Name: Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir İn Vitro Co-kültür Modeli Periferik Sinir Rejenerasyon Eğitim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Keşfedin dorsal kök ganglion nöronları ve Schwann benzeri yağ-kökenli kök hücrelerle in vitro ko-kültür modeli. Bu yöntem periferik sinir rejenerasyonu ve hücre etkileşimlerini araştırmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Araştırmaları Enstitüsü, Tıp Bilimleri Akademisi ve İngiliz El Cerrahisi Derneği tarafından desteklenmektedir. Ayrıca, Acorda Therapeutics, ABD'den devam eden GGF-2 tedarikini minnetle kabul ediyoruz. Yazarlar son olarak, bu protokolün geliştirilmesine ve optimizasyonuna yol açan son yıllarda grubumuza verdiği değerli destek ve rehberlik için Prof. Giorgio Terenghi'ye teşekkür etmek isterler.

NOT: hayvanları kapsayan tüm deneyler İngiltere Hayvanlar (Scientific Usul) Yasası, 1986 uyarınca yapılmıştır. 1. Deney Seti-up <ol><li> Tüm araçlar steril olup olmadığını kontrol edin, doku ve hücre hasat başlatmak için önce. Gerekli olsun, keskin cerrahi makas, çok ince forseps ve ince standart forseps bir çift otoklav. Ayrıca UV sterilizasyon, etanol pozlama veya uygun olarak buhar sterilizasyon kullanarak hücre tohumlama önce her substrat sterilize. </li><li> Kök hücre hasat ve farklılaşması için medya hazırlanması <ol><li> % 10 fetal sığır serumu (FBS), 200 mM L-glutamin ve% 1 penisilin-streptomisin (PS) ile takviye edilmiş minimum temel ortam (α-MEM) içeren, kök hücre büyüme ortamı hazırlar. </li><li> Steril dimetil sülfoksid içinde 2,436 ml forskolin 10 mg çözülmesiyle forskolin 10 mM&#39;lik bir stok çözelti hazırlayın. 14 uM son konsantrasyonda kullanın. &lt;/ Li&gt; <li> Steril dimetil sülfoksid 1.43 ml, 50 mg çözülmesiyle retinoik asit, 35 mg / ml stok çözelti hazırlayın. 350 ng / ml nihai konsantrasyonda kullanın. </li><li> Damıtılmış steril su, 100 ul, liyofilize bir toz, 10 ug çözülmesiyle trombosit türevli büyüme faktörü (PDGF) stokları, (100 ug / ml) hazırlayın. 5 ng / ml nihai konsantrasyonda kullanın. </li><li> Damıtılmış steril su içinde 500 ul, liyofilize bir toz, 50 ug çözündürülmesiyle temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) stokları, (100 ug / ml) hazırlayın. 10 ng / ml nihai konsantrasyonda kullanın. </li><li> 14 uM forskolin, 126 ng / ml arasında glial büyüme faktörü-2 (GCF-2), 5 ng / ml trombosit türevi büyüme faktörü (PDGF) ve 10 ng ile takviye edilmiş kök hücre büyüme ortamı içeren, kök hücre farklılaşması ortamı hazırlayın / ml temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF). </li></ol></li><li> Nöron hasadı ve ayrılması için ortam ve stok çözeltilerinin hazırlanması <ol><li> Bottenst hazırlayınein ve Ham&#39;ın F12 ortamı,% 1 PS ve% 1, N2 ek ekleyerek Sato&#39;nun (BS) orta 28. (24-iyi plaka kullanılıyorsa) oyuk başına 500 ul olarak gerekli nihai hacim hesaplanır. </li><li> Ağırlık / hacim olarak% 1.25 konsantrasyonda Ham F12 ortamı içinde kolajenaz IV stokları hazırlayın. 200 ul alikotları olarak -20 ° C&#39;de çözüm ve mağaza Filtre-sterilize. </li><li> ,% 2.5 ağırlık / hacim konsantrasyonunda Ham F12 ortamı içinde sığır pankreatik tripsin stokları Hazırlama 200 ul alikolar -20 ° C&#39;de filtre-sterilize saklayın. </li><li> Sinir büyüme faktörü (NGF), 200 ul -20 ° C sıcaklıkta, bir filtre ile sterilize edilmiş 1 mg F12 ortamında ve mağaza / ml yağ asidi-içermeyen sığır serumu albümini (BSA) solüsyonu içinde 5 ug / ml konsantrasyonda stok çözelti hazırlayın alikotları. Hazırlandıktan sonra NGF filtre etmeyin. </li></ol></li><li> Durumda, herhangi bir yüzey modifikasyonu, oda sıcaklığında 15 dakika karıştırıldı ve kat lamelleri / poli-D-lisin ile plakanın (0.1 mg / ml gerçekleştirilmiştir) Ve / veya laminin (37 ° C &#39;de 2 saat süre ile 2-10 ug / cm2) uygun şekilde nöron eki ve nörit gelişimini desteklemektir. </li><li> Her zaman kullanmadan önce 37 ° C&#39;de su banyosunda medya ısınmak. </li></ol> Bir SC Fenotip içine 2. Yağ kaynaklı Kök Hücre (ASC) Hasat ve Farklılaşma <ol><li> Yetişkin erkek Sprague-Dawley viseral ve kasık yağ ASC hasat <ol><li> Başlatmak Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi yağ hasat kadar buz PS çözeltisi ve mağaza% 1 v / v ile takviye (HBSS) içinde 10-15 ml bir tüp hazırlamak için önce. </li><li> Servikal dislokasyon ve başları kesilerek sıçan sonlandırın. Iç organların açığa ve kanama kaçınarak, sıçan Tıraş ve karın deri yoluyla bir kesi yapmak. Mide ve bağırsakları (genellikle yağlı sarı tutarlılık ile karakterize) ve yetişkin bir erkek Sprague-Dawley sıçan testisleri çevreleyen kasık yağ encasing visseral yağ çıkarın. Aktarım inciBuz üzerinde HBSS içeren tüp e yağıdır. </li><li> Biyolojik güvenlik kabini (sınıf II) ince ulaşıldığında bir makas ve ince kıvamına gelene kadar steril bir jilet kullanarak yağ doğrayın ve ağırlık / hacim kollajenaz tip I çözümü taze hazırlanmış% 0.2 15 ml içeren bir tüp içine transfer ve günde filtre ve sterilize edilmiştir. </li><li> 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde tüp aktarın ve sürekli ajitasyon altında 30 dakika-1 saat süre ile, ve enzim mevcudiyetinde sindirimi yağ dokusu bırakın. Yakından sindirim Monitör ve doku tamamen ayrışmış önce, bu hücre canlılığı ve hücre verimi artıracak durdurun. Filtre 100 mikron hücre süzgecinden doku Theun-ayrışmış. NOT: hafifçe bej görünüm elde, tüp dönen zaman iyi doku sindirim gözle görünür yağ, homojen kıvamda neden olacaktır. </li><li> C santrifüj 37 ° C&#39;de fetal sığır serumu içeren, kök hücre büyüme ortamı 15 ml ilave etmek suretiyle enzim nötralizetüpün dibinde, kök hücreler dahil stromal vasküler kısmını toplamak amacıyla 10 dakika için 160 g çözelti. </li><li> Bu aşamada, topak, kırmızı kan hücreleri, 1 ml olarak yeniden süspanse edilebilir kan hücresi neden olduğu kirliliğin çıkarılması için liziz tamponunda. 1 dakika süre ile yeniden süspansiyon haline getirilmesi ve pipetleme sonra, 10 dakika boyunca 160 g taze kök hücre büyüme ortamı ve santrifüj 10 ml ekleyin. </li><li> Dikkatle altta biriken hücre pelet bakımı, tüpten aspire. Kök hücre büyüme ortamı, 10 ml hücrelerin tekrar 75 cm içine 2 şişeler aktarmak ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe edin. Her 3 günde orta değiştirerek, geçit 1-2 kadar alt-birleşik düzeyde hücreleri koruyun. </li></ol></li><li> Bir SC fenotipi ASC farklılaşma <ol><li> Geçit 1-2 içinde 75 cm2 şişeye kök hücre büyüme ortamı çıkarın ve Prepa taze 1 mM β-merkaptoetanol ihtiva eden taze ortam, 10 ml ile değiştirinKırmızı ve günde filtre ve sterilize edilmiştir. 24 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO2 de hücreleri inkübe edin. Bu aşamada, bu hücrelerin farklılaşmasını başlamadan önce düşük yoğunluklu (% 30) tohumlanır önemlidir. </li><li> Dikkatle HBSS, aspirat hücreleri yıkayın ve 350 ng / ml retinoik asit ihtiva eden bir ortamda 10 ml ile değiştirin. 72 saat için 37 ° C,% 5 CO2 de hücreleri inkübe edin. Işığa hücre orta maruziyetini en aza indirmek için deneyin. </li><li> (Aşama 1.2.6 bakınız) 3 gün sonra, HBSS, aspirat ile dikkatli bir şekilde yıkama hücreleri ve kök hücre farklılaştırma ortamının 10 ml&#39;si ile değiştirin. Her 3 günde bir ortam değiştirilerek, alt konfluent düzeyde hücreleri koruyun. NOT: (. Kingham ark 5 tarafından gösterildiği gibi) inkübasyon 2 hafta sonra, ASC karakteristik fenotip ifade, SC-benzeri ASC ayrılırlar. Daha sonra davranış 29 gözle görülür bir değişiklik olmadan 10 geçişi kadar kullanılabilir. </li></ol></li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Hasat ve Dorsal Kök Ganglionlar (DRG) Nöronlar Ayrılma <ol><li> Servikal dislokasyon ve başları kesilerek sıçan sonlandırın. Sıçan Tıraş ve omuriliğe maruz cilt kaldırın. Keskin bir makas kullanarak, sınırlı organ ve kan damarlarının ekstra özen omuriliğe excide. Bir Petri kabı kullanarak biyolojik güvenlik kabini (sınıf II) spinal sütun aktarın ve herhangi bir sırt kısmını kaldırın. </li><li> Kord doku maruz steril ve keskin cerrahi makas kullanarak boyuna ekseni boyunca yarısında omurga bölün. Bu noktada, o kolay DRG nöron hasat sırasında ele yapmak, göğüs kafesinin seviyesinin altında iki küçük segmentlerde omuriliğe kesmek için yararlıdır. Ince forseps kullanarak, hafifçe çekin ve DRG kökleri çıkarmayın dikkat, tüm kord doku kaldırmak. DRG ve kökleri omurga kanallar içinde maruz kalacağı Bu şekilde, hala sütununda kaplı. Beyaz filamentler COMI olarak DRG gözlemleyinkanallarından doğrudan dışarı ng. </li><li> Ganglionlar kökenlerini zarar değil dikkat, çok ince forseps kullanarak vertebra kanallar derinliklerine gidiyor ve ödeme ile omurga kanallarından tüm DRG kök (sadece DRG) çekin. % 1 PS ile desteklenmiş Ham F12 ortamı 3-4 ml ihtiva eden bir küçük bir petri kabı (60 mm 2) içine DRG aktarın. Farklı hayvanlar kullanıyorsanız, ayrı yemekler kullanın. </li><li> Bir mikroskop altında, glial hücre kontaminasyonu azaltmak için steril forseps ve bir neşter kullanılarak ganglionlar çevreleyen sinir köklerinin herhangi bir aşırı DRG temizleyin. Taze F12 ortamı, 1.8 ml küçük bir petri (35mm 2) içine DRG aktarın. </li><li> % 1.25 ağ / h kolajenaz tip IV stok çözeltisi (0.125,% nihai konsantrasyon) 200 ul ilave edin ve 1 saat süre ile 37 ° C,% 5 CO2 de DRG kuluçkalayın. Dikkatlice aspire veya DRG zarar vermemeye dikkat, bir cam pipet ile orta aspire. Taze F12 ortamı esnek EkleDaha önce tarif edildiği gibi,% 0.125 ağırlık / hacim kolajenaz tip IV enzimi ile olmasına ve 1 saat süre ile inkübe edilir. </li><li> Orta aspire yavaşça F12 ortamı ile DRG yıkayın. F12 ortamı, daha sonra 1.8 ml tripsin 200 ul ilave edin (nihai konsantrasyon% 0.25 ağ / h) ve 30 dakika boyunca 37 ° C,% 5 CO2 inkübe edin. </li><li> Tripsin çıkarın ve enzimatik reaksiyonu durdurmak için 500 ul FBS ile takviye edilmiş F12 ortamı içinde 1 ml. Orta aspire ve yavaşça serum izlerini çıkarmak için üç kez F12 ortamı ile DRG yıkayın. </li><li> Taze F12 ortamı içinde 2 ml ilave edilir ve dikkatli bir şekilde bir cam pipet kullanılarak 15 ml&#39;lik bir tüp içine ortam maddesi ile DRG aktarın. Yavaşça (plastik ipuçları alternatif olarak kullanılabilir) cam pipet aşağı (yaklaşık 8-10 kat) kadar pipetleme tarafından DRG nöronlar ayırmak. </li><li> Topak, tüp dibinde biriken ve yeni bir tüp içinde ortam toplanır. Topaklarını içeren tüp taze F12 ortamı içinde 2 ml ilave edilir ve m tekrarcam pipet ile echanical ayrışma. Süspansiyon homojen (yaklaşık 3-4 kat) olana kadar bu adımı tekrarlayın ve yeni tüp bütün ayrışmış DRG toplamak. Bu yöntem, mekanik ayrışmasından kaynaklanan stresi azaltır ve nöron canlılığını artırır. </li><li> Un-ayrışmış nöronlar ve diğer enkaz kaldırmak için 100 mikron hücre süzgeç kullanarak yeni bir 15 ml tüp içine çıkan homojenize süspansiyon Filtre. Bu aşamada, ilk önce bir 50 ml tüp içine hücre süspansiyonu filtre ve bir cam pipet ile daha küçük bir tüp içine çözelti transfer uygun olabilir. 5 dakika boyunca 110 g süspansiyon santrifüjleyin. </li><li> F12 ortamı, 500 ul% 30 BSA çözeltisi 500 ul ilave edilerek% 15 bovin serum albümini (BSA) hazırlayın. Yavaş yavaş kademeli bir protein iz oluşturmak için 15 ml tüp duvarına aşağı çözüm pipetle. Bu aşamada, bu sayılar üzerinde kullanarak BSA 45 ° açıyla tüp tutun ve yavaşça serbest bırakmak için yardımcı oluroluşturan &quot;parça&quot; için bir referans olarak şahin tüp. </li><li> Tüpün alt kısmında 500 ul bırakarak adım 3.10 gelen süpernatan aspire ve aynı ortam içinde hücre pelletini. Yavaş yavaş daha önce 5 dakika boyunca 500 g aşama 3.11 (bir referans olarak tüp üzerindeki numaraları kullanın) ve santrifüj hazırlanan protein yol boyunca süspansiyonu pipetle. </li><li> Aşama 4.5 altında tarif edildiği gibi, süpernatan aspire ve modifiye BS ortamı (veya SC-benzeri ASC / DRG ko-kültür için karma bir orta 1 ml pelletini. Not: DRG nöronlarını yeniden askıya almak için ses tohumlanmış istenen nihai hücre konsantrasyonu ve örneklerin sayısına bağlı olarak, gerekli olan gerçek hacme yapılabilir. Bir hayvan, bir 24 yuvalı plaka deney için yeterli hücre sağlar. </li><li> Hücre bağlantısı oluşturmak için 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 seviyesinde tohumlanmış örnekleri inkübe ve son olarak sinir büyüme fa 50 ng / ml ile takviye edilmiş, taze BS orta ekleyinctor (NGF). </li></ol> SC-benzeri ASC ve DRG Nöronlar 4. Doğrudan Co-kültür <ol><li> Aşama 2.2.3 tarif edildiği gibi alt konfluent seviyelerde kültür SC benzeri ASC koruyun. DRG hasat öncesinde Yirmi dört saat, kök hücre farklılaşması orta aspire ve HBSS hücreleri yıkayın. Aspire ve 3 dakika için 37 ° C,% 5 CO2 de tripsin 3 ml inkübe edilir. </li><li> Tüm hücreler şişeden çözülmüş olan bir ışık mikroskobu altında edin. Yavaşça dekolmanı yardım şişeyi dokunun. Tripsin reaksiyonu durdurmak 5 dakika boyunca 110 g&#39;da bir 15 ml tüp ve santrifüj hücre süspansiyonu toplamak için orta 7 ml ilave edilir. </li><li> Süpernatan aspire ve kök hücre farklılaştırma ortamının 5 ml hücre pelletini. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve istenen nihai konsantrasyonuna göre hücre süspansiyonu seyreltin. İdeal olarak, 20,000 SC benzeri ASC tohum / cm2 hücrelerinin konfluent tabakası garantisi olacaktır. </li><li> SC-benzeri TohumVe alt-tabaka üzerinde ASC hücre bağlantıya olanak vermek üzere, 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe edin. </li><li> 24 saat inkübe edildikten sonra, ortam aspire ve adım 3.14 ve 3.15 de tarif edildiği gibi hücreler üzerine DRG nöronlarını ekleyin. Kök hücre farklılaştırma ortamının% 50 ve BS ortam% 50 ihtiva eden bir karışık ortama orta değiştirin. Buna ek olarak, nihai karışık bir ortam içinde 1-2.5% FBS maddelerin azaltılması DRG ayrışma elde edilen uydu hücreleri, kirletici çoğalmasını önlenmiş olur. </li><li> 37 ° C,% 5 CO2 de birlikte kültüre örnekleri inkübe ve gelecekteki deneyler için gerekli süre boyunca kültür içinde muhafaza. </li></ol>

<ol><li>Wiberg, M., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Will+it+be+possible+to+produce+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Technol+Int%22%5BJournal%5D)">Will it be possible to produce peripheral nerves.</a> Surg Technol Int. 11, 303-310 (2003).</li>
<li>Terzis, J. K., Sun, D. D., Thanos, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+and+basic+science+review%3A+past%2C+present%2C+and+future+of+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reconstr+Microsurg%22%5BJournal%5D)">Historical and basic science review: past, present, and future of nerve repair.</a> J Reconstr Microsurg. 13 (3), 215-225 (1997).</li>
<li>Bruyns, C. N., Jaquet, J. B., Schreuders, T. A., Kalmijn, S., Kuypers, P. D., Hovius, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictors+for+return+to+work+in+patients+with+median+and+ulnar+nerve+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hand+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Predictors for return to work in patients with median and ulnar nerve injuries.</a> J Hand Surg Am. 28 (1), 28-34 (2003).</li>
<li>Geuna, S., Raimondo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3%3A+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int Rev Neurobiol. 87 (09), 27-46 (2009).</li>
<li>Kingham, P. J., Kalbermatten, D. F., Mahay, D., Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+differentiate+into+a+Schwann+cell+phenotype+and+promote+neurite+outgrowth+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro.</a> Exp Neurol. 207 (2), 267-274 (2007).</li>
<li>Stoll, G., Jander, S., Myers, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degeneration+and+regeneration+of+the+peripheral+nervous+system%3A+From+Augustus+Waller%E2%80%99s+observations+to+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peripher+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Degeneration and regeneration of the peripheral nervous system: From Augustus Waller’s observations to neuroinflammation.</a> J Peripher Nerv Syst. 7 (1), 13-27 (2002).</li>
<li>Schmidt, C. E., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tissue+engineering%3A+strategies+for+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration.</a> Annu Rev Biomed Eng. 5, 293-347 (2003).</li>
<li>Johnson, E. O., Zoubos, A. B., Soucacos, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+repair+of+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Regeneration and repair of peripheral nerves.</a> Injury. 36S (4), S24-S29 (2005).</li>
<li>Liu, R., Lin, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+dorsal+root+ganglia+neurons+purification+with+a+one-time+anti-mitotic+reagent+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">An efficient method for dorsal root ganglia neurons purification with a one-time anti-mitotic reagent treatment.</a> PloS One. 8 (4), e60558(2013).</li>
<li>Stettner, M., Wolffram, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+in+vitro+model+for+studying+peripheral+nerve+myelination+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">A reliable in vitro model for studying peripheral nerve myelination in mouse.</a> J Neurosci Meth. 214 (1), 69-79 (2013).</li>
<li>Kingham, P. J., Mantovani, C., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+and+neuron+co-cultures+for+the+study+of+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cell and neuron co-cultures for the study of nerve regeneration.</a> Method Mol Biol. 695, 115-127 (2011).</li>
<li>Nissinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+mouse+dorsal+root+ganglion%2FSchwann+cell+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures.</a> Mol Cell Neurosci. 37 (3), 568-578 (2008).</li>
<li>Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+aligned+3D+neuronal-glial+co-culture+model+for+peripheral+nerve+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies.</a> Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).</li>
<li>Lewallen, K. a, Aa Shen, Y. -, De la Torre, A. R., Ng, B. K., Meijer, D., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+role+of+the+cadherin%2Fcatenin+complex+at+the+Schwann+cell-axon+interface+and+in+the+initiation+of+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assessing the role of the cadherin/catenin complex at the Schwann cell-axon interface and in the initiation of myelination.</a> J Neurosci. 31 (8), 3032-3043 (2011).</li>
<li>Evans, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+to+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Challenges to nerve regeneration.</a> Semin Surg Oncol. 19 (3), 312-318 (2000).</li>
<li>Webber, C., Zochodne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nerve+regenerative+microenvironment%3A+early+behavior+and+partnership+of+axons+and+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The nerve regenerative microenvironment: early behavior and partnership of axons and Schwann cells.</a> Exp Neurol. 223 (1), 51-59 (2010).</li>
<li>Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+current+findings+and+future+persperctives%5BTitle%5D)+AND+%22Discov+Med%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: current findings and future persperctives.</a> Discov Med. 11 (57), 160-170 (2011).</li>
<li>Faroni, A., Terenghi, G., Reid, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+and+nerve+regeneration%3A+promises+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells and nerve regeneration: promises and pitfalls.</a> Int Rev Neurobiol. 108, 121-136 (2013).</li>
<li>Strem, B. M., Hicok, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotential+differentiation+of+adipose+tissue-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Keio+J+Med%22%5BJournal%5D)">Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells.</a> Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).</li>
<li>Xu, Y., Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin-forming+ability+of+Schwann+cell-like+cells+induced+from+rat+adipose-derived+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Myelin-forming ability of Schwann cell-like cells induced from rat adipose-derived stem cells in vitro.</a> Brain Res. 1239, 49-55 (2008).</li>
<li>Tomita, K., Madura, T., Sakai, Y., Yano, K., Terenghi, G., Hosokawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+differentiation+of+human+adipose-derived+stem+cells%3A+implications+for+cell-based+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial differentiation of human adipose-derived stem cells: implications for cell-based transplantation therapy.</a> Neuroscience. 236, 55-65 (2013).</li>
<li>Clauser, L., Tieghi, R., Palmieri, A., Carinci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+secrete+neurotrophic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oral+and+Maxillofacial+Surgery%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells secrete neurotrophic factors.</a> Annals of Oral and Maxillofacial Surgery. 1 (2), 1-5 (2013).</li>
<li>Di Summa, P. G., Kingham, P. J., Raffoul, W., Wiberg, M., Terenghi, G., Kalbermatten, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+enhance+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plastic%2C+Reconstructive+%26+Aesthetic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells enhance peripheral nerve regeneration.</a> Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (9), 1544-1552 (2010).</li>
<li>Di Summa, P. G., Kalbermatten, D. F., Pralong, E., Raffoul, W., Kingham, P. J., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+regeneration+of+peripheral+nerves+through+bioengineered+nerve+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo regeneration of peripheral nerves through bioengineered nerve grafts.</a> Neuroscience. 181, 278-291 (2011).</li>
<li>Sun, F., Zhou, K., Mi, W., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+use+of+decellularized+allogeneic+artery+conduits+with+autologous+transdifferentiated+adipose-derived+stem+cells+for+facial+nerve+regeneration+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Combined use of decellularized allogeneic artery conduits with autologous transdifferentiated adipose-derived stem cells for facial nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 32 (32), 8118-8128 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nerve+graft+constructed+with+xenogeneic+acellular+nerve+matrix+and+autologous+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 31 (20), 5312-5324 (2010).</li>
<li>Gomillion, C. T., Burg, K. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+and+adipose+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stem cells and adipose tissue engineering.</a> Biomaterials. 27 (36), 6052-6063 (2006).</li>
<li>Bottenstein, J. E., Sato, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+a+rat+neuroblastoma+cell+line+in+serum-free+supplemented+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (1), 514-517 (1979).</li>
<li>Mantovani, C., Raimondo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+molecular+and+functional+differences+of+adult+bone+marrow-+and+adipose-derived+stem+cells+isolated+from+rats+of+different+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Morphological, molecular and functional differences of adult bone marrow- and adipose-derived stem cells isolated from rats of different ages.</a> Exp Cell Res. 318 (16), 2034-2048 (2012).</li>
<li>Luca, A. C., Faroni, A., Downes, S., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+adipose-derived+stem+cells+act+synergistically+with+RGD-modi+fi+ed+surfaces+to+improve+neurite+outgrowth+in+a+co-culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiated adipose-derived stem cells act synergistically with RGD-modi fi ed surfaces to improve neurite outgrowth in a co-culture model.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2013).</li>
<li>Summa, P. G., Kalbermatten, D., Raffoul, W., Terenghi, G., Kingham, P. J. Extracellular Matrix Molecules Enhance the Neurotrophic Effect of Schwann Cell-Like Differentiated. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSumma%2C+PG+%22Tissue+Eng%22">Tissue Eng</a>. 19 (3-4), 368-379 (2013).</li>
<li>Fudge, N. J., Mearow, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix-associated+gene+expression+in+adult+sensory+neuron+populations+cultured+on+a+laminin+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix-associated gene expression in adult sensory neuron populations cultured on a laminin substrate.</a> BMC Neurosci. 14 (15), 1-19 (2013).</li>
<li>Stabenfeldt, S. E., LaPlaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+rigidity+and+ligand+density+influence+neuronal+response+in+methylcellulose-laminin+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Variations in rigidity and ligand density influence neuronal response in methylcellulose-laminin hydrogels.</a> Acta Biomater. 7 (12), 4102-4108 (2011).</li>
<li>Terenghi, G., Wiberg, M., Kingham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+21%3A+Use+of+stem+cells+for+improving+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Inl+Revi+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Chapter 21: Use of stem cells for improving nerve regeneration.</a> Inl Revi Neurobiol. 87 (09), 393-403 (2009).</li>
<li>Richardson, J. a, Rementer, C. W., Bruder, J. M., Hoffman-Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+of+dorsal+root+ganglion+neurites+and+Schwann+cells+by+isolated+Schwann+cell+topography+on+poly%28dimethyl+siloxane%29+conduits+and+films%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Guidance of dorsal root ganglion neurites and Schwann cells by isolated Schwann cell topography on poly(dimethyl siloxane) conduits and films.</a> J Neural Eng. 8 (4), 046015(2011).</li>
<li>Seggio, aM., Narayanaswamy, A., Roysam, B., Thompson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-aligned+Schwann+cell+monolayers+demonstrate+an+inherent+ability+to+direct+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Self-aligned Schwann cell monolayers demonstrate an inherent ability to direct neurite outgrowth.</a> J Neural Eng. 7 (4), 046001(2010).</li>
<li>Xu, F. J., Wang, Z. H., Yang, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+functionalization+of+polycaprolactone+films+via+surface-initiated+atom+transfer+radical+polymerization+for+covalently+coupling+cell-adhesive+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Surface functionalization of polycaprolactone films via surface-initiated atom transfer radical polymerization for covalently coupling cell-adhesive biomolecules.</a> Biomaterials. 31 (12), 3139-3147 (2010).</li>
<li>Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G., Kingham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+molecules+mediate+both+Schwann+cell+proliferation+and+activation+to+enhance+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">ECM molecules mediate both Schwann cell proliferation and activation to enhance neurite outgrowth.</a> Tissue Eng. 13 (12), 2863-2870 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar, bu yayınla ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını onaylar.

Birincil kültür in vivo axotomy sonra nöronların rejenerasyon çalışması için DRG nöronlar sıklıkla nöronal hücreleri arasında kullanılır. İşte yetişkin farelerin DRG hasat için doğru bir protokol nöronal hayatta ödün vermeden çevredeki uydu hücrelerinin nüfusu azaltmayı amaçlayan, sunulmuştur. SC-benzeri fenotip ayrışmıştır ASC gibi, hücre terapisi için SC için geçerli bir alternatif, SC-benzeri ASC / DRG ko-kültür sistemi de detaylı bir şekilde tarif edilmektedir. 33 - yaygın laminin (veya laminin türetilmiş peptid dizileri) nöron sağkalım ve nörit oluşumu 31 üzerinde yararlı bir etkiye sahip olduğu bilinmektedir. DRG nöron kültürleri gerçekleştirirken bu nedenle nöronal hücrelerin işlevsellik kaybını önlemek için, önceden kaplanması için laminin ile her alt tabaka, tavsiye edilir. laminin kaplama kavramı da tasarımı için biyomalzeme yüzeylere uygulanırpoli doku mühendisliği yapılan, - kaprolakton (PCL) sık sık sinir boruları 30 üretimi için de kullanılır. Aynı zamanda, önceki eser, fibrin matrisi üç boyutlu 11 nöronal kültürler için uygun malzemeler olduğunu ortaya koymuştur. Protein kaplamasına ek olarak, ko-kültür modelleri DRG nöron sağkalım ve yaralanma sonrası periferik sinir sistemindeki nöronların, SC arasında meydana gelen etkileşimler üzerinde çalışmak için uygun bir ortam için değerli koşulları sağlar. Hücreler ayrıca, yara alanında otolog hücrelerin alım süresini kısaltmak için nöral cihazları kullanarak, in vivo olarak transplante edilebilir. Bu hücre yaşlanması / ölümü ve kas atrofiye neden olabilir ağır yaralanmalar, özellikle önemlidir. SC periferik sinir rejenerasyonu ve miyelinasyonu, sınırlı kullanılabilirlik ve yavaş çoğalması oranı sürecine dahil en önemli glial hücreler olmasına rağmen onları uygun haledoku mühendisliği uygulamaları 34. ASC nedeniyle bolluk ve SC fenotip içine ayırt yeteneği, belirli glial belirteçleri ifade ve yerli SC 19 fonksiyonel benzerlikler gösteren bir geçerli bir alternatif vardır. ASC, aynı zamanda, bir ko-kültür sisteminde DRG nöronlarının formasyon ve nöritlere genişletilmesi için faydalı olabilir proteinleri ve büyüme faktörleri 5 üretebilmektedir. Ancak, iki farklı ko-kültür sistemleri deneysel ihtiyaçları fonksiyonu olarak ayarlanabilir. Bu çalışmada önerilen yöntem laboratuarımızda 11 köklü protokolün gözden geçirilmiş bir versiyonu ve ikinci hücre tipi (DRG nöronlar) numaralı seribaşı olan iki hücre tipleri arasında doğrudan bir temas (doğrudan ko-kültür), içerir diğerleri (SC-benzeri ASC) üstünde. Bu yaklaşım, nöron hücreleri 35 ekim sırasında alt tabaka üzerinde bir glial hücre tabakasının bulunmasının önemini gösterdi önceki bulgulara dayanmaktadır <sup&gt; - 37. Bu etki, kök hücre yüzeyinde ASC ve diğer bilgileri çökeltilen DRG integrinler ile hücre-hücre etkileşimleri ve ECM moleküllerinin nedeniyle olasıdır. Aynı zamanda, ortam maddesi içinde serum bir azalma ASC fonksiyonlarını etkilemeden, DRG nöronlarının ayrışma türetilebilen uydu hücreleri, kirletici proliferasyonunu düşük olduğu gözlenmiştir. Bununla birlikte, SC içeren küçük bir popülasyonda uydu hücreleri, tam da ko-kültür sisteminde mevcut olacaktır DRG nöronlarının ve birkaç diğer hücre kültürlerinden ortadan kaldırmak zordur. Bu küçük alt-popülasyonları da yaralanma sonrası in vivo mevcut olan otolog hücrelerin hatırlatarak, in vitro çalışmalar sırasında miyelinasyonun süreçlerine katılmaları dikkat etmek önemlidir. İkinci yaklaşım (burada sunulmamıştır), iki farklı hücre tipleri arasında doğrudan bir temas (aktarmalı ko-kültür) kaçınarak, hücre kültürü insertlerin kullanımını içerir. Ancak buradaner, sinir rejenerasyonu (uzun nevritlerle geliştirmek için nöronal hücrelerin azalması yeteneği) sırasında in vivo koşullarda temsilcisi değil, ama diğer 38 üzerine belirli bir hücre popülasyonu tarafından ortamda yayımlanan yayılabilir faktörlerin etkisini araştırmak için kullanılır .

Periferik sinir yaralanmaları İngiltere&#39;de yaklaşık 9.000 vaka ağırlıklı olarak genç her yıl meydana gelen ve nüfusu 1 çalışma ile ortaktır. Mikrocerrahi sinir onarım teknikleri rağmen, fonksiyonun normal restorasyon engelli el hissi, azaltılmış motor fonksiyon ve sık ağrı ve soğuk intoleransı 2 ile sonuçlanan ulaşılamaz. Bu tür yaralanmalar derin ve kalıcı bir hasta üzerindeki etkisini ve daha az% 60 3. çalışmak için dönen, günlük yaşam aktivitelerini gerçekleştirmek için yeteneği var. Yaralanma, fenotip ve nöronların morfolojisi ve Schwann hücrelerinin akson filizlenmesini sağlamak için uygun bir ortam yaratmak amacıyla (SC) değişikliğinin ardından. Transeksiyonu durumunda, sinir yakın ve uzak uçlarının ayrıldı; rejeneratif süreç distal güdük iken, yer aldığı noktasıdır olmak proksimal güdük SC kopmakta bunun Wallerian dejenerasyonunu uğraryaralı aksonlar, de-farklılaştırmak ve çoğalırlar gelen. Bu miyelin enkaz kaldırma ve sinir yeniden nesil 4,5&#39;ten için uzak güdük hazırlanıyor yönelik esastır. Akson filizlenmesi distal güdük de SC tarafından yayımlanan nörotrofik faktörlerin ve kemokin üretimi tarafından desteklenen ve Wallerian dejenerasyon 6,7 aşağıdaki geride bazal lamina tarafından yönlendirilir. SC Büngner bantlarını oluşturan rejenere akson, yanında hizaya yardımcı olan endonöral tüp dışında dallanma azaltılması hedef organa doğru akson büyümesi. Reinnervation ardından, Güney Carolina rejenere akson sarma yeni miyelin kılıfını oluşturan, ancak duyusal ve motor fonksiyon sadece kısmen 8 restore edilmiştir. Dorsal kök gangliyon (DRG), duyusal sinir hücreleri, çevresel organlar innerve içeren omurga intervertebral foraminanın bulunan yapılar vardır. Ayrışmış, bunlar, uygun bir in vitro mod olarak kullanılabilirmiyelin oluşumu soruşturma da dahil olmak üzere 11, - sinir rejenerasyonu 9 çalışma için el. Özel olarak, yetişkin DRG nöronlarında, bu hücrelerin in vivo özelliklerini taklit eden ve doku mühendisliği periferik sinir onarımı için yeni stratejiler incelemek için üstün bir araç sağlar. Eş-kültür, in vitro olarak, bir, özellikle iki (veya daha fazla) hücre tiplerinin etkileşimi, in vivo ortamı taklit eden dinamik bir sistemi temsil eder. Bu hücre ko-kültürü modelleri avantajlarından biri, hücre dışı ortama tatbik edilebilir esnekliği ve yüksek kontrolüdür. 14 - DRG nöronlarında çevresel sinir sisteminde 10,12 iki hücre tipleri arasında meydana gelen gerçek etkileşimi taklit eden SC ile ko-kültür sistemlerinde sık sık kullanılmaktadır. Bu SC dışı matriks (ECM) proteinleri ve son derece artırabilir büyüme faktörleri salgılar olduğu gösterilmiştirDRG nöronlar yeteneği hayatta ve neurites 15,16 filiz. Bununla birlikte, SC hücre kültürü tekniği ilerlemelere rağmen, doku mühendisliği uygulamaları için bir hücre, uygun bir sayı üretmek için hala zordur çoğalmaya zaman uzun süre gerektirir ve. Buna ek olarak, sağlıklı bir sinir kurban otolog SC hasat için gerekli olan. Bu nedenle, kaynak SC fark her iki doku mühendisliği için ve sinir rejenerasyonu vitro testler de önemlidir. Bu görünümde, ASC, periferik sinir tamiri 17,18 için kullanılmak üzere, bir doku mühendisliği yapısının geliştirilmesi için önemli bir alternatif olarak kabul edilebilir. Daha önceki çalışmalar, S-100, p75 ve glial fibriler asidik protein (GFAP) 19, hem de miyelin proteini sıfır (P0) gibi karakteristik glial belirteçleri, 20 eksprese eden, Güney Carolina gibi ASC farklılaşırlar, bu hücrelerin yeteneği gösterdi . beyin-türevi nörotrofik faktör olarak glial büyüme faktörlerinin salgılanması (BDNF), sinir gelişme faktörü (NGF) ve glial hücre-türevi nörotropik faktör (GDNF), aynı zamanda 21,22 gözlenmiştir. 26 - in vitro hem de gösterdiği ve in vivo olarak 23 çalışmalar nedenle, Güney Carolina gibi ASC, periferal sinir rejenerasyonu için promoter olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, ASC, diğer kök hücre tiplerine göre daha yüksek sayıda minimal invaziv prosedürler aracılığıyla hasat edilebilir; adipoz dokusunda kök hücrelerin sıklığı 100- kemik iliği 27 daha yüksek 1000-kat, ve SK ve kemik iliği mezenkimal kök hücreleri ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir proliferasyon oranına sahiptir. Bu eser sırasıyla ayrışmış DRG nöronlar ve ASC yüksek verimli hasat gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol, ikinci SC-benzeri hücrelere ayırt ediliyor sağlamayı amaçlamaktadır. Bu iki hücre tipi ko-kültür nedenle DRG KD yeteneği gelecekteki çalışmalar için kullanılabilecek bir çok pratik bir sistem temin edecektirurons neurites ve sinir doku mühendisliği için farklı iskele üzerinde miyelin oluşumu mekanizmaları filiz.

<table><tbody><tr><td>100 ve mikro; m hücre süzgeci</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td>70 & mu; M süzgeçler (ref. 352350) alternatif olarak kullanılabilir</td></tr><tr><td>15 ml plastik tüpler</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>50 ml plastik tüpler</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 şişeleri</td><td>Corning</td><td>BC301</td><td></td></tr><tr><td>Retinoik Asit >98% HPLC</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>ARA-C takviyesi</td><td>Sigma</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan FGF-bazik (154 aa)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9205</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz tip I</td><td>Gibco</td><td>17100-017</td><td>Not: Bu kollajenaz sadece yağ dokusu sindirimi için kullanılır</td></tr><tr><td>Kollajenaz tip IV</td><td>Worthington Biyokimyasal</td><td>LS004188</td><td>Not: Bu kollajenaz sadece DRG eksplantlarını ayırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Biosera</td><td>FB-1001</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F3917</td><td></td></tr><tr><td>Cam pipetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50253</td><td>Keskin malzeme uygun şekilde atılmalıdır</td></tr><tr><td>Glial Büyüme Faktörü-2 (GGF-2)</td><td>Acorda Therapeutics</td><td></td><td>GGF-2, Acorda Therapeutics tarafından bağışlanmıştır. Ticari olarak mevcut bir alternatif için NRG1-&beta'yı öneririz; 1 (Ar-Ge D Systems, Abingdon) kök hücre farklılaşması için 200 ng/ml nihai konsantrasyonda kullanılacak</td></tr><tr><td>Besin Karışımı F12 HAM</td><td>Sigma</td><td>N6658</td><td>37 ° C'de sıcak; C belirtilmedikçe bir su banyosunda</td></tr><tr><td>Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td> <td>Sigma</td><td>H9394</td><td>37 ° C'de ısıtın; Belirtilmedikçe bir su banyosunda C</td></tr><tr><td>N-2 takviyesi (100x)</td> <td>İnvitrojen</td><td>17502</td><td></td></tr><tr><td>Sinir Büyüme Faktörü 2.5s Protein, Fare Submaksiller Bezleri ve nbsp; (NGF)</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (PS)</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan PDGF-AA</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td>37 °C'de sıcak & Bir su banyosunda C. Bu, doku kültürü şişelerinden hücre ayrılması için kullanılır</td></tr><tr><td>Tripsin (2x sığır pankreası)</td><td>Worthington Biyokimyasal</td><td>LS003703</td><td>Bu, DRG ayrışması için kullanılır</td></tr><tr><td>Minimum Esansiyel Orta Kartal (MEM)</td><td>Sigma</td><td>M8042</td><td>37 °C'de sıcak; C belirtilmedikçe bir su banyosunda</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>Çözeltiyi biyolojik kabinde hazırlayın</td></tr></tbody></table>

kök ganglia nöronlar ve farklılaştırılmış yağ-türetilmiş kök hücreler dorsal: bir<em&gt; İn vitro</em&gt; co-kültür modeli periferik sinir rejenerasyon eğitim

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Omurganın intervertebral foraminasında bulunan dorsal kök gangliyonları (DRG) nöronları, sinir rejenerasyonu ve miyelinasyon çalışmasını kolaylaştıran bir in vitro sistem oluşturmak için kullanılabilir. Periferik sinir sisteminin glial hücreleri, Schwann hücreleri (SC), bu süreçlerin anahtar kolaylaştırıcılarıdır; Bu nedenle, bu hücresel bileşenlerin etkileşimlerinin birlikte incelenmesi çok önemlidir. DRG nöronları ve glial hücreler arasındaki doğrudan temas, spesifik membran reseptörleri tarafından algılanan ek uyaranlar sağlayarak nöronal yanıtı daha da iyileştirir. SC, kültür ortamında nöron sağkalımını artıran ve nörit filizlenmesini ve uzamasını uyaran büyüme faktörlerini ve proteinleri serbest bırakır. Bununla birlikte, SK'nin doku mühendisliği uygulamaları için uzun proliferasyon süresi ve bunların kaynağı için sağlıklı bir sinirin feda edilmesi gerekir. SK fenotipine farklılaşan adipoz kaynaklı kök hücreler (ASC), sinir rejenerasyonunu incelemek için DRG nöronları ile bir ko-kültür modelinin kurulması için SK'ye geçerli bir alternatiftir. Bu çalışma, yetişkin sıçanlardan hem DRG nöronlarını hem de ASC'yi hasat etmek için ayrıntılı ve tekrarlanabilir bir adım adım protokol sunmaktadır; ASC'yi bir SC fenotipine doğru ayırt etmek için; ve periferik sinir sistemindeki nöronlar ve SC arasındaki etkileşimi araştırmak için iki hücre tipini doğrudan bir ko-kültür sisteminde birleştirir. Bu araç, periferik sinir onarımı için doku mühendisliği yapılarının optimizasyonunda büyük bir potansiyele sahiptir.

Ayrışmış DRG nöronlarının Kültürleri sinir rejenerasyonu çalışması için bir in vitro model uygun temsil eder. Ancak, işlenmemiş yüzeyler DRG eki ve neurites uzatılması için uygun bir ortam vermeyin. SC-benzeri ASC onlar kültür ortamında yayımlanan zaman neurites filiz DRG nöronların yeteneğini artırabilir büyüme faktörleri ve kemokinleri 19 üretebiliriz. kültür sisteminde SC benzeri ASC varlığı dolayısıyla DRG fonksiyonlarının düzenlenmesinde önemli bir rol oynayabilir. Bu protokol (Şekil 1) nöronal hücrelerin önceden ekilmiş SC-benzeri ASC ile doğrudan temasa sırasında SC-benzeri ASC ve DRG nöronlar, doğrudan ko-kültür gerçekleştirmek için prosedürü gösterir. Bu prosedür ile ilgili ana zorluk farklı hayvanların hasat DRG nöronların sayısının yüksek değişkenlik olduğunu. Bu nedenle, sonuçlar COMPAR bazen zor olabilirE ve belirli bir önem verilmektedir, her deneyde benzer bir hücre yoğunluğu elde etmek üzere tohum işlemi sırasında dikkat edilmelidir. protokol BSA degrade (adım 3.11) kullanılarak DRG nöron ayrışma kalan uydu hücrelerin en azından sayısını azaltmak için optimize edilmiştir. Kingham&#39;deki ve ark. 11 tarafından tarif edildiği gibi ek olarak, sitosin-arabinoz (Ara-C) ek, daha da uydu hücre popülasyonu en aza indirmek için BS ortamına ilave edilebilir. Bununla birlikte, tedavi süresi seçimi aynı zamanda, kültür ortamı içinde ARA-C ek mevcudiyeti ile etkilenmektedir DRG SC benzeri ASC canlılık ile dikkatle dengelenmiş olması gerekir. Bu nedenle, bir uydu hücre serbest sistemini gerçekleştirmek çok zor. Alt-tabakalar olarak kaprolakton (PCL) film - Şekil 2, muamele edilmemiş ve kimyasal olarak modifiye edilmiş poli ile bir ko-kültür modelinde filizlenme DRG akson SC benzeri ASC önemini göstermektedir. DRG nöronlar vardı maiAşama 4.5 de tarif edildiği gibi, BS ortam% 50 ve kök hücre farklılaştırma ortamının% 50 ihtiva eden bir karışık çözeltisi kullanılarak varlığında veya SC-benzeri ASC yokluğunda, 3 gün için kültür içinde ntained. Bu dönemin ardından, hücreler% 4 paraformaldehid içinde sabitlendi ve β-tubulin III (DRG nöronlarında), S100 (SC-benzeri ASC), hücre morfolojisi araştırmak ve nörit çıkıntı yapacak DRG nöronlarının yeteneği çalışma ile boyanmıştır. Nöritlerin oluşumu açık eş-kültür sistemine (Şekil 2C) geliştirilmiş iken Resim nevritler kendilerine SC-benzeri (ASC Şekil 2A) yokluğunda muamele edilmemiş yüzeyler üzerinde gözlenmiştir. Ortalama olarak, hücre gövdesi başına yapılan akson sayısı, önemli ölçüde kök hücrelerin varlığında 0-3 yükselmiştir. Bu sonuçların doğrulanması da Şekil 3 &#39;de gösterilen elektron mikroskobu (SEM) analizi, taramalı verildi. Özellikle, SEM görüntüleri nevritlerle filiz DRG nöronlarının yeteneği bağlantılı olarak, tercihen gerçekleştiğini göstermekSC-benzeri ASC, Şekil 3C&#39;de sarı oklarla gösterilen. Bu nörit oluşumu ve uzantısı ile ilgili kayda değer etkilere sahip olan, DRG nöronlarını içeren kültür sistemleri (laminin türetilmiş peptidler de dahil olmak üzere), laminin ile modifiye edilmiş alt-tabakaların kullanımı ise genellikle nöronal hücre kültürü için uygun bir tıbbi vaziyet olarak tanımlanmaktadır olduğunu belirtmek gerekir 30-32 . Bununla birlikte, Şekil 2 ve Şekil 3D&#39;de gösterilen sonuçlar, kimyasal ve biyolojik ipuçlarının kombinasyonu ayrıca DRG nöronlarının yanıtı arttırmak olduğunu gösterir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52543/52543fig1highres.jpg" /> Doğrudan DRG-SC-benzeri ASC ko-kültür sisteminin Şekil 1. hazırlanması. DRG nöronlar ve ASC spinal kolon ve yetişkin mal viseral ve kasık yağ sırasıyla elde edilire Sprague-Dawley rat. Enzimatik reaksiyon bir çağlayanı içinden adipoz doku sindirilmesinden sonra, ASC SC-benzeri hücrelerin farklılaşmasını ve ihtiyaç duyulana kadar alt konfluent koşullarda muhafaza edilmiştir. SC-benzeri ASC DRG hasat öncesinde her bir taban 24 saat önceden numaralı seribaşı bulunmaktadır. Günde, DRG nöronlarında ekstre edilir ve enzimatik ve mekanik olarak yürütülen bir dizi ile ayrışmış. nöronlar daha önce ekilmiş SC benzeri ASC üzerine ekilmiş ve deneye tabi tutulana kadar kültür içinde muhafaza edilmiştir (karışık ortam: kök hücre farklılaştırma ortamının% 50 ve modifiye BS ortamının% 50 ihtiva eder). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig1large.jpg" target="_blank">Burada tıklayın bir büyük görmek için Bu rakamın sürümü.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52543/52543fig2highres.jpg" /> Farklı kültür koşullarında DRG nöronların Şekil 2. Floresan görüntüleri.(A) muamele edilmemiş PCL filmler (B), RGD modifiye PCL filmler, (C) eş-kültür SC gibi, ham PCL filmler ASC, (D), eş-kültürlenen RGD modifiye PCL filmler SC benzeri ASC. Hücreler, modifiye edilmiş BS ortamı% 50 ve kök hücre farklılaştırma ortamının% 50 ihtiva eden bir karışık çözeltisi kullanılarak, 3 gün için kültür içinde muhafaza edilmiştir. Bu süre geçtikten sonra, hücreler,% 4 paraformaldehid içinde sabitlendi Triton-X-çözeltisi içinde permeabilize ve spesifik olmayan bağlanma bölgeleri,% 1 BSA ile bloke edildi. Ve S-100 karşı SC-benzeri ASC (AlexaFluor568; kırmızı) antikorları; nöronal hücreler daha sonra β-tubulin III (yeşil FITC) karşı boyandı. Son olarak çekirdekleri DAPI (mavi) ile boyanmıştır. Görüntüler, bir floresans mikroskobu (Olympus BX60, Japonya) kullanılarak elde edildi. Izni ile (Re-print de Luca ve ark., 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir vers görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın iyon. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52543/52543fig3highres.jpg" /> Farklı kültür koşullarında DRG nöronlarının Şekil 3. SEM görüntüleri, (A) muamele edilmemiş PCL filmler (B), RGD modifiye PCL filmler. (C), ko-kültürlenmiştir işlenmemiş PCL filmler SC benzeri ASC, (D), eş-kültürlenen RGD modifiye PCL filmler SC-benzeri ASC ile. Sarı oklar ko-kültür sisteminde doğrudan etkileşim teyit SC-benzeri ASC ve DRG arasındaki temas noktalarını gösterir. Hücreler, 3 gün için kültür içinde muhafaza ve% 2.5 glutaraldehid içinde sabitlendi. Dereceli etanol serisi (% 50,% 70,% 90,% 100) dehidrasyon sonra hücreler son olarak heksametildisilazan ile durulanmış ve SEM analizi için püskürtme kütüklerden ve altın monte edilmeden önce kurutulmuştur. Görüntüler hızlanan vol ile SEM (Zeiss EVO60, İngiltere) kullanılarak elde edildi10kV ve tage. (De Luca ve ark., 30 izniyle yeniden baskı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Dorsal kök gangliyon (DRG), periferal sinir sisteminin duyusal nöronlar ihtiva eden yapılardır. Ayrışmış zaman, yaralanma yerinde in vivo ortamda taklit in vitro sinir rejenerasyonu ve miyelin incelemek için değerli bir model sağlayan, Güney Carolina gibi yağ elde edilen kök hücreleri (ASC) ile birlikte kültürlenebilir.

Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Co-kültür Modeli Periferik Sinir Rejenerasyon Eğitim

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Bu prosedürün genel amacı, in vitro sinir rejenerasyonunu incelemek için adipoz kaynaklı kök hücre ve dorsal kök ganglion veya DRG nöron ko-kültürleri kurmaktır. Bu işlem, öncelikle sıçan yağ dokusundan farklılaşmamış adipoz kaynaklı kök hücrelerin elde edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda hücreler, büyüme faktörlerinden oluşan bir kokteyl kullanılarak Schwann benzeri hücrelere farklılaştırılır.Ardından, sırt kök gangliyonu (DRG) nöronları bir sıçan spinal kordundan hasat edilir ve son adımda, in vitro ko-kültür sistemini oluşturmak için nöronlar farklılaşmış kök hücrelerin üzerine yerleştirilir. Son olarak, nörit büyümesinin kolaylaştırılması, kantifikasyon ve morfolojik değerlendirme amacıyla hücreler nöronal ve glial belirteçler için boyanır ve taramalı elektron mikroskobu ile görüntülenir. Bu yöntem, rejeneratif tıp alanındaki farklı soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, adipoz kaynaklı kök hücreler farklı biyomalzemeler üzerinde DRG nöronları ile nasıl etkileşime girer?Bu yöntemin gösterimi kritik öneme sahiptir çünkü işlem, biyolojik güvenlik kabini içerisinde dokuların düşük erişilebilirliği ve küçük boyutları nedeniyle öğrenilmesi zor adımlar içermektedir. Öncelikle, yetişkin erkek Sprague Dawley sıçanlarından alınan visseral ve inguinal yağları, bir makas ve steril bir jilet kullanarak ince bir kıvama gelene kadar ince ince kıyın. Ardından, elde edilen yağ bulamacını 15 mililitre taze hazırlanmış, filtre edilmiş ve sterilize edilmiş kollajenaz tip 1 çözeltisi içeren bir tüpe aktarın ve tüpü, sürekli ajitasyon altında 37 °C su banyosunda 30 ila 60 dakika bekletin.Hücre canlılığını ve verimini artırmak için, doku tamamen disosiye olmadan önce durdurarak sindirimi yakından izleyin. Doku hazır olduğunda, 100 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün. Başarılı bir sindirim, hafifçe çalkalandığında bej renkte görünen homojen bir yağ kıvamı ile sonuçlanacaktır.Sindirici enzimleri, FBS ile takviye edilmiş 37 degrees Celsius sıcaklıktaki 15 milliliters kök hücre büyüme ortamı ile nötralize edin. Ardından, stromal vasküler fraksiyonu toplamak için hücreleri santrifüjleyin. Süpernatantı, üstteki yağ tabakasından başlayarak aspire edin.Pelleti, bir mililitre eritrosit ISIS tamponu içerisinde pipetleme yaparak yeniden süspanse edin. Bir dakika sonra, 10 mililitre taze besiyeri ekleyerek lizisi durdurun ve hücreleri tekrar santrifüjleyin. Şimdi, S süpernatanını dikkatlice aspire edin.Hücreleri 10 mL besiyerinde yeniden süspande edin ve 75 cm²'lik flasklara 37 °C ve %5 CO2 koşullarında ekimleyin. Hücreleri, spinal kord hasadından sonra DRG nöronları elde etmek amacıyla beta-mercaptoethanol ve retinoik asit uygulamasıyla Schwann benzeri hücrelere farklılaşmaya hazır hale geldikleri birinci veya ikinci pasaja kadar sub-konfluen seviyelerde tutun.Öncelikle tüm dorsal kısımları çıkararak başlayın ve ardından spinal kolonu boylamsal eksen boyunca ikiye bölmek için steril ve keskin cerrahi makas kullanarak kord dokusunu açığa çıkarın. Spinal kolonu göğüs kafesi seviyesinin altından iki daha küçük segmente bölün ve ardından tüm kord dokusunu nazikçe çıkarmak için ince pensler kullanın. Kanallardan doğrudan çıkan beyaz filamentler şeklinde görünen DRG köklerini çekmemeye ve koparmamaya dikkat edin.Tüm çekirdek doku çıkarıldıktan sonra, vertebra kanallarının derinliklerine ulaşarak ve gangliyon köklerine zarar vermemeye dikkat ederek, tüm DRG kökünü çekmek için çok ince pensler kullanın. DRG'yi, antibiyotiklerle desteklenmiş üç ila dört mililitre hams F 12 besiyeri içeren 60 kare milimetrelik bir petri kabına yerleştirin. Ardından, bir diseksiyon mikroskobu altında, uydu hücre kontaminasyonunu azaltmak için gangliyonları çevreleyen fazla sinir köklerini temizlemek amacıyla steril pens ve neşter kullanın.Ardından, DRG'yi 1,8 mililitre taze F 12 medyumu içeren 35 milimetrekarelik bir Petri kabına aktarın ve 200 mikrolitre kollajenaz Tip dört stok çözeltisi ekleyin. DRG'yi bir saat boyunca inkübe edin ve ardından medyumu cam bir pipetle dikkatlice aspire edin.DRG'nin aspire edilmemesine veya zarar görmemesine dikkat edin. Kollagenaz adımını tekrarlayın ve DRG'yi F 12 medyumu ile yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, hücrelere 1.8 milliliters F 12 medyumu ve 200 microliters tripsin ekleyin.Enzimatik reaksiyonu durdurmak için tripsin uzaklaştırılır ve 500 µL FBS ile desteklenmiş bir mililitre besiyeri eklenir. Ardından, serumun tüm kalıntılarını temizlemek için besiyeri aspire edilir ve DRG, F 12 besiyeri ile üç kez nazikçe yıkanır. Şimdi hücrelere iki mililitre taze F 12 besiyeri verilir ve hücre süspansiyonunu 15 ml'lik bir tüpe dikkatlice aktarmak için bir cam pipet kullanılır.Nöronları nazikçe ayrıştırmak için pipetle sekiz ila 10 kez çekip bırakın ve ardından pelletin tüpün dibinde toplanmasını bekleyin. Üst fazı yeni bir tüpe aktarın ve pelletin üzerine iki mililitre taze F 12 medyumu ekleyin. Süspansiyon homojen hale gelene kadar mekanik ayrıştırma ve medyum aktarma işlemlerini tekrarlayın.Ardından hücre süspansiyonunu üç ila dört kez yeniden değerlendirin ve ardından elde edilen homojenize süspansiyonu 100 mikronluk bir hücre süzgeci aracılığıyla yeni bir 50 mililitrelik tüpe filtreleyin. Hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte santrifüjleyin; hücreler yavaşça dönerken, kademeli bir protein izi oluşturmak için 45 derecelik açıyla tutulan 15 mililitrelik bir tüpün iç yüzeyine taze hazırlanmış %15 sığır serum albümini pipetleyin.Tüp üzerindeki rakamları izi oluşturmak için referans olarak kullanarak, hücrelerden snat'ı aspire edin; resüsitasyon için son 500 µL'yi saklayarak peleti süspansiyona getirin ve hücreleri protein izi boyunca yeni tüpe yavaşça dağıtın. Hücreleri tekrar santrifüjle çöktürdükten sonra, peleti bir mL modifiye BS besiyerinde yeniden süspansiyona getirin ve hücreleri düşük hacimli bir besiyeri içinde ekim yapın. Hücreler tutunduğunda, 24 kuyucuklu plaka içerisinde iki saat beklettikten sonra, disosiyasyonu takiben mililitrede 15 ng sinir büyüme faktörü ile desteklenmiş taze BS besiyeri ekleyin.DRG hücreleri, önceden ekilmiş hücrelerin üzerine ekilerek Schwann hücresi benzeri adipoz kök hücrelerle ko-kültür için de kullanılabilir. Bu görüntüler, substrat olarak polikaprolakton filmlerin kullanıldığı bir ko-kültür modelinde, Schwann hücresi benzeri adipoz kök hücrelerin DRG nörit filizlenmesi için önemini göstermektedir. Schwann hücresi benzeri adipoz kök hücrelerin yokluğunda, işlem görmemiş yüzeylerde hiçbir nörit gözlemlenmezken, ko-kültür sisteminde nörit oluşumunun belirgin şekilde iyileştiği görülmüştür.Kök hücrelerin varlığında, hücre gövdesi başına düşen nörit sayısı ortalama olarak önemli ölçüde artar. Gerçekten de, bu görüntülerin örneklendiği üzere, DRG nöronlarının nörit çıkarma yeteneği, sarı oklarla belirtildiği gibi, öncelikli olarak farklılaşmış kök hücrelerle birlikte gerçekleşir. Bu videoyu izledikten sonra, kök hücreleri türetebilmeli ve DRG nöronlarını dissosiye edebilmelisiniz.Ancak aynı zamanda, periferik ortalama dejenerasyonu incelemek için bir model kurabilmeniz gerekir.

dorsal-root-ganglia-neurons-differentiated-adipose-derived-stem-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

Bu videoda, izole fare DRG dokuları kullanılarak dorsal kök gangliyonları veya DRG eksplant kültürü ve DRG ile ayrışmış hücre modelleri geliştirmek için bir yöntem gösterilmektedir. Bu modeller, kontrollü bir ortamda nöron-glial etkileşimlerle çeşitli mekanizmaların incelenmesine yardımcı olur.

Dorsal Kök Ganglion Eksplant ve Disizosiyasyon Hücre Kültürü Oluşturulması

Bu video, dorsal kök gangliyonlarından (DRG) nöronları toplamak için bir yöntem gösterir. Bir sıçanın omurgasından DRG izole edilir, enzimlerle muamele edilir ve daha sonra tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için mekanik olarak ayrıştırılır. Nöronlar, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme kullanılarak glial hücrelerden ayrılır ve bir büyüme ortamında kültürlenir.

Nöronal Kültürler için Dorsal Kök Gangliyonlarının Toplanması ve Ayrıştırılması için Bir Teknik

Bu video, bir dorsal kök ganglion eksplant ve Schwann hücrelerinin kokülasyon modelini göstermektedir. Kokültür koşullarında, askorbik asit, Schwann hücrelerinin miyelinatör formlara farklılaşmasını teşvik eder. Miyelinizan Schwann hücreleri, sinir fonksiyonu için gerekli olan bir miyelin kılıfı oluşturmak için aksonları birden çok kez sarar.

Nöron Miyelinasyonu için Dorsal Kök Ganglion Eksplantının Schwann Hücreleri ile Birlikte Kültürlenmesi

Bu protokol, duyusal akson rejenerasyonunu incelemek için bir model olarak yetişkin bir sıçanda viral vektör ile bir dorsal kök ganglion (DRG) enjeksiyonunun ve eşzamanlı bir dorsal kök ezilme yaralanmasının kullanımını sunar. Bu model, duyusal akson rejenerasyonunu teşvik etmek için gen terapisinin kullanımını araştırmak için uygundur.

Sırt kök ganglion Enjeksiyon ve Dorsal Kök Duyusal Axon Rejenerasyon Modeli Olarak Ezilme Yaralanması

Bu raporda, organotypic ve fare kaynaklı dorsal kök gangliyon Disosiye birincil kültürler avantajları ile nöron gliyal etkileşim, nöroplastisite ilişkili mekanizmaları geniş bir araştırmaya vurgulanır, neuroinflammation ve viral enfeksiyon yanıt.

Yetişkin fare DRG Explant ve nöroplastisite ve Viral enfeksiyon da dahil olmak üzere çevre hakaret yanıtlar araştırmak için hücre modelleri ayrışmış

Dorsal kök gangliyon (DRG) birincil kültürler sık fizyolojik fonksiyonları veya patoloji ile ilgili olayların duyusal sinir hücreleri incelemek için kullanılır. Burada, peptit FF reseptör yazdıktan sonra 2 stimülasyon ile seçici bir agonist nörotransmitter sürümü algılamak için bel DRG kültürler kullanımını göstermektedir.

Dorsal kök gangliyon yalıtım ve birincil kültür nörotransmitter yayın çalışmaya

Nöral yaralanmadan sonra koku alma glia (OEG) nörojeneratif kapasitesini değerlendirmek için bir in vitro model sunuyoruz. RGN aksonal ve somatodendritik belirteçleri analiz ederek, OEG monolayerleri üzerinde axotomized adult retinal ganglion nöronlarının (RGN) bir kokülatürüne ve daha sonra aksonal rejenerasyon çalışmasına dayanmaktadır.

Beyazlatılmış Sıçan Retinal Ganglion Nöronlarının Koku Alma Ensheathing Glia ile Birlikte, Yetişkin Aksonal Rejenerasyonun In Vitro Modeli Olarak

Dorsal kök gangliyonları ve Schwann hücrelerinin kokültür sisteminde, periferik sinir sisteminin miyelinasyonu incelenebilir. Bu model, periferik miyelinasyonu gözlemlemek ve ölçmek ve ilgilenilen bileşiklerin miyelin kılıfı üzerindeki etkilerini incelemek için deneysel fırsatlar sunmaktadır.

Sıçan dorsal kök ganglion eksplantları ve schwann hücrelerinin bir kokültüründe periferik aksonların in vitro miyelinasyonu

Bu protokol, çok bölmeli (MC) bir cihazda yetişkin Sprague Dawley sıçanlarından ekilen dorsal kök ganglionunu (DRG) hasat etmek ve kültürlemek için bir teknik sağlar.

Periferik Nöronal Özellikleri İncelemek için Çok Bölmeli Cihazlarda Dorsal Kök Gangliyonlarının Toplanması, Gömülmesi ve Kültürlenmesi

Bu protokol, fare Dorsal Kök Gangliyonlarının (DRG) tüm mount ve ayrışmış kültürlerinin oluşturulması için yöntemleri ve bunların tümör-sinir etkileşimlerini değerlendirmek için kullanımlarını açıklar.

Dorsal Kök Gangliyon Kültürünün İn Vitro Modellerinin Oluşturulması: Kanser-Sinir Karışmasının Araştırılmasında Tamamlayıcı Yaklaşımlar

Keşfedin dorsal kök ganglion nöronları ve Schwann benzeri yağ-kökenli kök hücrelerle in vitro ko-kültür modeli. Bu yöntem periferik sinir rejenerasyonu ve hücre etkileşimlerini araştırmak için kullanılır.

Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir İn Vitro Co-kültür Modeli Periferik Sinir Rejenerasyon Eğitim (Video) | JoVE Journal

Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir

Daha fazla video keşfet