Bir ile Bulaşıcı Süngerimsi Ensefalopati Türler Engelleri değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, bulaşıcı süngerimsi ensefalopatilerin (TSE) belirli bir türe karşı olan tür bariyerini, canlı hayvanları maruz bırakmaya gerek kalmadan değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle in vitro bir analizde kullanılmak üzere iki konversiyon analizi substratı hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım ise, bu substratların test etmek istediğiniz TSE ajanları ile inkübe edilmesidir.

Proteinaz K ile sindirildikten sonra, örnekler SDS-PAGE ve immün bloklamaya tabi tutulur. Son adım, her bir substrattaki proteinaz K'ya dirençli PreOn protein miktarının akış sitometrisi kullanılarak ölçülmesi ve bu miktarların bir dönüşüm verimlilik oranı veya CER hesaplanarak karşılaştırılmasıdır. Nihayetinde CER, test edilen TSE'nin, substratın hazırlandığı konakçı türe karşı tür bariyerinin bir ölçütünü sağlar.

Bu analizin avantajları arasında düşük maliyeti, kısa deney süresi ve canlı hayvanların doku örnekleriyle değiştirilmesi yer almaktadır. Bu yöntem, yaban hayatındaki prion hastalıklarının tür bariyerleri hakkında içgörü sağlamak için oldukça uygun olsa da, ilgi duyulan diğer tüm türlere uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan bireyler substrat hazırlama, kalite kontrol ve standardizasyon konularında zorluk yaşayabilirler.

İlgili türden sağlıklı, enfekte olmamış beyin dokusu elde ettikten sonra, boncuklu değirmendir veya havan ve havan eli kullanarak lizis tamponu içinde ağırlık/hacimce %10'luk bir homojenat hazırlayın. Ardından, substrat 27 gauge bir şırınga iğnesi ile kolayca aspire edilip dışarı atılabilecek hale gelene kadar, artan gauge değerindeki iğnelerle şırınga ve iğne homojenizasyonuna tabi tutarak homojenatları daha da inceltin. Sonra, beyin homojenatını iki eşit hacme bölerek ayrı etiketlenmiş plastik konik tüplere aktarın ve her bir tüpe, beyin homojenatı ile birer bir hacim oranında olacak şekilde, bir tüpe 3 molar guanidin hidroklorür, diğerine ise pH 3,5 veya 7,4'te PBS ekleyin.

Şimdi, substrat çözeltilerinin pH değerlerini kontrol edin ve her bir substratın pH'ının hedef pH değerinin artı veya eksi 0,05 sınırları içinde kaldığından emin olmak için gerektiğinde derişik hidroklorik asit veya sodyum hidroksit kullanın. Çözeltileri oda sıcaklığında, bir uçtan uca karıştırıcıda beş saat boyunca döndürün. Ardından, iyi karışması için her bir konik vorteksteki substrat çözeltilerine dört hacim metanol ekleyerek proteinleri çöktürün ve -20 °C'de 16 ila 18 saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sonrası, numuneleri 4 °C'de 13.000 G'de 30 dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün. Ardından süpernatantları dikkatlice döküp atın ve peletlerdeki metanolün buharlaşmasını bekleyin. Tüpün iç yüzeyine yapışmış metanolün emilmesine yardımcı olmak için pamuk uçlu aplikatörler kullanın.

Pelletlerin aşırı kurumasını önleyin. Metanol artık görünmez olduğunda bir sonraki adıma geçin; protein pelletlerini yeniden süspande etmek için başlangıçtaki beyin homojenatı miktarına eşit miktarda konversiyon tamponu kullanın. Yeniden süspansiyon sonrası, substrat çözeltilerini 10 saniye boyunca kısaca sonike edin.

Bir kap boynuzunda, maksimum gücün yaklaşık %30'unda sonikasyon uygulayın. Ardından, her iki substrattaki hücresel prion proteinleri proteinaz K'ya duyarlı olması gerektiğinden, çözeltileri etiketli 1,5 mL mikro santrifüj tüplerine 0,5 ila 1 mL'lik hacimlerde paylaştırın. Her bir substratın 10 ila 25 µL'sini, nihai konsantrasyonu 100 µg/mL olacak şekilde proteinaz K ile işleyin ve numuneleri termoshaker'da 37 °C'de, 1000 RPM'de bir saat boyunca sindirin; proteinaz K ile sindirilmiş substratları, sindirilmemiş her bir substratın 10 ila 25 µL'si ile birlikte yükleyin.

Konak prion proteinini, proteinaz K direncini ve sindirilmemiş protein seviyelerini değerlendirmek için, bir SDS page jelinde prion proteinine özgü bir antikor ile jel ve immün bloklama yapın. Bu görüntü, immün blot sonuçlarını göstermektedir. İlk iki şerit sindirilmemiş substratları, sağdaki iki şerit ise proteinaz K ile sindirilmiş substratı içermektedir.

pH 7,4 ve 3,5 substratlarındaki protein seviyeleri birbirine yaklaşık %10 oranında yakınsa ve proteinaz K'ya dirençli değilse, substrat çiftleri CER çalışmalarında kullanım için uygundur; diğer alikotlar CER analizi gerçekleştirilene kadar -80 °C'de saklanmalıdır. TSE ajanları, uygun biyogüvenlik önlemleri kullanılarak ve kurumsal kılavuzlara uygun olarak taşınmalıdır. İlgilenilen türden TSE enfekte beyin dokusu elde edildikten sonra, substrat çiftlerinin hazırlanması için daha önce kullanılan homojenizasyon yöntemi kullanılarak pH 7,4'te 1X PBS içinde %10 ağırlık/hacim oranında bir homojenat hazırlayın.

Elde edilen homojenatları, CER analizi gerçekleştirilmeye hazır hale gelene kadar 0,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerinde 100 ila 300 mikrolitrelik hacimler halinde paylaştırın ve negatif 80 derece Celsius'ta saklayın. Başlamak için, pH 3.5 ve 7.4 enfekte olmamış CER substratlarını ve TSE enfekte tohum çözeltilerini yaklaşık bir saat boyunca buz üzerinde bekleterek eşit miktarlarda yavaşça çözdürün. Çözündürme işleminden sonra, çözeltileri buz üzerinde tutun ve önce her bir substrat çözeltisini 27 gauge şırınga iğnesiyle aspire edip püskürterek yeniden homojenleştirin.

Ardından, her bir TSE enfekte çözeltiyi maksimum gücün yaklaşık %30'unda 10 saniye boyunca kısaca sonike edin. Daha sonra, düşük bağlanma özellikli, ince duvarlı ve etiketlenmiş PCR tüplerine 95 µL CER substratı pipetleyerek dönüşüm reaksiyonlarını hazırlayın. pH 7.4'te hazırlanan substratı iki tüpe çift örnek şeklinde ve pH 3.5'te hazırlanan 95 µL CER substratını diğer iki tüpe çift örnek şeklinde ekleyin.

Ardından, pH 7.4 ve 3.5 substratlarının her bir tüpüne beş mikrolitre %10 TSE enfekte tohum çözeltisi ekleyin. Paralel olarak, spesifik olmayan şablon bağımsız dönüşümü kontrol etmek için, pH 7.4 ve 3.5 substratlarının diğer tüplerine beş mikrolitre dönüşüm tamponu ekleyin. Ayrıca, proteinaz K'ya dirençli başlangıç prion proteini için bir kontrol hazırlayın.

Test edilen her bir TSE ajanı için, kontrol olarak 95 µL konversiyon tamponuna beş µL %10'luk TSE enfekte tohum çözeltisi ekleyin. Kapalı PCR tüplerindeki her bir örneği, tüp tabanına ve substrata temas edecek şekilde kısa süreli olarak vorteksleyin. Ardından, PCR tüpü kapağında hapsolmuş olan reaksiyon karışımı miktarını gidermek için düşük hızda bir masaüstü mini santrifüjde anlık bir çevirme işlemi uygulayın.

Tüpleri, PCR tüplerini destekleyen bir masaüstü termo çalkalayıcıya yerleştirin ve örnekleri 37 °C'de, 1000 RPM hızda 24 saat boyunca çalkalayın. Ertesi gün, nihai konsantrasyonu ağırlık/hacim oranında %2 olacak şekilde sarco cell ve nihai konsantrasyonu 100 µg/mL olacak şekilde proteinaz K ekleyin. Örnekleri termo çalkalayıcıda 37 °C'de, 1000 RPM hızda bir saat boyunca sindirin. SDS-PAGE örnek tamponu ekleyin, örnekleri 95 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın ve her örnekteki geri kalan proteinaz K dirençli PrP proteinini SDS-PAGE ile ayırın, ardından daha önce olduğu gibi immünoblotlama yapın. Son olarak, tür bariyerinin bir ölçüsü olarak dönüşüm verimlilik oranını hesaplayın.

Yazılı protokoleki talimatlara uygun olarak, pH 7.4 veya 3.5'te hazırlanan fare CER assay substratı; fareye adapte edilmiş RML scrapy, evcil koyun klasik scrapy, beyaz kuyruklu geyik kronik zayıflama hastalığı veya hamsterlara adapte edilmiş 2 63 K suşu scrapy ile inkübe edildi. CER assay'inde, "none" olarak etiketlenen kontrol örnekleri eşit miktarda enfeksiyöz ajan içeriyordu ve hiçbir fare substrat örneği, monoklonal antikor SAF 83 kullanılarak proteinaz K'ye dirençli prion proteininin varlığı açısından immünoblot ile analiz edilmedi.

Her bir şerit için ham tric değerleri, sonuç veren proteinazın altına görüntülenmiştir. K dirençli prion proteini seviyeleri, pH 7.4'te denatüre edilen ve çeşitli TSE ajanları ile işlenen fare substratları arasında değişkenlik göstermiştir. pH 3.5'te denatüre edilip bir TSE ajanı ile işlenen tüm substratlarda pronaz K dirençli prion proteini bulunurken, bu sütun grafiği en az üç bağımsız analiz çalışmasına dayanarak her bir enfeksiyöz ajan için pH 7.4 ve 3.5 fare substratları arasındaki ortalama oranları artı veya eksi standart sapma ile göstermektedir.

Küçük harfler, varyans analizi kullanılarak 0,05'ten küçük bir p değeri ile belirlenen istatiksel olarak homojen alt kümeleri ifade eder. Tookie Kramer minimum anlamlılık farkları yöntemi ile. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, uygun şekilde uygulandığında 48 saatten kısa sürede tamamlanabilir. CER analizi, canlı hayvanlarda ek çalışmaların gerekçelendirilmesi veya gereksiz kılınması sağlayabilecek bir TSE tür bariyerinin varlığının ön değerlendirmesi olarak kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra; substratların nasıl hazırlanacağı, dönüştürme reaksiyonlarının nasıl kurulacağı ve tür bariyerlerini değerlendirmek için dönüştürme verimlilik oranlarının nasıl hesaplanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.