Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir İn Vitro Co-kültür Modeli Periferik Sinir Rejenerasyon Eğitim

Bu prosedürün genel amacı, in vitro sinir rejenerasyonunu incelemek için adipoz kaynaklı kök hücre ve dorsal kök ganglion veya DRG nöron kokültürlerini kurmaktır. Bu, ilk olarak sıçan yağ dokusundan farklılaşmamış yağ türevli kök hücrelerin elde edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, hücreler bir büyüme faktörleri kokteyli kullanılarak schwan benzeri hücrelere farklılaştırılır.

Daha sonra, DRG nöronları bir sıçan omuriliğinden toplanır ve son adımda ilişkilendirilir, nöronlar in vitro ko-kültür sistemini oluşturmak için farklılaşmış kök hücrelerin üzerine oturtulur. Sonuç olarak, hücreler nörit büyümesini, nicelleştirilmesini kolaylaştırmak için nöronal ve glial belirteçler için boyanır ve morfolojik değerlendirme için taramalı elektron mikroskobu ile görüntülenir. Bu yöntem, rejeneratif tıp alanındaki farklı soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir, bu nedenle doğru kök hücrenin farklı biyomateryaller üzerindeki organik nöronlarla nasıl etkileşime girdiği gibi?

Bu yöntemin gösterilmesinin kritik olmasının nedeni, biyolojik bir dolaptaki dokuların düşük erişilebilirliği ve küçük boyutu nedeniyle öğrenilmesi zor olan adımları içermesidir. Yetişkin erkek spro dolly sıçanlarından toplanan viseral ve inguinal yağı ince bir kıvamda doğramak için bir makas ve steril bir tıraş bıçağı kullanarak başlayın. Daha sonra, elde edilen yağ bulamacını 15 mililitre taze hazırlanmış filtre, sterilize edilmiş kollajenaz tip bir çözelti içeren bir tüpe aktarın ve bir tüpü 30 ila 60 dakika boyunca sürekli çalkalama altında 37 derece Santigrat su banyosuna yerleştirin.

Hücre canlılığını ve verimini artırmak için doku tamamen ayrışmadan önce durarak sindirimi yakından izleyin. Doku hazır olduğunda, 100 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün. İyi bir sindirim, hafif bir dönme ile bej görünen homojen bir yağ kıvamı ile sonuçlanacaktır.

FBS ile desteklenmiş 15 mililitre 37 santigrat derece kök hücre büyüme ortamı ile sindirim enzimlerini nötralize edin. Daha sonra stromal vasküler fraksiyonu toplamak için hücreleri aşağı doğru döndürün. Sırtüstü, yağın en üst tabakasından başlayarak aspire edin.

Peletleri pipetleme ile bir mililitre kırmızı kan hücresi ISIS tamponunda yeniden süspanse edin. Bir dakika sonra, hücrelere tekrar 10 mililitre taze, orta ve santrifüj ekleyerek lizisi durdurun. Şimdi S süpernatanı dikkatlice aspire edin.

Hücreleri 10 mililitre ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri 75 santimetre karede tohumlayın. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte şişeler. Omuriliği çıkardıktan sonra DRG nöronlarını elde etmek için beta, daha fazla kapak, etanol ve retinoik asit ile muamele ederek hücrelerin schwan benzeri hücrelere farklılaşmaya hazır olduğu birinci veya ikinci geçişe kadar hücreleri alt birleşen seviyelerde tutun.

Herhangi bir sırt parçasını çıkararak başlayın ve ardından omurgayı uzunlamasına eksen boyunca ikiye bölmek ve kordon dokusunu açığa çıkarmak için steril ve keskin cerrahi makas kullanın. Omurgayı göğüs kafesi seviyesinin altında iki küçük parçaya kesin ve ardından tüm kordon dokusunu nazikçe çıkarmak için ince forseps kullanın. Kanallardan direkt olarak çıkan beyaz filamentler şeklinde görünen DRG köklerinin çekilip çıkarılmamasına özen gösterin.

Çekirdek dokunun tamamı çıkarıldıktan sonra, tüm DRG kökünü çekmek için çok ince forseps kullanın, dikey kanalların derinliklerine ulaşın ve ganglionların köklerine zarar vermemeye dikkat edin. DRG'yi, antibiyotiklerle desteklenmiş üç ila dört mililitre jambon F 12 ortamı içeren 60 milimetrelik bir evcil hayvan ağacı tabağına yerleştirin. Daha sonra bir diseksiyon mikroskobu altında, uydu hücrelerinin kontaminasyonunu azaltmak için gangliyonları çevreleyen fazla sinir köklerini temizlemek için steril forseps ve bir neşter kullanın.

Daha sonra, DRG'yi 1.8 mililitre taze F 12 ortamı içeren 35 milimetre karelik bir Petri kabına aktarın ve 200 mikrolitre kollajenaz ekleyin. Dört stok çözeltisi yazın. DRG'yi bir saat inkübe edin ve ardından ortamı bir cam pipetle dikkatlice aspire edin.

DRG'yi aspire etmemeye veya zarar vermemeye dikkat edin. Kollajenaz adımını tekrarlayın ve DRG'yi F 12 besiyeri ile yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, hücrelere 1.8 mililitre F 12 orta ve 200 mikrolitre tripsin ekleyin.

Tripsinin çıkarılması ve enzimatik reaksiyonu durdurmak için 500 mikrolitre FBS ile desteklenmiş bir mililitre ortam eklenmesi. Daha sonra ortamı aspire edin ve serumun tüm kalıntılarını gidermek için DRG'yi F 12 ortamı ile üç kez nazikçe yıkayın. Şimdi hücreleri iki mililitre taze F 12 besiyeri ile besleyin ve hücre süspansiyonunu dikkatlice 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için bir cam pipet kullanın.

Nöronları nazikçe ayırmak için sekiz ila 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından damak yerleştiğinde damağın tüpün dibinde birikmesine izin verin. Sırtı yeni bir tüpe aktarın ve damağa iki mililitre taze F 12 medium ekleyin. Mekanik ayrışmanın tekrarlanması ve süspansiyona ortam transferi homojen hale gelir.

Daha sonra hücre süspansiyonunu üç ila dört kez yeniden derecelendirin, ardından elde edilen homojenize süspansiyonun 100 mikronluk bir hücre süzgecinden yeni bir 50 mililitrelik tüpe süzülmesi ile devam edin. Hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte yavaşça dönerken santrifüjleyin, taze hazırlanmış pipetleyin. 15 mililitrelik bir tüpün iç kısmında% 15 sığır serum albümini, kademeli bir protein izi oluşturmak için 45 derecelik bir açıyla tutulur.

Tüp üzerindeki sayıları şekillendirme yolu için bir referans olarak kullanarak, daha sonra hücrelerden snat'ı aspire edin, son 500 mikrolitreyi resüs için saklayın, peleti askıya alın ve hücreleri protein izi boyunca yavaşça yeni tüpe dağıtın. Hücreleri döndürdükten sonra, tekrar, peleti bir mililitre modifiye BS ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri küçük bir hacimde tohumlayın. İki saat boyunca 24 oyuklu bir plakada, hücreler bağlandığında, ayrışmayı takiben mililitre sinir büyüme faktörü başına 15 nanogram ile takviye edilmiş taze BS ortamı ekleyin.

DRG hücreleri, kuğu hücresi benzeri adipoz kök hücrelerle, tohum öncesi hücrelerin üzerine tohumlanarak ko-kültür için de kullanılabilir. Bu görüntüler, substrat olarak polikaprolakton filmler kullanan bir ko-kültür modelinde DRG Nörit filizlenmesi için schwan hücresi benzeri yağ kök hücrelerinin önemini göstermektedir. Kuğu hücresi benzeri yağ kök hücrelerinin yokluğunda işlenmemiş yüzeylerde nörit gözlenmezken, nöritlerin oluşumu ko-kültür sisteminde açıkça iyileşmiştir.

Ortalama olarak, hücre gövdesi başına düşen nörit sayısı, kök hücrelerin varlığında önemli ölçüde artar. Gerçekten de, bu görüntülerin gösterdiği gibi, DRG nöronlarının nöronları filizlendirme yeteneği, tercihen sarı oklar gülü ile gösterildiği gibi farklılaşmış kök hücrelerle birlikte gerçekleşir. Yani bu videoyu izledikten sonra, artık lib türevi kök hücreler elde edebilmeli ve DGen nöronlarını ayrıştırabilmelidir.

Ama aynı zamanda periferik ortalama dejenerasyonda çalışmak için bir model kurabilmelisiniz.