Name: Bir ile Bulaşıcı Süngerimsi Ensefalopati Türler Engelleri değerlendirilmesi İn Vitro Prion Proteini Dönüştürme Deneyi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Öğrenin, bulaşıcı süngerimsi ensefalopatilerin türler engellerini hayvan deneyleri olmadan değerlendirmek için in vitro prion proteini dönüştürme deneyini. Bu yöntem, dönüştürme verimlilik oranı hesaplayarak risk değerlendirmesi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

John Olsen (Wisconsin Doğal Kaynaklar Departmanı), Tom Cooley, Daniel O'Brien ve Steve Schmitt'e (Michigan Doğal Kaynaklar Departmanı) ve Dr. Daniel Walsh'a (USGS Ulusal Yaban Hayatı Sağlığı Merkezi) doku edinimi konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca tanı testi hizmetleri için Wisconsin Eyalet Hijyen Laboratuvarı'na ve ekipman kullanımı için Dr. Tonie Rocke ve ekibine (USGS Ulusal Yaban Hayatı Sağlık Merkezi) teşekkür ederiz. Ticaret, ürün veya firma adlarının herhangi bir şekilde kullanılması yalnızca açıklama amaçlıdır ve ABD Hükümeti tarafından onaylandığı anlamına gelmez.

USGS Ulusal Yaban Hayatı Sağlığı Merkezi&#39;nde gerçekleştirilen Hayvan çalışmaları Laboratuar Hayvan Refahı kurallar NIH Ofisi uyarınca ve kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi protokol # EP080716 altında yapıldı. Avcı-hasat hayvanlardan dokular Wisconsin veya Doğal Kaynaklar Michigan Müdürlüklerinden hediye edildi. 1. Çözüm hazırlanması Not: Aşağıda listelenen çözümler aşağıda Bölüm 2 CER deney alt-tabakanın hazırlanması için gereklidir. Daha yüksek konsantrasyonu, stok çözeltilerinden, bu çözümlerin her birinin hazırlanması; stok çözeltileri için tavsiye edilen konsantrasyon listelenen her biri ilgili kimyasal tanımlamanın sonra parantez içinde verilmektedir. Kullanılana kadar 4 ° C&#39;de Yüzey hazırlığı ve mağaza üzerine taze tüm çözümleri hazırlayın. <ol><li> 100 mM s: liziz tamponu için, 10 mM Tris içinde, pH 7.5 (1M Tris, pH 7.5 stok çözeltisi tavsiye edilir) aşağıdaki içeren bir çözelti hazırlamakde sodyum klorid (NaCI, 1 M stok çözelti), 10 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA, 500 mM EDTA, pH 8.0 stok çözelti),% 0.5 NP-40 (% 10 stok çözelti),% 0.5 deoksikolat (DOC,% 10 stok çözeltisi ). </li><li> Dönüşüm tamponu sağlamak için,% 0.05 sodyum dodesil sülfat (SDS,% 10 stok çözelti) ve% 0.5 Triton X-100 1, fosfat tamponlu tuzlu su içinde (% 10 stok çözelti) (PBS, 10, pH 7.4 stok çözelti) ihtiva eden bir çözelti hazırlayın. </li><li> Chaotropic çözümler için, guanidinhidroklorid 1x PBS (GdnHCl, 8 M stok) (10x stok çözelti) iki 3 M çözüm hazırlamak. Konsantre edilmiş hidroklorik asit (HCl) ile 3.5 ± 0.05&#39;e çözümlerden biri pH ayarlayın. İkinci çözeltinin pH değeri pH 7,4 ± 0,05 kalmasını kontrol edin ve konsantre HCI veya sodyum hidroksit (NaOH), gerekirse kullanarak ayarlayın. </li></ol> 2. CER Testi Yüzey Çiftleri hazırlayın <ol><li> Ilgi türlerin sağlıklı olmayan TSE-enfekte beyin dokusu elde edilir ve% 10 ağırlık başına hacim hazırlamakAşağıdaki yöntemlerden herhangi biri kullanılarak parçalama tamponu içinde homojenatı (ağ / hac): Dounce, boncuk değirmeni veya havan ve dibek homojen hale getirilmesi. Ayrıca, şırınga-ve-iğne homojenizasyon onları tabi tabaka aspire ve 27 G şırınga iğne ile kolaylıkla sınırdışı edilebilir kadar artan göstergesi iğneler kullanarak homojenatları ortaya çıkan rafine. <ol><li> Kemirgenler ve diğer küçük memeliler hazırlanan yüzeyler için, bütün beyin (ler) homojenize; Daha büyük memeliler hazırlanan yüzeyler için, homojenatları hazırlamak için obex (beyin sapı) doku kullanın. Beyin homojenatının miktarını seçerken, Aşama 2.6 protein çökelmesi için kullanılan santrifüj kapasitesinin en fazla% 50 hazırlar. </li><li> Edinilmiş beyin dokusunun kalitesi sorgulanabilir ise, SDS-PAGE 16 ve immunoblot 17 alt tabakaya önce hazırlık PrP ​​C düzeylerini değerlendirmek. </li></ol></li><li> Ayrı etiketli plastik konik tüpler iki eşit hacimlerde içine beyin Homojenat bölün. (GdnHCl EkleBeyin homojenatı 1 hacim oranı: pH 3.5 ya da 1, her bir tüpe 7.4 ya da 1 PBS içinde 3 M solüsyonu). </li><li> Iki çözeltinin pH değeri kontrol edin. Konsantre HCI kullanılarak 0.05 ± pH, pH 3.5, substratın pH ayarlayın. Diğer alt-tabakanın pH&#39;ı, pH 7.4 ± 0.05 olarak kalmasını sağlamak ve HCI veya NaOH ile gerektiğinde gerekli olduğu yerde pH&#39;ı ayarlamak. Asit veya bir baz makul ilavesiyle pH değerleri aşılması kaçının. </li><li> 5 saat boyunca oda sıcaklığında (RT), bir ucu-üzerinde-ucunda karıştırıcı çözüm döndürün. </li><li> Her konik bir tüp içinde alt-tabaka çözeltiler metanol dört hacmi eklenerek proteinin çökeltilmesi, girdap, iyice karıştırılmakta ve 16-18 saat süre ile -20 ° C &#39;de inkübe etmek. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 13,000 x g&#39;de santrifüj ile tortu örnekleri. Dikkatle süzün ve Süpernatantlar atmak ve metanol pelet buharlaşmasına izin verin. Tüp içine sarıldı metanol emmede yardım sağlamak için pamuk uçlu aplikatörler kullanın. Pelet over-dr izin vermeyiny ve metanol artık görünür bir kez, bir sonraki adıma geçin. </li><li> Dönüşüm tampon maddesi içinde yeniden süspanse Protein peletleri. Aşama 2.2 Her tüpe dağıtılmıştır beyin homojenatı başlangıç ​​malzemesinin miktarına eşit dönüşüm tampon bir miktar kullanın. NOT: Bu dönüşüm tampon hem de pH 3.5 ve 7.4 ile muamele edilmiş alt-tabaka preparatlar protein pelet yeniden askıya almak için (deterjan düşük seviyeleri ve fizyolojik bir pH&#39;a sahip) Yukarıdaki adım 1.2 tanımlanan bir çözelti kullanılır kritiktir. </li><li> Bir cuphorn sonikatörde Kısaca sonikasyon altyapı solüsyonları, (% 30 maksimal gücü ° &#39;de 10 sn), 0.5 içine kısım - etiketli bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde, 1.0 ml hacim. Her bir alt-tabakanın bir tümbölen üzerinde bir kalite kontrol immüno (adım 2.9) yapın. CER tahlili (Bölüm 4) gerçekleştirmek için hazır olana kadar -80 ° C&#39;de diğer alikotları saklayın. </li><li> Kullanmadan önce CER substrat çiftleri (Şekil 2) kalite kontrolünü gerçekleştirin. Bu adımlar CER alt-tabakalar provid sağlamakDönüşüm çalışmalarında E en iyi sonuçlar. <ol><li> İki yüzeylerde PrP C karşılaştırılabilir miktarda olun. 10-25 SDS-PAGE 16 tarafından her alt tabakanın ul ve 17 imünolekeleme PrP seviyelerini karşılaştırın. 7.4 ve 3.5 alt-tabakalar birbirinin% 10 ~ dahilinde pH protein seviyeleri, alt-tabaka çiftlerinin CER çalışmalarda kullanım için uygun ise. NOT: PrP immünblotlarında geniş PrP C bozulma kanıt göstermek gerekir. PrP imünoreaktivite özellikle&gt; 20 kDa olmalıdır. Bu moleküler kütleye daha az Grupları bozunma ürünleri olabilir. Bantlama desen substrat çiftleri arasında kabaca eşit olmalıdır. </li><li> Her iki alt tabaka PrP Cı duyarlı PK olması gerektiği gibi, 100 ug / ml bir son konsantrasyonda PK ile her bir alt tabaka 10-25 ul tedavi ve ısı bir çalkalayıcıda 1 saat süreyle 37 ° C&#39;de 1000 rpm&#39;de örnekleri özet. SDS-PAGE 16 ve 17 imünolekeleme kalan herhangi bir sinyal PrP değerlendirin.PrP res ile Yüzeyleri CER çalışmalarında kullanılmak için uygun değildir. </li></ol></li></ol> 3. TSE Ajan tohumları hazırlayın <ol><li> Çevrede türünden TSE ile enfeksiyona uğramış beyin dokusu elde edilir ve 1 x PBS, pH 7.4 içinde homojenat yukarıdaki adım 2.1 listelenen yöntemler kullanılarak (a / h), 10% hazırlar. Not: Tohumlar aynı zamanda merkezi sinir sistemi dışındaki diğer TSE ile enfeksiyona uğramış doku elde edilebilir, bununla birlikte, TSE ile enfeksiyona uğramış periferik dokularda türetilen tohumlar ile beyin türevi substratların dönüşüm etkinliği daha deneysel yayınlanmış literatürde değerlendirilmemiştir. </li><li> 100 içine Homojenat (ler) elde edilen kısım - hazır olana kadar -80 ° C de, 0.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde 300 ul hacim ve mağaza CER deneyi gerçekleştirmek için. </li></ol> 4. CER Testi Not: CER deney bir türden (&quot;tohum&quot; olarak verilen), PrP TSE nispeten küçük bir miktarının ilave edilmesini içerirkısmen pH 3.5 ya da 7.4 ya da C&#39;da denatüre edilmiş olan başka bir türden (enfekte edilmemiş beyin &quot;alt-tabaka&quot; olarak verilen), PrP ° C&#39;lik bir kıyasla, daha fazla içine. Uzun bir çalkalama enkübasyon süresinin ardından, her bir reaksiyon PrP TSE PrP C şablon odaklı dönüştürme PrP res kalan PK sindirim hem de immün algılama sonra densitometrik sinyali ile değerlendirilir. Daha önce pH değeri 3.5 vs 7.4 de denatüre yüzeylerde PrP res seviyelerini karşılaştırılması tür engeli bir ölçü sağlar. Bu deney prosedürü bir deneme genel görünüşü Şekil 1&#39;de verilmiştir. <ol><li> Yavaş yavaş bulaşmamış CER substrat çiftleri çözülme buz yatağı (yaklaşık 1 saat çözülme zamanı) üstüne yerleştirerek ve TSE-enfekte tohum çözümleri (tahlil daha önce hem pH 3.5 ve 7.4 de denatüre yüzeylerde eşit hacimlerde gerektirir). </li><li> Tamamen çözülmüş sonra, aspirat ve ardından aracılığıyla her bir taban çözüm sınırdışı27 G iğne şırınga birkaç kez yeniden homojenize. Kısaca, 30% maksimum güç ° &#39;de 10 saniye boyunca her bir TSE ile enfeksiyona uğramış tohum çözeltisi sonikasyon. Dönüşüm reaksiyonları hazırlarken buz üzerinde tüm çözümleri tutun. </li><li> TSE ajanı başına Etiket 5 ayrı düşük bağlanma, ince duvarlı PCR tüpleri test edilir. </li><li> PH 3.5 hazırlanmış, pH 7.4 ve (b) CER alt-tabaka hazırlanır: (a) CER alt-tabaka 95 ul% 10 TSE ile enfeksiyona tohum çözeltisi 5 ul ekleyerek, bu tüpler dönüşüm reaksiyonları hazırlayın. <ol><li> Her deney örneği için, önce her iki pH değeri 3.5 ve 7.4 de denatüre CER substrat çiftleri paralel reaksiyonlar hazırlamak. </li><li> Ampirik belirlenmesi yoluyla enfekte olmamış beyin yüzeye TSE ajanı tohum oranları optimize. Ortak tohum: kullanılan alt-tabaka oranları 100 ul toplam reaksiyon hacmi korumak ve 1:99 ul 2:98 ul ve 5:95 ul bulunmaktadır. Çoğu uygulama için, 5:95 ul tohumu: Yüzey hacim oranı uygun ve inci ne sunulmuştur edilirprotokoldür. </li></ol></li><li> Aşağıdaki gibi, TSE maddesi başına üç kontrol numuneleri, test edilen hazırlayın: (a) giriş PrP res için bir kontrol olarak 95 ul dönüşüm tamponu,% 10 TSE ile enfeksiyona tohum çözeltisi 5 ul; (b) pH değeri 3.5 ve non-spesifik olmayan şablonu dönüşüm için kontrol olarak (C), pH 7.4&#39;te hazırlanan 95 ul substrata 5 ul dönüşüm tampon eklemek. </li><li> Kısaca iyi tohum ve alt tabakayı karıştırmak için kapalı PCR tüpünde her örnek vorteks. PCR tüp kapağına sıkışan reaksiyon karışımının herhangi hacmi kaldırmak için düşük hızda tezgah üstü mini santrifüj bir anlık darbe ile izleyin. </li><li> PCR tüpleri kabul donanımlı bir tezgah üst termo-çalkalayıcı içine ayrı ayrı etiketli PCR tüpleri yükleyin örnekleri. 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de 1000 rpm&#39;de örnekleri çalkalayın. </li><li> Izlenerek (ağırlık / hacim) ve FK-100 ug / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar% 2&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar Sarkosyl ilave sarsma. Özet örnekleri termo-karıştırıcısı içinde 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de 1,000 rpm&#39;de. NOT: PrP C PK sindirim örneklerin sonrası dönüşüm yardımları için Sarkosyl eklenmesi. Giremeyen numuneler (4.5 Adım) yanlış pozitif sinyaller neredeyse Sarkosyl eklenmesiyle ortadan kalkar. </li><li> 17 immunoblotting SDS-PAGE 16 her bir numune içinde Kalan PrP res 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;ye kadar, SDS-PAGE numune tampon maddesi, ısı örnekleri ekleyin ve çözmek. Not: Örnek tampon ve ısıtma ek olarak, örnekler hemen işlenebilir veya örnekleri -20 ° C&#39;de saklandı veya -80 ° C önce immunoblotting sonra. Burada sunulan tüm veriler Novex NuPAGE jel ve transfer sistemleri kullanılarak üretildi. CER tahlilinden Tüm örnekler örnek tamponu ve üreticinin talimatlarına uygun olarak indirgeme maddesi ile muamele edilmiştir. Numuneler daha sonra 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;de ısıtıldı ve her numune için 30 ul% 12 Bis-Tris hazır jel yüklenmiştir. </li><li> Bir tedbir olarak dönüşüm verimliliği oranı (CER) hesaplayıntür bariyer. Dansitometri 17 ile PrP res Tedbir seviyeleri ve pH 3.5 örnek olduğu pH 7.4 numunenin toplam yoğunluğunu bölmek. Bir yüzdesini üretmek için 100 ile çarpın. </li><li> Belirli bir TSE ajanı ile bir tür için ortalama CER ± standart sapma oluşturmak için bağımsız deneysel çoğaltır gelen verileri derlemek. </li></ol>

<ol><li>Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833(2011).</li>
<li>Hill, A. F., Collinge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+strains+and+species+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Contrib+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prion strains and species barriers.</a> Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).</li>
<li>Scott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+expressing+hamster+prion+protein+produce+species-specific+scrapie+infectivity+and+amyloid+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques.</a> Cell. 59 (5), 847-857 (1989).</li>
<li>Prusiner, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenetic+Studies+Implicate+Interactions+between+Homologous+Prp+Isoforms+in+Scrapie+Prion+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication.</a> Cell. 63, 673-686 (1990).</li>
<li>Telling, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+Propagation+in+Mice+Expressing+Human+and+Chimeric+Prp+Transgenes+Implicates+the+Interaction+of+Cellular+Prp+with+Another+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein.</a> Cell. 83, 79-90 (1995).</li>
<li>Hill, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+same+prion+strain+causes+vCJD+and+BSE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The same prion strain causes vCJD and BSE.</a> Nature. 389 (6650), 448-450 (1997).</li>
<li>Torres, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elements+modulating+the+prion+species+barrier+and+its+passage+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences.</a> PLoS One. 9 (3), e89722(2014).</li>
<li>Groschup, M. H., Buschmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+for+prion+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Rodent models for prion diseases.</a> Vet Res. 39 (4), 32(2008).</li>
<li>Korth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abbreviated+incubation+times+for+human+prions+in+mice+expressing+a+chimeric+mouse-human+prion+protein+transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4784-4789 (2003).</li>
<li>Kocisko, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+specificity+in+the+cell-free+conversion+of+prion+protein+to+protease-resistant+forms%3A+a+model+for+the+scrapie+species+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3923-3927 (1995).</li>
<li>Raymond, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+molecular+barrier+limiting+susceptibility+of+humans%2C+cattle+and+sheep+to+chronic+wasting+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease.</a> EMBO J. 19 (7), 4425-4430 (2000).</li>
<li>Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+of+the+transmission+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">In vitro studies of the transmission barrier.</a> Prion. 3 (4), 220-223 (2009).</li>
<li>Zou, W. Q., Cashman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+pH+and+detergents+enhance+in+vitro+conversion+of+human+brain+PrPC+to+a+PrPSc-like+form%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form.</a> J Biol Chem. 277 (46), 43942-43947 (2002).</li>
<li>Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+barriers+for+chronic+wasting+disease+by+in+vitro+conversion+of+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein.</a> Biochem Biophys Res Commun. 364 (4), 796-800 (2007).</li>
<li>Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+prion+protein+conversion+suggests+risk+of+bighorn+sheep+%28Ovis+canadensis%29+to+transmissible+spongiform+encephalopathies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies.</a> BMC Vet Res. 9, 157(2013).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page</a> (2014).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot</a> (2014).</li>
<li>Chandler, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalopathy+in+mice+produced+by+inoculation+with+scrapie+brain+material%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material.</a> Lancet. 1 (7191), 1378-1379 (1961).</li>
<li>Browning, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+prions+from+mule+deer+and+elk+with+chronic+wasting+disease+to+transgenic+mice+expressing+cervid+PrP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP.</a> J Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).</li>
<li>Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+infection+of+sheep+and+goats+with+transmissible+mink+encephalopathy+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus.</a> Can J Vet Res. 51 (1), 135-144 (1987).</li>
<li>Rubenstein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+surveillance+and+antigen+conformation+determines+humoral+immune+response+to+the+prion+protein+immunogen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen.</a> J Neurovirol. 5 (4), 401-413 (1999).</li>
<li>Castilla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+species+barrier+by+PrP%28Sc%29+replication+in+vitro+generates+unique+infectious+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions.</a> Cell. 134 (5), 757-768 (2008).</li>
<li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).</li>
<li>Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quaking-induced+conversion%3A+a+highly+sensitive+assay+for+prion+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection.</a> Prion. 5 (3), 150-153 (2011).</li>
<li>Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaking+Alone+Induces+De+Novo+Conversion+of+Recombinant+Prion+Proteins+to+beta-Sheet+Rich+Oligomers+and+Fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils.</a> PLoS One. 9 (6), e98753(2014).</li>
<li>Mathiason, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+domestic+cats+to+chronic+wasting+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease.</a> J Virol. 87 (4), 1947-1956 (2013).</li>
<li>Seelig, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lesion+Profiling+and+Subcellular+Prion+Localization+of+Cervid+Chronic+Wasting+Disease+in+Domestic+Cats%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats.</a> Vet Pathol. , (2014).</li>
<li>Stewart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+predictions+of+prion+disease+susceptibility+in+carnivore+species+based+on+variability+of+the+prion+gene+coding+region%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region.</a> PLoS One. 7 (12), e50623(2012).</li>
<li>Russell, W. M., Burch, R. I. The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. , Methuen. (1959).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokolün başarıyla tamamlanması için, dikkat substrat hazırlanması (adım 2.1.2) ve dönüşüm reaksiyonlarının (adım 4.4.2) için madde oranı için tohum için kullanılan bulaşmamış beyin dokusunda PrP C seviyelerine dikkat edilmelidir. Bizim tecrübelerimize göre, beyinleri sürece PrP C immunoblotting (Şekil 4) ile mevcut olduğu gibi, önemli bir dönem otopsi sonrası CER substrat olarak kullanılmak üzere elde edilebilir. Aslında, bazı otoliz CER çalışmalar için kullanılan bobcats bey...

Bulaşıcı sünger tipi ansefalopatiler (TSEler prion hastalıkları, vs.), hayvanlarda ve insanlarda çeşitli etkiler uzun kuluçka dönemleri ile ölümcül nörodejeneratif hastalıkların bir grubudur. TSElerin varsayılan etiyolojik ajan bir enfeksiyon, hastalık ile ilişkili olarak PrP ​​(PrP C) normal hücre formunun şablon odaklı dönüştürme yoluyla kendi kendine yayılma kapasitesine sahip konakçı prion proteini (PrP), bir yanlış katlanmış izomer oluşur enfekte konak 1 merkezi sinir sistemi dokularında biriken formu (PrP TSE). Bulaşıcı memeli prionların genellikle türler arası iletim olayları 2 sınırlayıcı &quot;TSE tür engeli&quot; kavramına yol açmıştır bir türe özgü bir şekilde, konak-to-host dan iletir. prion tür bariyer biyolojik belirleyicileri iyi anlaşılmış değildir. Bulaşıcı PrP TSE ve ana PrP Cı C arasında amino asit dizisi benzerliğibir kuvvetle dönüşüm 3-5 gerçekleşir, ancak in vivo 6,7 gözlenen tüm prion iletim olayları açıklamak için yetersiz kalır mı etkilemektedir. Böylece, TSE tür engellerin karakterizasyonu büyük ölçüde hayvan meydan çalışmaları güvenerek etti: diğerinden prionlara verilen bir türe naif hayvanların teşhir ve hastalığın başlangıcında ve iletim verimliliği göstergeleri olarak saldırı hızı ortaya çıkan kuluçka süresi ölçme. Insan olmayan primat, PrP C ifade eden fareler da çalışma 8, bu tür kullanılır. transgenik fare üretimi ve uzun süreli prion biyoanalizlerin yanı sıra, hayvan kullanımının etik hususlar ile ilgili maliyetler, TSE türleri engellerin deneysel soruşturma engeller vardır. TSEler insan türü bariyer değerlendirilmesi, insan PrP C ifade etmek üzere geliştirilen fareler üzerinde dayanır. Bu fareler insan TSElerinin veya t değişikliklere yenik uzun kuluçka dönemleri gerektirirhızlı hastalık başlangıcı 9 o insan PrP C molekülü. Bu farelerde insan olmayan TSEler için İnkübasyon süreleri zorlu negatif sonuçların yorumunu yapıyor normal fare ömrü ötesine uzanabilir. Sigara insan primatlar da insan türü engelleri incelenmesi için vekiller olarak kullanılmıştır, ama insan konakta ilerlerken bu çalışmalar tam hastalığı özetlemek olmayabilir hayvan deneyleri ve insan olmayan primatların diğer türleri gibi aynı sorunlarla doludur. Hayvan biyodeneyler bir TSE için bir türün hassasiyetini ölçmek için &quot;altın standart&quot; yöntemi kalır, ancak engeller, maliyetler ve bu canlı hayvan çalışmalarının etik alternatifler soruşturma mecbur var. PrP TSE tarafından seribaşı bir proteinaz K (PK) dirençli devlet (PrP res) ev sahipliği PrP C dönüşüm değerlendirilmesine dayanmaktadır in vitro tahliller, bir dizi gelişmiş ve TSE sp araştırmak için kullanılmıştırecies engelleri 10-12. In vitro tahlillerin örnekleri, hücre içermeyen dönüşüm tahlilleri, protein siklik amplifikasyon (PMCA) yanlış katlanması ve dönüşüm verimliliği oranının (CER) deney 10-14 içerir. Bu testlerin hiçbiri doğal enfeksiyondan sonra tür engelleri katılan hesap periferik faktörler içine alırken, tüm TSEler için potansiyel duyarlı ana belirlemek için yararlı olabilir. Burada normal beyin homojenatlanndaki elde edilen iki denatüre PrP substratı tezgah üstü prion dönüştürme reaksiyonlarında kullanıldığı CER tahlili için protokol, (Şekil 1) 13 sunulmaktadır. PH değeri 7.4 &#39;de denatüre alt-tabaka PrP Cı sadece bir tür bariyer 14 yokluğunda reaksiyona içine ekildi PrP TSE PrP res dönüştürülebilir. Bunun aksine, pH 3.5, diğer alt-tabaka PrP C denatürasyonu PrP res aşağıdaki kuluçkalama dönüştürülmesini sağlarve herhangi bir türden elde edilen PrP TSE ile dönüşüm için bir kontrol olarak işlev görür. pH 3.5 substratın pH 7.4 alt-tabaka görece PrP res PrP C dönüşüm oranı tür bariyer bir ölçü sağlar. Bu da, CER deneyi, çeşitli TSElerin laboratuar farelerin türler arası bilinen tahmin eder ve kronik bitkinlik hastalığını (CWD) ve diğer TSEler 14 Hammond koyun dahil olmak üzere birçok memeli türünden, bir tür bariyer tahmin çabalarında deneyi kullandık bulmuşlardır 15. Yararlı Bu metodoloji bulacaksınız TSE türleri engelleri ya da PrP C -to-PRP res dönüşüm değerlendirilmesi hızlı tarama sağlayan bir araç ilgilenen Müfettişler.

<table><tbody><tr><td>%12 Bis-Tris SDS-PAGE jeller</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>NP0342</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mm Zirkonyum oksit boncuklar</td><td>Sonraki İlerleme</td><td>ZROB05</td><td>Diğer boncuk çeşitleri de etkilidir</td></tr><tr><td>Antikorlar</td><td>çeşitli tedarikçiler</td><td></td><td>İlgilenilen türlerden PrPres immünoblot tespiti için uygun primer ve sekonder antikorları seçin</td></tr><tr><td>Boncuk homojenizatör</td><td>Sonraki İlerleme</td><td>BBY24M</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>369434</td><td>Sıcaklık kontrollü yüksek hız</td></tr><tr><td>Konik tüpler</td><td>herhangi bir marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pamuk uçlu aplikatör</td><td>Uline</td><td>S-18991</td><td></td></tr><tr><td>Cuphorn sonicator</td><td>Isı Sistemleri-Ultrasonik</td><td>W-380</td><td>Isı Sistemleri-Ultrasonik, Inc. artık Qsonica, LLC</td></tr><tr><td>Densitometri yazılım programı</td><td>UVP</td><td>Vision Works LS Görüntü Alma ve Analiz yazılımı</td><td>NIH ImageJ gibi diğer programlar da çalışacaktır</td></tr><tr><td>Dounce homojenizatör</td><td>Kimble Chase</td><td>885300</td><td></td></tr><tr><td>Uçtan uca karıştırıcı</td><td>Labnet International</td><td>H5600</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetra asetik asit</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-770</td><td>Tehlikeli kimyasal: göz tahrişi</td></tr><tr><td>Guanidin hidroklorür, 8 M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24115</td><td>Tehlikeli kimyasal: akut toksisite, cilt tahrişi, göz tahrişi</td></tr><tr><td>Isıtma bloğu</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435570</td><td>Tehlikeli kimyasal: güçlü asit</td></tr><tr><td>Lityum dodesil sülfat numune tamponu, 4x</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>NP0008</td><td>Tehlikeli kimyasal: cilt ve solunum yolu tahrişi, ciddi göz hasarı, yanıcı katı</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>Tehlikeli kimyasal: akut toksisite, yanıcı sıvı</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>herhangi bir marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-santrifüj</td><td>Labnet International</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroyl-sarkozin (sarkosil)</td> <td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L-5125</td><td>Tehlikeli kimyasal: akut toksisite, cilt tahrişi, göz hasarı</td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Amresco</td><td>M158</td><td>Tehlikeli kimyasal: cilt tahrişi, göz hasarı</td></tr><tr><td>SDS-PAGE jel sistemi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>NuPAGE elektroforez sistemi</td><td>Diğer SDS-PAGE sistemleri de</td></tr><tr><td>PCR tüpleri (düşük bağlayıcı)</td> <td>çalışacaktırAxygen</td><td>PCR-02-LC</td><td></td></tr><tr><td>Havaneli homojenizatör</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-392-106</td><td></td></tr><tr><td>pH metre</td><td>Sentron</td><td>SI600</td><td></td></tr><tr><td>Polivinildiflorür membran</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Promega</td><td>V3021</td><td>Tehlikeli kimyasal: cilt ve göz tahrişi, solunum hassasiyeti, organ toksisitesi</td></tr><tr><td>SDS-PAGE numuneleri için indirgeyici ajan, 10x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D6750</td><td>Tehlikeli kimyasal: akut toksisite</td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28364</td><td>Tehlikeli kimyasal: akut toksisite, cilt tahrişi, göz hasarı, yanıcı katı</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>Tehlikeli kimyasal; güçlü baz</td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>çeşitli</td><td>Homojenize edilecek substrat hacimlerine uygun şırınga boyutu kullanın</td></tr><tr><td>Şırınga iğneleri</td><td>BD Biosciences</td><td>çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker (PCR tüp çalkalayıcı)</td> <td>Hangzhou Tüm Sheng Instruments</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Bio Basic</td><td>77-86-1</td><td>Tehlikeli kimyasal: cilt, göz, solunum yolu tahrişi</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Integra Chemical Company</td><td>T756.30.30</td><td>Tehlikeli kimyasal: akut toksisite, göz tahrişi</td></tr><tr><td>Girdap</td><td>Balıkçı Bilimsel</td><td>12-812</td><td></td></tr></tbody></table>

bir ile bulaşıcı süngerimsi ensefalopati türler engelleri değerlendirilmesi<em&gt; İn vitro</em&gt; prion proteini dönüştürme deneyi

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Bulaşıcı süngerimsi ensefalopatilerin (TSE'ler, prion hastalıkları) türler arası geçişini anlamaya yönelik çalışmalar, tipik olarak uzun ve maliyetli in vivo hayvan mücadele çalışmalarına dayandıkları için zordur. Prion tür engellerinin ölçülmesine yardımcı olmak, böylece hayvan kullanımını azaltmak ve hayvan biyo-tahlillerinden daha hızlı sonuçlar sağlamak için bir dizi in vitro test geliştirilmiştir. Burada, dönüşüm verimlilik oranı (CER) testi adı verilen hızlı bir in vitro prion dönüşüm testi için protokolü sunuyoruz. Bu tahlilde, enfekte olmamış bir konakçı beyinden alınan hücresel prion proteini (PrPC), iki substrat üretmek için hem pH 7.4 hem de 3.5'te denatüre edilir. pH 7.4 substratı TSE ajanı ile inkübe edildiğinde, proteinaz K (PK) dirençli duruma dönüşen PrPC miktarı, orijinal konakçının TSE ajanına olan tür bariyeri tarafından modüle edilir. Buna karşılık, pH 3.5 substratındaki PrPC, herhangi bir TSE ajanı tarafından yanlış katlanır. İki substrattaki PK'ye dirençli prion proteininin miktarını karşılaştırarak, konakçının tür bariyerinin bir değerlendirmesi yapılabilir. CER testinin, laboratuvar farelerinin bilinen prion tür bariyerlerini doğru bir şekilde tahmin ettiğini ve örnek olarak, vaşakların (Lynx rufus) ak kuyruklu geyiklere (Odocoileus virginianus) kronik israf hastalığı ajanına duyarlı olabileceğini düşündüren bazı ön sonuçlar gösteriyoruz.

CER testinin başarılı kullanımı dönüşüm reaksiyonlarında kullanılan substrat çiftlerinin kalitesine büyük ölçüde bağlıdır. Bu nedenle, alt-tabaka çiftini CER hazırlanması için prosedürler takip edilerek, bir kalite kontrol immünoblot (Şekil 2) yapılmalıdır. Her iki yüzeyler için, tahlil imünoblotlama ile 10-25 ul. PrP Cı her alt-tabaka olarak kolaylıkla tespit edilebilir ve PrP C düzeyleri ikisi arasında yaklaşık olarak aynı olmalıdır. Immünoreaktivite 20 kDa üzerinde ağırlıklı ola...

Prion hastalıklarının türler arası bulaşmasının önündeki engeli ölçmek zordur ve tipik olarak hayvan zorluklarını veya biyokimyasal analizleri içerir. Burada, tür engellerini tahmin etme yeteneğine sahip bir in vitro prion protein dönüşüm testi sunuyoruz.

Bir ile Bulaşıcı Süngerimsi Ensefalopati Türler Engelleri değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Prion Proteini Dönüştürme Deneyi

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Bu prosedürün genel amacı, bulaşıcı süngerimsi ensefalopatilerin (TSE) belirli bir türe karşı olan tür bariyerini, canlı hayvanları maruz bırakmaya gerek kalmadan değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle in vitro bir analizde kullanılmak üzere iki konversiyon analizi substratı hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım ise, bu substratların test etmek istediğiniz TSE ajanları ile inkübe edilmesidir.Proteinaz K ile sindirildikten sonra, örnekler SDS-PAGE ve immün bloklamaya tabi tutulur. Son adım, her bir substrattaki proteinaz K'ya dirençli PreOn protein miktarının akış sitometrisi kullanılarak ölçülmesi ve bu miktarların bir dönüşüm verimlilik oranı veya CER hesaplanarak karşılaştırılmasıdır. Nihayetinde CER, test edilen TSE'nin, substratın hazırlandığı konakçı türe karşı tür bariyerinin bir ölçütünü sağlar.Bu analizin avantajları arasında düşük maliyeti, kısa deney süresi ve canlı hayvanların doku örnekleriyle değiştirilmesi yer almaktadır. Bu yöntem, yaban hayatındaki prion hastalıklarının tür bariyerleri hakkında içgörü sağlamak için oldukça uygun olsa da, ilgi duyulan diğer tüm türlere uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan bireyler substrat hazırlama, kalite kontrol ve standardizasyon konularında zorluk yaşayabilirler.İlgili türden sağlıklı, enfekte olmamış beyin dokusu elde ettikten sonra, boncuklu değirmendir veya havan ve havan eli kullanarak lizis tamponu içinde ağırlık/hacimce %10'luk bir homojenat hazırlayın. Ardından, substrat 27 gauge bir şırınga iğnesi ile kolayca aspire edilip dışarı atılabilecek hale gelene kadar, artan gauge değerindeki iğnelerle şırınga ve iğne homojenizasyonuna tabi tutarak homojenatları daha da inceltin. Sonra, beyin homojenatını iki eşit hacme bölerek ayrı etiketlenmiş plastik konik tüplere aktarın ve her bir tüpe, beyin homojenatı ile birer bir hacim oranında olacak şekilde, bir tüpe 3 molar guanidin hidroklorür, diğerine ise pH 3,5 veya 7,4'te PBS ekleyin.Şimdi, substrat çözeltilerinin pH değerlerini kontrol edin ve her bir substratın pH'ının hedef pH değerinin artı veya eksi 0,05 sınırları içinde kaldığından emin olmak için gerektiğinde derişik hidroklorik asit veya sodyum hidroksit kullanın. Çözeltileri oda sıcaklığında, bir uçtan uca karıştırıcıda beş saat boyunca döndürün. Ardından, iyi karışması için her bir konik vorteksteki substrat çözeltilerine dört hacim metanol ekleyerek proteinleri çöktürün ve -20 °C'de 16 ila 18 saat boyunca inkübe edin.İnkübasyon sonrası, numuneleri 4 °C'de 13.000 G'de 30 dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün. Ardından süpernatantları dikkatlice döküp atın ve peletlerdeki metanolün buharlaşmasını bekleyin. Tüpün iç yüzeyine yapışmış metanolün emilmesine yardımcı olmak için pamuk uçlu aplikatörler kullanın.Pelletlerin aşırı kurumasını önleyin. Metanol artık görünmez olduğunda bir sonraki adıma geçin; protein pelletlerini yeniden süspande etmek için başlangıçtaki beyin homojenatı miktarına eşit miktarda konversiyon tamponu kullanın. Yeniden süspansiyon sonrası, substrat çözeltilerini 10 saniye boyunca kısaca sonike edin.Bir kap boynuzunda, maksimum gücün yaklaşık %30'unda sonikasyon uygulayın. Ardından, her iki substrattaki hücresel prion proteinleri proteinaz K'ya duyarlı olması gerektiğinden, çözeltileri etiketli 1,5 mL mikro santrifüj tüplerine 0,5 ila 1 mL'lik hacimlerde paylaştırın. Her bir substratın 10 ila 25 µL'sini, nihai konsantrasyonu 100 µg/mL olacak şekilde proteinaz K ile işleyin ve numuneleri termoshaker'da 37 °C'de, 1000 RPM'de bir saat boyunca sindirin; proteinaz K ile sindirilmiş substratları, sindirilmemiş her bir substratın 10 ila 25 µL'si ile birlikte yükleyin.Konak prion proteinini, proteinaz K direncini ve sindirilmemiş protein seviyelerini değerlendirmek için, bir SDS page jelinde prion proteinine özgü bir antikor ile jel ve immün bloklama yapın. Bu görüntü, immün blot sonuçlarını göstermektedir. İlk iki şerit sindirilmemiş substratları, sağdaki iki şerit ise proteinaz K ile sindirilmiş substratı içermektedir.pH 7,4 ve 3,5 substratlarındaki protein seviyeleri birbirine yaklaşık %10 oranında yakınsa ve proteinaz K'ya dirençli değilse, substrat çiftleri CER çalışmalarında kullanım için uygundur; diğer alikotlar CER analizi gerçekleştirilene kadar -80 °C'de saklanmalıdır. TSE ajanları, uygun biyogüvenlik önlemleri kullanılarak ve kurumsal kılavuzlara uygun olarak taşınmalıdır. İlgilenilen türden TSE enfekte beyin dokusu elde edildikten sonra, substrat çiftlerinin hazırlanması için daha önce kullanılan homojenizasyon yöntemi kullanılarak pH 7,4'te 1X PBS içinde %10 ağırlık/hacim oranında bir homojenat hazırlayın.Elde edilen homojenatları, CER analizi gerçekleştirilmeye hazır hale gelene kadar 0,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerinde 100 ila 300 mikrolitrelik hacimler halinde paylaştırın ve negatif 80 derece Celsius'ta saklayın. Başlamak için, pH 3.5 ve 7.4 enfekte olmamış CER substratlarını ve TSE enfekte tohum çözeltilerini yaklaşık bir saat boyunca buz üzerinde bekleterek eşit miktarlarda yavaşça çözdürün. Çözündürme işleminden sonra, çözeltileri buz üzerinde tutun ve önce her bir substrat çözeltisini 27 gauge şırınga iğnesiyle aspire edip püskürterek yeniden homojenleştirin.Ardından, her bir TSE enfekte çözeltiyi maksimum gücün yaklaşık %30'unda 10 saniye boyunca kısaca sonike edin. Daha sonra, düşük bağlanma özellikli, ince duvarlı ve etiketlenmiş PCR tüplerine 95 µL CER substratı pipetleyerek dönüşüm reaksiyonlarını hazırlayın. pH 7.4'te hazırlanan substratı iki tüpe çift örnek şeklinde ve pH 3.5'te hazırlanan 95 µL CER substratını diğer iki tüpe çift örnek şeklinde ekleyin.Ardından, pH 7.4 ve 3.5 substratlarının her bir tüpüne beş mikrolitre %10 TSE enfekte tohum çözeltisi ekleyin. Paralel olarak, spesifik olmayan şablon bağımsız dönüşümü kontrol etmek için, pH 7.4 ve 3.5 substratlarının diğer tüplerine beş mikrolitre dönüşüm tamponu ekleyin. Ayrıca, proteinaz K'ya dirençli başlangıç prion proteini için bir kontrol hazırlayın.Test edilen her bir TSE ajanı için, kontrol olarak 95 µL konversiyon tamponuna beş µL %10'luk TSE enfekte tohum çözeltisi ekleyin. Kapalı PCR tüplerindeki her bir örneği, tüp tabanına ve substrata temas edecek şekilde kısa süreli olarak vorteksleyin. Ardından, PCR tüpü kapağında hapsolmuş olan reaksiyon karışımı miktarını gidermek için düşük hızda bir masaüstü mini santrifüjde anlık bir çevirme işlemi uygulayın.Tüpleri, PCR tüplerini destekleyen bir masaüstü termo çalkalayıcıya yerleştirin ve örnekleri 37 °C'de, 1000 RPM hızda 24 saat boyunca çalkalayın. Ertesi gün, nihai konsantrasyonu ağırlık/hacim oranında %2 olacak şekilde sarco cell ve nihai konsantrasyonu 100 µg/mL olacak şekilde proteinaz K ekleyin. Örnekleri termo çalkalayıcıda 37 °C'de, 1000 RPM hızda bir saat boyunca sindirin. SDS-PAGE örnek tamponu ekleyin, örnekleri 95 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın ve her örnekteki geri kalan proteinaz K dirençli PrP proteinini SDS-PAGE ile ayırın, ardından daha önce olduğu gibi immünoblotlama yapın. Son olarak, tür bariyerinin bir ölçüsü olarak dönüşüm verimlilik oranını hesaplayın.Yazılı protokoleki talimatlara uygun olarak, pH 7.4 veya 3.5'te hazırlanan fare CER assay substratı; fareye adapte edilmiş RML scrapy, evcil koyun klasik scrapy, beyaz kuyruklu geyik kronik zayıflama hastalığı veya hamsterlara adapte edilmiş 2 63 K suşu scrapy ile inkübe edildi. CER assay'inde, "none" olarak etiketlenen kontrol örnekleri eşit miktarda enfeksiyöz ajan içeriyordu ve hiçbir fare substrat örneği, monoklonal antikor SAF 83 kullanılarak proteinaz K'ye dirençli prion proteininin varlığı açısından immünoblot ile analiz edilmedi.Her bir şerit için ham tric değerleri, sonuç veren proteinazın altına görüntülenmiştir. K dirençli prion proteini seviyeleri, pH 7.4'te denatüre edilen ve çeşitli TSE ajanları ile işlenen fare substratları arasında değişkenlik göstermiştir. pH 3.5'te denatüre edilip bir TSE ajanı ile işlenen tüm substratlarda pronaz K dirençli prion proteini bulunurken, bu sütun grafiği en az üç bağımsız analiz çalışmasına dayanarak her bir enfeksiyöz ajan için pH 7.4 ve 3.5 fare substratları arasındaki ortalama oranları artı veya eksi standart sapma ile göstermektedir.Küçük harfler, varyans analizi kullanılarak 0,05'ten küçük bir p değeri ile belirlenen istatiksel olarak homojen alt kümeleri ifade eder. Tookie Kramer minimum anlamlılık farkları yöntemi ile. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, uygun şekilde uygulandığında 48 saatten kısa sürede tamamlanabilir. CER analizi, canlı hayvanlarda ek çalışmaların gerekçelendirilmesi veya gereksiz kılınması sağlayabilecek bir TSE tür bariyerinin varlığının ön değerlendirmesi olarak kullanılabilir.Bu videoyu izledikten sonra; substratların nasıl hazırlanacağı, dönüştürme reaksiyonlarının nasıl kurulacağı ve tür bariyerlerini değerlendirmek için dönüştürme verimlilik oranlarının nasıl hesaplanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

assessing-transmissible-spongiform-encephalopathy-species-barriers

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Burada hemen arındırıcı intraperitoneal aşılama ve floresan sonra enjeksiyon yerinde alımı ve hareket izleme ve bu olaylara aracılık eden hücreler karakterize enfekte beyin malzeme toplanan prion çubuklar etiketleme prion alımı ve ticareti bağışıklık hücreleri tarafından izlenmesi için yeni bir tahlil açıklar.

İntraperitoneal Enfeksiyon sonra Bağışıklık Hücreleri Ticareti Floresan Prion Çubuklar Saat İzlenmesi

Protein misfolding siklik amplifikasyon (PMCA) Prion dönüşüm ve zorlanma ve tür engellerin çalışma için bir in vitro testtir. Aynı zamanda, bir prion saptama sistemi olarak da kullanılabilir.

Prionlar protein misfolding Döngüsel Amplifikasyon

Normal prionları sindirmek için proteolitik bir enzim ile inkübe edin ve dirençli agregaları sağlam bırakın.

Fare Beyin Dokusunda Yanlış Katlanmış Prion Protein Agregatlarının Western Blotting Kullanılarak Saptanması

Süpürücüleri hastalıksız bölgelere kendi dışkılarıyla bulaşıcı bulaşıcı süngerimsi ensefalopati prionları translokasyonunda potansiyele sahiptir. Biz fare adapte skrapi prıonlar Amerikan kargalar sindirim sisteminde (Corvus brachyrhynchos), ölü hayvanların ortak bir tüketici olsa geçtikten sonra bulaşıcı kalırsa belirlemek için kullanılan ayrıntı yöntemleri.

Bir Kuş Türlerinin Sindirim Sistemi geçtikten sonra Bulaşıcı prions belirlenmesi için prosedürler

Protein agregatlarının prion benzeri yayılımı, son zamanlarda birçok nörodejeneratif hastalıkta rol oynadığı ortaya çıkmıştır. Bu protokolün amacı, nematod C. elegans'ın protein yayılımını izlemek ve prion benzeri olayları araştırmak için bir model sistem olarak nasıl kullanılacağını açıklamaktır.

Metazoan Model Organizma kullanma Serim ve toksisitesi prion-benzeri Proteinler incelenmesi<em&gt; ° C. elegans</em

Bu iletişim kuralı işlevsel olarak protein bazlı miras S. cerevisiaeiçin ekran için bir yüksek-den geçerek metodoloji açıklar.

S. cerevisiae Protein bazlı miras için yüksek üretilen iş tarama

Burada, bir basit, hızlı ve verimli prion amplifikasyon tekniği, gerçek zamanlı dönüştürme (RT zlı) gökyüzünden kaynaklı yöntemi açıklamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Gerçek zamanlı depremin dönüşüm tahlil CWD Prionlar fekal madde olarak algılanması için kaynaklı

İmmünohistokimya protokollerini kullanarak anormal prion proteininin immüno-etiketlemesi, spesifik numune ve anti-PrP antikor hazırlama metodolojileri gerektirir. Bu protokol, uygun PrP immün etiketlemesini sağlamak ve spesifik olmayan arka plan boyamasını en aza indirmek için epitop demasking işlemindeki temel adımları açıklamaktadır. Ayrıca, bu yaklaşım, prion ile enfekte olmuş dokularla immünohistokimya çalışmaları yaparken biyogüvenlik önlemlerini de göz önünde bulundurur.

İmmünohistokimya ile Anormal Prion Proteininin Saptanması

Prion kontaminasyonu ve etkili dekontaminasyon için laboratuvar ortamlarında yaygın olarak kullanılan alanları değerlendirmek için bir yöntem eksiktir. Burada açıklanan protokol, belirli laboratuvarların bireysel ihtiyaçlarını karşılamak için kolayca değiştirilebilen bir laboratuvar prion güvenlik kaydırma testinin uygulanması için temel temelleri sağlar.

Prion Güvenlik Laboratuvarı Kaydırma Testi

Biz TSSB hastalarının karakteristik nöroendokrin fonksiyonlarda kalıcı değişikliklere ve gecikmiş uzun vadeli, abartılı bir korku tepkisi, ortaya travma sonrası stres bozukluğu (TSSB) bir sıçan modelinde tarif. Hayvan modeli ve burada tarif edilen yöntemler, fakat mekanistik çevresel beyaz kan hücrelerindeki biyolojik olan hastalarda ölçülemez beyin çekirdeklerinde biyo, kutu arasında ilişki için yararlıdır.

TSSB, Nöral Hematolojik ve Davranış Bağlantılı Revealing için Hayvan Modelinde Biyobelirteçler

Öğrenin, bulaşıcı süngerimsi ensefalopatilerin türler engellerini hayvan deneyleri olmadan değerlendirmek için in vitro prion proteini dönüştürme deneyini. Bu yöntem, dönüştürme verimlilik oranı hesaplayarak risk değerlendirmesi sağlar.

Bir ile Bulaşıcı Süngerimsi Ensefalopati Türler Engelleri değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet