daha hızlı sağlamak gürültü seviyeleri. Toplam iç yansıma (TIRF) mikroskopi ile birlikte bu görüntüye artık tek Ca 2 + kanal olayları 8,9 mümkündür. Impracticable manuel işleme, görsel kimlik ve analiz hale ve otomatik algoritmalarının geliştirilmesi yapma yükümlülüğü büyük veri setleri (min başına yaklaşık 1Gb) oluştururken Bu yaklaşım, aynı zamanda kanal / olayların yüzlerce görüntüleme için izin verir. 2 + göstergeleri kullanarak sağlam memeli hücrelerinde yerel Ca 2 + sinyalleri görüntüleme prosedürlerini ve protokolleri sunuyoruz. Biz daha TIRF ve geleneksel geniş alan epi-floresan (WF) mikroskopi hem görüntülü yerel Ca 2 + olayların belirlenmesi ve analizi otomatik açık kaynak kodlu ortam Python geliştirilen bir algoritma göstermek. Biz IP Ca 2 + sinyalleri -generated 3 bağlamında bu yaklaşımları açıklamak rağmen, [Ca 2 +] Ca çeşitli ya yüzeye bulunan 2+ -geçirgen iyon kanallarını yayılan sitozolik yerel değişiklikleri incelemek için kolayca mükellef olan Membran ya da hücre içi organellerin 8-10.

<table><tbody><tr><td>İnsan Nöroblastomu SH-SY5Y hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520 /</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21130</td><td></td></tr><tr><td>ci-IP3 (D-23-O-İzopropiliden-6-O-(2-nitro-4,5-dimetoksi)benzil-myo-İnositol 1,4,5-trisfosfat-Hexakis(propionoksimetil) Ester</td><td>SiChem</td><td>cag-iso-2-145-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO/%20 çoğul F127</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>EGTA/</td><td>Invitrogen</td><td>E-1219</td><td></td></tr><tr><td>35 mm cam tabanlı görüntüleme plakaları</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

görüntüleme yerel ca<sup&gt; 2+</sup&gt; kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Sitosolik Ca + 2 iyonları, gen transkripsiyonu, elektriksel uyanlabilirliği ve hücre çoğalması gibi çok kapsamlı işlemlerin kontrol, hemen hemen tüm hücre tiplerinde hücresel aktivitesi sayısız yönlerini düzenleyen. Ca 2 + sinyalizasyon çeşitliliği ve özgünlüğü yerel geçici Ca 2 + microdomains dakika süre boyunca meydana gelen hücre çapında titreşimler ve dalgalar arasında değişen Ca 2 + sinyalleri farklı zaman ve mekansal ölçekler üzerinde hareket oluşturulur hangi mekanizmalar, türemiştir (Ca 2+ ponponları) kalıcı milisaniye. Elektron son gelişmeler CCD (EMCCD) kameralar artık&gt; 500 kare saniye -1 (fps) oranlarında 128 x 128 piksel mekansal çözünürlüğe sahip yerel Ca 2 + sinyalleri görüntüleme için izin çarpılır. Bu yaklaşım son derece paralel ve tek bir deneyde kanallar veya puf sitelerin yüzlerce eşzamanlı izlenmesini sağlar. Ancak, verilerin büyük miktarlarda üretilen (yaklaşık 1 Gb per dk) 2+ olayları uygulanamaz yerel Ca görsel kimlik ve analiz kılıyor. Burada tarif ve satın alma, algılama için prosedürleri göstermek ve geniş alan epi-floresan (WF) ve toplam iç yansıma ikisini de kullanarak Ca 2 + göstergeleri ile yüklenen sağlam memeli hücrelerinde Ca 2+ sinyalleri aracılı 3 yerel IP analizi floresan (TIRF) mikroskopi. Ayrıca, bu yerel Ca 2 + sinyallerin belirlenmesi ve analizi otomatik açık kaynak yazılım ortamı Python içinde geliştirilen bir algoritma tarif. algoritma alt piksel çözünürlüğe sahip Ca 2+ sürümü siteleri lokalize; veri kullanıcı gözden sağlar; ve bir Excel uyumlu tabloda genlik ve kinetik verileri ile birlikte floresan oranı sinyallerinin zaman dizilerini çıktılar.

Şekil 1A, CI-IP 3 yüklü insan nöroblastoma SH-SY5Y hücrelerinin Cal-520 floresan dinlenme bir WF görüntüsünü gösterir. Fotoğraf-sürüme 100 milisaniye UV flaş bu hücrelerin Pozlama i-IP 3 (Şekil 1A beyaz çevreler tarafından not) ayrık siteleri geçici Ca 2 + ponponları ortaya çıkardı. Bu sitelerde ölçülen Floresan izleri yavaş yavaş bırakma sitesinden yayılan 2+ Ca gibi bir çok yavaş düşen faz (Şekil 1B ve 1C) i...

Burada, Ca2+ göstergeleri ile yüklü sağlam memeli hücrelerinde floresan mikroskobu kullanarak yerel IP3 aracılı Ca2+ olaylarını görüntüleme tekniklerini ve bu olayların tanımlanmasını ve analizini otomatikleştiren bir algoritma sunuyoruz.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Bu prosedürün genel amacı, kamera tabanlı görüntüleme kullanarak sağlam memeli hücrelerde lokal IP three aracılı kalsiyum sinyallerinin elde edilmesini, tespitini ve analizini göstermektir. Bu işlem, öncelikle hücrelerin cam tabanlı lameller üzerine kültüre edilmesi ve ardından hücre membranından geçebilen floresan kalsiyum indikatörü olan CAL five 20 ve kafeslenmiş IP three ile yüklenmesiyle gerçekleştirilir.İkinci adım, lamel camın ters bir mikroskobun tablasına yerleştirilmesi ve kalsiyuma duyarlı floresan boya Cal five 20'yi uyarmak için örneğin 488 nanometre ışıkla aydınlatılmasıdır. Ardından, hücrelerin kısa bir UV ışığı darbesine maruz bırakılmasıyla lokal kalsiyum sinyalleri indüklenir. Bu fotoliz işlemi, IP üç'ü kafeslenmiş bir öncüden serbest bırakarak acetol trisphosphate reseptörüne bağlanmasını ve endoplazmik retikulumdan kalsiyum salınımını aracı kılmasını sağlar.Son adım, kaydedilen verilerin otomatik analizini başlatmak için görüntü yığınını özel olarak yazılmış algoritmaya aktarmaktır. Algoritma nihayetinde, kalsiyum salınım bölgelerini alt piksel çözünürlükle hızla yerelleştirir, kullanıcının verileri gözden geçirmesine olanak tanır ve floresan oran sinyallerinin

imaging-local-ca2-signals-in-cultured-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Endoplazmik retikulum, protein biyogenezi ve kalsiyum homeostazında önemli bir rol oynar. Biz, bize Ca2 + kaçak kanal rolü ele almak ve kendi varsayılan düzenleyici mekanizmaların karakterize sağlayan deneysel bir sistem kurduk. Bu sistem siRNA aracılı gen susturulması ve canlı hücre Ca2 + görüntüleme içerir.

Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar 2 + ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları

Striatumdaki astrosit hücre içi Ca2+ sinyallerinin özellikleri ve işlevleri tam olarak araştırılmamıştır. Striatal astrositlerde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini ifade etme yöntemlerini, adeno-ilişkili serotip 2/5 (AAV2/5) virüslerini ve ayrıca striatal astrositler içindeki Ca2+ sinyallerini yerinde güvenilir bir şekilde görüntüleme prosedürlerini açıklıyoruz.

Görüntüleme hücre içi Ca 2+ Genetik olarak kodlanmış Kalsiyum Göstergelerini Kullanma Yetişkin fareler ile Striatal Astrositler Sinyalleri

Bu makalede bir veya daha fazla plazma ve/veya zemin durumu tükenmesi (GSD) süper çözünürlük mikroskobu memeli hücrelerinde kullanarak hücre içi zar proteinleri tespiti için bir protokol özetlenmektedir. Burada, faydaları ve görselleştirme ve proteinlerin miktar için bu tür yaklaşımlar kullanarak konuları tartışmak.

Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer

Burada bir protokol için tek tek hücre tiplerinin fare nöromusküler kavşakta nüfus sinyal görüntü kalsiyum mevcut.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

Genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri (turk) nasıl yerinde Ca2 + görüntüleme gerçekleştirilir kökten değişti. Veri kurtarma gibi kayıtları en üst düzeye çıkarmak için Ca2 + sinyal uygun analiz gereklidir. Bu kağıt Protokoller'de Ca sinyalleri2 + yerinde kronolojik zamanmekansal haritalama ve analiz parçacık tabanlı kullanarak kaydedilen miktar kolaylaştırmak.

Kendisinin geçici eşleme ve parçacık analiz teknikleri intrasellüler Ca sinyal2 + in Situ ölçmek için uygulamaları

Burada bir iletişim kuralı için Ca2 + sinyaller hücre altı çözünürlükte diseksiyon sağlayan Ca2 + düşsel nöronlar ve gliyal hücreler, mevcut. Bu işleme genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri ifade izin tüm hücre tipleri için geçerlidir.

Yerel Ca2 + sinyalleri membran hedefli Ca2 + göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Floresan kalsiyum görüntülemeile in situ hibridizasyonunu birleştiren ve deneycinin kalsiyum aktivitesi modellerini tek hücreli düzeyde gen ekspresyonu profilleriyle ilişkilendirmesine olanak tanıyan iki parçalı bir protokol salıyoruz.

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Bu protokol, vahşi tip farelerde korteksi bozulmadan bırakırken iki foton mikroskobu ile tek nöron aktivitesinin görüntülenmesi ve kısmi korteks mutant farelerde geniş alan mikroskobu ile tüm SC'nin görüntülenmesi dahil olmak üzere, uyanık farelerin superior colliculus'unda (SC) kalsiyum yanıtlarını görüntüleme prosedürünü detaylandırır.

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

Burada, floresan mikroskobu kullanarak birincil murin ve insan T hücrelerinde Ca2+ mikro alanları olarak bilinen ilk yerel Ca 2+ sinyallerini çözmek için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, bağışıklık hücreleri içindeki Ca2+ sinyal yolaklarını inceleyen ve işlevlerini daha da çözen araştırmacılar için değerli bir kaynak görevi görür.

Primer T Hücrelerinde İlk Ca2+ Mikro Alanlarının Görüntülenmesi

Bu makale, Fura-2/boyası ile tek hücreli Ca2+ görüntüleme kullanılarak hücrelerde kalsiyum iyonu (Ca 2+) konsantrasyonlarının gerçek zamanlı, kantitatif izlenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, floresan yoğunluk oranları aracılığıyla verimli boya yüklemesi ve Ca2+ seviyelerinin doğru bir şekilde hesaplanmasını sağlayarak araştırma uygulamaları için basit ve hızlı bir yaklaşım haline getirir.

Kalsiyum iyon kanallarının aktivasyonunu incelemek için tek hücreli kalsiyum görüntüleme

Öğrenin, memeli hücrelerinde IP3 aracılığıyla lokal kalsiyum sinyallerinin floresan mikroskopi ile görüntülenmesini ve otomatik analiz algoritması kullanımını. Bu yöntem, kalsiyum salınım dinamiklerini yüksek verimlilikle incelemeyi sağlar.

Görüntüleme Yerel Ca

Daha fazla video keşfet